JPH03502578A - 7/7a因子活性部位阻害剤 - Google Patents
7/7a因子活性部位阻害剤Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
■/■a因子活性部位阻害剤
本願は、ここに援用される。 1988年4月に出願された同時係属出願第17
8.495号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、血液凝固の分野に関し9組織因子と結合する外因性凝固因子■/■a
の阻害剤であるペプチド分子を包含する。
発明の背景
ヒトの外因性凝固プロテアーゼのカスケード反応を細胞が開始する生理学的機序
の確認された主要部分は、細胞表面における糖タンパク組織因子(TF) (M
orrisseyら(1987)、 Ce1l。
2重鎮誘導体■aと、■=1の比率で特異的に結合して二成分複合体[TF:■
]または[TF:■a] (以後、 [TF:■/■a]で表わす)を形成
する細胞表面のレセプターである。その触媒的に活性な部分は、ここでは■/■
a因子と呼ばれ、 TFに結合していない場合でさえ、エステラーゼ活性を有す
る(ZurおよびNemerson(1978)、 J、 Biol、Chem
l、 253: 2203−2209)。
[TF :■/■a]二成分複合体は、この複合体の■/■a因子の機能的セリ
ンプロテアーゼ型活性部位と基質との結合による。タンパク加水分解活性を有す
る(NemersonおよびGentry2つの他のタンパクであるセリンプロ
テアーゼチモーゲン類。
すなわちX因子(S i lverbergら(1977)、 J、 Biol
、 Chem、、252:8481−8488)および■因子(Osterud
ら(1977)、 Proc、Natl。
テアーゼとして作用する。この両方の因子は、二成分複合体[TF :■/■a
]に組織化される際、■/■a因子のセリン型触媒部位の作用によって、プロテ
アーゼとして順に活性化される。[TF:■/■a]の■因子に対する特異性に
よって。
[TF :■/■a]も、いくつかの細胞9例えば血管系の内皮細胞における内
因性凝固プロテアーゼのカスケード反応を活性化することができる(Stern
ら(1984)、 Proc、 Natl、 Acad。
くは両方の凝固プロテアーゼカスケード反応の開始は、血栓症の開始(Niem
etzおよびFani(1973)、 Blood、42: 47−59.5t
ernら(1984)、同上)および散在性血管向凝固(Niemetzおよび
Fani(1971)、 NatureNew Biol、、232 : 24
7−248 )に対する非常に重大な病因である。両方の凝固プロテアーゼカス
ケード反応は、ウィルスに対する炎症反応および免疫仲介疾患におい遊離形態、
または[TF :■/■a]二戊分複合体の一部としての形態である場合の■/
■a因子に対して特異的な阻害剤は、まだ確立されていない。タンパク分解活性
を有する[TF:■/■a]二成分複合体による凝固プロテアーゼカスケード反
応の上記の「開始」に対する特異的な阻害剤は全く知られていない。
本発明は、 [TF:■/■a]二成分複合体のタンパク分解活性を特異的に
阻害する能力を提供するものであり1重要で有用な進歩を示す。本発明の化合物
によって、血栓凝固、炎症性凝固、および関連する血管内凝固、ならびに免疫学
的疾患における凝固の細胞活性化を1分子基準で診断評価をすることができる。
第2に、このような化合物によって、[TF:■/■a]複合体の活性に基づく
薬剤の開発を検討することができる。第3に、このような化合物は、新種の抗血
栓薬剤および抗炎症薬剤となる。
本発明で述べる種類の化合物の有用性は、これらの化合物が■/■a因子に特異
的な活性部位阻害剤として機能する能力に由来するものである。可逆的阻害剤お
よび不可逆的阻害剤の両方について述べる。不可逆的阻害剤は、タンパク分解活
性の二成分複合体[TF :■/■a]の組織因子(TF)と結合することによ
って活性になった場合、■/■a因子に対して有効な阻害を行うことができ、か
つこの因子に対して選択的である。
本発明の化合物は、 [TF:■/■a]による凝固プロテアーゼカスケード
反応の開始を特異的に阻害する分析試薬および治療剤として用いられる。また、
この化合物によって、凝固の活性化が、二成分複合体[TF :■/■a]に基
因するかどうかを、インビボおよび半ビボで正確に決定することができる。これ
らの化合物は、血栓形成と血栓症および関連する疾患9敗血症性ショックに関連
する散乱性血管向凝固などの疾患過程、ならびに組織内の凝固の過剰な活性化に
関連するある種の炎症症状に必要とされる病原機序の1つである凝固本発明には
、セリンプロテアーゼ凝固■/■a因子の高親和性細胞レセプターTFと結合し
た結果、活性化された場合に。
該因子のタンパク分解活性部位を特異的に阻害するペプチドおよびペプチド誘導
体が含まれる。
本発明の、 [TF:■/■a]複合体における■/■a因子の阻害剤は次式
Iで表される化合物である。
ここでT R1はアルギニン側鎖−[C)1.] 、−Nll−CN)INH2
である;R2はトレオニン側鎖−(1:110H−C13,セレン側鎖−CH2
0Hまたはプロリン側鎖−(CH2)!−であり、P、がトフェニルアラニンで
ある場合を除いて+ R2はプロリンである+R3は以下のアミノ酸の側鎖であ
る。すなわちアスパラギン側鎖〜CH2[:ONH,、アスパラ側鎖−CL−C
H[CL] 2 、グルタミン側鎖−[C112] 2−CONH2゜であり、
R3がD異性体またはL異性体であるように配列している。水酸基、もしくは1
〜4個の炭素原子を有する直鎮または分枝状のアルコキシ基(例えば、メトキシ
基、エトキシ基、n−プロポキシ基、イソプロポキシ基、n−ブトキシ基など。
ならびにベンジルオキシ基)、あるいはNA、A2基[ここで。
AI右よびA2の各々はOUt もしくは1〜4個の炭素原子を有する低級アル
キル基(例えば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基)であ
ってeAlおよびA2は同一または相異なる]、あるいはクロロメチル基または
フルオロメチル基、あるいは−Nil−アリールスルホニルフルオリド基である
殻構造POOII−Y2 (ここで+ Y2は、アミノ酸、もしくはペプチドま
たはその塩である)で表されるホスホンアミデートで置き換えられている。Zは
1通常■であるが、直鎖または分枝状のアルキル基、 CI(またはCHOの環
状基、1〜6個の炭素原子を有するCHO基、 (例えば、メチル基、エチル基
、n−プロピル基またはイソプロピル基、n−ブチル基、 tert−ブチル基
。
ベンジル基など)、あるいはさらに複雑な化学的誘導体(例えば、ホルミル基、
アセチル基、ダンシル基(5−ジメチルアミノナフタレンスルホニル基)、トシ
ル基(p−)ルエンスルホニル基)、またはBoc基(tert−ブチルオキシ
カルボニル基)などを含む各種の基で置換されていてもよい。余り有利ではない
誘導体としては+P3部分を有さず、ZがR2のNに結合している一般的な化合
物がある。
上記一般式の化合物は、Yが、セリンプロテアーゼの電荷リレー系に反応性のセ
リンまたはヒスチジンを有するような酵素内における反応性部位の残基と共有結
合または密着結合(tight bond)を形成し得る反応性基である場合、
二成分[TF二■/■a]複合体における■/■a因子の不可逆的阻害剤または
密着阻害剤(tight 1nhibitor)である。不可逆的阻害剤として
は、 Yが、クロロメチル基、フルオロメチル基、または−NH−アリールスル
ホニルフルオライド基である場合の上記一般式で表される化合物が挙げられる。
密着阻害化合物としおよびY2はアミノ酸またはその誘導体、好ましくはイソロ
イシン、バリン、またはアラニンであるが、セリンプロテアーゼの代表的な基質
構造のp+1を意味するこれらの構造に限定されない)で置換されているホスホ
ンアミデート構造で置換されている化合物(SchechterおよびBerg
er(1967)、 Biochem。
このような不可逆的阻害剤または密着阻害剤は、他の点では、 Z、 R,、
R2,R,の基について、上記の可逆的阻害剤と同様である。
一般式Iで表される化合物の薬学的に許容される塩も、P1アルギニン、R2ト
レオニン、またはP3側鎮の化学的誘導体と同様に1本発明の範囲内に含まれる
。式■の化合物と、その薬学的に許容される塩は、血栓症、散在性血管向凝固症
1敗血症性ショック症、関節炎のような細胞免疫型疾患における炎症、および類
肉腫症の治療に有用である。
(以下余白)
発恩911」象説贋
本発明の化合物は、〔TF:■/■a〕の生理学的基質のトリペプチド類似体と
して作用すると考えられる。これらの化合物は、二成分複合体[TF :■/■
a〕の高親和性細胞レセプターTFと結合する場合にのみ、活性酵素形態の■因
子もしくはその誘導体である■aにおけるPl−Ps部位(Schech te
rおよびBerger(1967)、 Bioche+++、 Bjophys
、 Res、Comm、、27 : 157−162の命名法による)に結合す
ると考えられる。式■のp、、 p。
およびP、で示されるアミノ酸残基もしくは類似体は、それぞれ、セリンプロテ
アーゼ型の酵素の基質のpHR2およびR3に対応すると考えられる。
置換基R,としては、アルギニンの側鎖、あるいは局所の構をできるだけ導入す
る反応性の誘導体が好ましい。可逆的阻害剤では、アルギニンのアミノ酸側鎖を
R1に用いることが好ましい。
R2としては、トレオニン残基の側鎖が好ましい。
R1としては、 (TF:■/■a)の基質に対する高い選択的特異性と矛盾
しない各種の構造が用いられ得る。たとえ天然の基質中にこのような構造が存在
せず明らかでなくてもよい。
表1に列記したアミノ酸残基によって好ましいR3の構造を例示する。最も有効
なものを相対阻害活性について列記しである。
表1
P、置換基の相対効力
相対効力はメガ単位(MU)で示す。その1単位は、X因子活性を5%阻害する
場合のモル濃度の逆数に等しい。組織因子を有する二成分複合体の■/■a因子
に対する阻害は。
5chinartz、 B、S、ら(1981)、 J、 Cl1n、 Inv
est、67 : 1650に記載されるのと同様にして精製したX因子と、ク
ロモゲン基質S−2222(Helena Labs、米国、テキサス州、ボー
モント)とを用いる酵素結合色素形成検定法(linked enzyme c
