JPH03504496A - 水素結合の共有結合置換により安定化されたポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水　紡ムの共　　台管　によ　　　　されたポリペプチド 該ｊｂＬ証 本発明は、ポリペプチドの化学と合成に関する。特に、１個以上の推定される水 素結合を共有結合した代替物で置き換えることによって、ペプチドの３次元構造 を保証することに関する。

ｍ血 タンパクの３次元構造が、その１次アミノ酸配列と同様に生物学的機能における タンパクの効果を決定することは、数十年間にわたって理解されてきた。もちろ ん、適切な環境下での３次元構造は、ある程度までは、１次構造の必然的な結果 である。しかし、３次元構造を説明するファクターの大きな要素は、分子鏡開水 素結合および大部分の分子鎖内水素結合を形成するアミド結合成分の能力である 。場合によっては、側鎖のアミドも水素結合に参加する。多くのタンパクの活性 領域は比較的少ないアミノ酸でなる。しかし、これらのアミノ酸配列はタンパク の残りのアミノ酸配列がら単離された場合、はとんどまたは全く活性を示さない 。これは、短いポリペプチド（例えば、＜　２０アミノ酸）が、水中で構造が乱 れ、固定された構造を持たないからである。天然ではこれらの活性配列はタンパ クの中に取り込まれて並べられる。このタンパク内では凝集力が３次元構造を銹 導する。したがって、分裂しにくい結合を用いて、類ペプチドの適切な３次元構 造を安定化する試みがなされてきた。

そのような安定化に対して主に３つアプローチが用いられてきた。第１に、ペプ チドをアミド結合のＮ末端とＣ末端とに連結して環状にし、対応する天然のタン パクの形態と類似の形態を得た（　Ｃ，Ｍ、　Ｄｅｂｅｒら、Ａｃｅｔ　Ｃｈｅ ＋ａ　Ｒｅ５（１９７６）　ｉ：１０６；Ｄ、　Ｆ、　Ｖｅｂｅｒら、Ｎａｔｕ ｒｅ（１９８１）　２９２：５５））。このアプローチはソマトスタチンなどの 比較的小さなペプチドに最も効果的である。Ｖｅｂｅｒの文献では、例えば、２ 環式類似体がソマトスタチンの効力と等しいかそれ以上の効力を有することが示 された。

第２のアプローチでは、インビトロでジスルフィド架橋を形成して構造を安定化 する。例えば、Ａ、Ｒａｖｉ　ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　（１９８４）　４ Ｑ：２５７７；　Ｒ，Ｘ１ｓｈｏｒｅ　ら、Ｊ　Ａｒｍ　Ｃｈｅｖａ　Ｓｏｃ　 　（１９８５）１０７：２９８６を参照せよ。これらの文献は、それぞれ１連の 環状ペプチドにおけるβ折り返しくｔｕｒｎ）構造、および環状ペプチドにおけ るβシートの安定化に関する。

最後は、環化反応において修飾されたアミノ酸側鎖を用いて折り返し構造を固定 した。例えば、Ｒ，Ｍ、　Ｆｒｅｉｄｆｎｇｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８ Ｇ）　２１０：６５６；　Ｊ、Ｌ、Ｋｒ５ｔｅｎａｎｓｋｙ　ら、Ｂｉｏｃｈｅ ＋ｉ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏ＋ｎｕｎ　（１９８２）　１０９：１３６ ８；　Ｄ、Ｓ、Ｋｅｒａｐ　　ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　　（１ ’１２）　２３：３７５９；　Ｄ、Ｓ、に６１１１１）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎ　Ｌｅｔｔ（１９８２）　２３：３７６１；　Ｕ、Ｎａｇａｉ　　ら、Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８５）　２６：６４７　；　Ｍ、　Ｆｅ ｆｇｅｌ　　ら、Ｊ　Ｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ　（１９８６）　　１０８：１８１ ；　Ｍ、ｋａｈｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９Ｈ）　２に４ ８４１を参照のこと。例えば、Ｎａｇａｉの文献には、（Ｄ−Ａｌａ）−グラミ シジンのＤ−Ａ　１ａ−１，−Ｐｒ。

の■型β折り返し構造の上にほとんど重ね合わせることが可能な構造を有する２ 環式アミノ酸の合成が記述されている。

Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒの文献には、成分アミノ酸のラクタム構造の制約を用いた ＬＨＲＨ類似体の合成が記述されている。

丁、Ａｒｒｂｎｉｕｓらは、後述の成果の予告として、１９８７年４月のＵＣＬ Ａ／デュポン社タンパク構造会議において、ヘソックス、βシート、および折り 返しの水素結合に共有結合置換基を用いることを示唆し、ヒドラゾン結合がｉ　 −−−＞　ｆ＋４水素結合の代わりになることを示したポスターを表した。これ は、水素結合が代替の共有結合によって共有結合的に置き換えられ得ることを初 めて示唆したもののようである。この方法および類似の置換法は、幅広いペプチ ドの構造を保証するための信頼性があり、容易に使用できる方法を提供するとい う利点がある。

＆朋Ｕ本 本発明は、構造を安定化する水素結合に参加するアミノ酸に代えて用いられ得る ｌ連の部分を提供し、所望の３次元構造の安定化を達成する。本発明は、アミノ 酸を該部分に置換する方法をも提供する。この方法は、その３次元的な形態が、 完全な水素結合に依存しているペプチドを安定化するために最も容易に利用され 得る。しかし、本発明で提供される結合は、結合の存在が所望の形態と矛盾しな いような他の位１ｔテも用いられ得る。

したがって、１局面において、本発明は、少なくとも１つの水素結合（および関 連するアミノ酸）を空間的に等価な結合を形成する共有結合的に結合した部分で 置き換えることによって、構造が安定化されたペプチドに関する。本発明は、こ れらのペプチド、ペプチドを製造する方法、およびこれらのペプチドを天然のタ ンパクに代えて用いる方法に関する。

ポリペプチドを活性な構造に制限するには、しばしば、１つの共有結合的な水素 結合の模倣で充分である。例えば、一旦ヘリックスの１つの折り返しが確立され たならば、主鎖にどのような他のアミノ酸を拡張しても、さらに螺旋状の折り返 しが形成される傾向がある。したがって、式２．３および５で提供される化合物 は、それから誘導されるポリペプチドのへリノクス構造および逆折り返し構造を 安定化するために直接役立つ。

