JPH0383599A

JPH0383599A - アルカリ性ホスファターゼ測定用分析素子

Info

Publication number: JPH0383599A
Application number: JP21729689A
Authority: JP
Inventors: Shunkai Katsuyama; 春海勝山
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1989-08-25
Filing date: 1989-08-25
Publication date: 1991-04-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、液体試料中のアルカリ（性）ホスファターゼ
活性を測定するための一体型多層分析素子に関するもの
である。さらに詳しくは本発明は、水性液体試料の分析
、特に体液を試料とする臨床検査に有用なアルカリ（性
）ホスファターゼ活性測定用一体型多層分析素子に関す
るものである。

〔従来の技術〕

臨床検査上、人の体液中のアルカリ（性）ホスファター
ゼの活性を測定することは極めて重要である。すなわち
、骨１腫を含む骨疾患、閉塞性黄度をはじめとする肝障
害等の診断に体液中のアルカリ（性）ホスファターゼ（
以下ＡＬＰと略す場合もある）活性の測定がなされてい
る。

アルカリホスファターゼ活性測定法は、エイチ・デー・
ケイ（Ｈ，Ｄ、　Ｍａｙ）の方法（ジャーナル・オプ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　８９２３５（１９３０）参照）以来、様
々な検討がなされてきた。それらのうちでは、イー・ジ
ェイ・キング（Ｅ、　Ｊ、　Ｋｉｎｇ）　（バイオケミ
ストリー・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、　Ｊ、　”
Ｊ　３３１１８５．１９３９参照）等によって開発され
たアリールホスフェート類、さらには自己顕色性のある
ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として導入した
ことが測定方法の簡便化に著しい効果をもたらした。

上記の測定方法はその後、多くの研究者によって改良が
なされ、顕色反応の至適ｐｌ（が１０付近であること、
好ましい共存アルコールの種類及び活性化剤としての無
機塩、特にマグネシウムイオンの存在等が明確になりＰ
−ニトロフェニルホスフェートジナトリウム塩を基質と
してＩＦＣＣ法（クリニカ・キミカ・アクタ（Ｃ１ｉａ
、　Ｃｈｉｍｉｃａ、　Ａｃｔａ）（１９８３）　３３
９Ｆ〜３８７Ｆ　）として確立されつつある。

しかしながら、Ｐ−ニトロフェニルホスフェートジナト
リウム塩溶液は測定時に調製する必要がある上に、安定
性が乏しいとの問題がある。すなわち２０〜２６°Ｃで
の溶液保存は８時間が限度であるという不便さがある。

さらにＰ−ニトロフェニルホスフェートジナトリウム塩
はアマドール・イー（八ｍａｄｏｒ、　Ｅ、）等がジャ
ーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエイシ
ョン（Ｊ、　Ａｎ＋ｅｒ。

Ｍｅｄ、　Ａｓｓ、）　１８４．９５３（１９６３）に
示すように、フリーザー温度においても不安定である。

それゆえ、測定前に試薬の純度検定を実施し、かつ試薬
の保存、調液後から測定に至るまでの保存等に特別の注
意を必要とする。

上記のｐ−ニトロフェニルホスフェートの不安定性の問
題は、特公昭４５−３４８７２号公報記載のｐ−ニトロ
フェニルホスフェートの有機アミン塩の開発により著し
く改善された。また、ｐ−ニトロフェニルホスフェート
よりも長波長側に吸収スペクトルを有するチモールフタ
レインモノホスフェートのアミン塩がジョン・エム・エ
リクソン等によって合成された（クリニカル・ケミスト
リー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　Ｖｏ
ｌ、１９　Ｎｏ、　８．１９７３．８６４真記載）。こ
れらの研究によって基質自身の保存性は著しく改善され
、従って基質をＡＬＰ測定試薬キットに組み込むことが
容易になった。

一方、臨床検査の領域においては診断に関与する医師等
の医療関係者からの、簡便な操作による迅速な測定を求
める強い要請がある。これに答える方向として近年にお
いて乾式分析法、特に取扱いの簡便な一体型多層分析要
素を用いるＡＬＰ測定法が開発され、さらにその改良が
進められている。

上記の一体型多層分析素子の構成としては、ビー・ウォ
ルタ−（Ｂ、　Ｗａｌｔａｒ）がアナライザー・ケミス
トリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
（１９８３）　５５゜４９３Ａに提案した。透明支持体
上に呈色反応試薬と親水性ポリマーバインダーとを含む
吸水性試薬層及び最上層に多孔性展開層を設けた一体型
多層分析素子が知られており、その他にも多数提案され
ている。

しかしＡＬＰの分析を乾式分析により実施する場合には
、前述した湿式分析法におけるｐ−ニトロフェニルホス
フェート等の基質の保存性の改良程度では不十分である
。従って、更に保存性を、特に基質の保存性を改良した
アルカリホスファターゼ活性測定用一体型多層分析素子
の開発が待たれていた。

この様な多層分析素子は、米国特許第４５５５４８４号
に開示されている。米国特許明細書によれば、支持体上
に第一の試薬帯及び第二の試薬帯を有し、第一の試薬帯
にはＡＬＰの基質を、第二の試薬帯には、約９〜約１１
．５のｐＫａ値を有するアルカリ金属塩又はアンモニウ
ム塩である緩衝剤を含有するものである。

特開昭６０−２３７９９９号公報においては、上記基質
が微粉末の状態で含有され、かつ該基質が展開層に含有
される素子が開示され、特開昭６１−１１００５８号公
報においては、燐酸受容体及び緩衝剤として機能する１
もしくは２以上の化合物を含有する緩衝剤層及び自己顕
色性を示す基質を含有する多孔性展開層から成ることが
開示されている。さらに特開昭６１−２６９０６７号公
報には、耐拡散性塩基を含有する緩衝剤層を導入し、基
質の保存性を改良した分析素子が開示されている。