hro−mogenic assay)によって定量された。簡単に言えば、ペ
プチドを精製ヒト■因子(1渕)であらかじめインキュベートし、 Fair、
D、S、、 (1983)、Blood 62 : 784−791に記載し
であるのと同様にして精製し、全体積75p!を室温で30分間保温した後、
25tlの20a+M CaC1z、 l Xl0SのTF陽性ヒト膀胱癌腫
由来J82細胞(米国、メリーランド州、ロックビルのアメリカンタイプカルチ
ャーコレクションから受託番号ATCCHTBIで入手可能)50pZのトリス
緩衝食塩水中の25p!の精製ヒトX因子(100渕)および50plの2+m
M S−2222を添加した。
J82細胞の使用は、これらのインビトロ検定法の重要な特徴である。なぜなら
ばこの細胞は、活性TF:■/■aの形成に対して有効な量のTFを産生ずるか
らである。X因子のXa因子への変換率は、 405nmの吸光度でS−22
22の色素生成物を測定することによって速度論的にモニターされた。
R1としてのその他の置換基には、アラニル、プロリル、グリシル、アルギニル
、セリル、フェニルアラニル、トリプトファニル、バリル、イソロイシル、グル
タミル、チロシル。
システイニルもしくはメチオニルの側鎖が包含される。これらの置換基はジペプ
チドであるトレオニルーアルギニンもしくはその誘導体の弱い阻害活性を積極的
に打消して不活性化合物にする。
式Iの置換基R1は、アスパラギンもしくはヒスチジンのアミノ酸側鎖の構造に
基づいたものが最も好ましく1機能的阻害剤であるアスパラギン酸とロイシンの
アミノ酸側鎖に基いた構造のものはあまり好ましくな(、トレオニンおよびグル
タミンの側鎖に基づいた構造のものは可逆的阻害剤としてさらに好ましくない、
ジペプチドであるトレオニルーアルギニンはわずかな活性を有し、その活性は適
当な置換基を有するR3を付加することによって改善される。アミノ末端基2と
しては、水素原子、もしくは水素結合、あるいは共有結合を容易にする他の置換
基によって反応性を増大させる。当該技術分野で発表されている種々の他の基が
好ましい。
比較的有効な形態の可逆的阻害剤は、一般式■と実施例1に示t L−アスパラ
ギニル−L−トレオニルーし一アルギニン(L−Asn−L−Thr−L−Ar
g)である。
ここで、Zは水素原子、R3はL−アスパラギニル側鎖である一Cut−CON
Hア;R2はL−)レオニル側鎖である一CH0H−CHz、および1はL−7
/I/ギニル側鎖である−[CI!] 1−N)l−CNHNHzである。ペプ
チジル部分を形成する個々のアミノ酸のD−異性体も利用することができる。特
に断らない限り、ここではL形のP I +P、およびP、が用いられる。
不可逆的阻害剤もしくは密着阻害剤は、可逆的阻害剤の誘導体であり、■/■a
因子の触媒領域の活性部位と共有結合もしくは非常に密着した結合を形成して安
定な阻害剤−酵素される。不可逆的阻害剤の周知な例としては、 1)ペプチド
クロロメチルケトン類(CMK) (Powersら(1977)、 Bioc
him、 Biophys。
Acta 485 : 156−166 ; 2)ペプチドフルオロメチル
ケトン(FMK)(Isperiali and Abeles(1986)
、 Biochem、25 : 3760−3767) ;および3)−HN−
アリールスルホニルフルオライド類(Yoshiw+uraら(19B2) J
、 Biol、 Chew、 ’257 : 507?−5084) カ包含さ
れ;密着結合の阻害剤としては、1)ペプチドボウ酸類(Mattesonら(
1981)J、 Am、 Chess、 Soc、 103 : 5241−
5242 ; Kettnerおよび2)ペプチドホスホンアミデート類(Ja
cobsenおよびBartlett(1981)J、^ta、 Chew、
Soc、 103 : 654−657)が含まれる。
クロロメチルケトン誘導体は、 TF陽性検定用細胞の表面における(TF :
■/■a〕の特異的なタンパク分解活性の阻害性について分析された。相対的阻
害効力は1表2に示すように、かなり増加している。
表2
クロロメチルケトン類似体の阻害活性の比較上記のペプチド類とペプチジルクロ
ロメチルケトンi (CMK)の阻害効力を表1について記載したのと同様にし
て検定した。 K、5は?l[lで示す(表1参照)。K工50は1通常のモル
数。
すなわち、X因子の活性率を50%阻害するのに要する濃度で示す。
好ましい形態の不可逆的阻害剤は、一般式■と表2と表3に示す)l−L−口イ
シル−L−)レオニル−し−アルギニルクロロメチルケトン(L−Leu−L−
Thr−L−Arg−CMK)である。
式■:
ここで、2は水素原子;R1は−CHz−CI [CH3コ2;R1は−coo
n−ct+s ;R3は−CHg−CHz−CHx−NH−CNHNHzである
。
P2位置におけるロイシル残基は2例えば1表3に示すように生物学的活性を著
しく失うことなくアセチル基もしくはトシル基を含有するように化学的に修飾さ
れてもよい(ただし。
R3のロイシン残基を修飾して2位置にダンシル基を含有させると生物学的活性
が低下する)。さらに、好ましいL−Leu−L−Thr−L−Arg−CMK
阻害剤化合物では、 Pg位置のアミノ酸残基は。
表3に示すように、阻害活性を著しく失うことな(セリンもしくはプロリンで置
換され得る。
より好ましい形態の不可逆的阻害剤は、D−ロイシル−L−)レオニル−し−ア
ルギニルクロロメチルケトン(D−Leu−L−Thr−L−Arg−CMK)
であり、この化合物の25位のアミノ酸残基はロイシンのD−異性体である。こ
のトリペプチジル−CMKの阻害活性は+h位置にL−ロイシンに代えてD−ロ
イシンを含有する場合は著しく増化する(表3参照)。P8位置のD−ロイシン
がD−フェニルアラニンで置換されると活性は50%より大きく減少する(表3
)。
表3
いくつかのペプチジルクロロメチルケトン類の阻害活性ペプチジル−CMK
j15L−Leu−L−Thr−L−Arg−CMK
68 M[ID−Leu−L−Thr−L−Arg−CMK 100
ペプチジルクロロメチルケトン類の阻害活性は1表1で記載したのと同様にして
検定した。Ki5はMUで示す(表1参照)。
Ac=アセチル基。
Tosyl =p−)ルエンスルホニル基。
Dansyl =5−ジメチルアミノナフタレンスルホニル基。
本発明の代表的な化合物が合成され、これらの化合物がTF分子を発現するヒト
細胞によるX因子の活性化を積極的に阻害することが証明された。このTF分子
は■因子とともに供給されて、二成分タンパク分解活性化複合体(TF :■/
■a〕を形成する。X因子における(TF :■/■a〕のタンパク分解活性を
1本発明の化合物が阻害することは9色素検定法によって分析された0色素検定
法では、基質であるS−2222が。
発生したXa因子によって切断される。正常なヒトの血漿の凝固の阻害も、 T
F陽性細胞、阻害剤化合物およびカルシウムを添加した後に分析して証明された
。分析の結果、このような化合物はすべて、Xa因子、すなわち因子■および■
aに非常によく類似した酵素に対して効果を有さないことが分かった。いずれの
化合物も、 S−2222のXa因子による切断に対して阻害効果を全く示さな
かった。
不可逆的阻害剤としてのハロメチルケトン誘導体は、Yにおけるへロメチル基に
、好ましくはCIの代わりにFが入っていることを除くと、置換基については、
クロロメチルケトン誘導体について先に述べたのと同様である。
当該技術分野でよく知られているように、ペプチドのホスホンアミデート誘導体
は、セリンプロテアーゼを阻害し得る。
本発明のこのような誘導体も、■/■a因子の触媒部位に密着結合することによ
って[TF :■/■a〕のタンパク分解油で、Y2はアミノ酸、ペプチドもし
くはその塩、好ましくはイソロイシン、バリンもしくはアラニンのような疎水性
アミノ酸)で構成されていることを除いて、クロロメチルケトン誘導体について
先に記載した前記化合物および置換基に基づいたものである。これらの化合物は
下記一般式■で表される。
その他の基の置換は、クロロメチルケトン類と可逆ペプチド化合物について記載
したのと同様である。
本発明のホウ酸誘導体は、■/■a因子の触媒部位に密着結合することによる。
[:TF:■/■a]のタンパク分解活性の密着阻害剤である。これらの誘
導体は+PlのYと結合カルボニル基、COとがQで置換されている。一般式V
において。
Qはホウ酸の−B[OH]、である。その他の基の置換は、クロロメチルケトン
類と可逆的なペプチド化合物について記載したのと同じである。
本発明の化合物の薬学的に許容される塩の例としては、有機もしくは無機の酸、
もしくは塩基で形成される非毒性の塩が包含される0例えばナトリウム、カリウ
ムもしくはリチウムのようなアルカリ金属の塩;カルシウムもしくはマグネシウ
ムのようなアルカリ土類金属の塩;シクロヘキシルアミン。
エチルアミン、ピリジン、エタノールアミンもしくはピペラジンのような有機ア
ミンの塩;および塩素、フッ素、臭素。
コハク酸もしくは酢酸塩のようなアニオンで形成される塩である。上記の塩は通
常の方法で調製される。
一般式Iで表される本発明の化合物は、タンパク分解性二成分複合体1:TF
:■/■a〕中の■/■a因子の触媒部位の阻害剤であり5表1の脚注に記載し
たようにして検定されるXa因子発生を阻害する性能によって証明された。その
阻害活性によって、これらの化合物とその塩は、血栓症の凝固の細胞活性化、汎
発性脈管向凝固症1敗血症性ショック、細胞免疫応答症、類肉腫症、および炎症
応答の一部分として凝固経路が活性化される関連疾病の治療に有用である。
本発明を実施する際には2式Iの化合物および薬学的に許容されるそれらの塩は
、単独で用いるかまたは薬学的に許容される担体と混合してもよい。このような
化合物もしくは塩は、非経口で患者に投与することができる。例えば皮下、静脈
もしくは腹腔内投与が可能である。このような化合物は。
鼻腔内への点滴注入;または口の舌下部の粘膜もしくは鼻や気管支の粘膜のよう
な粘膜に、スプレー、乾燥粒子の懸濁液あるいは水または食塩水の溶液として塗
布することによって投与することができる。
ここに示すデータは、 (TF:■/■a〕の■/■a因子部分の活性触媒部
位と結合して阻害することによって、 [:TF:■/■a〕のタンパク分解
活性を阻害する本発明の代表的化合物の活性を、X因子のタンパク分解活性化の
インビトロでの検定法と血漿の凝固時間検定法で証明する。患者の治療条件は、