水素結合の模倣は、あらゆるペプチドの生物学的活性を改良するために用いられ 得、代替ホルモンおよび合成ワクチンにおける用途が見いだされるであろう。

例えば、表皮増殖因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ）の活性断片は、アミノ酸２０〜３１を包含 し、Ａ、　Ｋｏｍｏｒｉｙａ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ Ａ、８Ｌ２３と残基２８〜３１は、逆平行βシートを形成し、逆折り返しで残基 ２４〜２７に結合している（　Ｇ、　Ｔ、　Ｍｏｎｔｅｌ　ｌ　ｔｏｎｅら、Ｐ ｒｏｃ　ＮａｔＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、８３：８５９４−９８（１９８６） ）　、本発明の模倣のいずれのクラスもペプチド断片の構造を安定化するために 用いられ得る。例えば、クラス１のアミノエタンアミジニウム架橋（式３）は、 逆折り返し構造を安定化するために残基２４と２７との間に用いられ得る。クラ ス２の架橋は、Ｔ２Ｏ（Ｎ−Ｈ）　：Ｎ２１　（Ｃ＝０）の水素結合および／ま たはＮ３２（Ｎ−Ｈ）：Ｖ１９（Ｃ＝Ｏ）の水素結合を安定化するために用いら れ得る。（ｒＴ３０Ｊ、ｒ　Ｎ２１　Ｊなどは、１文字のコードでアミノ酸を示 し、そして完全なタンパク中の位置を示す。したがって、Ｔ２Ｏは、３０位のト レオニンである）したがって、サイズの大きな１連のＥＧＦペプチド誘導体を調 製することができる。あるいは、最も小さい安定化構造（クラス１の例）を用い 、そして従来のペプチド化学を用いて適切なアミノ酸配列を追加してもよい。

共有結合の模倣物は、合成ペプチドワクチンを構造的に制限するためにも用いら れ得る。タンパクの３次元表面に一致する形を持つペプチドは、天然のタンパク 表面に非常に相補的な結合ポケットを有する抗体を誘導するであろう。抗体表面 とタンパク表面との間の３次元的な゛相補性は、強く結合する相互作用を引き起 こし、親和性を改善するであろう。構造的に制限されたペプチドに対する全体的 な免疫応答は、従来技術の制限されていないペプチドより大きいであろう。

・　　　の　　　　な号　日 第１図は、２つのポリペプチド鎖間、または、１つのポリペプチドの２部分間の ”正常な”水素結合を表す。これは、クラスｌの模倣物、およびクラス２の模倣 物と比較される。

クラス■の模倣物では、水素結合とカルボニル基とがメチレンアミジンで置き換 えられている。クラス２の模倣物では、水素結合とカルボニル基とがイミドで置 き換えられている。

８を−るための　　旦且ヱ Ａ、友騰 ここで用いられているように、「タンパク」と「ポリペプチド」と「ペプチド」 は、交換可能に用いられ、アミノ酸のアミド結合によって形成されるポリマーま たはオリゴマーを指す。これらの用語は、得られる構造のアミノ酸残基の数に係 わらず交換可能に用いられる。１つ以上の該「アミノ酸」が、本発明の結合部分 に合わせてわずかに修飾されたり、アミノ酸の類似体であっても、これらの用語 は、基本的にポリマーアミノ酸である構造を指し示すために用いられる。他に指 示しない限り、アミノ酸残基はＬ配置であるが、本発明には、Ｄ配置の残基、お よび１種以上のアミノ酸の鏡像異性体のタンパク混合物が包含される。さらに、 α炭素および／またはアミドの窒素上での置換によって修飾されたアミノ酸をも 包含する。適切な置換基には、例えば、ハロ、炭素数が１〜６のアルキル、炭素 数が１〜６のアシル、ベンジル、炭素数が１〜６のハロアルキルなどが包含され る。

ここで′用いられている「ポリペプチド類似体」という用語は、本発明の化合物 を指し、１つ以上の天然のアミノ酸が本発明の１個の共有結合を有するアミノア シル部分子ｌき換えられている。ポリペプチド類似体は、それが模倣するタンパ クの断片と同じ名目上のアミノ酸配列を有し、安定化された水素結合が共有結合 基で置き換えられていることが異なる。

「水素結合」は、従来の意味で用いられ、炭素、あるいは、窒素、酸素またはイ オウなどの電気陰性原子に共有結合した水素と、Ｏ，Ｎ、またはＳなどの電子供 与性原子の非共有電子対との間の、比較的弱く、非共有結合性の相互作用を表す 。

水素結合のジオメトリ−は、電子供与性原子、水素、および水素が結合している 原子との間が直線に近い；しかじ、直線からの妥当なずれが含まることは理解さ れており、実際に通常観測される。

「対応する天然ペプチド」は、本発明のペプチドが置き換えようとするタンパク を意味する。したがって、例えば、ＬＨＲＨの類似体、ソマトスタチン、成長ホ ルモン、種々のセリンプロテアーゼなどの酵素、インターフェロンなどの抗ウイ ルスタンパク、ＴＮＦなどのリンフ才力イン、リンフォトキシン、およびコロニ ー刺激因子、感染病原体の表面に見られる免疫優性エピトープなどは、一般に、 種々の位置での水素結合により分子鎖内結合および分子鏡開結合を形成し、３次 元構造を保証している。このような水素結合を本発明の方法によって調製される 空間的に等価な共有結合で置き換えることによって、これらの天然タンパクに対 応するペプチドを得る。

「空間的に等価な共有結合」は、共有結合のみを含み、基本的に水素結合によっ て保持されていたのと同じ構造に分子鎖を保持する、水素結合に関与するものの 代替物を意味する。

「空間的に等価である」は、得られたペプチドの活性が保持される限り、正確な 空間の模写のわずかなずれにも適応すると理解される。本発明の目的においては 、「空間的に等価な共有結合」には、−（Ｎ）−ＣＨ２−ＮＨ−（Ｃ）−１−（ Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−（Ｃ）−１および−（Ｎ）−Ｎ−ＣＨ−（Ｃ）−が 包含され、括弧内の原子は、アミドおよびカルボニルのペプチド主鎖原子を表す 。（−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−は厳密には水素結合の長さと等しくないけれども、逆 折り返しなどの特定の構造において非常に有用であることが見いだタンパクの構 造のＸ線結晶学研究を合理的な回数実施した結果は、形態の評価と、分子レベル でこれらの構造を保持している水素結合の特性を指摘することを可能にする。指 定された水素結合のタイプを表すには一定の慣例に従っている。

