JPH04103527A - リポソーム製剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、正又は負に荷電したリポソームの凍結乾燥製
剤又は噴霧乾燥製剤をそのリポソームの荷電とは逆に荷
電した薬物の水溶液と処理することを特徴とする薬物保
持率の高いリポソーム製剤の製造法に関する。

［従来の技術］ リポソームは生体膜モデルとして広く利用されていると
共に、近年話題となっているドラッグ・デリバリ−・シ
ステム（Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ、
ＤＤＳ）の代表例としてそのドラッグ・キャリヤーへの
応用研究も精力的になされている。

しかしながら、゛リポソームに薬物を保持させようとし
ても、その保持率は一般に低い（通常０１〜２０％）。

この理由としては、 ｉ）低分子量の薬物のリポソームへの保持様式が、基本
的にはリポソーム内水相と外水相とて濃度が同一に分配
することによってなされていること、ｉｉ）リポソーム
が個々の粒子として安定に水性溶媒中に存在するには、
必然的にリポソームの外側に分散媒として水性溶媒の存
在を必要とすることの２点が挙げられる。

以上から、薬物をリポソームに保持させた場合には、そ
の保持率を高率、特に１００％近くすることは非常に困
難であると考えられてきた。

このような薬物あるいは膜親和性の小さい薬物の保持率
を上げる方法としては、 ａ）逆相蒸発法（プロシイ−ディング・ナショナル・ア
カデミイ・サイエンスイズ・ニーニス−エイ、７５巻、
４１９４頁、１９７８年）、ｂ）薬物自身の化学修飾法
（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシ
ューテイクス、１４巻、１９１頁、１９８３年、ジャー
ナル・オブ・ファーマコバイオ・ダイナミクス、７巻、
　１２０　頁、１９８４年；ケミカル・アンド・ファー
マシューテイカル・ブレタン、３６巻、３５７４頁、１
９８８年）、Ｃ）他の助剤等を用いる方法（ジャーナル
・オブ・ファーマシューティカル・サイエンスイズ、７
１巻、９５８頁、１９８２年；ドラッグ・デイベロプメ
ント・アント・インダストリアル・ファーマシ−１１０
巻、６１３頁、１９８４年）、 ｄ）リポソームあるいはリポソーム膜自身の性質を変え
る方法（バイオキミカ・エト・バイオフイジカ・アクタ
、８１２巻、６６頁、１９８５年；バイオキミカ・エト
・バイオフィジカ・アクタ、８５７巻、１２３頁、１９
８６年）、 ｅ）薬物の荷電と対となる荷電を有するリン脂質を利用
する方法（バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュニケーションズ１０７　巻１３Ｂ頁
１９８２年：インターナショナル・ジャーナル・オブ・
ファーマシューテイクス、１７巻、１３５頁、１９８３
年；特開昭６２−８７５１４号公報）などの例がある。

しかしながら、以上の如き従来の方法については、薬物
をリポソームに高率に保持するものとして満足し得るも
のとは云えなかフた。

更に、あらかじめ薬物を含有しないリポソームの凍結乾
燥製剤あるいは噴霧乾燥製剤に単に薬物の水溶液を加え
るだけで＆率に薬物をリポソームに保持させる方法は未
だ見出されていなし１゜［発明が解決しようとする問題
点］ 本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討した結
果、本発明を完成した。

［発明の構成］ 本発明は、正又は負に荷電したリポソームの凍結乾燥製
剤又は噴霧乾燥製剤をそのリポソームの荷電とは逆に荷
電した薬物の水溶液と処理することを特徴とする薬物保
持率の高いリポソーム製剤の製造法に関する。

本発明にかかわる正又は負に荷電したリポソームの凍結
乾燥製剤又は噴霧乾燥剤は、−旦荷電したリポソームの
水分散液を調製し、これを凍結乾燥又は噴霧乾燥したも
のを意味する。

正に荷電したリポソームの水分散液を調製するには、リ
ポソームの膜成分として正に荷電する脂質（カチオン性
脂質）を使用すればよく、その例としては、ステアリル
アミン等の塩基性脂質、Ｎｏ−アシル−し−アルギニン
等の塩基性アミノ酸系界面活性剤などが挙げられる。こ
れらカチオン性脂質は、リポソーム膜の他の主成分物質
、例えばホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等
とともに一定量添加して用いればよく、その添加比率は
何ら限定されるべきものではないが、好ましくはリポソ
ーム膜構成成分の合計量に対し、モル分率１０〜３０％
加えるのが通している。