さらに、当該技術分野で公知の原理にしたがって、半ビボおよび実験動物で活性
を定量することによって最適化することができる。阻害剤を、活性な形態で、か
つ生理学的に適合した形態で投与するための、薬学的に許容される担体。
希釈剤および賦形剤の開発は、公知の原理に基づいて行われる。実用上、阻害投
与量は、患者の血液中、 300−より少なく、好ましくは30−より少なく
なければならず、このことは薬学的に有効な阻害剤は、 300JMより小さい
K150値がまたは。
2.0以上のに、5値を持っていなければならないことを意味する。
さらに阻害剤は(TF :■/■a〕に対して特異的でなければならない。多く
の非特異的なセリンプロテアーゼ阻害剤が当該技術分野で知られている。これら
はここでは関連がない。
なぜならば、これらの阻害剤は、多くの酵素を阻害するので有効投与量で有毒で
あり得るからである。本発明の阻害剤は。
(TF :■/■a〕の■/■a因子部分に対し高度に選択的である。本発明の
阻害剤は1例えば、 300−という高い投与量で、同種のセリン形プロテア
ーゼであるIXa因子もしくはトロンビンに対する阻害効果を持っていない0本
発明の好ましい化合物は、高いKiS値(Flu)と低いに、50値(IM)を
有する化合物であり、その理由は、このような化合物は、少ない投与量で有効で
あり、副作用の可能性が減少するからである。
本発明は2本願で開示した特別な教示事項を、当該技術分野で公知の種々の技術
や手段と組合わせている。手段の選択は、ペプチドの長さの選択、活性部位との
結合を限定する反応性基の選択、各アミノ酸残基内の修飾の程度、活性部位の安
定化/不安定化に影響するアミノ酸配列の操作+hとP3の部位の適確な形態と
反応性を反映するアミノ酸の挿入、結合親和性を将来利用するための化学配位子
の付加と修飾などのような変化によって決まる。新規な、天然および合成のペプ
チド基質と阻害剤分子が発見され評価され、活性部位の結合性と反応性の増強に
寄与する配列と配位子が明確になれば。
当業者は、所望の生物学的活性を有する“改良された”合成ペプチジル類似体を
産性する要素を、上記の要°素から選択することができる。本発明の主要な局面
は、新規なペプチジル化合物を利用して、 (TF:■/■a〕のタンパク分
解活性を阻害することができることである。このことは、ペプチジル化合物を、
■/■a因子の触媒部位に対して選択的にかつ高い親和性を、持って結合するよ
うに設計することにより達成される。
(以下余白)
実施例
以下の実施例は本発明の実施態様を例示するために提供される。これらの実施例
は本発明の範囲を限定することはなく。
その範囲は特許請求の範囲によって決定される。
本発明のペプチジル阻害剤の化合物は、当該技術分野で用いられている数多くの
化学合成法のいずれかを用いて容易に合成することができる(Fridkin
and Patchornik (1974)。
好ましい方法は、(a)均一系(溶液)もしくは不均一系(液体/固体相)での
合成と(b)フラグメント縮合反応もしくは段階的縮合反応を包含する方法(B
odansky and 0ndetti (1965)Peptide 5
ynthesis 、 New York、 Interscience)であ
る。所望のペプチドのハロメチルケトンとその他の種類の誘導体(例えば、′ホ
スホンアミデート類、ホウ酸類、アリールスルホニルフルオリド類など)の合成
は、当業者に周知の方法で容易に実施され得る。(Powers and Tu
hy (1973) Biochemistry3760−3767 ; Im
periali and Abeles (1986) Tetrahed
ronJ、 Biol、 Chem、257 : 5077〜5084参照)。
この化合物の代表的な固相合成は、 t−Boc基で保護された誘導体であるN
−α−Boc−L−アスパラギン、 N−Boc−0−Bzl−L−トレオニ
ンおよびトシル−L−アルギニンで誘導体化(derivatize)したPA
M樹脂を支持体として用い、かつメーカーの標準プロトコルを用いて、 App
lied Biosystems 430A型ペプチド合成装置で行った。トリ
ペプチドを、脱保護化処理し、標準プロトコルに従い、HF解離剤〔アニソール
:樹脂:HF(1:1:10)〕を含有する試薬で60分間0℃で処理してPA
M支持体から解離させる。生成物を、0.1%(V/V)のTFAを含有する1
0〜40%(V/V)アセトニ) IJル水溶液の匂配液で溶出するバイダック
(Vydac) C−18カラムで精製し、減圧乾燥する。生成物は水あるいは
所望の水溶液に溶解して分析に使用される。
実施例2 : H−L−Asp−L−Thr−L−Argの合成この類似体の合
成は、 Applied Biosystems 430 A型ペプチド合成装
置で、トシル−し−アルギニンでデリバタイズされたPAM樹脂カー) +3ツ
ジに結合させるための非対称の無水物形成の標準プロトコルを用いて満足すべき
状態で行なわれる。
すなわち、まず上記のトシル−し−アルギニンにN−Boc−0−Bz I−L
−)レオニンを結合させ、そのt−Boc基を除去し9次いでN−Boc−L−
アスパラギン酸−β−ベンジルエステルを活性化して非対称の無水物とし、トレ
オニル基に結合させる。得られたトリペプチドを脱保護化し、標準の)IPプロ
トコルを用いてPAM樹脂から解離させ、上記(実施例1)したのと同様にして
調製した。
実施例3 : H−L−11is−L−Thr−L−Argの合成最終のアミノ
酸結合反応にN−α−Boc−N−im−Cbz−L−ヒスチジンを代わりに用
いて、実施例2に記載しであるのと基本的に同様にしてペプチドを合成した。
実施例4 : II−L−Leu−L−Thr−L−Argの合成最終のアミノ
酸結合反応にN−Boc−L−ロイシンを使用すること以外、実施例2に記載し
であるのと基本的に同様にして合成を行った。
実施例5 : H−L−Thr−L−Thr−L−Argの合成最終のアミノ酸
結合反応にN−Boc−0−Bzl−L−)レオニンを代わりに用いて、実施例
2に記載したのと基本的に同様にして合成を行った。
実施例6 : l(−L−Gln−L−Thr−L−Argの合成最終のアミノ
酸結合反応にN−α−Boc−L−グルタミンを代わりに用いて、実施例1に記
載したのと基本的に同様にして合成を行った。
実施例7 : H−L−Thr−L−Argの合成最終のアミノ酸結合反応を省
略して実施例1に記載したのと基本的に同様にして合成を行った。
この方法がより好ましい方法であり、以下のようにして実施され得る。
15、6mmol)をテトラヒドロフラン(TIIP) (200mf)に溶解
し。
N−メチルモルホリン(1,72mf、 15.6mmol)の存在下、クロル
ギ酸イソブチル<2.06 g 、 15.6mmo I)で、0℃にて10分
間処理した。得られた混合無水物の調製物を濾過し、その濾液を。
エーテル性ジアゾメタン〔ダイアザルト(口1azald) (5,4g 。
25mmo1)から調製された120m1)に5分間かけて添加した。
反応液を0℃で45分間攪拌した後、酢酸(0,5rnl)を添加して過剰のジ
アゾメタンを失活させた。生成物は反応混合物から結晶化した。溶媒を除去し、
残渣をクロロホルム(25mN)で希釈した。結晶生成物であるBoc−L−A
rg(NO2)C)lN2を濾過し、減圧乾燥させた。Boc−L−Arg(N
o2)C)lN* (3,97g、 11.5mmol)をエタノール(23m
f)に溶解し、0℃に冷却した。HCI (10%エタノール溶液12.5m1
)を、20分間かけて滴下した。反応混合物を室温(RT)で1時間攪拌後、こ
れをジエチルエーテル(400ml)に注入した。得られた溶液を2時間、5℃
で静置し。
窒素中で濾過し、減圧デシケータ−中で乾燥させて、 1.72gのH−L−A
rg (NOa)CH2C1・HCIを白色粉末として得た。360M1(zの
’HNMRで生成物の特性を決定した。
2.66g 、 0. Olmol)とN−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1
,53g、 0.Olmol>の氷冷THF (40ml)溶液に、(トt−ブ
チル)−トレオニンメチルエステルHCI (2,26g、 0.Olmol)
、 N−メチルモルホリン(1,lomf、 0. Olmol)、およびジシ
クロへキシルカルボジイミド(DCC) (2,16g 、 O,Olmol
)含有T)IP(5ml)を続けて添加した。添加が完了した後、溶液を0℃で
1時間1次いでRTで16時間攪拌した。得られた反応混合物を水浴で冷却し、
過剰のDCCを酢酸(0,50m1)で失活させた。1時間後。
得られた溶液を濾過し、得られたジシクロヘキシル尿素(DCU)の沈澱を酢酸
エチル(25d)で洗浄した。得られた濾液から溶媒を除去し、残渣を酢酸エチ
ル<25m1)に溶解した。得られた溶液を3時間5℃で静置し、残留するDC
Uの沈澱を濾過して除去した。濾液を酢酸エチルで希釈して100m1とし、1
0%のクエン酸、水、飽和NaHCO3および食塩水(飽和NaC1溶液)(各
々15m1ずつ)で洗浄し、 MgSO4で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減
圧下で除去して、 Cbz−L−Asn−L−(0−t−ブチル)−ThrO
Me (4,02g、 89%)を得た。Cbz−L−Asn−L−(0−t−
ブチル)−ThrOMe (4,02g、 8.9mmol)の、水冷メタノー
ル/ジオキサン(1: 1)(25mA’)溶液に、 NaOH(1,ON溶液
12mf、 12mmol)を添加した。得られた溶液をRTで3時間攪拌した
。メタノールとジオキサンを減圧下で除去した。得られた水溶液を水(50rr
L1.)で希釈し、酢酸エチルで2回(各25−ずつ)洗浄し、1MのNaHS
O,溶液でpH2に酸性化した。水層を50rrLlずつの酢酸エチルで2回抽
出した。得られた有機層を合わせて9食塩水で3回(各101nI!ずつ)洗浄
し、 MgSO4で乾燥させ、溶媒を減圧除去して、 (Jz−L−八5n−
L−(0−1−ブチル)−Thr[lll (2,14g。
55%)を得た。60MHzの’HNMRで生成物の特性を決定した。
H−Asn−Thr−Arg−CMKの調製 予め調製しておいた。保護化ジペ
プチドであるCbz−L−Asn−L−(0−t−ブチル)−ThrOH(0,
88g。
2、0mmol)を、N−メチルモルホリン(0,24m1.2. Immol
