JPH0371413B2

JPH0371413B2 -

Info

Publication number: JPH0371413B2
Application number: JP56148725A
Authority: JP
Inventors: Katsutaka Nagai; Hayao Abe; Masanobu Arita
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1981-09-22
Filing date: 1981-09-22
Publication date: 1991-11-13
Also published as: DE3234947A1; US5112810A; JPS5852225A; GB2109684A; FR2513125A1; GB2109684B; FR2513125B1; US5464816A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は多発性硬化症などの脱髄疾患の治療用
剤に関する。原因不明の脱髄性疾患の一つである多発性硬化
症はその有効な治療手段が殆んど開発されてい
ず、難病の一つとして世界的に問題にされてい
る。〔黒岩義五郎：多発性硬化症：「難病−研究と
展望」、東京大学出版会（沖中重雄編）、Ｐ，７〜
P.27，1979〕他方アレルギー性脳炎モデルとして実験的アレ
ルギー性脳脊髄炎（experimental allergic
encepholomyelitis，以下EAE）が動物を用いて
つくられてきた。即ち1947年、フロイントら
（Freund，J.et al，J.Exp.Med.，85，179〜，
1947），カバツトら（Kabat，E.A.et al，J.Exp.
Med.，85，117〜，1947）及びモルガン
（Morgan，I.M.，J.Exp.Med.，85，131〜，
1947）はそれぞれ独立に、いわゆるフロイントの
完全アッジユバント法を導入して、少量の動物脳
の乳剤を用いて２〜３週間という短期間でEAE
を動物に惹起発症させ、死に至らしめることに成
功した。以来、EAEは多発性硬化症の実験モデ
ルとしてまた細胞性自己免疫疾患のモデルとして
研究され、免疫不全が関与する脱髄性疾患や自己
免疫疾患の治療剤の数少ないin vivoスクリーニ
ング系として用いられてきた。 EAEを用いてスクリーニングされてきた薬剤
にはステロイド系坑炎症剤、非ステロイド系坑炎
症剤の１つフルビブロフエン（Flubiprofen）、サ
イクロスポリンＡ（Cyclosporin Ａ）〔Davison，
A.N.and cuzner，M.L.，ed.“The suppression
of experimental allergic encephalomyelitis
and multiple sclerosis”，Academic press，
1980〕，E.N.3638など（Levine，S.and
Sowinshi，R.，J.Immunol.，120，602〜，1978
及びPaterson，P.Y.and Drobish，Ｄ，Science，
165，191〜，1969），シクロホスフアミド
（Cyclophosphamide）〔Levine，S.and
Sowinshi，R.，J.Immunol.，120，602〜，
1978〕，ニトリダゾール（Nitridazole）
〔Paterson，P.Y.et al，J.Immunol.，118，2151
〜，1977及びBernard，C.A.et al，Int.Arch.
