JPH03502578A - ７／７ａ因子活性部位阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■／■ａ因子活性部位阻害剤 本願は、ここに援用される。　１９８８年４月に出願された同時係属出願第１７ ８．４９５号の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は、血液凝固の分野に関し９組織因子と結合する外因性凝固因子■／■ａ の阻害剤であるペプチド分子を包含する。

発明の背景 ヒトの外因性凝固プロテアーゼのカスケード反応を細胞が開始する生理学的機序 の確認された主要部分は、細胞表面における糖タンパク組織因子（ＴＦ）　（Ｍ ｏｒｒｉｓｓｅｙら（１９８７）、　Ｃｅ１ｌ。

２重鎮誘導体■ａと、■＝１の比率で特異的に結合して二成分複合体［ＴＦ：■ ］または［ＴＦ：■ａ］　　（以後、　　［ＴＦ：■／■ａ］で表わす）を形成 する細胞表面のレセプターである。その触媒的に活性な部分は、ここでは■／■ ａ因子と呼ばれ、　ＴＦに結合していない場合でさえ、エステラーゼ活性を有す る（ＺｕｒおよびＮｅｍｅｒｓｏｎ（１９７８）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ ｌ、　２５３：　２２０３−２２０９）。

［ＴＦ　：■／■ａ］二成分複合体は、この複合体の■／■ａ因子の機能的セリ ンプロテアーゼ型活性部位と基質との結合による。タンパク加水分解活性を有す る（ＮｅｍｅｒｓｏｎおよびＧｅｎｔｒｙ２つの他のタンパクであるセリンプロ テアーゼチモーゲン類。

すなわちＸ因子（Ｓ　ｉ　ｌｖｅｒｂｅｒｇら（１９７７）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、、２５２：８４８１−８４８８）および■因子（Ｏｓｔｅｒｕｄ ら（１９７７）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

テアーゼとして作用する。この両方の因子は、二成分複合体［ＴＦ　：■／■ａ ］に組織化される際、■／■ａ因子のセリン型触媒部位の作用によって、プロテ アーゼとして順に活性化される。［ＴＦ：■／■ａ］の■因子に対する特異性に よって。

［ＴＦ　：■／■ａ］も、いくつかの細胞９例えば血管系の内皮細胞における内 因性凝固プロテアーゼのカスケード反応を活性化することができる（Ｓｔｅｒｎ ら（１９８４）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

くは両方の凝固プロテアーゼカスケード反応の開始は、血栓症の開始（Ｎｉｅｍ ｅｔｚおよびＦａｎｉ（１９７３）、　Ｂｌｏｏｄ、４２：　４７−５９．５ｔ ｅｒｎら（１９８４）、同上）および散在性血管向凝固（Ｎｉｅｍｅｔｚおよび Ｆａｎｉ（１９７１）、　ＮａｔｕｒｅＮｅｗ　Ｂｉｏｌ、、２３２　：　２４ ７−２４８　）に対する非常に重大な病因である。両方の凝固プロテアーゼカス ケード反応は、ウィルスに対する炎症反応および免疫仲介疾患におい遊離形態、 または［ＴＦ　：■／■ａ］二戊分複合体の一部としての形態である場合の■／ ■ａ因子に対して特異的な阻害剤は、まだ確立されていない。タンパク分解活性 を有する［ＴＦ：■／■ａ］二成分複合体による凝固プロテアーゼカスケード反 応の上記の「開始」に対する特異的な阻害剤は全く知られていない。

本発明は、　　［ＴＦ：■／■ａ］二成分複合体のタンパク分解活性を特異的に 阻害する能力を提供するものであり１重要で有用な進歩を示す。本発明の化合物 によって、血栓凝固、炎症性凝固、および関連する血管内凝固、ならびに免疫学 的疾患における凝固の細胞活性化を１分子基準で診断評価をすることができる。

第２に、このような化合物によって、［ＴＦ：■／■ａ］複合体の活性に基づく 薬剤の開発を検討することができる。第３に、このような化合物は、新種の抗血 栓薬剤および抗炎症薬剤となる。