)の存在下、クロJL/ギ酸イソブチル(0,29mf、 2.1mtno I
)と0℃で20分間反応させた。HL Arg(N02)CHzCI・)ICI
(0,60g、2.0mmol)のジメチルホルムアミド(4mjり溶液を滴下
した。0℃で20分間攪拌後、N−メチルモルホリン(0,22+++1. 2
.0mmol)含有のTHFを添加した。得られた溶液を、0℃でさらに40分
間。
次いでRTで1時間攪拌した。得られた反応混合物を水と食塩水(各々25−ず
つ)で希釈し、酢酸エチルで2回(各々25W11ずつ)抽出した。有機層を合
わせて、10%クエン酸、飽和NaHCO,および食塩水(各々15rn1ずつ
)で洗浄し、 1g3口4で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、 Cbz−L
−Asn−L−(0−t−ブチル)−Thr−L−Arg (NO2) Cf1
aC1を得た。生成物をl(P(7ml)とアニソール(0,5mf)とで0℃
にて20分間処理した。HFを除去した後。
残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで2回(各々5−ずつ)洗浄した。有機
揮発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製H−L−Asn−L−Thr−L−
Arg−CMK ・2HPを凍結乾燥させて粉末とした。得られた物質を、0〜
1.0NHCIの段階的匂配液を用いるセファデックス(Sephadex)
5P−C25(H+形)カラムで粗精製し、 124mgのトし一へsn−L
−Arg−CMK・21IC1を得た。生成物を。
10〜50%(V/V)のヘキサン/イソプロパツール(10%メタノール)匂
配液で溶出するスベルコ (Supelco) LCNH2カラムでさらに精製
し減圧乾燥させた。360MHzの’HNMRによって生成物の特性を決定した
。生成物を、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解し9分析もしくは他の
用途に用いた。
(b)固相法を用いるペプチドの合成
H−Arg(NO□)C)IzCI−HCIの調製 Boc−Arg(NOz)
DH(5,Og。
15、6mmol)を60m1のテトラヒドロフラン(THF)に溶解し、 N
−メチルモルホリン(1,72−、15,6mmol)の存在下、クロルギ酸イ
ソブチル(2,06m1.15.6mmol)と−20t’で1o分間反応させ
た。得られた混合無水物の調製物を濾過し、濾液を120m1のエーテル性ジア
ゾメタンに添加した。反応溶液を30分間0℃で攪拌した後、 80m/のエー
テルを添加した。生成物は、冷時に9反応溶液から結晶化した。Boc−Arg
(H[]2) C)IN+(2生成物を最小堆積のTIIPに溶解し、エタノ
ールICI (20mmo I)と、窒素放出がなくなるまで室温で反応させた
。
)1−Asn−Thr−Arg−CMKの調製 ペプチドのBoc−Asn−0
−Bzl−Tbr−O11を、当該技術分野で公知の方法と、標準の装置プロト
コルによるApplied Biosystems 430A型ペプチド合成装
置とでSt、 Louis、 G、 R,Marsha11編集、 ES[:D
M Leiden、 259頁参照)、そのImmolを、5mlのTHF中の
N−メチルモルボリン(l mmol)と−20℃で1o分間反応させた。。冷
却したN、N−ジメチルホルムアミド5mlに溶解した)l−Arg(N[]2
)C)12[:l・)IcI (1mmol)を上記の混合無水物の調製物に添
加した。15分後にトリエチルアミン(Immol)含有の冷却T)IP (2
0rnIりを添加した。−20℃で1時間1次いで室温で2時間攪拌後1反応混
合物を濾過し、その濾液を酢酸エチル中に懸濁させ、酢酸エチル層を水で洗浄し
9次いで蒸発乾固した。粗生成物をIIP解離剤〔アニソール:粗生成物:ll
P (1:1 :10) ’]で0℃で60分間処理して脱保護化し、粗生成物
の水性懸濁液を、エーテルで3回洗浄し9次いでクロロホルムで3回洗浄した。
有機層を合わせて、 0.IN HCI、水、 IM K2CO,および飽
和NaC1で順に洗浄し、 MgSO4で乾燥させ、溶媒を減圧で除去した。生
成物を。
0.1%(V/V) TFA ヲ含有スルアセトニトリルノ10〜40%(V/
V)水溶液の匂配液で溶出するバイダックC−18カラムで精製し。
減圧下で乾燥させた。生成物を水に溶解するか、または適切な水溶液に溶解して
分析もしくはその他の用途に用いた。
まったく同じ方法を用いて、 Boc−L−Arg (NO2) DHを最初に
3oc−L Arg (NO2) CNI(2に変換し1次いでt(L Arg
(NO□)CH2C1・tlClに変換した。
を、 L−(0−t−ブチル)−ThrOMe(0,Olmol)に結合させて
、 N−a−cbz−β−t−ブチルエステル−L−AsP−L−(0−t−ブ
チル)−ThrOMeを形成させ、これを、 cbz−L−Asn−L−(0
−t−ブチル)−Thrillの調製について実施例8で略記した方法を用いて
、脱エステル化し、 N−α−cbz−β−t−ブチルエステル−L−Asp−
L−(0−t−ブチル)−Thr叶を得た。
H−L−Asp−L−Thr−L−Arg−CMKの調製 予め調製した保護化
ジペプチドであるN−α−cbz−β−t−ブチルエステル−L−Asp−L
(0−t−ブチル)−ThrOH(2,On+mol)を、N−メチルモルホリ
ン(2,immol)の存在下、0℃で20分間クロルギ酸イソブチル(2,1
ssol)と反応させた。H−L−Arg(No□)C)IzCl・HCl (
2−Ommol)のジメチルホルムアミド(4yd)溶液を滴下した。0℃で2
0分間攪拌後。
N−メチルモルホリン<2.0ssol)のT)IF溶液を添加した。得られた
溶液を、0℃でさらに40分間1次いでRTで1時間攪拌した。得られた反応混
合物を水と食塩水(各25rrilずつ)で希釈し、酢酸エチルで2回(各25
m1ずつ)抽出した。合わせた有機層を10%クエン酸、飽和NaHCO3およ
び食塩水(各15mfずつ)で洗浄して、 Mg5O<で乾燥させ1次いで減圧
下で溶媒を除去してN−a−cbz−β−t−ブチルエステル−L−Asp−L
−(0−t−ブチル)−Thr−L−Arg(NO2)CLCIを得た。生成物
をHP (7mf)とアニソール(0,5rrL1)とで0℃にて20分間処理
した。肝を除いた後。
残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで2回(各5rniずつ)洗浄した。有
機揮発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製の)l−L−Asp−L−Thr
−L−Arg−CMK・2HFを凍結乾燥させて粉末とした。生成物の粗精製を
、0〜1.ON llClの段階的匂配液を用いるセファデックス5P−C25
(H+形)カラムで行い、 H−L−Asp−L−Thr−L−Arg−CMK
・2HC1を得た。さらに生成物を、10〜50%(V/V)のヘキサン/イソ
プロパツール(10%メタノール)匂ス崖■刊: H−L−His−L−Thr
−L−^r−ChKの人配液で溶出するスペルコL(:NH2カラムで精製し、
減圧乾燥させた。生成物は360Mflzの’■NMRによって特性決定された
。生成物を、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解して分析もしくはその
他の用途に用いた。
Asp−0−Bzl−Thr−DH(1mmol)を、 5m7!のTIP中
のN−メチルモルホリン(1ssol)と−20℃で10分間反応させた。5r
n1の冷却したN、N−ジメチルホルムアミドに溶解したH Arg(NO2)
CH2C1・HCI (l mmol)を、前記の混合無水物の調製物に添加し
た。
15分後にトリエチルアミン(1ssol)を含有する冷却THF (20ml
)を添加した。−20℃で1時間1次いで室温で2時間攪拌後1反応混合物を濾
過し、濾液を酢酸エチル中に懸濁させ。
酢酸エチル層を水で洗浄し次いで蒸発乾固した。得られた粗生成物をHP解離剤
〔アニソール:粗精製物:HF (1: 1 :10)]でO0にて60分間処
理して脱保護を行い、粗生成物の水性懸濁液をエーテルで3回洗浄し9次いでク
ロロホルムで3回洗浄した。合わせた有機層を、 0−IN HCI、水、
IM K2CO,および飽和NaC1で順に洗浄し、 Mg5Onで乾燥させ
、溶媒を減圧除去した。生成物を、0.1%(V/V)のTFAを含有する10
〜40%(V/V)アセトニトリル水溶液の匂配液で溶出するバイダックC−1
8カラムで精製し、減圧乾燥させた。生成物を、水もしくは適切な水溶液に溶解
して分析もしくは他の用途に用いた。
各々25dずつ)で希釈し、酢酸エチルで2回(各25dずつ)a″″ い
るペプチドA
H−L−Ar No CI Cl−HClのf ′1 実施例8に記載した
のと全く同じ方法を用いて、 Boc−L−Arg(NOx)O)lを最初にB
oc−L−Arg(NOx)CN)1zに変換し9次いでll−L−Arg(N
Oz)CHzCl−FICIに変換した。
N−α−cbz−N−im−トシルーL−His−L−(0−t−ブチル)−T
hrOHの81N−α−Cbz−N−i+*−トシルーL−FIisOH(0,
01sol)をL−(0−t−ブチル)−ThrOMe (0,01sol)に
結合させて、 N−cr−cbz−N−is−トシル−L−His−L−(0−
t−ブチル)−ThrOMeを形成させ、 cbz−L−Asn−L−(0−t
−ブチル)−Throl(の調製について実施例8に概略説明した方法を用いて
、カップリング工程でのN−ヒドロキシベンゾトリアゾールの使用を省略して9
上記のN−α−cbz−N−im−トシルーL−His−L−(0−t−ブチル
)−ThrOMeを脱エステル化して、 N−α−cbz−N−is−トシルー
L−His−L−(0−t−ブチル)−ThrOHを得た。
H−L−His−L−Thr−L−Ar −CMKの量 予め調製した保護化
ジペプチドであるN−cr−cbz−N−im−トシル−し−旧5−L−(0−
t−)゛チル)−ThrOH(2,0+*mol)を、N−メチルモルホリンの
存在下,クロルギ酸イソブチル(0.29m.2.1ssol)と、o℃テ20
分間反応させた, H−L−Arg(Not)CHxCl−HCI(0.60g