一般に、関与基は、参照残基（ｉ）と他の残基（ｉ　＋＃）とで示され、残基（ １＋＃）は指定された数（＃）の残基だけさらに下流に位置する残基である（分 子鎖のＣ末端から数えて）。水素結合自体は、矢印で表され、その矢印は水素供 与の方向を示す。すなわち、矢印は、水素を供与している残基から水素を受は入 れる電子を持っている残基に向いている。

したがって、例えば、ｉ＋４−−−＞　ｉ水素結合とは、アミドの水素がｆ＋４ 残基からカルボニル基の酸素に、すなわち４アミノ酸下流にあるｉ残基に供与さ れることを意味する。これらの関与基の間の水素結合はαヘリックスとなる。

表１は、単一鎖結合タンパク及び分子鏡開結合タンパクの、一般に見られる構造 的な特性を形成すると認識されている水素結合のタイプを示す。これらの構造の いくつかは他の構造より頻繁に見られる。全てのタンパクの約６０〜７０％がα ヘリックス、βシート、またはβ折り返しのいずれかの形態で見いだされる。折 り返しとへワックスの他のタイプも見られるが、あまり一般的ではない。表１で は、水素結合のタイプが環の大きさ、すなわち、得られる環を形成する原子の数 （電子供与原子と水素を含む）とともに示されている。これらの構造の詳細な説 明は、Ｇ、　Ｎｅ＋ｍｅｔｈｙと■、Ａ、Ｓｃｈｅｒａｇｅ、　ＢＢＲＣ，！ｉ ：３２０（１９１１０）に示されている。得られる構造は、与えられた水素結合 タイプの結果として得られる２次構造または３次構造のタイプとして示されてい る。

（以下余白） 表１ １＋３−−−＞ｔｅｌ　　　　７　　　　　タイプＩ、ｎ３逆折り返しｉ＋７− −−＞ｉ　　　　　２２　　　　逆平行βシート（折り返しを越える（ａｃｒｏ ｓｓ）　） これらの分子鎖内結合に加えて、逆平行および平行βシート水素結合も本発明の 共有結合によって置換され得る。このような分子間結合の概略は以下の通りであ る。

上記に加えて、アス／ずラギン、グルタミン、セ１ノンおよびシスティンは水素 原子を供与または受容するので、側鎖−ｍｌ鎖および側鎖−主鎖水素結合が形成 され得る。例えば、２つのアスパラギン残基間、アスパラギンとグルタミン、ま たはグルタミンとグルタミン、またはこれらのアミド側鎖と主鎖残基との間に水 素結合が形成され得る。

水素結合を模倣する共有結合部分は、前述の結合のいずれとも置き換えて用いら れ、所望の２次または３次構造を維持することができる。

Ｃ３Ａ　　　　のタイプ 一般に、天然タンパクの水素結合のジオメトリ−をうまく模写する２つのクラス の模倣が見いだされている。これらは典型的な水素結合と比較して第１図に示さ れている。

第１図に示されているように、第１のクラスはＮ−メチルアミノアミジン結合を 包含する。ここでＸはＮである。この実施態様では、メチレンまたはエチレン基 が１＋＃アミノ酸のαアミノ基に結合している水素に取って代わり、ｌアミノ酸 のカルボキシル基の電子を供与している酸素が窒素で置き換えられている。

共有結合の第２のクラスはヒドラゾン−炭化水素結合である。この実施態様では 、ｌ＋＃アミノ酸のαアミノの水素が窒素で置き換えられ、その窒素は次に１残 基のカルボニル酸素に代わる炭素に二重結合で共有結合する。この実施態様では 、■＋１残基のαアミノ基が炭素で置き換えられ、共有単結合または二重結合を 介して残基Ｉに結合している。

上記の模倣物のクラスのいずれもが表１に示す水素結合の構成および分子鏡開結 合に用いられ得る。ペプチド鎖に関連してこれらの模倣物の合成を以下に示す。

模倣物が合成されると、標準的なタンパク合成技術を用いて分子鎖を拡張し、ペ プチドの残りの部分を形成することができる。

クラスｌの膚　　の八 クラスｌのリンカ−を形成する基本的な反応は、以下の反応にしたがってメチル チオ置換を行うためにチオアミドと保護された１級アミンまたは非保護の１級ア ミンとを用いて実施される： 上記の反応において、ｒ、、−Ｊはペプチド鎖の延長を示す。

反応式ｌは、分子鎖内模倣に関連して所望の結合を形成するための上記反応の応 用を示す： （以下余白） 一ヱニ」 ペプチド合成に適応するために、タンパクのカルボキシル末Ｗ４（Ｒｅを有する 残基を超えて）を樹脂に結合させ、中間アミノ酸と類似体を含有させて、間に入 る分子鎖を完成する。

例えば、１−−−）ｉ＋４αヘリブクス形成模倣物では、トリペプチド配列を、 反応式２に従って、ア！／メチルｌｉ！換基を有する残基とチオアミドを有する 一基との中間に置く。

基本的な反応は、それ自身がペプチドの同じ分子鎖または異なる分子鎖のアミド 支索のメチルアミノ置換基である１級アミンを用いてメチルチオ！ＰＡ基を置換 することである。ここで本発明を例示するために用いられた式によれば、水素結 合において電子供与原子であったカルボニルの酸素が、イオ受ける水素に取って 代わるアミノメチル置換基を用いてｆｆ１ｔＡされる。反応式１に示すように、 得られるアミノメチレン結合は、供与された電子とそれを受は取る水素に取って 代わる。

ペプチド鎖にクラス１の模倣物が導入される詳細な化学は、αヘリ、クスの１折 り返しの中の（１４４）−−−＞　１水素結合の置換に関連して発展した。そし て式２に示されている。各ステップの反応は下記の実施例に示されている。最終 生成物の構造は、ＮＭＲを用いて確認された。モデル研究から、最終生成物はα ヘリックスの１折り返しを形成することがわかる。天然タンパクの約２５％が螺 旋構造を示す。