一方、負に荷電したリポソームの水分散液を調製するに
は、リポソームの膜成分として負に荷電する脂質（アニ
オン性脂質）を使用すればよく、その例としては、ホス
ファチジルコリン、天然由来のホチファチジルグリセロ
ール、シミリストイルホスファチジルグリセロール、ジ
パルミトイルホスファチジルグリセロール、カルジオ参
りビン、ホチファチジルイノシトール、ホチファチジン
酸等の酸性リン脂質、ガングリオシドＧＭ、、ガングリ
オシドＧＭ３等のシアル酸を有するガングリオシド類、
ジセチルリン酸等の酸性脂質、Ｎ−アシル−し−グルタ
ミン酸等の酸性アミノ酸系界面活性剤、オレイン酸、ス
テアリン酸等の脂肪酸などが挙げられる。これらアニオ
ン性脂質は、他のリポソーム膜の主成分物質、例えばホ
スファチジルコリン、スフィンゴミエリン等とともに一
定量添加して用いればよく、その添加比率は何ら限定さ
れるべきものではないか、好ましくはリポソーム膜構成
成分の合計量に対し、モル分率で１０〜３０％加えるの
が通している。又、ホスファチジルセリン、ホチファチ
ジルグリセロール、ホチファチジルイノシトール等の酸
性リン脂質は、単独でもリポソームを形成することが可
能であり、この場合にはリポソーム膜構成成分の合計量
に対し、モル分率で１０〜１００％用いてもよい。

なお、リポソーム膜の主成分物質として用いられるホス
ファチジルコリン、スフィンゴミエリンなどは、その分
子内の近傍部位にカチオンであるコリン基とアニオンで
あるリン酸基の両方を有しているが、分子全体としては
中性領域において電荷を有していないので、本発明にお
けるアニオン性脂質あるいはカチオン性脂質（以後、“
荷電脂質”と略）の中には一般的に含めないことが望ま
しい。

また、リポソーム膜成分としては、上記の荷電脂質や原
生成分物質としてのホスファチジルコリン、スフィンゴ
ミエリン以外に、更に膜安定化剤としてコレステロール
等のステロール類や抗酸化剤としてα−トコフェロール
等を加えもよい。このような添加物質の添加比率も何ら
限定されるへきものではないが、リポソーム膜構成成分
の合計量に対し、安定化剤として用いられるステロール
類はモル分率で０〜６０％、好ましくは３０〜５５％、
抗酸化剤として用いられるα−トコフェロール等はモル
分率で０〜２０％、好ましくは１％前後それぞれ加える
のが通している。

上記の如きカチオン性脂質及びアニオン性脂質を共に使
用してリポソームを形成させてもよく、この場合には、
リポソーム全体としての荷電量から正又は負の荷電のリ
ポソーム水分散液とすればよい。

次に、正又は負に荷電したリポソームの水分散液の製造
法を説明する。

即ち、種々の公知の方法例えは、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー、１３巻２３８頁（１９６５
年）に開示された方法に従い、上記の如き組成のリポソ
ームの膜成分物質をクロロホルム、メタノール等の適当
な有機溶媒にまず熔解させ、溶媒を留去することにより
リピットフイルムを形成させることができる。次に、こ
のリピットフィルムに、水性溶媒を加えてリビツドフイ
ルムを水和、膨潤させ、更にポルテックスミキサーやア
ジホモミキサーなどの乳化機を用いて懸濁させることに
より薬物を含有せず正又は負に荷電したリポソームの水
分散液を製造することができる。

この時、水性溶媒の温度は高いほど乳化の効率は良い。

又、このようなリポソームの水分散液は、他の公知のリ
ポソームの製造方法例えば、アニュアル・レビュー・オ
ブ・バイオフィジックス・アンド・エンジニアリング、
９巻、４６７頁（１９８０年）に開示された操作方法に
従って製造してもよい。