,2.0ssol)のジメチルホルムアミド(4m)溶液を滴下した。0″Cで
20分間攪拌した後,N−メチルモルホリン(0.22m, 2.0mmol)
のTHF溶液を添加した。得られた溶液を0℃でさらに40分間撹拌し。
次いでRTで1時間攪拌した.反応混合物を水および食塩水(抽出した。酋わせ
た有機層そ,lυ%クエン殻.妃和NaHCU,および食塩水(各15dずつ)
で洗浄し, MgSO4で乾燥させ.そして溶媒を減圧下で除去してN−αー
cbzーNーi+mートシルーL−His−L−(0−t−ブチル)−Thr−
L−Arg(NOx)CHzClを得た。生成物を, 8F(7d)とアニソー
ル(0.5m)とで、0℃にて20分間処理した。
IPを・除去した後.残渣を冷水で希釈し.ジエチルエーテルで2回(各5II
iずつ)洗浄した.有機揮発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製のH−L−
His−L−Thr−L−Arg−CMK−2HFを凍結乾燥させて粉末とした
。生成物の粗精製を.O〜1,O NHCIの段階的勾配液を用いるセファデッ
クスsp−c25(II”形)カラムで行い, H−L−His−L−Thr−
L−Arg−CMK−2HCIを得た。得られた生成物を,さらに、10〜50
%V/Vヘキサン/イソプロパツール(10%メタノール)勾配液で溶出するス
ペルコt,cNnzカラムで精製し,減圧乾燥させた。生成物は360MHzの
′HNMRで特性決定された.生成物は,水.メタノールもしくは適切な水溶液
に溶解させて,分析もしくはその他の用途に用いた。
法を いるペプチド人
H−L−Ar (NO )CI CI−HCIの量 実施例8(口)参照。
II−His−Thr−Ar−CMKの1 予め調製したペプチドであるN−
αーBocーNーisーCbz−His−0−Bzl−ThrOH(lsmo
l)を、 TIiF Sd中のN−メチルモルホリン(1ssol)と−20℃
で10分間反応させた。
冷却したN.N−ジメチルホルムアミド5I11に溶解したH−Arg (NO
x)CIICI −HCl (1−■ol)を前記混合無水物の調製物に添加し
た.15分後に、トリエチルアミン(1+u+ol)を含有する冷却THF (
20d)を添加した。−20°Cで1時間1次いで室温で2時間攪拌した後1反
応混合物を濾過した。その濾液を酢酸エチル中に懸濁させ、酢酸エチル層を水で
洗浄し、蒸発乾固した。粗生成物を、HF解離剤〔アニソール:粗生成物: 1
(F(1:1:10) )で、60分間、0°Cで処理して脱保護化し、粗生成
物の水性懸濁液をエーテルで3回洗浄し1次いでクロロホルムで3回洗浄した。
合わせた有機層を、 O,lN HCI 、水、 IM K、Co3および飽
和NaC1で順番に洗浄し、 Mg5O,で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し
た。生成物を、0.1%(V/V)のTFAを含有するアセトニトリルの10〜
40%(V/V)水溶液の勾配液で溶出するバイダックC−18カラムで精製し
、:$i圧乾燥させた。生成物を水もしくは適切な水溶液に溶解して2分析もし
くはその他の用途に用いた。
実施■旦: H−L−Leu−L−Thr−L−Ar −CMKの4(ar”
法を いるペプチド人
)!−L−Ar (No2)CHzC141C1の二 + 実施例8に記載した
のと全く同じ方法を用いて、 Boc−L−^rg−(NOx)OHを最初にB
oc−L−Arg−(N(h)CNHzに変換し1次いでH−L−Arg(N(
h)CHzCl・HClに変換した。
Cbz−L−Leu−L−(0−t−ブチル)−ThrO)lのQ Cbz−
L−LeuO)1(0,01sol)をL−(0−t−ブチル)−ThrOMe
(0,01sol)に結合させて。
Cbz−L−Leu−L−(0−t−ブチル)−ThrOMeを形成させ、これ
を、 Cbz−L−^5n−L−(0−t−ブチル)−ThrOHの調製につい
て実施例8で概略説明した方法を用いて脱エステル化して、 Cbz−L−Le
u−L−(0−t−ブチル)−ThrOHを得た。
H−L−Leu−L−Thr−L−Ar −CMKの81 予め調製した保護化
ジペプチドであるCt+z−L−Leu−L−(0−t−ブチル)−ThrO)
! (2,On+mol)を。
N−メチルモルホリン(0,241d、2.1wa+ol)の存在下、クロルギ
酸イソブチル(0,29d、2.1ms+ol)と、0°Cで20分間反応させ
た。H−L−Arg(NOx)CHzCl・HCI (0,6g、2.0+++
mol)のジメチルホルムアミド(4d)溶液を滴下した。0°Cで20分間攪
拌した後。
N−メチルモルホリン(0,22I11.2.0ms+ol)含有のT)IFを
添加した。得られた溶液を0°Cでさらに40分間攪拌し9次いでRTで1時間
撹拌した。反応混合物を水と食塩水で希釈しく各25dずつ)、酢酸エチルで2
回(各25M1ずつ)抽出した。合わせた有機層を、10%クエン酸、飽和Na
HCO3および食塩水(各15dずつ)で洗浄し、 Mg5O,で乾燥させ、
溶媒を減圧下で除去して、 Cbz−L−Leu−L−(0−t−ブチル)−T
hr−L−Arg(NOx)CHzClを得た。生成物をHF(7I11りとア
ニソール(0,5Inl)とで、0″Cで20分間処理した。IFを除去した後
、残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで2回(各5dずつ)洗浄した。有機
揮発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製H−L−Leu−L−thr−L−
Arg−CMK−2HFを凍結乾燥させて粉末とした。生成物の粗精製を、0〜
1.ON )IcIの段階的勾配液を用いるセファデックス5P−C25()l
”形)カラムで行い、 H−L−Leu−L−Thr−L−Arg−CMK−
2HC1を得た。生成物を、10〜50%(V/V)のヘキサン/イソプロパツ
ール(10%メタノール)勾配液で溶出するスベルコLCNHzカラムでさらに
精製し、減圧下で乾燥させた。360MHzの’HNMRによって生成物の特性
を決定した。生成物を、水、メタノールまたは適切な水溶液に溶解して2分析も
しくはその他の用途に用いた。
Φ 法を いるペプチド人
)1−Ar (N(h)CHzCI−)ICIの10′1 予め調製したペプチ
ドであるBoc−Leu−0−Bzl−Thr−0)1 (1mo+ol)を、
T)IF5d中のN−メチルホリン(1,mmol)と−20°Cで10分間反
応させた。5dの冷却したN、N−ジメチルホルムアミドに溶解したH−Arg
(N(h)CHzCl −HCI(Immol)を前記混合無水物の調製物に
添加した。15分後にトリエチルアミン(Immol)を含有する冷却T)IF
(20d)を添加した。−20°Cで1時間2次いで室温で2時間攪拌した後2
反応混合物を濾過した。その濾液を酢酸エチル中に懸濁させ。
酢酸エチル層を水で洗浄し1次いで蒸発乾固した。得られた粗生成物をHF解離
剤〔アニソール:粗生成物: IF(1:1:10) )で0°Cで60分間処
理して脱保護化し、粗生成物の水性懸濁液をエーテルで3回洗浄し1次いでクロ
ロホルムで3回洗浄した。有機層を合わせて、 0.1N HCI、水、 IM
KzCO3および飽和NaC]で順に洗浄し、 Mg5O,で乾燥させ、溶媒
を減圧下で除去した。生成物を、0.1%(V/V) TFAを含有するアセト
ニトリルの10〜40%(V/ν)水溶液の勾配液で溶出するバイダックc−1
8のカラムで精製し、減圧下で乾燥させた。生成物を水もしくは適切な水溶液に
溶解して1分析もしくはその他の用途に用いた。
実h」比1H−L−Gln−L−Thr−L−Ar −CMKのAa′六S ′
いるペプチド人
H−L−Ar (No CHC1−HClのi、′「Boc−L−Arg(N
ot)0)1を、実施例8に記載したのと全く同様の方法を用いて、最初にBo
c−L−Arg(NOx)CNHzに変換し1次いで、 H−L−Arg(NO
x)CHzCl−HClに変換する。
Cbz−L−Gln−L−(0−t−ブチル)−ThrOHの富、′Cbz−L
−G1nOH(0,01sol)を、 L−(0−t−ブチル)−ThrOMe
(0,01sol)に結合させて、 Cbz−L−Gin−L−(0−t−ブ
チル)−ThrOHを形成させ1次し1でこの生成物を、 Cbz−L−^5n
−L−(0−t−ブチル)−ThrOHの調製について実施例8で概略説明した
方法を用いて脱エステル化し、 Cbz−L−Gln−L−(0−t−ブチル)
−ThrOHを得る。
H−L−Gln−L−Thr−L−Ar−CMKのia′ 予め調製した保護
化ジペプチドであるCbz−L−Gln−L−(0−t−ブチル)−ThrOH
(2,0++uwol)を、N−メチルモルホリン(0,241R1,2,Im
mol)の存在下、クロルギ酸イソブチル(0,29d、2.1omol)と0
°Cで20分間反応させる。H−L−Arg(NOz)CHzCl−HCI (
0,60g、2.Ommol)のジメチルホルムアミド(4d) 溶液を滴下す
る。0°Cで20分間攪拌した後、N−メチルモルホリン(0,22d、2.抛
mol)のTHF溶液を添加する。得られた溶液を、0°Cでさらに40分間攪
拌し9次いでRTで1時間攪拌する。反応混合物を水と食塩水(各25M1ずつ
)で希釈し、酢酸エチルで2回(各25Jdずつ)抽出する。
有機層を合わせて、10%クエン酸、飽和NaHCO3および食塩水(各15d
ずつ)で洗浄し、 MgSO4で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、 Cbz
−L−Gin−L−(0−t−ブチル)−Thr−L−Arg(NOx)CHz
Clを得る。生成物を、肝(7d)とアニソール(o、511I1.)とでo″
cにて20分間処理する。)IPを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチル
エーテルで2回(各5dずつ)洗浄する。有機揮発成分を減圧下で除去し、得ら
れた粗精製H−L−Gln−L−Thr−L−Arg−CMK・2)IFを凍結
乾燥させて粉末とする。生成物の粗精製を、0〜1.0 N HCIの段階的勾
配液を用いるセファデックス5P−C25(H”形)カラムによって行ない、
H−L−Gin−L−Thr−L−Arg−CMK−2HC1を得る。生成物を