これらの乾式分析素子は基質としてｐ−ニトロフェノー
ルホスフェート塩を用い、４００ｎｍ付近の吸光度変化
を測定してＡＬＰ活性を求めている。

〔発明が解決しようとする課題〕

この様に、乾式分析素子の技術が進展すると共に、迅速
な簡易分析への要請は益々高まり、より簡易・軽量のア
ナライザーを用いた分析システムの開発が強く要望され
てきている。アナライザーの改良の一環として、光学ヘ
ッドの小型化が図られ、−技術としてＬＥＤ素子を組み
込んだシステムが知られている。しかし、ＬＥＤ素子の
実用化レベルは現状では５００ｎｍが限界といわれてお
り、従来のＡＬＰ測定用分析素子は、軽量化の困難な、
４００ｎｍ測光システムにしか適性を有しないという大
きな欠点がある。

また、特開昭６２−１６６８９９号公報には、アルカリ
性ホスファターゼ定量分析用として２−アミノ２−メチ
ル−１−プロパノール緩衝液中に５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルホスフェート、テトラゾニウム塩等
を含有する組成物が開示されている。しかしながら、２
−アミノ−２−メチル−１−プロパノールをテトラゾニ
ウム塩やインドリルホスフェート誘導体類と長時間接触
させることはこれらの化合物を変質させ失活させる原因
となる。特にゼラチン結合剤を使用しかつ上記２−アミ
ノー２−メチル−１−プロパノール、テトラゾニウム塩
、インドリルホスフェート類を含有する乾式分析要素に
おいては使用期限の短縮化が避けられないという大きな
問題点がある。

更に、特開昭６４−７１４９９号公報には、インドリル
リン酸系アルカリホスファターゼ系活性測定用基質と色
素形成性前駆物質とが異なる層中に含有されているアル
カリホスファターゼ測定用多層分析要素が開示されてい
るが、インドリルホスフェート誘導体及び色素形成前駆
！！Ｉ質共にアルカリと接触すると非酸素的付加水分解
や分解反応が進行し、カブリ増加及び感度低下を起こす
欠点がある。

本発明の目的は、保存安定性に優れ、軽量・簡易なアナ
ライザーに組み込める５００ｎｍ以上の光学ヘッドで測
定可能なアルカリ性ホスファターゼ測定用分析素子を提
供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の目的は基質がインドリルホスフェート誘導体で
あり、かつ、電子受容性染料形成性化合物を含有する、
少なくとも水平浸透性光透過性支持体、緩衝剤層及び展
開層を有するＡＬＰ測定用分析要素において、該インド
リルホスフェート誘導体及び電子受容性染料形成性化合
物が該緩衝剤層とは異なる同一層もしくは相互に接した
隣接層に含有され、かつ該緩衝剤層が非拡散性塩基性ポ
リマー緩衝剤を含有することを特徴とするアルカリ性ホ
スファターゼ測定用分析素子により達成された。

本発明において使用する基質はｐ−ニトロフェニルホス
フェートに代表される、それ自身で顕色する自己顕色性
を有する物質ではなく、ＡＬＰの作用を受けて加水分解
し、生成した化合物が適当な酸化剤の存在下に酸化縮合
し得る性質を有するモノ燐酸エステルである。

本発明に用いられる基質の例としては、置換もしくは未
置換インドリルリン酸及びそれらの塩が挙げられる。具
体的な代表例としては、３−インドリルリン酸及びその
塩、５−ブロモ−３−インドリルリン酸及びその塩、５
−ブロモ−４−クロロ−３〜インドリルリン酸およびそ
の塩等が挙げられる。これらの塩の陽イオンとしては、
アルカリ金属イオン、例えばナトリウムイオン、カリウ
ムイオン、及び有機アミノ、例えばトルイジン、トリス
（ヒドロキシメチルアξ））メタン、２−アミノ−２−
メチル−１，３−プロパンジオール、ビス（シクロヘキ
シル）アミン、２−（エチルアミノ）エタノール、Ｎ−
メチルグル力ごン、２−（メチルアミノ）エタノール、
２−（ジメチルアミノ）エタノール、２−（イソプロピ
ルアミノ）エタノール、２−アミノ−２−メチル−プロ
パノール及びｐ−トルイジン等から選択される。

本発明の分析要素に使用されるＡＬＰ用の上記の基質は
、ｐＦＩ約９．５〜約１２付近を緩衝する約８以上のｐ
Ｋａ値を有する緩衝剤の存在下、ＡＬＰの作用により加
水分解を受けて、リン酸と非自己顕色性化合物、例えば
置換もしくは未置換インドキシルを生成する。生成した
該非自己顕色性化合物、例えばインドキシル誘導体は、
それ自身可視部領域に吸収を有してはいない。

インドリルリン酸エステル（インドキシルリン酸エステ
ルとも称する）をＡＬＰ用の基質として使用できること
はＳｅｉｌａｍａｎ等〔ジャーナル・オブ・ヒストケミ
ストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ、　Ｈｉｓ
ｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）　２巻４４１〜
４４２頁１９５４　）により報告されている。しかし、
このインドリル誘導体をＡＬＰ用の基質として使用した
Ｋｏｈｎｏ等は高ｐＨ域では、遊離インドキシルの２分
子から酸化によって生成するインジゴ色素が退色しやす
いことを見いだしている（クリニカル・ケミ力・アクタ
１３５巻４１〜４８真１９８３）。

また、特開昭６３−１３７６９８号公報に開示されたイ
ンドリルリン酸エステルを基質として用い、公知の酸化
剤、例えばメタ過ヨウ素酸塩、メタ重亜硫酸塩、過硫酸
塩等を内在したＡＬＰ測定用素子は、生成色素が熱的に
不安定である欠点を有している。