Allergy＆Appl.Immunol.，53，555〜．1979〕及
びアミノ酸コポリマー（Arnon，R.and
Teitelbaum，D.，“The suppression of
experimental allergic encephalomyelitis and
multiple Sclerosis”，Academic press.P.105〜
1980）などがある。これら薬剤は免疫抑制作用を
介してEAEにそれぞれの程度で効力を示してい
ると考えられている。多発性硬化症に対してこれ
までこれら薬剤による治療が試みられてきたが、
ステロイド剤以外には、はつきりとした効果が認
められていない。ところで炎症性疾患、リウマチ性疾患の治療に
おいても、ステロイド剤は著明な効力を示す一方
で、様々な副作用を呈することから．今日非ステ
ロイド系抗炎症剤の開発が望まれ臨床的に主とし
て使用されてきているが、多発性硬化症、各種の
自己免疫疾患においてもステロイド剤以外の、著
明な効力を有し副作用の少ない治療剤の開発が望
まれてきた。最近の研究で、多発性硬化症はウイルス感染、
あるいは胸腺依存性リンパ球（thymus
dependent lymphocytes，Ｔ−cell）の機能不全
が原因と考えられており、特にサプレツサー・Ｔ
−cellの減少が問題とされている（Bach，M.A.，
Lancet，December ６，1221，1980及び
Reinherz et al，New Engl.J.Med，303，125，
1980）．Ｔ−cellの調節、分化及び機能に影響を
及ぼす生体成分として胸腺ホルモン（thymic
hormones），サイモシンなどの高分子タンパク質
が知られている。一方1976年、フランスのJ.F.バツハ（Bach）
は1976年多量のブタ血清よりナノペプチド
（pGlu−Ala−Lys−Ser−Gln−Gly−Gly−Ser
−Asn−OH，但しpGluはピログルタミン酸をあ
らわす。）を単離しserum thymic factor（以下
FTS）と命名した（Bach，J.F，et al，
Nature，266，55〜，1977）およびJean−Marie
Pleau et al，J.Biol.Chem.，252，8045〜，
1977）。本発明にかかわるFTSは本物質である。
FTSはＴ−cellに対して強い分化誘導能を持つて
おり、マウス，ヒトなどでも同じ作用を持つ低分
子ペプチドが血中に存在するものと考えられてい
る。本発明者らは低分子ペプチドのFTSに注目
し、多発性硬化症などの治療剤としての可能性を
鋭意検討した結果、FTSがモルモツトのEAE発
症を遅延させ、症状を軽減し、大きな延命・治療
効果を持つことを見い出し本発明を完成した。即ちEAE実験系においては、ミエリン塩基性
蛋白などの動物の脳抽出物質をフロイントの完全
アジユバントとともに動物に免疫する。EAEは
殆んどすべての動物種に惹起させうるが、特にモ
ルモツト，マウス，サルなどでの研究例が多い。
モルモツトの場合、免疫後体重の増加がそうみら
れず、10日目頃から体重減少を示し、12日目頃か
ら後半身部に運動失調、麻痺症状が現われ、そし
て必ず死に至る。マウスにおいては、モルモツト
同様の症状を呈するものの必ずしも死には至ら
ず、栄養状態の改善などで、回復することが多
い。モルモツトの場合、研究の進展により、10〜
16日目に必ず死に至る急性型のEAEも、また免
疫の方法、動物の週令などをかえることにより発
症及び死亡日を大幅に遅らせた、よりヒトの多発
性硬化症に近似した病態をたどる慢性型のEAE
も誘起させることが可能になつた。EAEを治療
しうる強力な薬剤をスクリーニングする場合、も
つぱら急性型のEAE実験系が用いられているが、
世界的にこれまで調べられた薬剤はステロイド剤
も含め、若干の延命効果は示すものの、本発明の
FTSを有効成分とする治療剤が免疫後30日ある
いは35日においても、モルモツトを生存せしめる
という、そのような顕著な効果はこれまで見られ
なかつた。 FTSによるEAEモルモツト実験系における延
命、治療効果の実際を簡単にまとめると、10μg
というわずかな量のFTSを免疫の日の１日前
（−１日目）から皮下投与し、免疫後４日目、10
日目、17日目に各10μgずつ投与した場合、免疫
後30日目でも10匹中６匹も存命した。またFTS
の投与スケジユールをかえ免疫後９日目から３日
おきに各10μgずつ投与した場合でも．30日目に
10匹中２匹は存命していた。このことはFTSの
投与開始を早い時期から行うことがより望ましい
ことを示すが、一方発症が始まる直前において
FTSの投与を開始しても30日目という長期経時
時点までも、モルモツトを存命させるという
FTSの効果を示すものである。FTS 50μgを様々
な投与開始の日からEAEモルモツトに連日投与
した場合でも免疫後35日経過した時点で５匹中３