、 10〜50%(V/ν)ヘキサン/イソプロパツール(10%メタノール)
勾配液で溶出するスペルコLCNH,カラムでさらに精製し、減圧乾燥させる。
生成物は360MHzのIHNMRで特性決定させる。生成物を、水、メタノー
ルもしくは適切な水溶液に溶解して1分析もしくはその他の用途に用いる。
伽 法を いるペプチド人
Fl−L−Ar (NOt)CI C14C1のt、′「 実施例8 (b)
参照。
H−Gin−Thr−^r−CMKのU 予め調製したペプチドであるBoc
−Gin−0−Bzl−Thr−OH(IIIIn+ol)を、 THF SI
d中のN−メチルモリホリン(IIIIIlol)と−20°Cで10分間反応
させる。5−の冷却したジメチルホルムアミドに溶解したH−Arg(N(h)
CHzC14C1(1+i+*ol)を、・前記混合無水物の調製物に添加する
。15分後に。
トリエチルアミン(1m+5ol)含有の冷却したTHF (20d)を添加す
る。−20℃で1時間2、次いで室温で2時間攪拌した後。
反応混合物を濾過した。その濾液を酢酸エチル中に懸濁させ。
酢酸エチル層を水で洗浄し9次に蒸発乾固する。粗生成物を。
在下、クロルギ酸イソブチル(0,29IIIl、2−1n+mol)と0°C
で20ノxww I;ピー −IP LL フ 1雷 豐 烏
−7−1八 −ハ11 ^11瞥n噛 l^ −^ @^ 八
1\ ^
肝解離剤〔アニソール:粗生成物: HF(1:1:10) ) テO’Cニテ
60分間処理して脱保護化し、粗生成物の水性懸濁液をエーテルで3回洗浄し2
次にクロロホルムで3回洗浄する。有機層を合わせて、 0.1N HCI、
水、 LM K、CO,および飽和NaCl T:順に洗浄し、 Mg5O
,で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去する。
生成物を、0.1%(V/V)のTFAを含有するアセトニトリルの10〜40
%(V/V)水溶液の勾配液で溶出するバイダックC−18カラムで精製し、f
Ii圧下で乾燥させる。生成物を水もしくは適切な水溶液に溶解して2分析もし
くはその他の用途に用いる。
H−L−Ar (NOx)CHzCl−HClo)il ’ Boc−L−A
rg(NOx)OBを、実施例8に記載したのと全く同じ方法を用いて、最初に
Boc−L−Arg(NOx)CNHzニ変換し1次イテH−L−Arg (N
O2)CHzCl 4C1に変換する。
Cbz−L−(0−t−ブチル)−Thr−L−(0−t−ブチル) −Thr
OHの: 1Cbz−L−(0−t−ブチル)−ThrOH(0,01mol)
を、 L−(0−t−ブチル)−ThrOMe (0,01wol)に結合させ
て、 Cbz−L−(0−t−ブチル)−Thr−L−(0−t−ブチル)Th
rOMeを形成させ1次いでこの生成物をCbz−L−Asn−L−(0−t−
ブチル)−ThrOHの調製について実施例8に概略説明し4た方、法を用いて
脱エステル化して、 Cbz−L−CO−t−ブチル) 4hr−L−(0−t
−ブチル)−ThrOHを得る。
H−L−Thr−L−Thr−L−Ar −CMKのU 予め調製した保護化
ジペプチドであるCbz−L−(0−t−ブチル)−Thr−L−(0−t−ブ
チル)−ThrOH(2,0mm+ol)を、N−メチルモルホリン(0,24
ad!、2.1w@ol)の存H−L−Ar (NO)CHC1−)1cIの−
リ 実施例8(b)参照。
分闇反沁させる。H−L−Arg(N(hンCJIzC1・、HCJ (0,6
0g、2.Oma+ol)のジメチルホルムアミド(4j11)溶液を滴下する
。0°Cで20分間攪拌した後、N−メチルモルホリン(0,22m 、 2.
01111101)含有のTHF溶液を添加する。得られた溶液を、0℃でさら
に40分間。
次いでRTで1時間攪拌する。得られた反応混合物を水と食塩水(各25dずつ
)で希釈し、酢酸エチルで2回(各25dずつ)抽出する。合わせた有機層を、
10%クエン酸、飽和NaHCO,および食塩水(各15adずつ)で洗浄し
、 Mg5O,で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、 Cbz−L−(0−t−
ブチル)−Thr−L−(0−t−ブチル)−Thr−L−Arg(NOx)C
HxClを得る。生成物を、 HF(7d)とアニソール(0,5d)とで0℃
にて20分間処理する。HPを除去した後。
残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで2回(各5dずつ)洗浄する。有機揮
発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製H−L−Thr−L−Thr−L−A
rg−CMK−2HFを凍結乾燥させて粉末とする。
生成物の粗精製を0〜1.0 N HCIの段階的勾配液を用いるセファデック
ス5P−C25(H”形)カラムで行い、 H−L−Thr−L−Thr−L−
/lrg−CMK・2HC1を得る。生成物を、10〜50%(v/v)ヘキサ
ン/イソプロパツール(10%メタノール)勾配液で溶出するスペルコLCNH
zカラムでさらに精製し、減圧乾燥させる。生成物は、 360MHzの’HN
MRによって特性決定される。生成物を水。
メタノールまたは適切な水溶液に溶解して2分析もしくはその他の用途に用いる
。
いるペブチ゛4
n−111r−1111−−L−Mr −Ll「l轟V−丁6’J 1lil
表L/ 1こヘノア「CのΦBoc−0−Bzl−Thr−0−Bzl−Thr
−OH(1mmol)を、 THF 511d!中のN−メチルモルホリン(1
mmol)と−20℃で10分間反応させる。5戚の冷却したN、N−ジメチル
ホルムアミドに溶解したH−Arg(NO□)CHICI−HCI (1ss+
01)を前記混合無水物の調製物に添加する。15分後に、トリエチルアミン(
1mmol)を含有する冷却したTHF(20m)を添加する。−20℃で1時
間1次いで室温で2時間攪拌した後1反応混合物を濾過し、その濾液を酢酸エチ
ル中に懸濁させ、酢酸エチル層を水で洗浄し1次いで蒸発乾固する。得られた粗
生成物をIP解離剤〔アニソール:粗生成物:HF(1: 1:10)〕でO℃
にて60分間処理して脱保護化し、粗生成物の水性懸濁液をエーテルで3回洗浄
し2次いでクロロホルムで3回洗浄する0合わせた有機層を、 0.I N H
CI、水、 IM KzCOlおよび飽和NaClで順に洗浄し、 Mg5
O,で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去する。生成物を、0.1%(V/V) T
FAを含有するアセトニトリルの10〜40%(V/V)水溶液の勾配液で溶出
するバイダックC−18カラムで精製し、減圧下で乾燥させる。生成物を水もし
くは適切な水溶液に溶解して2分析もしくはその他の用途に用いる。
(以下余白)
実施例14 : tl−L、−Thr−L−Arg−CMKの合成正確に同じ方
法を用いて、所望のクロロメチルケトンを調製することができる。
H−L−Thr−L−Arg−CMKの調製 Cbz−L−(0−t−ブチル)
−ThrOH(2、Ommol)を、N−メチルモルホリン(0,24mA、
2.1mmol>の存在下で、クロルギ酸イソブチル(0,29m1. 2.
1mmol)と、0℃で20分間反応させる。トL−Arg(NO2)CH2C
l−HCl (0,60g、2.Ommol>のジメチルホルムアミド(4d)
溶液を滴下する。0℃で20分間攪拌した後、N−メチルモルホリン(0,22
nl、 2.0+nmof)のTHF溶液を添加する。得られた溶液を、0℃で
さらに40分間次いでRTで1時間攪拌する。反応混合物を水と食塩水(各25
rdずつ)で希釈し、酢酸エチルで2回(各25m1.ずつ)抽出する。配合し
た有機層を、10%クエン酸溶液、飽和NaHCOa溶液および食塩水(各15
rILlずつ)で洗浄し、 Mg5Onで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、
Cbz−L−(0−t−ブチル)−Thr−L−Arg(N[1,)CH2Cl
を得る。生成物を、肝(7蔵)とアニソール(0,5m1)とで0℃にて20分
間処理する。IFを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで2回
(各5rrLlずつ)洗浄する。
有機揮発成分を減圧下で除去し9次いで得られた粗精製のH−L−Thr−L−
Arg−CMK−211Fを凍結乾燥させて粉末にする。生成物を。
0〜1.ON )It:Iの段階的勾配液を用いるセファデックス5P−C25
(H”形)カラムで粗精製して、 H−L−Thr−L−Arg−4:MK・2
HCIを得る。生成物を、10〜50%(V/V)ヘキサン/イソプロパツール
(10%メタノール)勾配液で溶出するスペルコL CN tl□カラムでさら
に精製し、減圧下で乾燥する。生成物を360MHzの’HN畦で特性決定をす
る。生成物を、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解して分析もしくはそ
の他の用途に用いる。
実施例15 : H−D−Leu−L−Thr−り−Arg−CMKの合成Cb
z−D−LeuOHをそのし一異性体の代わりに用いること以外は。
実施例11に記載したのと同様にして、 H−D−Leu−L−Thr−L−A
rg−CMKを合成した。
く同じ方法を用いて、 Boc−L−Arg(NOz)叶をまずBoc−L−A
rg (NO2)CNH2に変換し9次いでI(−L−Arg(NOz)Ct1
2C1−HCIに変換した。
Cbz−D−PheOH(0,Olmol)をL−(C1−t−ブチル)−Th
rOMe (0,Olmol)に結合させてCbz−D−Phe−L−(0−t
−ブチル)−ThrOMeを調製し1次いでこの生成物を、 Cbz−L−As
n−L−(0−t−ブチル)−Thr[lHの調製について実施例8に概略説明
した方法を用いて脱エステル化してCbz−D−Phe−L−(0−t−ブチル
)−ThrOHを得た。
)1−D−Phe−L−Thr−L−Arg−CMKの調製 予め調製した保護
化ジペプチドのCbz−D−Phe−L−(0−t−ブチル)−ThrOH(2
,Ommol)を。
クロルギ酸イソブチル(0,29mj!、 2.1mmol)と、N−メチルモ
ルホリン(0,24nl、 2.1mmol)の存在下で、0℃で20分間反応
させた。H−L−Arg(Now)CH2Cl−HCI (0,60g、 2.