本発明で述べる種類の化合物の有用性は、これらの化合物が■／■ａ因子に特異 的な活性部位阻害剤として機能する能力に由来するものである。可逆的阻害剤お よび不可逆的阻害剤の両方について述べる。不可逆的阻害剤は、タンパク分解活 性の二成分複合体［ＴＦ　：■／■ａ］の組織因子（ＴＦ）と結合することによ って活性になった場合、■／■ａ因子に対して有効な阻害を行うことができ、か つこの因子に対して選択的である。

本発明の化合物は、　　［ＴＦ：■／■ａ］による凝固プロテアーゼカスケード 反応の開始を特異的に阻害する分析試薬および治療剤として用いられる。また、 この化合物によって、凝固の活性化が、二成分複合体［ＴＦ　：■／■ａ］に基 因するかどうかを、インビボおよび半ビボで正確に決定することができる。これ らの化合物は、血栓形成と血栓症および関連する疾患９敗血症性ショックに関連 する散乱性血管向凝固などの疾患過程、ならびに組織内の凝固の過剰な活性化に 関連するある種の炎症症状に必要とされる病原機序の１つである凝固本発明には 、セリンプロテアーゼ凝固■／■ａ因子の高親和性細胞レセプターＴＦと結合し た結果、活性化された場合に。

該因子のタンパク分解活性部位を特異的に阻害するペプチドおよびペプチド誘導 体が含まれる。

本発明の、　　［ＴＦ：■／■ａ］複合体における■／■ａ因子の阻害剤は次式 Ｉで表される化合物である。

ここでＴ　Ｒ１はアルギニン側鎖−［Ｃ）１．］　、−Ｎｌｌ−ＣＮ）ＩＮＨ２ である；Ｒ２はトレオニン側鎖−（１：１１０Ｈ−Ｃ１３，セレン側鎖−ＣＨ２ ０Ｈまたはプロリン側鎖−（ＣＨ２）！−であり、Ｐ、がトフェニルアラニンで ある場合を除いて＋　Ｒ２はプロリンである＋Ｒ３は以下のアミノ酸の側鎖であ る。すなわちアスパラギン側鎖〜ＣＨ２［：ＯＮＨ，、アスパラ側鎖−ＣＬ−Ｃ Ｈ［ＣＬ］　２　、グルタミン側鎖−［Ｃ１１２］　２−ＣＯＮＨ２゜であり、 Ｒ３がＤ異性体またはＬ異性体であるように配列している。水酸基、もしくは１ 〜４個の炭素原子を有する直鎮または分枝状のアルコキシ基（例えば、メトキシ 基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基など。

ならびにベンジルオキシ基）、あるいはＮＡ、Ａ２基［ここで。

ＡＩ右よびＡ２の各々はＯＵｔ　もしくは１〜４個の炭素原子を有する低級アル キル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基）であ ってｅＡｌおよびＡ２は同一または相異なる］、あるいはクロロメチル基または フルオロメチル基、あるいは−Ｎｉｌ−アリールスルホニルフルオリド基である 殻構造ＰＯＯＩＩ−Ｙ２　（ここで＋　Ｙ２は、アミノ酸、もしくはペプチドま たはその塩である）で表されるホスホンアミデートで置き換えられている。Ｚは １通常■であるが、直鎖または分枝状のアルキル基、　ＣＩ（またはＣＨＯの環 状基、１〜６個の炭素原子を有するＣＨＯ基、　（例えば、メチル基、エチル基 、ｎ−プロピル基またはイソプロピル基、ｎ−ブチル基、　ｔｅｒｔ−ブチル基 。

ベンジル基など）、あるいはさらに複雑な化学的誘導体（例えば、ホルミル基、 アセチル基、ダンシル基（５−ジメチルアミノナフタレンスルホニル基）、トシ ル基（ｐ−）ルエンスルホニル基）、またはＢｏｃ基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ カルボニル基）などを含む各種の基で置換されていてもよい。余り有利ではない 誘導体としては＋Ｐ３部分を有さず、ＺがＲ２のＮに結合している一般的な化合 物がある。