上記水性溶媒のｐｉはリポソームや薬物の安定性から通
常３〜８程度であり、リポソームの安定性からすると６
〜８が好ましい。このようなｐｉの調整に用いる酸とし
ては、塩酸、硝酸、臭化水素酸等の一価の無機酸、ある
いは乳酸、グリセリン酸、酢酸等の一価の有機酸を、好
ましくは塩酸、乳酸を例示することができ、また塩基と
しては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リ
チウム等の一価の水酸化物、あるいはトリエチルアミン
、トリメチルアミン、ジイソプロパツールアミン、ジェ
タノールアミン、トリエタノールアミン、テトラメチル
アミン、トリスアミノメタン等の一価のアミン類を、好
ましくは水酸化カリウム、水酸化ナトリウムをあげるこ
とができ、更には二価あるいは三価イオンを含む酸であ
る第一リン酸カリウム、第ニリン酸ナトリウム、炭酸ナ
トリウム等も使用することができる。

また、水性溶媒の電解質イオン濃度は可及的少量にする
ことが望ましく、一般的にはイオンの総量で約４０ｍＭ
以下にすることが好適である。

更に、本発明にかかわるリポソームの凍結乾燥製剤また
は噴霧乾燥製剤に薬物水溶液を加えた後では、その浸透
圧は体液と同程度の浸透圧となるように制御されるのが
好ましく、一般的には該水溶性溶媒についても等張化剤
としてのグリセロール、プロピレングリコール等の多価
アルコール類やマンニトール、ショ糖、ブドウ糖、乳糖
等の糖類を添加すればよい。

このようにして得られたリポソームの粒子径は特に限定
されないが、一般的には５０〜１１０００ｎ、好ましく
は６０〜３００ｒ＋ｍ、特に好ましくは７０〜２００ｎ
ｍとすればよく、その制御については、通常の方法に従
って行えば良い。

更に、本発明にかかわるリポソームの膜枚数についても
特に限定されず、−枚膜から多重枚膜まで自由に選ぶこ
とができ、その制御についても通常の既知の方法に従え
ば良い。

このようにして得られたリポソームの水分散液は、通常
の方法により凍結乾燥製剤あるいは噴霧乾燥製剤とする
ことができる。例えば、凍結乾燥製剤を目的とした場合
には、上記のリポソームの水分散液をバイアル等の容器
に小分は充填した後通常の凍結乾燥操作を行えば良い。

凍結乾燥における望ましい操作としては凍結温度が−５
〜−８０℃好ましくは一３０℃で急速に凍結させること
及び０．１丁ｏｒｒ以下の減圧条件で水を昇華させるこ
とをあげることができる。また、噴ｎ乾燥製剤を目的と
する場合には、上記のリポソーム水分散液を噴霧乾燥に
て溶媒を除去した後、無菌的にバイアル等に粉末小分け
、密封すれは良く、噴ｎ乾燥における望ましい操作とし
ては、入り口温度を１１０〜２００℃、好ましくは１２
０〜１５０℃にすることをあげることができる。

以上のようにして得られたリポソームの凍結乾燥製剤あ
るいは唄π乾燥製剤に、該リポソームと逆に荷電した薬
物の水溶液を加えることにより、薬物保持率の高いリポ
ソームの水分散液を製造することができる。ここで加え
る薬物水溶液の薬物量は、それと逆の荷電を有するリポ
ソーム、更に詳しくはそのリポソームの荷電にかかわる
荷電脂質量に対し、イオン当量換算で２分の１以下、好
ましくは３分の１以下とすることにより、更に保持率を
高めることがてきる。また、薬物水溶液の電解質イオン
濃度は可及的少量であることが望ましく、薬物水溶液を
加えた後のリポソーム水分散液中において、電解質イオ
ン濃度が総量で４０ｍＭ以下とすることが特に望ましい
。

本発明において、正に荷電する薬物、即ちカチオン基を
有する薬物としては特に制限はなく、その例としては、
ダウノルビシン、ドキソルビシン、アクラルビシン、４
−０−テトラハイドロピラニル−アトリアマイシン、４
−エピアドリアマイシン、４−デメトキシダウノマイシ
ン、マイトマイシンＣ、プレオマイシン、メトトレキサ
ート等の制癌剤、アンピシリン、アモキシシリン、セフ
ァレキシン、セファクロル、ゲンタマイシン、シソマイ
シン、ストレプトマイシン、カナマイシン、アミカシン
、アムホテリシンＢ等の抗生物質、スルフイソミジン、
スルファジメトキシン、スルファモノメトキシン、イソ
ニアシト、オフロキサシン等の化学療法剤、トラネキサ
ム酸、グルタチオン等の一般薬剤、ネオカルチノスタチ
ン、インシュリン等の分子内に塩基性アミノ酸を有する
ポリペプチドや、インターフェロン、ＩＩ［壊死因子（
丁ＮＦ）　、上皮成長因子（ＥＧＦ）　、インターロイ
キン等の分子内に塩基性アミノ酸を有する生理活性物質
などが挙げられる。これらの薬物が有するカチオン基の
種類としては、特に制限はされず、第一級アミン、第二
級アミン、第三級アミン、環式アミンｆｊどが挙げられ
る。