これに反し、本発明のＡＬＰ分析要素においては、高ｐ
ｕ域でのインドキシル酸化生成色素インジゴ類の安定性
が改良され、精度、確度に優れたＡＬＰ活性の測定が可
能である。

本発明の分析素子においては、ＡＬＰ酵素によって基質
より遊離された電子供与性のインドキシル誘導体から電
子受容性染料形成性化合物に電子移動が起こり、インド
キシル基の２分子酸化によって生成するインジゴ色素よ
り安定性の高い、不溶性の染料を形威させる。

基質は後述する緩衝層と異なる層に含有させる。

この層は緩衝層の支持体と反対側の層である。基質の含
有量は０．１〜５Ｇ／ｒｒｆ程度が好ましい。

電子受容性染料形成性化合物としては、テトラゾリウム
塩、レサズリン等のレゾルフィン誘導体等が使用できる
。テトラゾリウム塩は電子を受容して不溶性のホルマザ
ン染料を形威し、レサズリンも還元されてピンク色に呈
色する。

好ましいテトラゾリウム塩の具体例としては、３．３°
−（３，３’−ジメトキシ−４，４“−ビフェニレン）
−ビス（２−（ｐ−ニトロフェニル−２Ｈ−テトラゾリ
ウムクロライド）（ＮＴＢ）、３−（ｐ−ヨードフェニ
ル−２−（ｐ−二トロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ
−テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）、３−（４，５
−ジメチル−２−チアゾリル）−２Ｈ−テトラゾリウム
ブロマイド（Ｍ　Ｔ　Ｔ）、３．３’−（４，４’−ビ
フェニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テト
ラゾリウムクロライド、３．３’−（３，３’−ジメト
キシ−４，４°−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジフ
ェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド及び３゜３’
−（３，３’−ジメトキシ−４，４゛−ビフェニレン）
−ビス（２，５−ビス（ｐ−二トロフェニル）−２Ｈ−
テトラゾリウムクロライドを挙げることができる。

電子受容性染料形成性化合物は緩衝剤層とは異なる層に
含有させる。この層は緩衝層の支持体と反対側の層であ
り、基質を含有する層と同一であるかあるいはこれに隣
接する層である。隣接層の場合には緩衝層側の隣接層が
好ましい。電子受容性染料形成性化合物の含有量は０．
１〜１．０Ｇ／ｎｒ程度が適当である。

本発明のＡＬＰ分析要素においては、緩衝剤層が非拡散
性塩基を含有している。該非拡散性塩基の例としては、
塩基性ポリマーを挙げることができ、具体的にはア漬ノ
基を有する高分子化合物を使用することができる。アミ
ノ基としては、第一級、第二級及び第三級アミノ基を使
用することができる。

なお、緩衝剤層を塩基性ポリマー及びゼラチン等の低融
点水溶性結合剤で構成する場合においては、緩衝剤層を
構成する際に硬膜化して、活性測定時に熱的に安定な状
態となるようにする必要がある。上記のような場合には
、アミノ基としては第三級アミノ基であることが好まし
い。すなわち、第一級および第二級アミノ基は上記硬膜
化反応を阻害する恐れがあるので、上記塩基性ポリマー
は第三級アミノ構造を含むくり返し単位を含む塩基性ポ
リマーであることが好ましい。上記第三級アミン構造を
含むくり返し単位の例としては、下記一般式（１）によ
って表されるくり返し単位を挙げることができる。

〔上記一般式（１）において、Ｒ１は水素原子またはメ
チル基であり、Ｘは酸素原子または−ＮＨ−であり、ｎ
は０，１．２．３または４であり、モしてＲ２およびＲ
３は炭素原子数１〜４のアルキル基またはヒドロキシア
ルキル基であるか（Ｒ１およびＲ３は同一であっても異
なっていてもよい）、あるいはＶとＲ３は隣接する窒素
原子と共に複素環を形成してもよい〕上記一般式（１）においては、Ｒ１は水素原子であるこ
とが好ましい。またｎは０，１，２または３であること
が好ましい。さらにｆｉｔおよびＲ３はメチル基または
エチル基であるか（Ｒ２およびＲ３は同一であっても異
なっていてもよい）、あるいは−ＮＲ１Ｒ３がピペリジ
ノ基を形成することが好ましい。

塩基性ポリマーが、上記一般式（１）によって表される
くり返し単位を含む場合には、少なくとも３０モル％含
むことが好ましい。

上記一般式（１）によって表されるくり返し単位を誘導
することができる化合物の具体例としては、アクリレー
ト系モノマー（上記一般式（１）において、Ｒ１が水素
原子で、Ｘが酸素元素であるもの）として、〔（ジメチ
ルアミノ）メチルコアクリレート、〔（ジメチルアξ〕
）エチルコアクリレート、〔（ジエチルア旦〕）エチル
コアクリレート、〔（ジエチルアミノ）メチルコアクリ
レート、〔（ジメチルアミノ）プロピルコアクリレート
、（モルホリノエチル）アクリレート、（ピペリジノプ
ロビル）アクリレートおよび（〔ビス（β−ヒドロキシ
エチル））アミノプロピル）アクリレートを挙げること
ができ、メタクリレート系モノマー（上記一般式（１）
において、Ｒ１がメチル基で、Ｘが酸素原子であるもの
）として、〔（ジメチルアξ〕）メチル〕メタクリレー
ト、（（ジエチルアミノ）エチル〕メタクリレート、〔
（ジメチルアミノ）エチル〕メタクリレート、〔（ジメ
チルアミノ）プロピル〕メタクリレート、（ピペリジノ
プロビル）メタクリレートおよび（〔ビス（β−ヒドロ
キシエチル）〕アミノプロピル）メタクリレートを挙げ
ることができ、アクリルアミド系モノマー（上記一般式
（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子で、Ｘが−ＮＨ−であ
るもの）として、Ｎ−（（ジメチルアミノ）プロピルコ
アクリルア電ドおよびＮ−（ジプロビルアξ））エチル
コアクリルア藁ドを挙げることができ、メタクリルアミ
ド系モノマー（上記一般式（１）において、Ｒ１がメチ
ル基でＸが−ＮＨ−であるもの）として、Ｎ−〔（ジメ
チルアξ〕）プロピル〕メタクリルアミドを挙げること
ができる。