以下の式では、次の略記を用いる：　Ｃｂｚ＝カルボベンゾキシ、Ｍｅ＝メチル 、Ｅｔ＝−！−チル、Ｂｕ＝ブチル、Ａｃ＝アセチル（ＣＨ３Ｃ−０）　、　Ｄ ＰＰＡ＝ジフェニルフォスフォリルアシト、ＴＥＡ＝　ト！、ｌエチルアミン、 ＥＤＣ＝Ｎ−エチル−Ｎ゛−３−ジメチルアミノプロピルカルポジイミド塩酸塩 、）ＩＯＢＴ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＤＭＦ＝ジメチルホルムア ミド、ＴＥＡ−トリフルオロ酢酸、Ｍｓ＝メシル（メタンスルホニル）、Ｂｚ＝ ベンジル、Ｂｏｃ＝ｔ−ブトキシカルボニル、ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン、１ ｍ＝イミダゾリル、およびＤＭＡＰ＝　Ｎ、　Ｎ−ジメチルアミノピリジン。全 ての原材料は市販の原料、および／または（引用されている）文献に記載されて いるもののいずれであってもよい。

（以下余白） −ｆ二二 （ヱ） （丘） （幻 （幻 −に−Ｌ区七二 （幻 （互い （封） 類似の化学を用いて、式３に概説するようにクラス１模倣物の変形（アミンエタ ンアミジニウム結合）が、αヘリックスの１折り返し中の（ｉ＋４　）−−−＞ 　ｉ水素結合の置換に関連して導入された。反応式の各ステップは、以下の実施 例に詳細に示されている。環のサイズが大きい（１つのメチレン基による）ため に、得られる構造は、ＤＭＳＯおよび水中でタイプｌの逆折り返し構造をとる。

それはＮＭＲ実験で明らかに示された。天然タンパクの約２５％が逆折り返し構 造をとる。

（以下余白） （且） （旦） ステ・・１７績 （互） （互） （２ｉ） （且） （坦） クラス２の　　　のＡ クラス２の模倣物は、以下の一般式にしたがうヒドラジン誘導体とアセタールま たはケタールとの反応によって生成さ分子鎖内結合に関連する反応を式４に示す 。

クラス２の模倣物の場合、水素結合はＮ−アシルヒドラゾンの炭素−窒素二重結 合（Ｃ＝Ｎ）で置き換えられる。このヒドラゾンは、Ｎ−アミドペプチドと、ア ルデヒド部分を有し、アセクールの形態でマスクされたペプチド断片との縮合反 応によって形成される。式４は、クラス２を含有するペプチドの合成を概説する 。反応は収束性（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）である。２種の断片ＵおよびＵを平行 して合成し、次いでペプチド縮合反応で結合させる。最終ステップでヒドラジン とアセタール官能基との環縮合反応により水素結合模倣物を形成する。３柵の■ 断片←■ａＪ　３１ｂ、　３１ｃ）を例示する。

（以下余白） 弐　４ （並） （里） （〃よ） （並） （並） Ｘ″Ｍｅ　（罎Ａ）（並） ＳＯＣ（刀よ） Ｈ（里） Ｑ旦） クラス２の水素結合を含む１種の特定のペプチドの合成を式５に示す。実験の詳 細は以下の実施例に示す。全ての合成は、ＮＭＲスペクトルと高分解能質量スペ クトルによって特徴付けられた。これらのペプチドの詳細な構造的分析は、差核 オー　ウｙ　−／”）ザー効果スヘクトル（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　Ｎｕｃｌｅ ａｒ　Ｏｗｅｒｈａｕｓｅｒ　Ｅｆｆｅｃｔ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）　、 Ｃ０５Ｙスペクトルおよび結合定数分析を含む、１次元ＮＭＲ技術と２次元ＮＭ Ｒ技術との組合せを用いて実施された。得られた生成物は螺旋状の特性がある。

（以下余白） 式゛　５ （且） （並） （並） （且） （並） （坦） （匹） このように、両方のクラスの模倣物は、成長するヘフチド鎖内で通常水素結合に よって安定化されている構造を安定化するために用いられ得、あるいは、シート 内の平行鎖または逆平行鏡開にさらにより簡単に形成され得る。このことは、こ れらの模倣物の幅広い用途を証明するものであり、あらゆる所望のペプチド内に 用いられ得る。

Ｌ立興 以下の実施例は、当業者のためのさらなる例示として示されるもので、どのよう な意味でも本発明の範囲を限定する意図はない。以下の実施例において溶液相合 成を示すが、他の方法（例えば、固相合成）も本発明の範囲内と考えられる。

夾亘五工 （式２、ステップ１） Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アラニンＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステ ル（上）を、Ｇ、　Ｗ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ　Ａ＋＋　ＣｈｅｍＳｏｃ、 　８６：１８３９（１９６４）にしたがって合成した。

藺単に言えば、等モルのＮ−Ｃｂｚ−ａｌａ、　Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド 、およびジシクロへキシルカルボジイミドを氷水洛中のＴＨＦ中に攪拌しながら 添加した。混合物を終夜低温（０”Ｃ）に維持した。ジシクロヘキシル尿素の沈 澱を濾過により除き、溶媒を減圧下でエバポレートした。残渣をインプロパツー ルから結晶化し、上を得た。

Ｋ直丘主 （式２、ステップ２） Ｃｂｚ−アラニンＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（上、ｚｏｍＭ）を無 水エタノール（ＥｔＯ）Ｉ、５０ａ＋１）に溶解させ、そして、溶液をグリシン （２０ｍＭ）とＮａＨＣＯ３（４０ｍＭ）との水（５０１１１１）溶液に添加し た。混合物を室温で終夜攪拌し、回転減圧エバポレーターで濃縮して体積を小さ くした。そして、濃塩酸でｐＨ２に酸性化した。生成物は、混合物を氷水洛中で 冷却することによって結晶化され、酢酸エチル−へ牛サンから再結晶されて、Ｃ ｂｚ−Ａｌａ−Ｇｌｙ　（２）を得た。

夫立匹主 （式２、ステップ３） Ｔ、　５ｈｉｏｉｒｉ　ら、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅ＋ｎ　Ｓｏｃ、　９４：１７（１ ９７２）の方法にしたがって、等モルのＣｂｚ−＾１ａ−Ｇｌｙ　（２）　、ジ フェニルフォスフォリルアシト（ＤＰＰＡ）、およびトリエチルアミン（ＴＥＡ ）をｔ−ブタノールに溶解させた。混合物を終夜還流した。溶媒をエバポレート した後、水性酸およびアルカリ処理（ｗｏｒｋ　ｕｐｓ）の後に得られた酢酸エ チル中の中性の画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーまたは酢酸エチル −へ牛サンからの再結晶によって精製し、Ｃｂｚ−Ａｌａ−ＣＯＮＨＣＨ２ＮＨ −Ｂｏａ　（３）を得た。

