JPH04148689A - 光学活性３―ヒドロキシ酪酸エステルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アセト酢酸エステルを微生物的に還元して、
光学活性３−ヒドロキシ酪酸エステル、即ち３（Ｒ）−
ヒドロキシ酪酸エステル又は３（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸
エステルを製造する方法に関するものである。３（Ｒ）
−ヒドロキシ酪酸エステル及び３（Ｓ）−ヒドロキシ酪
酸エステルは種々の医薬品、例えば抗生物質等の重要合
成原料である。

〔従来の技術〕

アセト酢酸エステルの不斉還元による３（Ｒ）−ヒドロ
キシ酪酸エステルの製造法としては、（Ｒ。

Ｒ）−酒石酸修飾ラネイニッケル等を触媒として用いる
有機合成による方法（日本化学会誌、ｌ０９１２７０　
（１９８６）、特開昭６０−３６４４２号公報）、ジオ
トリカム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　Ｃａｎ
ｄｉ−ｄｕｍ）、ロドトルラ・バリダ（Ｒｈｏｄｏｔｏ
ｒｕｌａ　ｐａｌｌｉ−ｄａ）等を用いる微生物的方法
（Ｈｅｌｖ、Ｃｈｉｍ、＾ｃｔａ、。

６６、４８５（１９８３）　、特開平１−１１７７９２
号公報）が知られている。

又アセト酢酸エステルの不斉還元による３（Ｓ）−ヒド
ロキシ酪酸エステルの製造法としては、不斉修飾ニッケ
ル触媒を用いる有機合成による方法（油化学、　２９．
４４（１９８０））　、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サーモアナエロビ
ウム轡ブ０７キー（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ
　ｂｒｏｃｋｉｉ等を用いる微生物的方法（＾ｎｇｅｗ
、　Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔ。

Ｂｄ、　Ｂｎｇｌ、、　２３．５７０（１９８４）；＾
ｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ、　Ｉｎｔ。

Ｂｄ、　Ｅｎｇｌ、、　２３．１５０１９８４））が知
られテイル。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の方法が知られているもののアセト酢酸エステルか
らの、３（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸エステル及び３（Ｓ）
−ヒドロキシ酪酸エステルの如き光学活性３−ヒドロキ
シ酪酸エステルの製造を工業的に実施するために、解決
すべき課題はまだ多い。中でも光学活性及び収率の高い
簡便な製造方法を得ることは重要である。

〔課題を解決するための手段〕 本発明者等は、上記の如き問題点を解決するため鋭意研
究を重ねた結果、アセト酢酸エステルにクロストリジウ
ム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、メタノバクテリウム
（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）属、メタノサ
ルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属及びアセト
ゲニュウム（Ａｃｅｔｏｇｅｎ　ｉｕｍ）属から選ばれ
る微生物又はその処理物を作用させた場合、光学活性３
−ヒドロキシ酪酸エステルが得られることを見出し、本
発明を完成するに至った。

本発明で用いる出発原料のアセト酢酸エステルとは、例
えば触媒存在下、アルコールとジケテンを反応させる等
して得られる一般式ＣＨ，Ｃ０ＣＨ，ＣＯロＲで示され
る化合物である。Ｒはアルキル基であり、好ましくは低
級アルキル基、例えばアセト酢酸メチル及びアセト酢酸
エチルが有用である。

本発明で用いる菌株として有用なものを例示すれば次の
通りである。クロストリジウム・サーモアセチクム（Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ
）ＤＳＭ　１７５４、メタノバクテリウム・サーモアウ
トトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｔｈｅｒｍｏａｕｔ。

ｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＤＳＭ　１０５３、メタノサルシ
ナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｂａｒ
ｋｅｒｉ）ＤＳＭ　８０４　、メタノサルシナ・エスピ
ー（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｓｐ、）０３Ｍ２
９０６、メタノサルシナ−ｘスピー（Ｍｅｔｈａｎｏｓ
ａｒ−ｃｉｎａ　ｓｐ、）ＤＳＭ　２９８０　、クロス
トリジウム・サーモオートトロヒカム（Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏ−ｔｒｏｐｈｉｃｕｍ
）ＤＳＭ　１９７４、アセトゲニュウム・キブイ（＾ｃ
ｅｔｏｇｅｎｉｕｍ　ｋｉｖｕｉ）ＤＳＭ　２０３０　
ａまたこれらの変異株も用いることができる。

本発明で用いる菌株の培養は、原則的には一般の微生物
の場合と同様であるが、酸素の混入を防ぐことが必要で
あり、実験室的には、ゴム栓などで密栓した培養器中で
、静置あるいは振盪する方法が用いられる。工業的には
通常用いられる発酵槽がそのまま利用でき、装置内の酸
素は窒素等の不活性気体あるいは培養で使用する二酸化
炭素、水素等の気体で置換することにより嫌気的な雰囲
気を作ることが可能である。

発酵槽の形式は特に問わないが、普通に使用される攪拌
混合槽のほか、−段あるいは多段の気泡塔型、ドラフト
チューブ型の発酵槽も利用できる。

培養に用いる培地は各種培地が考えられるが、炭素源と
して各種糖類、酢酸、メタノール、二酸化炭素等があり
、窒素源として無機塩類、酵母エキス、肉エキス、ペプ
トン、コーンスチーブリカー等がある。その他必要に応
じ、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マ
ンガン、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、明ばん、
モリブデン酸ナトリウム等の無機化合物、ビオチンやパ
ントテン酸等のビタミン類を添加することは通常行われ
るとおりである。

培地のｐ）１は３．０〜９．５、培養温度は２０〜７５
℃の範囲で培養するのが好ましい。

反応方法としては、培養液をそのまま用いる方法、遠心
分離などにより菌体を分離し、これをそのままあるいは
洗浄した後、緩衝液、水などに再懸濁したものに、アセ
ト酢酸エステルを添加し反応させる方法、菌体破砕物、
アセトン処理、凍結乾燥などの処理を施したものを生菌
体の代わりに用いる方法、これらを担体などに固定化し
て用いる方法なども適用できる。この反応の際、グルコ
ース、フルクトース、酢酸、メタノール、水素などをエ
ネルギー源止して添加した方が収率が向上する場合が多
い。

かかる反応時の媒体は水のみならず、水と相溶性のある
有機溶剤、例えばアルコール、アセトンなどの水／有機
溶媒混合系も用いられる。

微生物に対して害にならない有機溶媒を選択することは
もちろん必要である。

系に対しアセト酢酸エステルはそのまま、又は有機溶媒
に溶解あるいは分散させて添加される。該エステルの系
中濃度範囲は通常０．０１〜５０重量％であり、０．Ｏ
１重量％未渦の場合は反応的には不都合はないが、経済
的に実用に乏しく、一方、５０重量％より大きくなる場
合は菌体への負荷がかかりすぎ、収率が低下するなど問
題が生じやすい。

また反応はｐＨ３〜９．５の範囲で、４〜７５℃の温度
で行うのが好ましく、１〜２００時間、攪拌あるいは静
置下で行う。

反応終了後は反応液を酢酸エチノペヘキサン等の有機溶
媒を用いて抽出後、溶媒を除去するか、菌株を遠心分離
等の常法に従って分離し、直接蒸留により回収する方法
を用いて光学活性３−ヒドロキシ酪酸エステルを得る。

本発明に於いては、出発原料及び菌体を適当に組み合わ
せることにより目的とする光学活性３−ヒドロキシ酪酸
エステルを得ることができる。

〔実　施　例〕

以下、本発明を具体的に実施例にて説明するが、本発明
はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

実施例における光学純度及び収率は順相系カラム（ファ
インバック５ＩＬＣ，；日本分光製）と光学分割カラム
（キラルセルＯＤ；ダイセル化学製）をつないだものを
使用した高速液体クロマトグラフィー（移動層：ｎ−ヘ
キサン／２−プロパツール＝１９／１、検出２１０ｎｍ
）により測定した。