第三級アミン構造を含むくり返し単位の他の例としては
、下記一般式（ＩＩ）及び（ＩＩ［）によって表される
くり返し単位を挙げることができる。

Ｒ゛一←ＣＨＩＣＬ−Ｎ←−（ＩＩＩ）〔上記一般式（ｎ）および（Ｉ［［）において、Ｒは炭
素原子数１〜４のアルキル基である〕また、くり返し単
位に含むことができる第三級アミンの他の例としては、
ビニルピリジン（例、２−ビニルピリジン及び４−ビニ
ルピルジン）、ビニルイミタソール誘導体である１−ビ
ニル−３−アルキル−２゜３−ジヒドロイミダゾール（
例、１−ビニル−３−エチル−２，３−ジヒドロイミダ
ゾール）、１−ビニル−３−アルアルキル−２，３−ジ
ヒドロイミダゾール（Ｌ　１−ビニル−３−ベンジル−
２，３−ジヒドロイミダゾール）、２−ビニル−１−ア
ルキルイミダゾール（例、２−ビニル−１−メチルイよ
ダゾールおよび２−ビニル−１−エチルイ逅ダゾール）
および２−ビニル−１−アルアルキルイミダゾール（例
、２−ビニル−１−ベンジルイミダゾール）等を挙げる
ことができる。

上記様々な第三級アミン構造を含むくり返し単位を含む
塩基性ポリマーは、単独重合体であってもよく、共重合
体であってもよい。共重合体としては、上記くり返し単
位のみからなる共重合体であってもよいし、他のモノマ
ーとの共重合体であってもよい。他のモノマーとの共重
合体を製造する場合は、上記くり返し単位を少なくとも
３０モル％含有させることが好ましい。共重合体に用い
られる他のモノマーとしては、アクリルアミド、Ｎ置換
アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ置換メタクリル
アミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、
スチレン、スチレン誘導体、ジビニルベンゼン、Ｎ−ビ
ニルピロリドン等ヲ挙ケることができる。

塩基性ポリマーの分子量の好ましい範囲は、分子量が低
すぎると塩基性ポリマーが展開層中に拡散する恐れがあ
り、他方高すぎるものは緩衝Ｎ塗布液中の親水性コロイ
ドとの相溶性が悪くなることを考慮して各塩基性ポリマ
ーの種類に応じて決定する。一般には１％食塩水に塩基
性ポリマーを溶解し、３０°Ｃで測定した極限粘度が０
．１〜５．０程度、好ましくは０．３〜２．５程度の値
となる塩基性ポリマーを用いる。

また塩基性ポリマーは疏水性ポリマーとの水性ラテック
ス、架橋性モノマーを利用した水性ラテックスあるいは
微粒子としても本発明において実施することができる。

さらに非拡散性塩基の例としては、疏水性ラテックスや
微粒子（例、各種金属酸化物、結晶性セルロース）等の
担体表面に、物理的または化学的に上記塩基性ポリマー
あるいは低分子塩基やアルカリ性金属塩を吸着させた粒
子等も挙げることができる。

緩衝層における非拡散性塩基の好ましい含有量の範囲は
、含有量が低すぎると本発明の効果が不充分となる恐れ
があり、他方多すぎるものは緩衝層を形成する塗布液に
おける親水性ポリマーとの相溶性が悪くなることを考慮
して決定する。一般には緩衝層の乾燥質量当り５ないし
８０％の範囲、好ましくは１０ないし６０％の範囲であ
る。緩衝層は湿潤したときにｐＨ値が約８．５以上にな
るようにする。

緩衝剤として機能させることを主な目的として、上記非
拡散性塩基を緩衝層に含有させることもできる。

また、上記非拡散性塩基が燐酸受容体として機能するが
、緩衝剤としての機能が不充分である場合には、緩衝層
に少なくとも１種類の緩衝剤として機能する他の化合物
を含有させることが好ましい。

緩衝層に含有させることができる上記緩衝剤として機能
する他の化合物としては、アナライトであるアルカリホ
スファターゼの至適ｐ８１０〜ｌｌ付近を緩衝し、かつ
反応を阻害するなどの悪影響を及ぼすことのない緩衝剤
から選択する。

上記緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩や
グツド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤等の公知の緩衝剤を挙げる
ことができる。これらの緩衝剤は「蛋白質・酵素の基礎
実験法」（堀尾武−他、南江堂、１９８１）等の公知文
献を参考にして選択し、使用することができる。

本発明のＡＬＰ活性測定用分析素子においては、ＡＬＰ
酵素作用を共に生成するＡＬＰ活性に対して阻害性を有
する燐酸イオンの除去のため通常はアミノアルコールを
リン酸受容体として添加するが、アミノアルコール類の
添加は必須ではない。

本発明のＡＬＰ測定用分析素子の保存安定性を確保する
ために、ｐＨ約８．５以上を有する緩衝剤とＡＬＰ基質
は互いに別異の層に含有され、相互に保存中には接触し
ないようにすることが必要である。これは通常のエステ
ル類の加水分解からリン酸エステル基質を防護するため
である。非拡散性塩基を緩衝剤の主成分とすることは、
塩基の眉間移動によるリン酸エステルと高ｐＨ塩基緩衝
剤との接触を防止する一手段である。

緩衝剤とＡＬＰ基質を別異の層に含有させて、相互接触
を防止する他の手段としては、分析素子を組立てる際に
各々独立した工程で含有層を作威し、相互拡散の起り得
ない特願昭６３−８４６０号の技術に代表される方法で
一体化させる。