実１１先 （式２、ステップ４） 丸底フラスコ中で、３　（ｌｏｍＭ）のエタノール溶液に少量のＰｄ／Ｃ触媒を 添加した。水素を満たした風船をフラスコにつけた。脱気を繰り返した後フラス コを水素で満たし、混合物を３０分間激しく攪拌し、そしてセライトを通しテｉ ｌｉ過Ｌ、ＮＯ３−Ａｌａ−ＣＯＮＨＣＨ２ＮＨ−Ｂｏｃ　（土）を得た。

Ｋ亘五旦 （式２、ステップ５） Ｃｂｚ−アラニンＮ−コハク酸イミドエステル（Ｉ　ＳｌｏｍＭ）　’ｅ実施例 ４で得た土の生成物溶液に添加した。混合物を終夜攪拌し、回転減圧エバポレー ターで濃縮して体積を小さくした。

蒸留水を添加して混合物から、生成物を結晶化して、Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｌａ− ＣＯＮＨＣＨ２ＮＨ−Ｂｏｃ　（５）を得た。

Ｋ亘叢立 （式２、ステップ６） 化合物１を、上記の実施例４に記載の方法を用いて触媒水素化分解によって脱保 護化し、ＮＯ３−Ａｌａ−Ａｌａ−ＣＯＮＨＣＨ２ＮＨ−Ｂｏａ　（１）を得た 。

爽血亘Ｌ （式２、ステップ７） サルコシン（２ＳＯｍＭ）とｐ−）ルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ，２５５＋ｅＭ ）をベンジルアルコール（１００ｍ１）とトルエン（５０＋ｏｌ）との混合物に 添加した。混合物を還流するまで加熱し、反応で生成する水をディーンスターク レシーバーにトラップした。蒸留物中に水が認められなくなったら、混合物を室 温まで冷却し、エーテルを加えて氷水浴中で２時間冷却した。結晶生成物をフィ ルター上に回収し、ＣＨ２Ｃｌ２−Ｅｔ２０から再結晶してＭｅＮＨＣ）１２Ｃ ＯＯＣＲ２（ＣｅＨｓ）　・ＴｓＯＨ（７）を得た。

大上ＬＬ影 （式２、ステップ８） 無水酢酸（Ａｃ０Ａｃ、　１０ｍＭ）を、”　（１０＋ｎＭ）とＴ　Ｅ　Ａ　（ ２０＋ｎＭ）とのＴＨＦ溶液に攪拌しながらゆっくりと添加した。無水酢酸の添 加を完了した後、混合物を室温に保って２時間放置した。溶媒を減圧蒸留で除去 した後、残渣を酢酸エチルに再溶解し、クエン酸（Ｉ　Ｍ）　、ＮａＨＣＯ３（ ０，５Ｍ）　、水、飽和ＮａＣ１溶液で洗浄し、無水Ｍｇ５Ｏ，で乾燥した。溶 媒を減圧エバポレーターで除去して生成物を回収し、ＡｃＮ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＯ ＯＣＨ２（ＣａＨｓ）　（８）を得た。

見立五主 （式２、ステップ９） Ｓ、　５ｃｈｅｉｂｙｅ　ら、Ｂｕｌｌ　Ｓｏｃ　Ｃｈｉ＋ａ　Ｂｅｌ　、　８ ７：２２９（１９７８）に記述されている方法にしたがって、ｐ−メト牛ジフェ ニルチオノフォスフインスルフィド（１３ｙｅｓｓｏｎ試薬）をｌのベンゼン溶 液に添加し、混合物を還流するまで１０分間加熱した。冷却後、混合物を、飽和 ＮａＨＣＯ３溶液、クエン酸、水、飽和ＮａＣ１溶液で洗浄し、無水Ｍｇ５Ｏ， で乾燥した。溶媒を減圧蒸留で除去した後、残渣を酢酸エチル−へ牛サンから結 晶化して、ＭｅＣ（・Ｓ）Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＯＯＣＨ２（ＣｓＨｓ）　（９） を得た。

見立皿旦 （式２、ステップ１０） Ｎ−チオアセチルサルコシンベンジルエステル（９、１０ｄ）ノメタノール（２ ０１１１１）　溶液を室温の水浴で覆い、ＩＮのＮａＯＨ（２２ｍｌ）を攪拌し ながら添加した。混合物を２時間室温で放置し、強酸性のイオン交換体で処理し た。溶媒を減圧蒸留で除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ−へ牛サンから結晶化し、 ＭｅＣ（＝Ｓ）Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＯＯＨ（１０）を得た。

夫立旦旦 （式２、ステップ１１） ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の、６．１０、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメ チルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびｌ−ヒドロキシベン ゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の等モル混合物を０℃で終夜反応させた。混合物を 混合イオン交換体で処理し、溶媒を減圧蒸留で除去した。残渣をエタノールと水 から結晶化し、縮合生成物、ＭｅＣ（□Ｓ）Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＯ（Ａｌａ）２ ＮＨＣＨ２ＮＨ−Ｂｏａ　（１１）を得た。

Ｌ立匠■ （式２、ステップ１２） 化合物旦を酢酸中に溶解させ、過剰モルのヨードメタンを添加した。混合物を６ 時間攪拌した後、溶媒、未反応のＭｅ＋を減圧回転エバポレーターで除去した。

このステップで生成物を安定化するために溶媒として酢酸（ａｃｉｄ　ａｃｅｔ ｉｃ）を用いることが重要であった。ＤＭＦまたはＴＩ（Ｆなどの他の溶媒はか なりの副生成物を形成した。反応によって、ＭｅＣ（−ＳＭｅ）　：ρ−（Ｍｅ ）ＣＨ２ＣＯ（Ａｌａ）２ＮＨＣＨ２ＮＨ−ＢＯｃ（１２）を得た。

Ｋ嵐匠Ｕ （式２、ステップ１３） 化合物Ｕをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で１０分間処理して溶媒を減圧蒸留で除 去して以下の化合物胆を得た。