Ommol)のジメチルホルムアミド(4ml)溶液を滴下した。0℃で20分
間攪拌した後、N−メチルモルホリン(0,22m12.2. Ommol)の
THF溶液を添加した。得られた溶液を、0℃でさらに40分間次いでRTで1
時間攪拌した。反応混合物を水と食塩水(各25m1ずつ)で希釈し、酢酸エチ
ルで2回(各25rnI!、ずつ)抽出した。有機層を合せて10%のクエン酸
溶液、飽和NatlCO3および食塩水(各15m1ずつ)で洗浄し、 Mg
5Oiで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去してCbz−D−Phe−L−(0−t
−ブチル) Thr−L−Arg(NO2)(:H2C1を得た。
生成物をHF(71nl)とアニソール(0,5mf)とで、0℃にて20分間
処理した。HFを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで2回(
各5−ずつ)洗浄した。有機揮発成分を減圧下で除去し1次いで得られた粗精製
のH−D−Phe−L−Thr−L−Arg−CMK・211Fを凍結乾燥させ
て粉末とした。生成物を、 0〜1、ON )HClの段階的勾配液を用いるセ
ファデックス 5P−C25(]1゛形)カラムで粗精製を行い、 tl−D−
Phe−L−Thr−L−Arg−(1:MK’2H[:1を得た。生成物を、
10〜50%(V/V)ヘキサン/イソプロパツール(10%メタノール)勾配
液で溶出するスペルコLCN)12カラムでさらに精製し、減圧で乾燥させた。
生成物を360MHzの1HNMRで特性決定を行った。生成物を、水、メタノ
ールもしくは適切な水溶液に溶解して分析もしくはその他の用途に用いた。
実施例17 : Ac−L−Leu−L、−Thr−L−八rg−CMKの合成
tl−L−Leu−L−Thr−L−Arg−CMKを実施例4に記載したのと
同様にして合成した。得られたH−L−Leu−L−Thr−L−Arg−CM
Kの361.1m0I(水でldにした16.4mg)に、1当量のIN Na
OHを添加し。
次いで30%過剰の無水酢酸と、さらに1当量のIN NaOHとを加えた。得
られた溶液を2時間インキュベートし、凍結乾燥させて、セファデックス5P−
C25カラムで精製した。生成物を360MHzの’HNMRで特性を決定した
。
H−L−Leu−L−Thr−L−Arg−CMKを実施例4に記載したのと同
様にして合成した。得られたH−L−Leu−1、−Thr−L−Arg−(:
MKの43.cIrnol(水で1rnlにした19.8mg)に、1当量のI
N NaOH、1,4当量のトシル(トルエンスルホニル)塩化物、 2mj
2のアセトニトリルふよび追加の1当量のIN NaOHを順に添加した。得ら
れた溶液を攪拌し9次いで6時間静置し9次いでアセトニトリルをロータリーエ
ヴアボレーションさせて除去した。生成物をクロマトグラフィで精製し9次いで
360Mtlzの’HNMRで特性を決定した。
H−L−Leu−L−Thr−L−Arg−CMKを実施例4に記載したのと同
様にして合成した。得られたH−L−1、eu−L−Thr−L−Arg−CM
Kの37Jsol(0,3−の水を添加した17■)に、1当量のIN NaO
H、1,4当量のダンシル(5−ジメチルアミノナフタレンスルホニル)塩化物
、0.5mlのアセトニl−IJルおよび追加の1当量のIN Na叶を順に添
加した。攪拌した後、得られた溶液をRTで6時間静置し9次いで一20℃で1
6時間インキュベートした。アセトニトリルを[]−タリーエヴアポレーション
によって除去した。
生成物をクロマトグラフィで精製し1次に360MHzの’II NMRで特性
決定をした。
確に同じ方法を用いて、 Boc−L−Arg (NO2) OHを最初にBo
c−L−Arg(NO2)CNII2に変換し9次にHL−Arg(NO2)C
HzCl・HCIに変換した。
Cbz−L−Leu−L−(Q−t−ブチル)−SetOf(の調製 CBz−
L−Leu[lH(0,Olmol)をL−(0−t−ブチル)−SerOMe
(0,Olmol)に結合させてCbz−L−Leu−L−(0−t−ブチル)
−SetOleを調製し9次に[:bz−L−Asn−L−(0−t−ブチル)
−ThrOHの調製について実施例8に概略記載した方法を用いて、脱エステル
化してCbz−L−Leu−L−(0−t−ブチル)−3erGtlを得た。
トL−Leu−L−Ser−L−Arg−CMKの調製 予め調製した保護化ジ
ペプチドのCbz−L−Leu−L−(0−t−ブチル)−3erOfl (2
,0II1mol)を、 N−メチルモルホリン(0,24m1.2.1mmo
l)の存在下、0℃で20分間、クロルギ酸イソブチル(0,29rr11.2
.1mmol)と反応させた。
HL−Arg(NOx)Cf12CI−HCI (0,60g%2゜Ommol
)のジメチルホルムアミド(41rL1)溶液を滴下した。0℃で20分間攪拌
した後。
N−メチルモルホリン(0,22rF11.2.Ommol)のTIF溶液を添
加した。得られた溶液を0℃でさらに40分間1次いでRTで1時間攪拌した。
得られた反応混合物を水と食塩水(各25dずつ)で希釈し、酢酸エチルで2回
(各25mfずつ)抽出した。有機層を合せて、 10%のクエン酸溶液、飽和
Na)lcO*および食塩水(各15rnlずつ)で洗浄し、 MgSO4で
乾煙させ、溶媒を減圧下で除去してCbz−L−Leu−L−(0−t−ブチル
)−Set−L−Arg (NO2)CH,C1を得た。この生成物をl(F(
7mliりとアニソール(0,5mf)とで。
0℃にて20分間処理した。IFを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチル
エーテルで2回(各5r111ずつ)洗浄した。有機揮発成分を減圧下で除去し
、得られた粗精製のトL−Leu−L−3er−L−Arg−CMK・2HPを
凍結乾燥させて粉末とした。生成物の粗精製を、 θ〜1.0 N 1(CIの
段階的勾配液を用いるセファデックx 5P−C25(H+形)カラムによって
行って、 H−L−Leu−L−3er−L−Arg−CMK・2HC1を得た
。コノ生成物を、10〜50%(v/v)ノヘキサン/イソプロパツール(10
%メタノール)勾配液で溶出するスペルコLCNH2カラムでさらに精製し、減
圧で乾燥させた。
生成物を360Mtlzの’II NMRで特性を決定した。生成物を、水。
メタノールもしくは適切な水溶液に溶解し9分析もしくはその他の用途に用いた
。
全く同様にして、 Boc−L−八rg(No2)OHを、まずBoc−L−A
rg (NO2)CNI(2に変換し1次にH−L Arg(Now)CH2[
:l・Hclに変換した。
Cbz−L−Leu−L−ProOHの調製 Cbz−L−LeuOH(0,O
lmol)をL−ProOMe (0,Olmol)に結合させて、 Cbz−
L−Leu−L−ProOMeを調製し1次いでCbz−L−Asn−L−(0
−t−ブチル)−ThrOf(の調製について実施例8に概略説明した方法を用
いて脱エステル化してCbz−L−Leu−L−ProOHを得た。
H−L−Leu−L−Pro−L−Arg−CMKの調製 予め調製された保護
化ジペプチドの、 Cbz−L−Leu−L−Prool((2,Ommol)
を、N−メチルモルホリン(0,24rn1.2.1mmol)の存在下、クロ
ルギ酸イソブチル(0,29n+1. 2.1mmol)と反応させた。H−L
−Arg(NO2)C112C1−HCI (0,60g、2.Ommol>の
ジメチルホルムアミド(4ml)溶液を滴下した。0℃で20分間攪拌した後、
N−メチルモルホリン(0,22mj?、 2.Ommol)のTIF溶液を添
加した。得られた溶液を0℃でさらに40分間9次いでRTで1時間攪拌した。
反応混合物を水と食塩水(各25dずつ)で希釈し、酢酸エチルで2回(各25
m1ずつ)抽出した。有機層を合せて10%のクエン酸溶液、飽和NaHCO,
および食塩水(各15dずつ)で洗浄し、 MgSO4で乾煙し、溶媒を減圧下
で除去して、 Cbz−L−Leu−L−Pro−Arg(NO2)[:1(2
C1を得た。生成物をIF(7mf)とアニソール(0,5mjlりとで。
0℃にて20分間処理した。HPを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチル
エーテルで2回(各5rILlずつ)洗浄した。有機揮発成分を減圧下で除去し
9次いで得られた粗精製H−L−Leu−L−Pro−L−Arg−CMK・2
HFを凍結乾燥させて粉末とした。生成物の粗精製を、0〜1.ON HCIの
段階的勾配液を用いるセファデックス 5P−C25(I(+形)カラムによっ
て行い、 H−L−Leu−L−Pro−L−Arg−CMK−2)ICIを得
た。コノ生成物を、10〜50%(v/v)ヘキサン/イソプロパツール(10
%メタノール)勾配液で溶出するスベルコLCNH,カラムでさらに精製し9次
に減圧乾燥した。生成物を360MHzの’HNMRで特性決定した。生成物を
、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解し9分析もしくはその他の用途に
用いた。
)1−Arg(NO,)CH,C1−H[:tの調製 実施例8に記載したのと
全く同じ方法を用いて、 Boc−L−Arg (NO2)口Hを、最初にBo
c−L−Arg(NOi)CNt12に変換し次にH−L−Arg(NO,)C
)1.CI・HClに変換した。
Cbz−L−Asn−L−(0−t−ブチル)−Serol(の調製 Cbz−
L−AsnOtl (0、Olmol>をL−(0−t−ブチル)−3erOM
e (0,Olmol)に結合させてCbz−L−Asn−L−(0−t−ブチ
ル)−3erOMeを形成させ1次いでCbz−L−Asn−L−(0−t−ブ
チル)−ThrOHの調製について実施例8に概略説明した方法を用いて脱エス
テル化して、 Cbz−L−Asn−L−(0−t−ブチル)−SerOHを得
た。
H−L−Asn−L−Ser−L−Arg−CMKの調製 予め調製した保護化
ジペプチドの、 Cbz−L−Asn−L−(0−t−ブチル)−3erOH(
2,Ommol>を。
N−メチルモルホリン(0,24m1.2.1mmol)の存在下、クロルギ酸
イソブチル(0,29mj7. 2.1mmol)と0℃で20分間反応させた
。H−L−Arg(NO2)C1,CI・flCl (0,60g、2.Omm
ol>のジメチルホルムアミド(4m17)溶液を滴下した。0℃で20分間攪
拌した後。
N−メチルモルホリン(0,22−、2,0mmo 1>のTHF溶液を添加し
た。得られた溶液を0℃でさらに40分間1次にRTで1時間攪拌した。反応混
合物を水と食塩水(各25mfずつ)で希釈し。
酢酸エチルで2回(各25−ずつ)抽出した。有機層を合せて10%のクエン酸
溶液、飽和NaHCOs溶液および食塩水(各15mj2ずつ)で洗浄し、 M
gSO4で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し。
Cbz−L−Asn−L−(0−t−ブチル)−3er−L−Arg(NO2)
(J12C1を得た。生成物をIIP(7mjりとアニソール(0,5mf)と
で、0℃にて20分間処理した。HFを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエ
チルエーテルで2回(各51n1.ずつ)洗浄した。有機揮発成分を減圧下で除
去し9次いで得られた粗精製H−L−Asn−L−Ser−L−Arg−CMK
・2)IFを凍結乾怪させて粉末とした。生成物の粗精製を、0〜1.ON H
CIの段階的勾配液を用いるセファデックス 5P−C25()l+形)カラム
で行いH−L−Asn−L−3er−L−Arg−CMK’2CIを得た。生成
物を。
10〜50%(V/V)ヘキサン/イソプロパツール(10%メタノール)勾配
液で溶出するスベルコLCNH2カラムでさらに精製し。
減圧乾燥した。生成物を360Mtlzの’II NMRで特性を決定した。
生成物を、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解し。
分析もしくはその他の用途に用いた。
実施例23:凝固阻害性
正常のヒトの血漿を、試験管中で、 0.02Mのクエン酸ナトリウム、 0.
14M NaC1p87.4によって1=3の容積比で希釈した。次いで希釈さ
れた血漿(IOM>を、lX1O’細胞/rn1のJ82細胞100AL1と、
100dの阻害剤とを混合した。20mMの塩化カルシウム100扉を添加
して濁り始めるのを肉眼観察することにより血漿の凝固時間を得た。結果を表4
に示す。ヒト血漿の凝固時間は、 (阻害剤が存在しないと仮定して)計算され
たTF活性のミリ単位で示した。データは、 LTR−CMKが。
[TF :■/■a〕複合体による凝固のタンパク分解活性化の有効な阻害剤で
あることを示している。
(以下余白)
表4
正常なヒトの血漿の凝固に対するLTR−CMK”の比阻害性”LTR−CMK
は、 H−L−Leu−L−Thr−L−Arg−りooメチルケトンを示す。
O阻害剤が存在しないと仮定した場合の、試料中に存在する[TF :■/■a
]活性のレベルを示す計算活性値。用いた換算係数は100OミIJ単位(mu
) −50sである。