匹あるいは５匹中２匹存命するという強力な効果
を示した。 EAEモルモツトの臨床症状は免疫後無処置の
場合、すべて失禁または下痢を伴い重篤な状態を
経て死に至るのに対して、FTS投与群では非常
に軽く、たとえ失禁が見られてもFTS投与続行
によつてその症状は消えた。また組織病理所見に
おいても、FTS投与群は無処置群に比して全般
的に軽い病理像を示した。また無処理群の病理像
に近い比較的重い病理像を示したFTS投与群の
場合でも、確実な延命と体重の増加が認められ
た。このようにFTS投与はEAEモルモツトの発症
の抑制及び治療について著効を示すものであつ
た。一方EAEを惹起させたサルにおいても、FTS
投与により、EAEサルの発症後、死に至るまで
の期間を大幅に延長させることができ、FTSの
延命効果が証明された。これまでFTSがＴ−cellに対し強い分化誘導能
を持つことは、単にマウスの実験系において知ら
れていたにすぎず、ヒトの多発性硬化症と密接な
関連性を持つとされる、モルモツト及びサルの
EAEの実験系でFTSが顕著な治療及びまた延命
効果を示したことは、この実験系である程度の効
力を示す薬剤がステロイド以外皆無であることか
らして特筆すべきものと考えられる。EAEがＴ
−cell介在性の自己免疫疾患と現在考えられてい
ることから、FTSの治療作用によりモルモツト
の免疫系バランスが回復されたことが実証され
た。FTSは天然の生体成分であり副作用は全く
なく、それ故ヒトの多発性硬化症、ギラン−バレ
ー症候群、炎症性神経炎、多発性神経炎などや他
の免疫性脱髄疾患などの免疫不全を伴う脱髄疾患
の治療剤として好適と考えられる。FTSの治療
剤として適応しうる疾患としては、他に全身性エ
リテマトーデス（systemic bupus
erythematodes），Di George症候群、慢性皮膚
粘膜カンジダ症、進行性の神経変性、眼球や皮膚
のtelangiectasia，易感染性を主徴とするAtaxia
−telangiectasia 症、血小板減少症、湿疹、反
復性易感染傾向を来すWiskott−Aldrich症候群、
また胸腺腫を伴う免疫不全症、また癌などがあ
る。一方FTSがこれら疾患に効果を持ちうること
から、FTSのアミノ酸配列の一部をかえたFTS
アナローグも効力を持つことが期待される。ま
た、いまだ世界的に実施されていないが、サイモ
シンα₁、サイモシン・フラクシヨン５また各種の
胸腺ホルモン（Di George症候群などへの適用の
報告はある。）なども多発性硬化症などの免疫不
全症の治療剤として可能性があるが、FTSより
も高分子であり、異種成分の場合特に抗原性の問
題があり、アレルギー，アナフラキシーの問題が
程度の差こそあれ、出現するものと考えられる。 FTSは多量の血清から分離することもできる
が、通常の液相および固相の合成法によつても容
易に製造することができる。また遺電子工学、細
胞工学的方法によつても調製することができる。 FTSはそのものあるいは製薬学的に許容しうる
塩の形で、温血動物に対して静脈内、皮下、筋肉
内にまたは坐剤として、非経口的に投与すること
ができる。静注あるいは筋注については約0.1〜
100mg／Kg／日の範囲の一日量で効力を発揮する。
投与量は各疾患の状態及び投与期間によつて変化
することとなる。FTSは単独ないし、他の免疫
増強剤と調合しても投与可能である。以下に実施
例及び実験例により本発明をさらに詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定はされない。実施例１ FTSの注射用バイアル製剤 FTS・AcOH・2H₂Ｏ（財団法人蛋白質研究奨
励会製）５mg（除菌ロ過したもの）をバイアル内
に充てんし、凍結乾燥した。実施例２ FTSの注射用アンプル製剤 FTS・AcOH・2H₂Ｏ 20mgを生理食塩水に溶
解し除菌ロ過し、アンプル内に充てんした。実験例１ EAEモルモツト１匹あたり10μg投
与の効果（） EAE惹起法：永井らの方法（永井ら、
神経研究の進歩、23，1001〜，1979）により、
モルモツト１匹あたり牛脳より調製したミエリ
ン塩基性蛋白（MBP）30μgとフロイントの完
全アジユバント（青山Ｂ株結核死菌100μgを含
む）とを細い連結管でまぜ合わせ、足蹠に接種
した（免疫）。（）モルモツト：Hartley系モルモツト〓、
体重260〜340gの５週令のものを使用した。（） FTS投与：リン酸緩衝生理食塩水
（PBS）１mlあたりFTS20μgを溶解し、−20℃
に保存し、接種直前に融解し、その0.5mlをモ
ルモツトの背部に１日１回皮下注射した
（FTS，10μg）。（）治療評価：体重測定：MBPを接種し
た当日を０日として、０日の体重を100％とし
て接種後の体重の変化を表わした。またFTS投与なしの対照動物についても測定
を行つた。臨床所見：コーツらの方法（Coates，V.A.