（式２、ステ、ツブ１４） 化合物Ｕを１０ｍＭより低い濃度でＤＭＦ中に溶解させ、弱塩基性のイオン交換 体で処理した。溶媒を減圧蒸留で除去した後、残渣をＨＰＬＣで精製し、以下に 示す本発明の化合物■（式３、ステップ１） Ｇ、Ｊ、Ａｔｖｅｌｌ　　ら、鉦担叫玉匡、　１９８４：１０３２に記載されて いる方法にしたがって、エチレンジアミン（０，２６Ｍ）を、指示薬としてブロ モクレゾールグリーンを含有する水に溶解させた。

青色が淡黄色になるまで、水（Ｓｏｕｌ）中のメタンスルホン酸（０，４８Ｍ　 ）を添加した。この溶液をＥｔＯＨ（１４０ｍｌ）で希釈し、激しく攪拌し、室 温下でジメトキシエタン（ＤＭＥ、５０＋１）と５０％水性ＫＯＡｃ中のベンジ ルオキシカルボニルクロリド（Ｃｂｚ−ＣＩ、０．２３Ｍ　）溶液で処理した。

添加が完了した後、混合物を１時間攪拌し、揮発成分を減圧下で除去した。残渣 を水（５００ｍｌ）とともに震盪し、濾過してビス誘導体を除去した。濾液をベ ンゼンで洗い、４０％ＮａＯＨで塩基性化し、次いで、ベンゼンで抽出した。有 機層を飽和ＮａＣ１水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして、減圧下で乾 燥して、ＣｂＺ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（■）を得た。

支巨匠旦 （式３、ステップ２） 化合物■を酢酸エチルに溶解させ、等モル量のｔ−ブチルピロカルボネートをゆ ゛っくりと添加した。この溶液を減圧回転エバポレーターを用いて乾燥し、残渣 を酢酸エチル−へ牛サンから結晶化してＣｂｚ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｂｏａ 　（１６）を得た。

支皿匠旦 （式３、ステップ３） 上記の実施例４で記述された方法にしたがって、化合物■を水素化分解してＮＨ ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２ＫＩ匹艮 （式３、ステップ４） 上記の実施例５に倉己述された方法にしたがって、化合物Ｕ尺立匠Ｕ （式３、ステップ５） 上記の実施例４で記述された方法にしたがって、化合物Ｕを水素化分解してＮｌ ２−Ａｌａ−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｂｏｃ　（１９）を得た。

叉ＪＪシ準 （式３、ステップ６） 上記の実施例５に記述された方法にしたがって、化合物Ｕ（式３、ステップ７） 上記の実施例４で記述された方法にしたがって、化合物■を水素化分解してＮ） ！２−Ａｌａ−Ａｌａ−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｂｏｃ　（２１）を得た。

大１１ｔは （式３、ステップ８） 上記の実施例７に記述された方法にしたがって、ＭｅＮＨＣＨ２Ｃ００Ｈをベン ジルアルコールとともにエステル化し、　ＭｅＮＨＣＨ２Ｃ００Ｂｚ　（２２） を得る。

支監匹ｎ （式３、ステップ９） 上記の実施例８に記述された方法にしたがって、化合物■をアセチル化し、Ａｃ ＮＨ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＯＯＨＺ　（２３）を得る。

Ｋ１丘■ （式３、ステップ１０） 上記の実施例９に記述された方法にしたがって、化合物Ｕ去１眼 （式３、ステップ１１） 上記の実施例１０に記述された方法にしたがって、化合物■をケン化し、ＭｅＣ （・Ｓ）Ｎｅ−（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＯＯＨ（２５）を得る。

爽立匠■ （式３、ステップ１２） 上記の実施例１１に記述された方法にしたがって、化合物■と且とを縮合してＭ ｅＣ（＝Ｓ）戸−（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＯＮＨ（Ａｌａ）２−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ ＮＨ−Ｂｏｃ　（■）を得る。

支嵐丘鉦 （式３、ステップ１３） 上記の実施例１２に記載された方法にしたがって、化合物■をＭｅｌでＳ−メチ ル化して、ＭｅＣ（−ＳＭｅ）　；Ｎｅ−＜Ｍｅ）ＣＨ２ＣＯＮＨ（Ａｌａ）２ −ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｂｏｃ　（４ｉユ）を得る。

Ｌ立五姐 （式３、ステップ１４） 上記の実施例１３に記述された方法にしたがって、化合物虹をＴＦＡでＢｏａ基 を加水分解して脱保護化し、そして、ＭｅＣ（−ＳＭｅ）□？ｉ’−（Ｍｅ）　 ＣＨ２Ｃ０ＮＨ（Ａ　Ｉａ）　２−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮｅＨ３（２８）を得 た。

見立五旦 （式３、ステップ１５） 上記の実施例１４に記述された方法にしたがって、化合物■をＴＥＡで環化し、 下式で表される本発明の化合物（２９）を化合物且は、ＮＭＩ？により決定され たように、逆折り返し構造を１２ｍｍｏｌｅの５．５−ジメトキシペンクン酸メ チル（５ｔｅｖｅｎｓ、　Ｒ。

ｖｌ、ら、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ、　７０５４．１９７９）を２（１ｍ　 １の５０％水性メタノールに溶解させた。１６＋ｍｏｌｅのＮａＯＨを添加し、 混合物を室温で２時間攪拌した。次いで溶媒をエバポレートし、残渣を３０ｍ１ のＥｔＯＡＣで層状にし、ナトリウム塩を、水冷したｌＮＨＣｌで中和した。水 相をさらに２０１１のＥ　ｔＯＡ　ｃで抽出し、有機相を合わせてに２ＣＯ３で 乾燥した。生成物を濾過し、溶媒をエバポレートして５．５−ジメトキシペンク ン酸を得た。

カルボニルジイミダゾール（１ｍ２ＣＯ，１０ａ＋ｍｏｌｅ）をアセトニトリル （１３ｍ１）中の５．５−ジメト牛ペンタン酸（ＩＯｍｍｏｌｅ）溶液に添加し 、混合物を室温で４０分間攪拌した。ロイシンベンジルエステルトシレート（Ｉ ｉｍｍｏｌｅ）を添加し、さらにジイソプロピルエチルアミン（１１＋ｕ＋ｏｌ ｅ）を添加し、混合物を室温で終夜攪拌した。溶媒をエバポレートし、残渣をエ チルアセテ−）　（５０ｍｌンに溶解し、水冷した１Ｍクエン酸（２０ｔｘｌン 、１ＭＮａＨＣＯ３（ＺＯｍｌ）およびブライン（２ｆ）ｍｌ）で洗浄した。生 成物をＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒をエバポレートし、残渣をシリカゲル上のり０ ？トゲラフイーにかけ、（Ｍｅｎ）２ＣＨ（ＣＨ２＞　３ＣＯＮＨＣＨ（ｉ−Ｂ ｕ）ＣＯＯＢｚ　（３２）を得た。