上記一般式の化合物は、Ｙが、セリンプロテアーゼの電荷リレー系に反応性のセ リンまたはヒスチジンを有するような酵素内における反応性部位の残基と共有結 合または密着結合（ｔｉｇｈｔ　ｂｏｎｄ）を形成し得る反応性基である場合、 二成分［ＴＦ二■／■ａ］複合体における■／■ａ因子の不可逆的阻害剤または 密着阻害剤（ｔｉｇｈｔ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ）である。不可逆的阻害剤として は、　Ｙが、クロロメチル基、フルオロメチル基、または−ＮＨ−アリールスル ホニルフルオライド基である場合の上記一般式で表される化合物が挙げられる。

密着阻害化合物としおよびＹ２はアミノ酸またはその誘導体、好ましくはイソロ イシン、バリン、またはアラニンであるが、セリンプロテアーゼの代表的な基質 構造のｐ＋１を意味するこれらの構造に限定されない）で置換されているホスホ ンアミデート構造で置換されている化合物（ＳｃｈｅｃｈｔｅｒおよびＢｅｒｇ ｅｒ（１９６７）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

このような不可逆的阻害剤または密着阻害剤は、他の点では、　　Ｚ、　Ｒ，、 Ｒ２，Ｒ，の基について、上記の可逆的阻害剤と同様である。

一般式Ｉで表される化合物の薬学的に許容される塩も、Ｐ１アルギニン、Ｒ２ト レオニン、またはＰ３側鎮の化学的誘導体と同様に１本発明の範囲内に含まれる 。式■の化合物と、その薬学的に許容される塩は、血栓症、散在性血管向凝固症 １敗血症性ショック症、関節炎のような細胞免疫型疾患における炎症、および類 肉腫症の治療に有用である。

（以下余白） 発恩９１１」象説贋 本発明の化合物は、〔ＴＦ：■／■ａ〕の生理学的基質のトリペプチド類似体と して作用すると考えられる。これらの化合物は、二成分複合体［ＴＦ　：■／■ ａ〕の高親和性細胞レセプターＴＦと結合する場合にのみ、活性酵素形態の■因 子もしくはその誘導体である■ａにおけるＰｌ−Ｐｓ部位（Ｓｃｈｅｃｈ　ｔｅ ｒおよびＢｅｒｇｅｒ（１９６７）、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　Ｂｊｏｐｈｙｓ 、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、２７　：　１５７−１６２の命名法による）に結合す ると考えられる。式■のｐ、、　ｐ。

およびＰ、で示されるアミノ酸残基もしくは類似体は、それぞれ、セリンプロテ アーゼ型の酵素の基質のｐＨＲ２およびＲ３に対応すると考えられる。

置換基Ｒ，としては、アルギニンの側鎖、あるいは局所の構をできるだけ導入す る反応性の誘導体が好ましい。可逆的阻害剤では、アルギニンのアミノ酸側鎖を Ｒ１に用いることが好ましい。

Ｒ２としては、トレオニン残基の側鎖が好ましい。

Ｒ１としては、　　（ＴＦ：■／■ａ）の基質に対する高い選択的特異性と矛盾 しない各種の構造が用いられ得る。たとえ天然の基質中にこのような構造が存在 せず明らかでなくてもよい。

表１に列記したアミノ酸残基によって好ましいＲ３の構造を例示する。最も有効 なものを相対阻害活性について列記しである。

表１ Ｐ、置換基の相対効力 相対効力はメガ単位（ＭＵ）で示す。その１単位は、Ｘ因子活性を５％阻害する 場合のモル濃度の逆数に等しい。組織因子を有する二成分複合体の■／■ａ因子 に対する阻害は。

５ｃｈｉｎａｒｔｚ、　Ｂ、Ｓ、ら（１９８１）、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖ ｅｓｔ、６７　：　１６５０に記載されるのと同様にして精製したＸ因子と、ク ロモゲン基質Ｓ−２２２２（Ｈｅｌｅｎａ　Ｌａｂｓ、米国、テキサス州、ボー モント）とを用いる酵素結合色素形成検定法（ｌｉｎｋｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃ ｈｒｏ−ｍｏｇｅｎｉｃ　ａｓｓａｙ）によって定量された。簡単に言えば、ペ プチドを精製ヒト■因子（１渕）であらかじめインキュベートし、　Ｆａｉｒ、 　Ｄ、Ｓ、、　（１９８３）、Ｂｌｏｏｄ　６２　：　７８４−７９１に記載し であるのと同様にして精製し、全体積７５ｐ！を室温で３０分間保温した後、　 ２５ｔｌの２０ａ＋Ｍ　ＣａＣ１ｚ、　　ｌ　Ｘｌ０ＳのＴＦ陽性ヒト膀胱癌腫 由来Ｊ８２細胞（米国、メリーランド州、ロックビルのアメリカンタイプカルチ ャーコレクションから受託番号ＡＴＣＣＨＴＢＩで入手可能）５０ｐＺのトリス 緩衝食塩水中の２５ｐ！の精製ヒトＸ因子（１００渕）および５０ｐｌの２＋ｍ Ｍ　Ｓ−２２２２を添加した。