国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.次式を有する化合物: ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで,R1はアルギニン側鎖−(CH2)3−NH−CNHNH2,R2はト レオニン側鎖−CHOH−CH3,またはセリン側鎖−CH2OHあるいはプロ リン側鎖−(CH2)3−であって,P3がD−フェニルアラニンである場合を 除いて,P2はプロリンであり,R3はアスパラギン−CH2−CONH2,ア スパラギン酸−CH−COO,ヒスチジン▲数式、化学式、表等があります▼ロ イシン−CH2−CH−[CH3]2,グルタミン−(CH2)2−CONH2 ,トレオニン−CHOH−CH3またはフェニルアラニン▲数式、化学式、表等 があります▼の側鎖であって,P3がL型またはD型のいずれかであるように配 列している;Yは,水酸基,もしくは1〜4個の炭素原子を有する直鎖または分 枝状のアルコキシ基,ベンジルオキシ基,NAlA2基(ここで,A1およびA 2の各々は,H,もしくは1〜4個の炭素原子を有するアルキル基である),ク ロロメチル基,フルオロメチル基または−NH−アリールスルホニルフルオリド 基であるか,あるいは▲数式、化学式、表等があります▼は,−B(OH)2, または一般構造POOH−Y2(ここで,Y2は,アミノ酸,ペプチドまたはそ の塩である)で表されるホスホンアミデートで置き換えられている;Zは,H, 直鎖または分枝状のアルキル基,CHまたはCHOの環状基,1〜6個の炭素原 子を有し,非置換のCHO基であるか,あるいはホルミル基またはtert−ブ チルオキシカルボニル基によって,もしくはダンシル基またはトシル基によって 置換されたCHO基である。 2.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼は,クロロ メチルケトン,フルオロメチルケトン,ホウ素含有酸または一般構造POOH− Y2(ここで,Y2は,アミノ酸,ペプチドまたはその塩である)で表されるホ スホンアミデートであり,そしてZはHである。 3.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼は,クロロ メチルケトンであり,そしてZはHである。 4.請求項1の化合物であって,Yは水酸基であり,そしてZはHである。 5.請求項1の化合物であって,Yは水酸基であり,ZはHであり,そしてR3 は−CH2−CH−(CH3)2である。 6.請求項1の化合物であって,1は水酸基であり,ZはHであり,そしてR3 は▲数式、化学式、表等があります▼である。 7.請求項1の化合物であって,Yは水酸基であり,ZはHであり,そしてR3 は−CHOH−CH3である。 8.請求項1の化合物であって,Yは水酸基であり,ZはHであり,そしてR3 は−CH2−CONH2である。 9.請求項1の化合物であって,Yは水酸基であり,ZはHであり,そしてR3 は−CH2−COOHである。 10.請求項1の化合物であって,Yは水酸基であり,ZはHであり,そしてR 3は−(CH2)2−CONH2である。 11.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり,そしてZはHであり,R2は−CHOH−CH3または− CH2OHまたは−(CH2)3−ドからなる群から選択され,P3がD−フェ ニルアラニンである場合を除いてP2はプロリンであり,そしてR3はCH2− CH−(CH3)2,▲数式、化学式、表等があります▼,−CHOH−CH3 ,−CH2−CONH2,−CH2−COOHおよび−(CH2)2−CONH 2および▲数式、化学式、表等があります▼からなる群がか選択され,P3がL 型またはD型のいずれかであるように配列している。 12.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり,ZはHであり,R2はトレオニン側鎖−CHOH−CH3 であり,そしてR3はロイシン側鎖−CH2−CH−(CH3)2である。 13.請求項12の化合物であって,P3位のアミノ酸はD異性体である。 14.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり,Zはアセチル基,トシル基およびダンシル基からなる群か ら選択され,R2はトレオニン側鎖−CHOH−CH3であり,そしてR3はロ イシン側鎖−CH2CH(CH3)2である。 15.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり,ZはHであり,R2はセリン側鎖−CH2OHであり,そ してR3はロイシン側鎖−CH2CH(CH3)2である。 16.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり,ZはHであり,R2はプロリン側鎖−(CH2)3−であ り,そしてR3はロイシン側鎖−CH2CH(CH3)2である。 17.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり,ZはHであり,R2はセリン側鎖−CH2OHであり,そ してR3はアスパラギン側鎖−CH2CONH2である。 18.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり,ZはHであり,R2はトレオニン側鎖−CHOH−CH3 であり,そしてR3はアスパラギン酸側鎖−CH2COO−である。 19.請求項1の化合物であって,▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり,ZはHであり,R2はトレオニン側鎖−CHOH−CH3 であり′そしてR3はヒスチジン側鎖▲数式、化学式、表等があります▼である 。 20.[TF:VII/VIIa]阻害効力Ki5が少なくとも2.0MUであ るか,あるいはKi50が300μMより低い,請求項1の化合物。 21.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項1による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 22.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項2による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 23.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項3による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 24.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項4による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 25.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項5による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 26.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項6による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 27.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項7による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 28.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項8による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 29.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項9による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 30.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項10による組成物またはその薬学的 に許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 31.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項11による組成物またはその薬学的 に許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 32.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項12による組成物またはその薬学的 に許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 33.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項13による組成物またはその薬学的 に許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 34.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組物であって,請求項14による組成物またはその薬学的に 許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 35.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項15による組成物またはその薬学的 に許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 36.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項16による組成物またはその薬学的 に許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 37.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項17による組成物またはその薬学的 に許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 38.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項18による組成物またはその薬学的 に許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 39.動物またはヒトにおける[TF:VII/VIIa]の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって,請求項19による組成物またはその薬学的 に許容される塩と,薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 40.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項1による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 41.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項2による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 42.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項3による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 43.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項4による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 44.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項5による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 45.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項6による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 46.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項7による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 47.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項8による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 48.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項9による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 49.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項10による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 50.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項11による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 51.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項12による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 53.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項13による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 54.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項14による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 55.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項15による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 56.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項16による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 57.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項17による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 58.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項18による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 59.動物またはヒトにおける血栓形成,血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって,薬物学的に効果的な量の請求項19による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。
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