尖１」」１ （式５、ステップ２） 化合物３２　（１０ｍ＋ａｏ１ｅ）を１５＋＊ｌのＭｅＯＨに溶解させた。５０ ｍｇのｌＯ％Ｐ　ｄ／Ｃを添加し、混合物を、室温、１　ａｌ＋の水素圧下で２ ０分間水素化分解した。混合物を次いで濾過し、溶媒をエバポレートシて、（Ｍ ｅＯ）２ｃＨ（ＣＨ２）ａｃＯＮＨｃＨ＜１−８１４）ＣｏｏＨ（３３）を得た 。

Ｋ１匠■ （式５、ステップ３） Ｎ−アミノグリシンエチルエステル塩酸塩（３２ｍ＋ｏｏｌｅ）をＮａ２ＮＯ３ （３２ｍｍｏｌｅ）で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、Ｋ２ＣＯ３で乾燥した。

次いで、アセトン（１０ｍｌ）を添加し、ＣＨ２Ｃｌ２をエバポレートした。さ らに２０ｍ　ｌのアセトンを添加し、溶媒をエバポレートした。残渣を次いでＣ Ｈ２Ｃｌ２　（２０ｍｌ）に溶解させ、Ｍｇ５Ｏ，で乾燥し、溶媒をエバポレー トしてＭｅ２Ｃ＝ＮＮＨＣ１（２ＣＯＯＥｔ　（３４）を得た。

爽血丘Ｕ （式５、ステップ４） 化合物■をＴＨＦ中の１．１当量のＢｏａ−ａｌａ無水物に添加し、１２時間反 応させた。粗生成物をＣ）１２ＣＩ２に溶解させ、ｌＮＨＣｌを添加し、２時間 攪拌した。次いで、相分離し、ＣＨ２Ｃｌ２をエバポレートして、Ｂｏａ−ＮＨ ＣＨ（Ｍｅ）ＣＯＮ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＯＯＥｔ　（３５）を得た。

支血五旦 （式５、ステップ５） Ｅｔ２０　（２０ｍｌ）中の化合物３５　（２０ｍｍｏｌｅ）を、５　ｍ１Ｈ２ ０中のＮａＨＣＯ３（２５ｍｏｌｅ）　、Ｃｂｚ−ＣＩ　（２５ｍ＋ｍｏｌｅ） 　、および３滴のＤＭＦで処理した。混合物を終夜激しく攪拌した。１ｃＨのピ リジンを過剰のＣｂｚ−Ｃ１を分解するために添加した。Ｅｔ２０相を、ＩＮＨ ＣＬ　Ｉ　ＮＮａＨＣＯ３、およびブラインで洗浄し、乾燥して、溶媒をエバポ レートした。残渣をＥｔ２０／ヘキサンから結晶化して、Ｂｏｃ−ＮＨＣＨ（Ｍ ｅ）ＣＯＮ（ＮＨ−Ｃｂｚ）ＣＨ２ＣＯＯＥｔ　（３６）を得た。

爽産匠ｎ （式５、ステップ６） 化合物■を４　Ｎ　ＨＣＩ／ジオキサンとともに室温で３０分間反応させること によって、Ｂｏｃ保護基を除いた。次いで過剰のジオキサン／ＨＣＩをエバポレ ートしてＮＨ２ＣＨ（Ｍｅ）ＣＯＮ（ＮＨ−Ｃｂｚ）ＣＨ２ＣＯＯＥｔの塩酸塩 （３７）を得た。

ｍ… （式５、ステップ７） エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（８ｍ＋ａｏ１ｅ）を、水冷 した化合物■のＣＨ３ＣＮ　（１５＋ａｌ）溶液に添加し、混合物を０℃で１時 間攪拌した。次いで、化合物３７　（ｇ　＋ａｍｏｌｅ）を添加し、続いてジイ ソプロピルエチルアミン（ｇ　Ｂｏｌｅ）を添加した。混合物を５℃で終夜攪拌 し、溶媒をエバポレートした。残渣をＥｔＯＡｃ　（３０＋ｎｌ）に溶解させ、 氷冷した１Ｍクエン酸（１５ｎ＋１）、Ｉ　ＮＮａＨＣＯ３（１５ｒＡｌ）およ びブライン（１５ｍｌ）で洗浄し、Ｍｇ５Ｏ，で終夜乾燥した。溶媒をエバポレ ートして、生成物をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、下式の化合物Ｕ を得た。

Ｌ立丘■ （式５、ステップ８） ＭｅＯＨ（１５ｍ１）中の化合物Ｈを、２０μｌ１ｇのｌＯ％Ｐｄ／Ｃを用い、 室温、１　ａｔｍの水素圧下で２０分間水素化分解した。次いで混合物を濾過し 、溶媒をエバポレートして下式の化合物Ｕを得た。

夫立丘用 （式５、ステップ９） 実施例３７由来の化合物Ｕを１００ｍ１のＣＨ３ＣＨに溶解させた。次いで、Ｂ Ｐ、・Ｅｔ２０　（１０μｌ）を添加し、溶液を室温で終夜攪拌した。溶媒をエ バポレートし、生成物を半調製のｃ４逆相ＨＰＬＣカラム上でクロマトグラフィ ーにかけ、下式の本発明の化合物赳を得た。

裏ＪＬｆｌ限 （εＣＦｆｆ似体の調製） 高い表皮増殖因子活性を有する合成ポリペプチドを以下のようにして！ｌｌ製す る： （Ａ）ム５Ｘ１　　　　：上述の実施例１５〜２８の方法にしたがって下式の化 合物を調製する： この化合物を、上述の実施例２９の方法にしたがって環化し、高い活性を有する 逆折り返し安定化ＥＧＦを得る。

（Ｂ）ム５ｘ２４　　　：上述の実施ｐ１３０〜３７の方法にしたがって下式の 化合物を調製する： この化合物を、上述の実施例３８の方法にしたがつて環化し、βシートを通して 安定化された、小さな逆平行βシート逆折り返しペプチドを得る。