又別の手段としては、他方を溶解し得ない溶剤を用いて
各々を塗布し、各々が混り合わない分離された状態を作
成する。

更により確実な方法は、安定なリン酸エステルのＡＬＰ
基質、特にリン酸エステルアミン塩を凝集した又は結晶
化した固体状態で塗布することによって著しい保存性改
良を得られた。

この固体状塗布液の作成には結晶状リン酸エステル類を
公知の分散器等で微粉末化する方法（特開昭６０−２３
７９９９号公報）や少量の良溶剤で基質を溶解し貧溶剤
で再沈分散する方法（特開昭６２−２６５９９５号公報
）等が採用される。

本発明の基質及び緩衝剤は、互いに異なった層に含有さ
れる。積層された上層のものは好ましくは、有機溶媒可
溶性でかつ水浸透性のバインダーの中に含有される。さ
らに好ましくは上記バインダーが水平溶性である。この
際、上層に含有されるＡＬＰ用基質又は緩衝剤を溶解し
ない溶媒が好ましい。上層に含有される基質又は緩衝剤
は微分散の状態で含有されることが好ましい。上記特性
に合致するバインダーとしては、ポリビニルピロリドン
、メチルセルロース、エチルセルロース、ビニルピロリ
ドン−酢酸ビニル共重体〔ＢＡＳＦ社からルビスコール
の商品名で市販されている〕等が挙げられる。

緩衝層の上下に、緩衝層を硬化させる目的で硬膜層を設
けてもよい。硬膜層を形成する親水性ポリマーバインダ
ーの例としては、前述の緩衝層の製造に用いられる親水
性ポリマーと同様の親水性ポリマーを用いることができ
る。

緩衝層を構成する水溶性結合剤がゼラチン等の低融点性
物質である場合には、緩衝層の製造は公知の写真フィル
ム製造技術を用いれば容易に製造することができる。た
だし、このような緩衝層は活性測定中に溶解または流動
化等を起こし、測定値をばらつかせる。上記問題点を改
良するために写真フィルム製造技術において公知のビニ
ルスルホン・アルデヒド等の硬化剤（架橋剤）が使用さ
れる。しかしながら、これらの硬化剤は本発明のｐＨ８
，５以上に緩衝した緩衝層塗布液に直接添加すると架橋
（硬化）反応が高ｐＨ域では著しく早いため、一般には
安定的な塗布が困難となる。そこで上記のような場合に
は、上記硬化剤を含む硬膜層を緩衝層に隣接して設ける
ことが好ましい。硬膜層は塗布の段階で物理的に緩衝層
と連続化できる位置であるならば、緩衝層と・の上下の
位置関係および中間に介在する他の機能層については特
に制限はない。なお緩衝層を構成する水溶性結合剤がア
ガロース等の高融点性物質である場合等においては、特
に硬膜層を設ける必要がない場合がある。

上記緩衝層または硬膜層の上に必要に応じて光遮蔽層を
設けることができる。好ましくは基質含有層と電子受容
性染料形成性化合物含有層の間に設ける。この光遮蔽層
は、光遮蔽性、または光遮蔽性と光反射性とを兼ね備え
た微粒子または微粉末（以下、単に微粒子という）が少
量の被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーに分
散保持されている水透過性または水浸透性の層である。

光遮蔽層は緩衝層にて発生した検出可能な変化（色変化
、発色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光す
る際に、後述する展開層に点着供給された水性液体の色
、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を
遮蔽するとともに光反射層または背景層としても機能す
る。

光遮蔽層と光反射層とを兼ね備えた微粒子の例としては
、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナタース型または
プルカイト型の粒子径が約０．１−から約１．２−の微
結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒
子または微小フレーク等を挙げることができ、光遮蔽性
微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブラック
、カニボンミクロビーズ等を挙げることができ、これら
のうちで特に二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子
が好ましい。

被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーの例とし
ては、前述の緩衝層の製造に用いられる親水性ポリマー
と同様の親水性ポリマーのほかに、弱親水性の再生セル
ロース、セルロースアセテート等を挙げることができ、
これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアク
リルアミド等が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘
導体は公知の硬化剤（架橋剤）を混合して用いることが
できる。

光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性
分散液を公知の方法により緩衝層の上に塗布し乾燥する
ことにより設けることができる。

また光遮蔽層を設ける代りに、後述する展開層中に光遮
蔽層の成分を含有させてもよい。

なお、緩衝層の上に、場合によっては光遮蔽層等の層を
介して、後述する展開層を接着し積層するために接着層
を設けてもよい。

接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤
しているときに展開層を接着することができ、これによ
り各層を一体化できるような親水性ポリマーからなるこ
とが好ましい。接着層の製造に用いることができる親水
性ポリマーの例としては、緩衝層の製造に用いられる親
水性ポリマーと同様な親水性ポリマーがあげられる。こ
れらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリ
ルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約０
．５ｍ１〜約２０−１好ましくは約ＩＪＭ〜約１０．ｎ
の範囲である。

なお、接着層は緩衝層上以外にも、他の層間の接着力を
向上させるため所望の層上に設けてもよい。接着層は親
水性ポリマーと、必要によって加えられる界面活性剤等
を含む水溶液を公知の方法で、支持体や緩衝層等の上に
塗布する方法などにより設けることができる。

これらの層の上には、多孔性展開層が設けられる０本発
明の多孔性展開層は液体試料計量作用を有していること
が好ましい。液体試料計量作用を有する展開層とは、そ
の上側の表面（支持体から遠い側の表面）に点着供給さ
れた水性液体試料を、その中に含有している成分を実質
的に偏在させることなしに、横（水平）方向に広げ、単
位面積当たりほぼ一定容量の割合で緩衝層に供給する作
用を有する層である。また本発明の多孔性展開層は、ア
ナライトであるアルカリホスファターゼが容易に通過・
拡張しうる空間を有する多孔性展開層であることが好ま
しい。