実施例Ｉ Ｋ２ＨＰＯｓ　０．３ｇ　：ＫＨ２ＰＯ，０，２ｇ　：
ＮＨ，ＣＩ　０．５ｇ　：Ｍｇ５Ｏ＝　・７Ｈ２００，
５ｇ　：ＣａＣ１ａ　・２Ｌ００＋ｇ　：ＮａＣｌ２、
Ｏｇ　：ＮａＨＣＯａ　１．０ｇ　：Ｆｅ５Ｌ　４ＨＪ
　Ｏ，００２ｇ　：酵母エキス２．０ｇ：ペプトン２．
０ｇ：ビタミン溶液（ビオチン２．　Ｑｍｇ　：葉酸２
．０ｍｇ　：ピリドキシン塩酸１０．０ｍｇ　：チアミ
ン塩酸５．０ｍｇ＋リボフラビン５．Ｑｍｇ：ニコチン
酸５．　Ｑｍｇ　：バントテン酸カルシウム５．Ｑｍｇ
：ビタミンＢＩ２０．１ｍｇ　：　Ｄ　−アミノ安息香
酸５．　Ｑｍｇ　：リポ酸５．Ｑｍｇ：水１１）１０−
：微量要素溶液（ＺｎＳＯ＜　・７Ｈ２００，Ｉｇ　：
　ＭｎＣＩａ−４Ｈ２００，０３ｇ　：Ｈ３ＢＯ３０，
３ｇ　：ＣＯＣｌ２　・６Ｌ００．２ｇ：ＣｕＣｌ２　
・２Ｈ２００，０１ｇ　：ＮｉＣｌ２−６Ｈ２００，０
２ｇ　：ＮａＭｏＯ４１２＋−１２００，０３ｇ　’水
Ｉ　ｎ　）　３　ｍｊ！　：　Ｎａ２Ｓ　・９ｔ１２０
０．３ｇ：Ｌ−システィン・ＨＣＩ　０．４ｇ　：　＜
えん酸チタニウム０．０７５ｍＭ　：メタノール８ピ：
水１βの組成の培地にメタノサルシナ・エスピーＤ！Ｊ
　２９０６を接種し、気相を窒素／二酸化炭素＝４／ｌ
の混合ガスとして５５℃、１０日間培養を行った。培養
終了後、遠心分離により菌体を分離、５０ｍＭ　！Ｊン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で２回洗浄し、生菌体を得た。

１００ｍｆ容バイアルびんに２５−の反応液（アセト酢
酸エチル１００ｍＭ、メタノール２５０ｒｎＭ、　５０
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，０）を入れ、これに上記生菌
体を懸濁させ、気相を窒素／二酸化炭素＝４／１の混合
ガスとして５５℃、１２時間反応させた。

反応終了後、酢酸エチル１００ｍ１で抽出した。この抽
出液を脱溶媒した後、高速液体クロマトグラフィーを用
いて生成した３（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸エチルの定量と
光学純度の測定を行った。得られた結果を表１に示す。

実施例２〜８ 表１に示す菌体を表１に示す炭素源で実施例１に準じて
培養を行い、表１に示すエネルギー源を用いて反応させ
たところ、対応する３（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸エステル
を得た。その結果も併せて表１に示す。