Ｊ８２細胞の使用は、これらのインビトロ検定法の重要な特徴である。なぜなら ばこの細胞は、活性ＴＦ：■／■ａの形成に対して有効な量のＴＦを産生ずるか らである。Ｘ因子のＸａ因子への変換率は、　　４０５ｎｍの吸光度でＳ−２２ ２２の色素生成物を測定することによって速度論的にモニターされた。

Ｒ１としてのその他の置換基には、アラニル、プロリル、グリシル、アルギニル 、セリル、フェニルアラニル、トリプトファニル、バリル、イソロイシル、グル タミル、チロシル。

システイニルもしくはメチオニルの側鎖が包含される。これらの置換基はジペプ チドであるトレオニルーアルギニンもしくはその誘導体の弱い阻害活性を積極的 に打消して不活性化合物にする。

式Ｉの置換基Ｒ１は、アスパラギンもしくはヒスチジンのアミノ酸側鎖の構造に 基づいたものが最も好ましく１機能的阻害剤であるアスパラギン酸とロイシンの アミノ酸側鎖に基いた構造のものはあまり好ましくな（、トレオニンおよびグル タミンの側鎖に基づいた構造のものは可逆的阻害剤としてさらに好ましくない、 ジペプチドであるトレオニルーアルギニンはわずかな活性を有し、その活性は適 当な置換基を有するＲ３を付加することによって改善される。アミノ末端基２と しては、水素原子、もしくは水素結合、あるいは共有結合を容易にする他の置換 基によって反応性を増大させる。当該技術分野で発表されている種々の他の基が 好ましい。

比較的有効な形態の可逆的阻害剤は、一般式■と実施例１に示ｔ　Ｌ−アスパラ ギニル−Ｌ−トレオニルーし一アルギニン（Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒ ｇ）である。

ここで、Ｚは水素原子、Ｒ３はＬ−アスパラギニル側鎖である一Ｃｕｔ−ＣＯＮ Ｈア；Ｒ２はＬ−）レオニル側鎖である一ＣＨ０Ｈ−ＣＨｚ、および１はＬ−７ ／Ｉ／ギニル側鎖である−［ＣＩ！］　１−Ｎ）ｌ−ＣＮＨＮＨｚである。ペプ チジル部分を形成する個々のアミノ酸のＤ−異性体も利用することができる。特 に断らない限り、ここではＬ形のＰ　Ｉ　＋Ｐ、およびＰ、が用いられる。

不可逆的阻害剤もしくは密着阻害剤は、可逆的阻害剤の誘導体であり、■／■ａ 因子の触媒領域の活性部位と共有結合もしくは非常に密着した結合を形成して安 定な阻害剤−酵素される。不可逆的阻害剤の周知な例としては、　１）ペプチド クロロメチルケトン類（ＣＭＫ）　（Ｐｏｗｅｒｓら（１９７７）、　Ｂｉｏｃ ｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　　４８５　：　１５６−１６６　　；　２）ペプチドフルオロメチル ケトン（ＦＭＫ）（Ｉｓｐｅｒｉａｌｉ　ａｎｄ　Ａｂｅｌｅｓ（１９８６）　 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２５　：　３７６０−３７６７）　；および３）−ＨＮ− アリールスルホニルフルオライド類（Ｙｏｓｈｉｗ＋ｕｒａら（１９Ｂ２）　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　’２５７　：　５０７？−５０８４）　カ包含さ れ；密着結合の阻害剤としては、１）ペプチドボウ酸類（Ｍａｔｔｅｓｏｎら（ １９８１）Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｓｓ、　Ｓｏｃ、　１０３　：　　５２４１− ５２４２　；　Ｋｅｔｔｎｅｒおよび２）ペプチドホスホンアミデート類（Ｊａ ｃｏｂｓｅｎおよびＢａｒｔｌｅｔｔ（１９８１）Ｊ、＾ｔａ、　Ｃｈｅｗ、　 Ｓｏｃ、　１０３　：　６５４−６５７）が含まれる。