また、本発明において、負に荷電する薬物、即ち、アニ
オン基を有する薬物についても特に制限はなく、その例
としては、メトトレキサート等の制癌剤、ベンジルペニ
シリン、アンピシリン、アモキシシリン、ピペラジリン
、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セフ
ァマンドール、セファレキシン、セファレキシン、セフ
オキシチン、セフメタゾール、セフオテタン等の抗生物
質、スルフイソミジン、スルファジメトキシン、スルフ
ァモノメトキシン、ナリジクス酸、オフロキサシン、二
ノキサシン等の化学療法剤、トラネキサム酸、グルタチ
オン、アスピリン等の一般薬剤、ネオカルチノスタチン
、インシュリン等の分子内に酸性アミノ酸を有するポリ
ペプチド、インターフェロン、１１１４！壊死因子（Ｔ
ＮＥ）　、上皮成長因子（ＥＧＦ）　、インターロイキ
ン等の分子内にシアル酸や酸性アミノ酸を有する生理活
性物質、あるいはヘパリン、コンドロイチン硫酸、デキ
ストラン硫酸等の硫酸化糖を含む多糖類が挙げられる。

上記薬物が有するアニオン基の種類としては特に制限は
されず、カルボキシル基、炭酸基、すン酸基、スルフォ
ンアミＦ基、硫酸基、亜硫酸基、硝酸基、亜硝酸基など
が挙げられる。

上記の如き薬物については例えば、ダウノルビシン、ド
キソルビシン（アドリアマイシン）等のアントラサイク
リン系抗癌性抗生物質やナリジクス酸などの場合には、
その分子内に１個のアミノ基だけ（前者）あるいは１個
のカルボキシル基だけ（後者）を有するので、これらは
それぞれ−僅のカチオン基を有する薬物あるいは一価の
アニオン基を有する薬物とみなすことができ、ホスホマ
イシンの場合には、その分子内に二価アニオンであるリ
ン酸基を１個基を有するので二価のアニオン基を有する
薬物とみなすことができ、またゲンタマイシンの場合に
は、その分子内に３個のアミノ基を有するので三価のカ
チオン基を有する薬物、デキストラン硫酸の場合には、
多くの硫酸基（単位グルコースあたり０〜２個の硫酸基
を持つ平均分子量７５００前後の多Ｗ）を有するので多
価のアニオン基を有する薬物とみなすことができる。

更に、アンピシリン、スルファジメトキシン、メトトレ
キサート、メトトレキサートなどの場合には、その分子
内の離れた部位に同じ数の同価のカチオン基とアニオン
基（前２者は１個ずつ、メトトレキサートは２個ずつの
同価のカチオン基とアニオン基とを持つ）を有するか、
この種の薬物については、本発明における分類上カチオ
ン基を有する薬物あるいはアニオン基を有する薬物のど
ちらにみなして用いてもよい。

例えば、アンピシリン、スルファジメトキシンの場合は
、−価のカチオン基を有する薬物あるいは一価のアニオ
ン基を有する薬物とみなせばよいし、メトトレキサート
の場合は、二価のカチオン基を有する薬物あるいは２価
のアニオン基を有する薬物とみなせばよい。

同様に、ネオカルチノスタチン、インシュリン等のポリ
ペプチドや、インターフェロンなどのように、その分子
内に塩基性アミノ酸等のカチオンとシアル酸や酸性アミ
ノ酸等のアニオンの両方を有する薬物の場合には、本発
明における分類上は、カチオン基を有する薬物あるいは
アニオン基ヲ有する薬物のどちらにみなして用いてもよ
い。ただし分子全体としてみたときに、分子の荷電状態
に対しカチオン基の寄与が犬きくカチオン性薬物として
みなされる場合にはカチオン基を有する薬物の分類に、
逆の場合にはアニオン基を有する薬物の分類に、それぞ
れみなした方が望ましい。また何個のイオン基を有する
薬物とみなすかについては、寄与の大きな荷電側のイオ
ン当量合計数を採用すれば良い。