以上の点から本発明のＡＬＰ活性測定用一体型多層分析
要素に備えられる多孔性展開層のマトリックスを構成す
る材料としては、濾紙、不織布、織物生地、編物生地、
ガラス繊維、濾紙、ブラシシュポリマーより形成される
メンブランフィルタ−１あるいはポリマー逅クロビーズ
等からなる三次元格子状構造物等を用いることが好まし
い。

展開層のマトリックスは、これらの材料から分析条件等
に応じて選択するが、全血など分析を阻害する非溶解性
物質（全血の場合は血球）を含む試料を用いる場合には
、阻害物質を除去する作用を有する織物生地または編物
生地を用いることが好ましい。

上記展開層に用いることができる織物生地（織布）とし
ては特開昭５５−１６４３５６号および特開昭５７−６
６３５９号の各公報に開示の広範囲の種類の織物生地が
あげられる。織物生地のうちでは、たて（経）糸とよこ
（緯）糸とで織った平織物が好ましく、平織物のうちで
は、ブロード生地、ボブリン生地等が好ましい。織物生
地を構成する糸としては後述する編物生地を構成する糸
と同様の素材からなる糸があげられ、糸の形態としては
フィラメント糸、紡績糸（加捻糸）のいずれをも用いる
ことができ、これらのうちでは紡績糸が好ましい。

織物生地の糸の太さは綿紡績糸番手で表して約２Ｏ３か
ら約１５０３．好ましくは約４Ｏ３から約１２Ｏ３相当
の範囲または絹糸デニールで表して約３５Ｄから約３０
０　Ｄ　、好ましくは約４５Ｄから約１３０Ｄ相当の範
囲、織物生地の厚さは約１００μから約５００Ｊ！ｍの
範囲、好ましくは約１２０−から約３５０−の範囲、織
物生地の有する空隙率は約４０％から約９０％、好まし
くは約５０％から約８５％の範囲である。

また、上記展開層に用いることができる編物生地（編布
、すなわち績んだ布状物）としては、広範囲の種類の編
物生地があげられ、それらのうちではたて（経）メリヤ
スとよこ（緯）メリヤスが好ましい、たてメリヤスとし
ては、−重アトラス編生地、トリコット編生地、ダブル
トリコツＩ−１！生地、２ラニ一ズ編生地、ラッシェル
編生地等を用いることができ、よこメリヤスとしては、
平編生地、バール編生地、ゴム編生地、円面編生地等を
用いることができる。編物生地を構成する糸としては、
綿、絹、羊毛等の天然繊維の糸、ビスコースレーヨン、
キュプラ等の再生セルロース、セルロースジアセテート
、セルローストリアセテート等の半合成有機ポリマー、
ボリアミド（各種のナイロン類）、アセタール化ポリビ
ニルアルコール（ビニロン等）、ポリアクリロニトリル
、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリウレタン等の合成有機ポリマー繊維から
なる糸または短繊維からなる糸、天然ｍｍと再生セルロ
ース、半合成または合成有機ポリマー繊維との混合繊維
からなる糸があげられる。糸形態としては、フィラメン
ト糸、紡績糸（加捻糸）のいずれをも用いることができ
、これらのうちでは紡績糸が好ましい。編物生地の糸の
太さは、綿紡績糸番手で表して約４０３から約１５Ｏ３
、好ましくは約６Ｏ３から約１２Ｏ３相当の範囲または
絹糸デニールで表して約３５Ｄから約１３０　Ｄ　、好
ましくは約４５Ｄから約９０Ｄ相当の範囲である。編物
生地の編成工程時のゲージ数としては約２０から約５０
の範囲、編物生地の厚さは約１００−から約６００−１
好ましくは約１５ＯＡ！ＩＩ＋から約４００−の範囲、
編物生地の有する空隙率は約４０％から約９０％、好ま
しくは約５０％から約８５％の範囲である。たてメリヤ
スのうちでは縦方向の伸縮が少なく、また編物展開層の
うξネーション工程における操作のしやすさ、裁断時の
編目はどけのなさ等の観点でトリコット編生地、ラッセ
ル編生地、ξラニーズ燻生地、ダブルトリコット編生地
が好ましい。

多孔性展開層に用いられる織物または織物生地は水洗等
の脱脂処理により少な（とも糸製造時、織物製造時ある
いは編物編成時に供給または付着した油脂類を実質的に
除去した織物または編物生地であるが、さらにその織物
または編物生地は特開昭５７−６６３５９号公報に開示
の物理的活性化処理（好ましくはグロー放電処理または
コロナ放電処理等）を生地の少なくとも片面に施すか、
あるいは特開昭５５−１６４３５６号、特開昭５７−６
６３５９号公報等に開示の親水性ポリマー含浸処理等の
親水化処理、またはこれらの処理工程を逐次実施するこ
とにより織物または編物を親水化し、下側（支持体に近
い側）の層との接着力を強化することができる。

織物または編物生地からなる展開層を反応層または接着
層に接着、積層するには、特開昭５５−１６４３５６号
および特開昭５７−６６３５９号各公報等に開示の方法
に従って作成することができる。すなわち、反応層また
は接着層の塗布後未乾燥のうちに、または乾燥後の層に
水（または界面活性剤を少量含む水）を実質的に均一に
供給して層を膨潤させ、ついで織物または編物生地を湿
潤または膨潤している層の上に実質的に均一に軽く圧力
をかけながら接着、積層し一体化する。

また展開層がプラッシュポリマーまたはメンブランフィ
ルタ−からなる場合には特公昭５３−２１６７７号公報
等、ポリマーミクロビーズからなる三次元格子状構造物
層である場合には特開昭５５−９０８５９号公報等、濾
紙または不織布からなる場合には特開昭５７−１４８２
５０号公報等にそれぞれ記載の方法に従って設けること
ができる。