et al，Cell.Immunol.，12，370〜，1974）に準
じて、次に示す数値でモルモツトの症状を表わし
た。またFTS投与なしの動物についても所見を行
つた。空白０：正常１：体重減少に伴なつた運動反応の減弱２：軽度の後肢運動失調３：後肢の明瞭な麻痺４(D)：死亡 △：２あるいは３に失禁または下痢を伴な
う。組織病理所見：無処置（FTS投与なし）群、
FTS接種群のモルモツトについて、脳、脊髄の
組織を取り出し、10％ホルマリンで固定し、切片
作成後、病理観察を行つた。所見は次の数値で表
わした。０：いかなるリンパ球の蓄積も血管壁に認め
られない。＋：まれに、小静脈周辺にリンパ球の集積が
みられる。：大部分の小静脈周辺にリンパ球の浸潤が
みられる。：すべての静脈周辺に強いリンパ球の浸潤
がみられる。以上の結果を表１，２，３，６に示した。実験例２ EAEモルモツト１匹あたり50μg投
与の効果実験例１の（）におけるFTS20μgを100μgか
えた以外は実験例１におけると同様の方法で試験
を行つた。結果を表４，５，６に示した実験例３毒性試験(1) 正常モルモツト１匹に、100mg／KgのFTS
を皮下注射したが死亡しなかつた。毒性試験(2) ddy系５週令雄性マウス１群５匹に、本剤
（FTS）1000mg／Kg、１回静脈内投与した
が、１日後および７日後、何ら毒性は見られ
なかつた。毒性試験(3) ddy系５週令雄性マウス１群５匹に、有効
成分物質50mg／Kg及び100mg／Kgをそれぞれ
連日14日間、皮下投与したが、何ら毒性は見
られなかつた。毒性試験(4) ５週令のウイスターラツト１群10匹に、有
効成分物質30mg／Kgを連日21日間、皮下投与
したが、何ら毒性は見られなかつた。実験例４ EAEサルへのFTS投与の効果（） EAE惹起法：サル脊髄とリン酸緩衝生
理食塩水との等量混合液をサル脊髄ホモジネー
ト（抗原液という）として用いた。サル１頭あ
たり、1.5mlの抗原液と結核死菌（青山Ｂ株）
１mgを含むフロイントの完全アジユバント1.5
mlとを細い連結管を通して混ぜ合わせエマルジ
ヨンとし、サル側頭筋の２ヶ所に接種（免疫）
した。（）サル：カニクイサル♀、体重５〜６Kgの
ものを使用した。（） FTS投与：FTSを必須アミノ酸混液あ
るいは電解質混液に溶解し、サルに免疫した当
日を０日として、EAEの臨床症状を現わした
日時に、サルに腹腔あるいは皮下注射した。注
射は１日１回行つた。（）治療評価法次のような基準で神経学的に所見を行い、サ
ルの症状を表わした。またFTS投与なしの動
物についても所見を行つた。神経学的所見臨床評価 (1) 一般状態１行動元気０元気なし＋１死亡（＋）＋７２食欲良０不良＋１ (2) 臨床所見１部分麻痺イ上半身麻痺起立可能＋２起立不能＋３ロ下半身麻痺起立可能＋２起立不能＋３ハ右あるいは左、片半身麻痺起立可能＋４起立不能＋５２四肢麻痺＋６ (3) 視力障害＋１（）実験結果サルNO.1 免疫24日目に元気がなく（＋１）、右
足片麻痺、起立不能の状態（＋３）となつたの
で、FTS2mgを腹腔に注射した。この状態が５
日間続いたが、FTS投与を連日行つたところ
29日目より元気となり（０）、バナナを食べる
ようになり、31日目からは麻痺は残つているも
のの起立可能となり（＋２）、外をかけまわる
ようになつた。そこでFTS投与は２mg×８日
間（24日目−31日目）で、中止した。38日目も