更に、アニオン性またはカチオン性脂質（荷電脂質）使
用量の効果と荷電脂質の種類に基づく効果について、よ
り詳細に説明する。例えば、ドキソルビシン（−価カチ
オン）の場合には、ホスファチジルグリセロール（−価
アニオン）、ホスファチジルセリン（−価アニオン）な
どのアニオン性−価荷電脂質をモル比で薬物に対し２倍
以上、好ましくは３倍以上、ホスホマイシン（二価アニ
オン１個）の場合には、ステアリルアミン（−価カチオ
ン）などのカチオン性−価荷電脂質をモル比で薬物に対
し４倍以上、好ましくは６倍以上、また、ゲンタマイシ
ン（−価カチオン３個）の場合には、ホスファチジルグ
リセロールをモル比で薬物に対し６倍以上、好ましくは
、９倍以上使用すれば良い。

このように、一般的には添加荷電脂質量をイオン当量換
算した当量比でイオン性薬物量に対し２倍以上好ましく
は３倍以上用いることによりリポソーム中への薬物保持
率を高めることができる。

［発明の効果］ 本発明により従来のものには見られなかったような薬物
高保持率のリポソームを製造することができ、本発明は
薬物高保持率リポソームの製造法として極めて優れたも
のである。

又、本発明の製造法は極めて　簡便である為、ネオカル
チノスタチン、インシュリン等のポリペプチド医薬、イ
ンターフェロン、腫瘍壊死因子、上皮成長因子、インタ
ーロイキン等の熱や乳化・攪拌などの機械的せん断力に
対し不安定な薬物を高率に保持するリポソームの製造法
としても優れたものである。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により説明するが、これらは本発
明を限定するものではない。なお、基本的な調製方法、
分析方法等は同じなので、始めにまとめて例示しておく
。

（１）空リポソーム水分散液の調製方法脂質膜成分をガ
ラス製容器にとり、−旦クロロホルムーメタノール混液
で完全に溶解させた後、窒素ガス気流下あるいは減圧下
で有機溶媒を留去し、デシケータ（減圧）中で更に乾燥
させた。次に、はぼ生体の浸透圧に等張化させた緩衝液
を加え、穏やかに加温しながらポルテックスミキサーあ
るいはアジホモミキサーにて攪拌後、リボツム粗分散液
を得た。

つぎに、このリポソーム粗分散液を更に一定孔径のポリ
カーボネート製メンブランフィルタ−で高圧下濾過し、
粒子径が一定のリポソーム水分散γ夜とした。

（２）凍結乾燥器リポソーム製剤の製造法（１）で得た
リポソーム水分散液をバイアルに一定量ずつ小分は充填
し半打栓後、あらかしめ棚温度を一４０℃に冷却してお
いた凍結乾燥器に入れ、通常の凍結乾燥条件により試料
を凍結乾燥させた。乾燥後、窒素置換して打栓をし、空
リポソームの凍結乾燥製剤とした。

（３）多価アルコール法 （１）で得たリポソーム水分散液を噴霧乾燥機にて溶媒
を留去後、その乾燥粉末を一定量ずつ小分は充填し打栓
をしてリポソームの噴霧乾燥製剤とした。

（４）薬物含有リポソームの製造法 上記で得たリポソームの凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤
に一定濃度の薬物水溶液を加えて復水させ、薬物含有リ
ポソーム水分散液を得た。

（５）粒子径の測定 上記（２）又は（３）で得たリポソームの凍結乾燥製剤
又は噴霧乾燥製剤に注射用蒸留水を加えて復水させたリ
ポソーム水分散液及び上記（４）の薬物含有リポソーム
水分散液につき！１！弾性光散乱法によりリポソームの
粒子径を測定した。結果を表１に示した。

（６）薬物保持率の測定 上記（４）の薬物含有リポソーム水分散液につき超遠心
分離法によりリポソーム分画を得、薬物のリポソームへ
の保持率を分光光度計を用いて測定した。結果を表１に
示した。

表１から明らかなように、本発明の製造法により薬物保
持率の高いリポソーム製剤を製造することができ、しか
もそのリポソーム製剤の粒子径は非常に良く制御されて
いることが確認された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 正又は負に荷電したリポソームの凍結乾燥製剤又は噴霧
   乾燥製剤をそのリポソームの荷電とは逆に荷電した薬物
   の水溶液と処理することを特徴とする薬物保持率の高い
   リポソーム製剤の製造法