緩衝層または接着層の親水性ポリマーバインダーがゼラ
チンまたはゼラチン誘導体の場合には、層の塗布後ゼラ
チン（誘導体）が未乾燥のゲル状層の間に上記多孔性展
開層を構成する材料（織物または編物生地等）を接着、
積層し一体化する方法を採用することができる。

本発明のＡＬＰ活性測定用一体型多層分析素子では、該
基質は展開層に含有させる。展開層に該基質を含有させ
るに際しては、基質が緩衝層の緩衝剤等に接触しないよ
うに含有させることが好ましい。その方法としては、展
開層に含有させる基質を、必要に応じて界面活性剤、高
分子化合物と共に有機溶剤、または有機溶剤と水との混
合溶剤等に溶解した塗布液を、前記した方法にて支持体
上に緩衝層、展開層を順次積層した積層体の展開層の上
から塗布する方法又は上記展開層に含浸させる方法が利
用できる。

上記の有機溶剤としてはエタノール、メタノール、プロ
パツール、アセトン、アセトニトリル等の水溶性極性溶
剤、及びトルエン、酢酸エチル等の疏水性溶剤を用いる
ことができる。

展開層がラミネートにより積層する展開層材料、例えば
織物、編物、濾紙、不織布、ガラス繊維紙からなる場合
には、あらかじめ基質を含浸し、乾燥した後ラミネート
してもよい。また塗布により形成される展開層、例えば
プラッシュポリマー層やξクロビーズ三次元格子状粒子
構造体等からなる展開層の場合には、展開層と基質の塗
布液を混合して塗布してもよい。

本発明における展開層には上記該基質以外にも、光遮蔽
性微粒子や界面活性剤等の試薬を必要に応じて含有させ
ることができる。これらの試薬は、該基質の塗布液に混
合して展開層に含有させてもよいし、基質とは別に上記
のいずれかの方法を利用して展開層に含有させてもよい
。

本発明のＡＬＰ活性測定用一体型多層分析素子は以上の
ように、支持体、緩衝層および展開層を積層してなるも
のであり、これらの支持体、緩衝層および展開層はこの
順で積層されていることが好ましい。なお、本発明のＡ
ＬＰ活性測定用一体型多層分析素子は前述のように上記
の必須の層以外にも他の機能層を含んでいてもよいこと
は勿論である。

〔実施例〕

実施例１〜３、比較例１透明ポリエチレンテレフタレート支持体（厚さ：　　１
８０ｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面上に下記
の！ｌ或の塗布液を塗布、乾燥して乾燥膜厚１５−の緩
衝層を形成した。

緩衝層形成用塗布液：アリカリ処理脱イオンゼラチン２
４ｇ１水２４０　ｇ　、ノニルフェノキシ・ポリグリシ
トール１．６ｇ、ポリ（Ｎ−（（ジメチルアミノ）プロ
ピルコアクリルアミド）　　１８％水溶液（平均分子貴
約１０万）３０ｇ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチ
レンシアミン−Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−三酢酸２ミリモル、Ｚ
ｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）ｚ・２Ｈｚ０　１ミリモル、Ｍｇ５
Ｏａ・ｌＨ２Ｏ２ξリモル以上の溶液に５ＮのＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨを１１
．０に調整した。

上記緩衝層の上に、下記の塗布液を乾燥膜厚が３．６μ
になるように塗布、乾燥して硬膜層を形成した。

硬膜層形成用塗布液：ゼラチン１２ｇ、水２６８ｇ、ノ
ニルフェノキシ・ポリグリシトール１．３ｇ、　１２−
ビス（ビニルスルホニルアセドア果ド）エタン０．７２
ｇ、水／アセトン（混合比＝１：ＩＨ８ｇ上記硬膜層の
上に、下記の塗布液を乾燥膜厚が３−になるように塗布
し、・接着層とした。

接着層形成用塗布液：ゼラチン１２ｇ、水２８６．７ｇ
１ノニルフェノキシ・ポリグリシトール１．３　ｇ上記
接着層の上に、０．４％ノニルフェノキシ・ポリグリシ
トール水溶液を塗布し、次に３６ゲージ５０Ｄポリエチ
レンテレフタレート紡績糸からなるトリコット編物を圧
着して展開層とした。

上記展開層に、下記の組成の塗布液（基質の再沈法微結
晶分散液）を１２０ｄ／ｒＷとなるように塗布、乾燥し
た。

基質含有塗布液＝３−インドキシルフォスフェート・ジ
（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール
）塩１．０ｇ、　ＮＴ　Ｂ　０．３５ｇ、ポリビニルピ
ロリドン（平均分子量１０万）５．９ｇ、エタノール２
２ｇ、アセトン２２ｇ以上の方法により、実施例１のＡＬＰ活性測定用一体型
多層分析素子を作成した。

分析素子を一辺が１５ａａの正方形に裁断し、プラスチ
ックマウント（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）
に封入して、ＡＬＰ分析用スライドを作成した。

第１表に示す組成で実施例２、実施例３及び比較例１の
ＡＬＰ分析用スライド゛を実施例１と同様にして作製し
た。第１表には主要試薬の塗布量が示されており、第１
表に記載のない試薬類はすべて実施例１と同じである。

尚、実施例３の試薬層は次のようにして作製した。

第１表これらの各分析素子の分析性能をＡＬＰ活性測定のため
の標準分析法であるＩＦＣＣ法により評価した。ＡＬＰ
が１１０．２０７．３６８．６１４．９２２および１１
８２１Ｕ＃！　（３７°Ｃ）と検定されたヒト血清■０
パを各マウント中の分析素子の展開層に点着し、水分の
蒸着が充分に制御された３７°Ｃ恒温加熱板上に静置し
、中心波長５４０ｎｍ　（比較例は４ＬＯｎｍ）で２分
および５分での反射光学濃度測定を実施した。測定結果
を第２表に示す。