実施例９ に２ＨＰＯ，０，３８：　Ｋｌ（２ＰＯ，０，２ｇ　：
ＮＨ，ＣＩ　０．５ｇ　：ＭｇＳＯ４”７Ｈａ００．５
ｇ　：ＣａＣ１ａ　’２８２００．３ｇ　：ＮａＣｌ２
゜Ｏｇ　：　ＮａＨＣＯａ　１．　Ｏｇ　：　Ｐｅ５ｏ
、　・７ＨｚＯＯ，００２ｇ　：酵母エキス２．０ｇ：
ベプトン２．０ｇ：ビタミン溶液（ビオチン２．０ｍｇ
　：葉酸２、Ｑｍｇ　：ピリドキシン塩酸１０．０ｍｇ
　：チアミン塩酸５．Ｏｍｇ：リポフラビン５．０ｍｇ
：ニコチン酸５．０ｍｇ　：パントテン酸カルシウム５
．０ｍｇ　：ビタミンＢＩ２０．１ｍｇ　：　Ｄ　−ア
ミノ安息香酸５．　Ｏｍｇ　：リポ酸５．０ｍｇ：水ｌ
ｌ１）１０ｒｎｌ：微量要素溶液（ＺｎＳＯ４−７Ｈａ
００．　Ｉｇ　：　ＭｎＣｌ２・４Ｈ２００，０３ｇ　
：　Ｈ，ＢＯ３０，３ｇ　：　ＣｏＣｌ□・６１（２０
０，２ｇ：　ＣｕＣｌ２−２Ｈ２００，０１ｇ　：ＬＣ
ｌｉ　−６）１２００．０２ｇ　：ＮａＭｏ０１・２Ｈ
２００，０３ｇ　：水Ｉ　Ｒ）　３−：　Ｎａ２Ｓ　・
９１１□００．３ｇ：Ｌ−システィン・ＨＣＩ　０．４
ｇ　：　＜えん酸チタニウム０．０７５ｍＭ　：メタノ
ール８ｇ：水１１の組成の培地にメタノサルシナ・エス
ピーＤＳＭ　２９０６を接種し、気相を窒素／二酸化炭
素＝４／１の混合ガスとして５５℃、１０日間培養を行
った。培養終了後、遠心分離により菌体を分離、５０ｍ
Ｍ　！Ｊン酸緩衝液（ｐ）Ｉ７．０）で２回洗浄し、生
菌体を得た。

１００ｒｎＩ！容バイアルびんに２５ｍｊ！の反応液（
アセト酢酸メチル１００ｍＭ、メタノール２５０ｍＭ、
　５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，０）を入れ、これに上
記生菌体を懸濁させ、気相を窒素／二酸化炭素＝４７１
の混合ガスとして５５℃、１２時間反応させた。

反応終了後、酢酸エチル１００ｒｎｌで抽出した。この
抽出液を脱溶媒した後、高速液体クロマトグラフィーを
用いて生成した３（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸メチルの定量
と光学純度の測定を行った。得られた結果を表２に示す
。

実施例１０〜１３ 表２に示す菌体を表２に示す炭素源で実施例９に準じて
培養を行い、表２に示すエネルギー源を用いて反応させ
たところ、対応する３（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸エステル
を得た。その結果も併せて表２に示す。

〔発明の効果〕

本発明は、前述の該菌株を用いることによって、光学純
度の高い３（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸エステル又は３（Ｓ
）−ヒドロキシ酪酸エステルを高い収率で簡便に製造で
きることを可能にさせるものであり、工業的製造法とし
てきわめて有利である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　アセト酢酸エステルにクロストリジウム（Ｃｌｏｓ
   ｔｒｉｄｉｕｍ）属、メタノバクテリウム（Ｍｅ−ｔｈ
   ａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノサルシナ（Ｍｅ
   ｔｈａ−ｎｏｓａｒｃｉｎａ）属及びアセトゲニュウム
   （Ａｃｅｔｏｇｅ−ｎｉｕｍ）属からなる群から選ばれ
   る微生物又はその処理物を作用させ、生成する光学活性
   ３−ヒドロキシ酪酸エステルを採取することを特徴とす
   る光学活性３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法。