麻痺は残つている（＋２）ものの元気であつた
が、39日目に食欲がなく（＋１）、異常行動を
とり（＋１）、40日目に死亡した（＋７）。他の
EAEサルに比較して発症（24日目）から死亡
（40日目）までの期間が16日間と大変長く、
FTSの延命効果が認められた。サルNO.2 免疫16日目に元気がなくなり（＋
１）、左目の瞳孔散大及び視力障害が現われ
（＋１），17日目にも同じ状態が続き、18日目に
FTS4mgを投与したが昏睡を生じ、19日目に死
亡した（＋７）。サルNO.3 43日目に元気がなく右半身片麻痺起
立不能（＋５）となつたのでFTS6mgを注射し
た。44日目には元気（０）となり食欲もあつた
（０）が、FTS4mgを注射した。45日目には食
欲がなくなり（＋１），FTS1mg投与したとこ
ろ、46日目には食欲が出た（０）。46，47日目
とFTS1mgずつ投与したが47日目急変して死亡
した（＋７）。サルNO.4 43日目に元気がなくなり（＋１）、44
日目にも元気がなく（＋１），同一行動（上に
登つたきりで、下に降りない）だけを繰りかえ
し、小脳麻痺を呈した（＋２）。そこで44日目
にFTS2mg、45，46，47日目にFTS1mgを投与
した。45日目からは元気（０）となつたが上半
身麻痺は続いた。51日目から左目まぶたがたれ
下つてきた（＋１）ので、FTSを１mgずつ51
〜54日目まで連日４日間投与した。視力障害が
続いたまま54日目に死亡した（＋７）。このサルも、発症（44日目）から死亡（54日
目）までの期間が10日間とかなり長く、サル
NO.1同様、FTSの延命効果が認められた。サルNO.5 23日目に元気がなく（＋１）、FTS2
mgを投与したところ、24日目には回復した
（０）。30日目にまた元気がなくなり（＋１）、
視力障害が見られた（＋１）ので、FTSを２
mg投与したところ、31日目には元気となり
（０）、38日目に再び元気がなくなつた（＋１）
ので、FTSを２mg投与したところまた回復し
た。これらは慢性あるいは反復性のEAEと考
えられ、一時このサルは完全にEAE状態から
回復していたが62日目に、急に食欲もなく（＋
１）、左半身起立不能となり（＋５）、FTS1mg
を投与したが、63日目には全身麻痺（＋６）と
なり、解剖した。サルNO.6 67日目に元気がなく（＋１）、FTS2
mgを投与した。68日目には食欲がなくなり（＋
１）、FTSを68，69日目と１mgずつ投与した
が、69日目に全身麻痺となり死亡した（＋７）。サルNO.2，サルNO.3，及びサルNO.6はFTS
投与回数も投与量も少なく、発症後死亡まで１
〜３日と、急激に死亡した例で、以下のFTS
投与なしのサルの対照例と殆んど同じ発症〜死
亡過程であつた。サルNO.7〔対照〕免疫後36日目に急性症状を呈
し死亡した。サルNO.8〔対照〕免疫後99日目に右半身片麻
痺、起立不能（＋５）を起し、翌日死亡した。サルNO.9〔対照〕免疫後73日目に上半身麻痺を
起し（＋２）、翌々日死亡した。サルNO.10〔対照〕免疫後41日目に右足片麻痺
起立不能（＋３）となり、翌日死亡した。実験例４のEAEサルの実験系においては、
EAEモルモツトの実験系より、脊髄注射（免疫）
後、発症までの期間が長かつた。が、一端発症
（視力障害、半身あるいは全身の運動失調、麻痺
症状などをおこす）すると、モルモツトの場合同