第２表上記の結果から明らかなように、光学的濃度の増加量と
ＡＬＰ活性値が正の相関を示し、本発明の分析素子がＡ
ＬＰ活性測定用として有効であることがわかる。

次に、本発明の分析素子を用い、病院患者血清を検体と
して多検体テストを行い、日立７０５０を用いた分析結
果との相関を調べた。

測定結果を以下に示す。

）’＝１．０３ｘ＋１．５　：回帰直線の式％式％：Ｓｙに＝３０．５　：回帰からの標本標準偏差ｎ−９９
：検体数（試料数）Ｘは実施例１のＡＬＰ測定用分析要素による測定値であ
る。この結果より上記分析要素は、他の標準的な測定方
法とも良好な相関関係があることが判明した。

実施例４実施例１の緩衝層形成用塗布液中のポリ（Ｎ−〔（ジメ
チルアミノ）プロピルコアクリルア果ド）１８％水溶液
の１３０　ｇを９０ｇに変更した以外は実施例１と同様
にして、本発明に従うＡＬＰ測定用分析素子を調製しそ
の分析性能を評価した。

その結果、本実施例のスライドもＡＬＰ活性測定用分析
素子として有効であることが判明した。

また本実施例においても実施例１と同様に反射光学濃度
測定を行った。ＡＬＰ低活性値での感度は下記第３表に
示す。

第３表スライド　　　Δ０Ｄ（５分−２分）／Ｕ上記第３表よ
り明らかなように、単位ユニット当りのＯＤの増加（Δ
０Ｄ（５分−２分）／Ｕ）で比較した場合には、ポリ（
Ｎ、Ｎ−ジメチルア旦ノプロビルアクリルアミド）の量
を増加させると感度はわずかに増加した。

実施例５実施例１の緩衝層形成用塗布液中の成分に２−アξノー
２−メチル−１，３−プロパンジオール３０置Ｍを加え
た以外は実施例１と同様にして、本発明に従うＡＬＰ測
定用分析素子を調製しその分析性能を評価した。

また本実施例においても実施例４と同様に単位ユニット
当たりのＯＤの増加を求めた。その結果を下記第４表に
示す。

第４表スライド　　　Δ○Ｄ（５分−２分）／Ｕ上記第４表よ
り明らかなように、２−ア亀ノー２−メチルー１．３−
プロパンジオールを加えることにより、感度の増加が見
られた。

実施例６〜１２実施例１において、展開層中の親水性バインダー、基質
、電子受容性染料形成性化合物又は緩（１１層の非拡散
性塩基を第５表に示すように各種素材に置換してそれ以
外は実施例１と同様の組成でＡＬＰ分析素子を作成した
。

１２　　　　０．３５１　　　　　　０．３８２各素子
ともＡＬＰ１００〜５０００／Ｌまでの検体に関しては
乾燥直後と４０°Ｃ１４日後とでの正確度の差異は±３
％以内に入っていた。

〔発明の効果〕

本発明の分析要素は保存安定性にすぐれており、簡便な
手段で容易に製造できるとともに取扱性が安易であると
いう利点も有する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）基質がインドリルホスフェート又はその誘導体で
あり、かつ、電子受容性染料形成性化合物を含有する、
少なくとも水平浸透性光透過性支持体、緩衝剤層及び展
開層を有するアルカリ性ホスファターゼ測定用分析素子
において、該インドリルホスフェート又はその誘導体及
び電子受容性染料形成性化合物が該緩衝剤層とは異なる
同一層もしくは相互に接した隣接層に含有され、かつ該
緩衝剤層が非拡散性塩基を含有することを特徴とするア
ルカリ性ホスファターゼ測定用分析素子
（２）請求項（１）において、該緩衝剤層が緩衝剤とし
て機能する非拡散性塩基及び少なくとも１種類の燐酸受
容体を含有することを特徴とするアルカリ性ホスファタ
ーゼ測定用分析素子
（３）請求項（１）において、非拡散性塩基が第三級ア
ミン構造を含む繰り返し単位を有するポリマーであるこ
とを特徴とするアルカリ性ホスファターゼ測定用分析素
子
（４）請求項（３）において、該塩基性ポリマーが下記
一般式（ I ）で表される繰り返し単位を含むことを特
徴とするアルカリ性ホスファターゼ測定用分析素子 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）〔上記一般式（ I ）において、Ｒ＾１は水素原子また
はメチル基であり、Ｘは酸素原子または−ＮＨ−であり
、ｎは０、１、２、３または４であり、そしてＲ＾２お
よびＲ＾３は炭素原子数１〜４のアルキル基またはヒド
ロキシアルキル基であるか（Ｒ＾２およびＲ＾３は同一
であっても異なっていてもよい）あるいはＲ＾２とＲ＾
３は隣接する窒素原子と共に複素環を形成してもよい〕
（５）請求項（１）において、該電子受容性染料形成性
化合物がテトラゾニウム塩であることを特徴とするアル
カリ性ホスファターゼ測定用分析素子（６）請求項（１
）において、該インドリルホスフェート又はその誘導体
が３−インドリルリン酸エステルもしくは５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルリン酸エステルであり、か
つアミンがトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、
２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、
２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、
ビス（シクロヘキシル）アミン、２−（エチルアミノ）
エタノール、Ｎ−メチルグルカミン、２−（メチルアミ
ノ）エタノール、２−（ジメチルアミノ）エタノール、
２−（イソプロピルアミノ）エタノール、２−アミノ−
２−メチル−１−プロパノール及びｐ−トルイジンより
成る群から選ばれたアミンであることを特徴とするアル
カリ性ホスファターゼ測定用分析素子