（Ｃ）ム　クラス２　　　：式（ＭｅＯ）２Ｃ［Ｉ（ＣＨ２）　３ＣＯＮ−Ｍｅ ｔ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｓｅ　ｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　５ｐ−Ｓａｒ−Ｔ ｙｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｃｙ　５−ＣＯＮ　（Ｎ　）＋２）　−ＣＩ　２ＣnＯε ｔの化合物を環化することによりて、拡張されたクラス２ＥＧＦｌリペブチド類 似体が同じように：！；Ｒ１２される。

実施例４Ｇ （マラリア抗原の調製） 近年、マラリアに対する合成ポリペプチドワクチンが、Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ　 ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２８：２５？＜１９８７）でヒトに試験された。

しかし、部分的な効果しか証明されなかった。ワクチンの能力の改善は、合成ポ リペプチドの構造を制限することによって達成され得た。その改善は、繰り返し のテトラペプチド（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）３に基づいている。Ｃｈ ｏｕ−Ｆａｓｓｎ＋ａｎの分析（Ｃｈｏｕら、Ｂｆｏｃｈｅ＋ａ、　１３：２２ ２（１９７４））によれば、枠を移動した配列Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　ｌ ａが天然タンパクで逆折り返しを形成する強い傾向を有していた。逆折り返しは 、プロリンの周りのＡｓｎ側鎖間の推定のアミド−アミド水素結合をクラスｌま たはクラス２の水素結合模倣物で置き換えることによって、位置が固定され得る 。

（Ａ）９５二Ｌ１鼠且：下式の化合物を上述の実施例１〜２９の方法にしたがっ て調製する： （ここで、（ａａ）ｎと（ａａ）ｆｆｉは、それぞれ独立して１〜１２のアミノ 酸のアミノ酸配列またはＲｏであり、Ｒｏは、炭素数１〜６のアル牛ル、フェニ ル、ナフチル、ベンジル、または−Ｎｌ２である）。そして、環化して、以下の 構造を有する、マラリアの予防接種に適したポリペプチド類似体を形成する。

上記の化合物を、注射のために、非毒性の植物油および殺菌水中に乳化させ、常 法により筋肉的注射によって投与する。

（以下余白） Ｆ工ＧＵＲＥ　　１ 国際調査報告 １ｍ＃ｌａａ１１１Ｒｍｌ　Ｍｏｌ＋ｔＡＩｌａ＋＋　Ｎｏ、　＝：＝、’　： ＝ヨ９／−＝”、４５二ｍｌ＃１１１１１１＋６−＾ｏａｍａｍＩＩＮＯ，ＦＩ ′ニー、′４ｓＥ９．／ｆ）：＝５２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．活性なタンパク構造に基づいて活性ポリペプチドを調製する方法であって、 該活性タンパクの活性領域についてのおおよその三次元構造を決定すること； 安定化水素結合を同定すること；および該活性タンパクの活性領域と同じアミノ 酸配列を有するポリペプチドを調製することを包含し、ここで、該安定化水素結 合が、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−、および−Ｎ＝ＣＨ−から選 択される架橋性の２価の基で置き換えられている，方法。 ２．ペプチド結合に結合した少なくとも３つのアミノ酸またはアミノ酸と同等の ものでなる配列を有する、安定化ポリペプチドであって、１つのアミド窒素（Ｎ ）とカルボニル（Ｃ）結合の酸素原子に結合する水素原子が、−（Ｎ）−ＣＨ２ −ＮＨ−（Ｃ）−、−（Ｎ）−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−（Ｃ）−、および−（Ｎ） −Ｎ＝ＣＨ−（Ｃ）−から選択される架橋性の２価の基で置き換えられている， ポリペプチド。 ３．前記架橋性の２価の基が、推定上の水素結合に取って代わる、請求項２に記 載のポリペプチド。 ４．前記架橋性の２価の基が、ポリペプチド主鎖の一部を形成する原子を連結す る、請求項３に記載のポリペプチド。 ５．前記架橋性の２価の基が、アミノ酸側鎖を、第２の側鎖またはポリペプチド 主鎖に連結する、請求項３に記載のポリペプチド。 ６．前記アミノ酸分子鎖と前記架橋性の２価の基が、７、１０、１３、１４、１ ６、または２２個の原子を有する環を形成するように選択される、請求項２に記 載のポリペプチド。 ７．下式の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、（ａａ）ｎは１〜１２のアミノ酸でなるアミノ酸配列であり； ｍは、１〜６の整数であり；そして、 Ｘは、水素、ハロ、炭素数が１〜６のアルキル、炭素数が１〜６のアシル、ベン ジル、炭素数が１〜６のハロアルキル、または１〜４０個のアミノ酸でなるアミ ノ酸配列である。 ８．（ａａ）ｎがＡｌａ−Ａｌａであり、ｍが１であり、Ｘがメチルである、請 求項７に記載の化合物。 ９．（ａａ）ｎがＡｌａ−Ａｌａであり、ｍが２であり、Ｘがメチルである、請 求項７に記数の化合物。 ｌ０．（ａａ）ｎがＧｌｕ−Ｓｃｒ−Ｌｅｕであり、ｍが２であり、Ｘがメチル である、請求項７に記載の化合物。 １１．下式の化合物： 【配列があります】 ここで、Ｒ′は、炭素数が１〜６のアルコキシ、フェノキシ、ナフチルオキシ、 ベンゾキシまたは−ＮＨ２であり；（ａａ）ｎは、アミノ酸配列であり；そして 、ｍは、１〜６の整数である。 １２．（３２）ｎがＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＡＳＰ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ であり、ｍが３であり、Ｒ′′がＮＨ２である、請求項１１に記載の化合物。 １３．（ａａ）ｎがＬｅｕ−Ａｌａであり、ｍが３であり、Ｒ′′がＥｔである 、請求項１１に記載の化合物。 １４．（ａａ）ｎが、Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＡＳ ｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓであり、ｍが３であり、Ｒ′′が−ＮＨ２ である、請求項１１に記載の化合物。 １５．下式の化合物： 【配列があります】 ここで、（ａａ）ｎおよび（ａａ）ｍは、それぞれ独立して１〜１２個のアミノ 酸でなるアミノ酸配列またはＲ′′であり、ここで、Ｒ′′は、炭素数が１〜６ のアルキル、フエニル、ナフチル、ペンジルまたは−ＮＨ２であり；そして、 ｐは、１または２である。 １６．（ａａ）ｎおよび（ａａ）ｍが、それぞれ独立してＡｌａまたはＲ′′で ある、請求項１５に記載の化合物。