様、発症後１〜３日以内に急死する。FTS投与
などを行わない、薬剤による処置をしない、免疫
したEAEサルの発症日は、免疫後36日から約100
日の間に分布していた。本実験例にあるようにFTSにより、EAEサル
の延命・治療を試みたが、この際モルモツトの試
験の場合と異なり、EAE発症前からのFTS投与
は行わず、サルのEAE発症を待つてFTS投与を
開始した。１頭あたり１日１mgから６mgの間の
FTSを投与したところ、数頭に死亡日までの日
数を大幅に延長させることに成功した。サルにお
いても、モルモツトの場合同様、免疫の当日前後
から、FTSを投与してゆけば、発症そのものも
大幅に遅延させることができよう。ヒトに、より
近い動物種のサルのEAEで、FTSの延命・治療
効果を確認したことは、ヒトでの多発性硬化症な
どの脱髄疾患の治療にFTSが有効であることを
示唆するものである。実験例５実験的アレルギー性神経炎（experi
−mental allergic neuritis，EAN）ルイスラツ
トへのFTS投与の効果（） EAN惹起法：牛の末梢神経である坐骨
神経根を採取し、アウテイリオら（L.A
Autilio et al，J.Neurochemistry，41，17〜、
1964）の方法により抽出したミリエンとフロイ
ントの完全アジユバントを１：１の割合で混ぜ
合わせ、エマルジヨンとして、ルイスラツトの
足蹠に接種した。（）ラツト：ルイスラツト♂、体重170±
30gの６週令のものを使用した。（） FTS投与：ミエリンを接種した当日を
０日として、６日目から35日目の実験終了日ま
で連日、ラツト１匹あたり、１日１回、リン酸
緩衝生理食塩水に溶解したFTSを50μg皮下注
射した。（）治療評価ラツトはミエリン接種後、薬剤無処置の場
合、13〜14日目頃から体重減少を示し、ついで
後半身部に運動失調、麻痺症状が現われる。
FTS投与群および無処置群のそれぞれの臨床
症状を次のような採点法で記録した。０：正常（徴候なし）１：体重減少に伴なつた運動反応の減弱２：軽度の後肢運動失調３：後肢の明瞭な麻痺４：死亡（）実験結果対照のFTS無処置群のラツト14匹の平均発
症日は14.3日であつたのに対して、FTS投与群
では、35日目の実験終了日まで発症しないラツ
トが３匹もおり、FTSにEAN発症抑制効果が
あることが明らかにされた。また発症した残り
５匹の平均発症日は17.8日でありFTS投与によ
り有意に発症の延長が見られた。他方無処置群においてもミエリン接種によつて
生じた運動失調や運動反応の減弱は経日的に消
え、正常に回復するラツトがいた。無処置群の発
症から正常復帰までの有症期間の平均は15.6日以
上であり、一方FTS投与群の有症期間の平均は
4.6日であつた。FTS50μgの６日目からの連日投
与により、ラツトの神経障害の症状はきわめて早
期に除去され、回復することが明らかとなつた。
これらをまとめて表−７に示す。EANがギラン
−バレー症候群や免疫性末梢神経炎、多発性神経
炎などや他の免疫性脱髄疾患などの実験モデルと
考えられていることから、ヒトにおけるこれらの
疾患の治療に、FTSが効力をもつことが示唆さ
れる。

【表】

【表】 ※ −：測定せず

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１血清胸腺因子を有効成分とする脱髄疾患治療
剤。