クロロメチルケトン誘導体は、　ＴＦ陽性検定用細胞の表面における（ＴＦ　： ■／■ａ〕の特異的なタンパク分解活性の阻害性について分析された。相対的阻 害効力は１表２に示すように、かなり増加している。

表２ クロロメチルケトン類似体の阻害活性の比較上記のペプチド類とペプチジルクロ ロメチルケトンｉ　（ＣＭＫ）の阻害効力を表１について記載したのと同様にし て検定した。　Ｋ、５は？ｌ［ｌで示す（表１参照）。Ｋ工５０は１通常のモル 数。

すなわち、Ｘ因子の活性率を５０％阻害するのに要する濃度で示す。

好ましい形態の不可逆的阻害剤は、一般式■と表２と表３に示す）ｌ−Ｌ−口イ シル−Ｌ−）レオニル−し−アルギニルクロロメチルケトン（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ− Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ）である。

式■： ここで、２は水素原子；Ｒ１は−ＣＨｚ−ＣＩ　［ＣＨ３コ２；Ｒ１は−ｃｏｏ ｎ−ｃｔ＋ｓ　；Ｒ３は−ＣＨｇ−ＣＨｚ−ＣＨｘ−ＮＨ−ＣＮＨＮＨｚである 。

Ｐ２位置におけるロイシル残基は２例えば１表３に示すように生物学的活性を著 しく失うことなくアセチル基もしくはトシル基を含有するように化学的に修飾さ れてもよい（ただし。

Ｒ３のロイシン残基を修飾して２位置にダンシル基を含有させると生物学的活性 が低下する）。さらに、好ましいＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ 阻害剤化合物では、　Ｐｇ位置のアミノ酸残基は。

表３に示すように、阻害活性を著しく失うことな（セリンもしくはプロリンで置 換され得る。

より好ましい形態の不可逆的阻害剤は、Ｄ−ロイシル−Ｌ−）レオニル−し−ア ルギニルクロロメチルケトン（Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ） であり、この化合物の２５位のアミノ酸残基はロイシンのＤ−異性体である。こ のトリペプチジル−ＣＭＫの阻害活性は＋ｈ位置にＬ−ロイシンに代えてＤ−ロ イシンを含有する場合は著しく増化する（表３参照）。Ｐ８位置のＤ−ロイシン がＤ−フェニルアラニンで置換されると活性は５０％より大きく減少する（表３ ）。

表３ いくつかのペプチジルクロロメチルケトン類の阻害活性ペプチジル−ＣＭＫ　　 　　　　　　ｊ１５Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ　　　　　　 ６８　　Ｍ［ＩＤ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ　　　　　１００ ペプチジルクロロメチルケトン類の阻害活性は１表１で記載したのと同様にして 検定した。Ｋｉ５はＭＵで示す（表１参照）。

Ａｃ＝アセチル基。

Ｔｏｓｙｌ　＝ｐ−）ルエンスルホニル基。

Ｄａｎｓｙｌ　＝５−ジメチルアミノナフタレンスルホニル基。

本発明の代表的な化合物が合成され、これらの化合物がＴＦ分子を発現するヒト 細胞によるＸ因子の活性化を積極的に阻害することが証明された。このＴＦ分子 は■因子とともに供給されて、二成分タンパク分解活性化複合体（ＴＦ　：■／ ■ａ〕を形成する。Ｘ因子における（ＴＦ　：■／■ａ〕のタンパク分解活性を １本発明の化合物が阻害することは９色素検定法によって分析された０色素検定 法では、基質であるＳ−２２２２が。

発生したＸａ因子によって切断される。正常なヒトの血漿の凝固の阻害も、　Ｔ Ｆ陽性細胞、阻害剤化合物およびカルシウムを添加した後に分析して証明された 。分析の結果、このような化合物はすべて、Ｘａ因子、すなわち因子■および■ ａに非常によく類似した酵素に対して効果を有さないことが分かった。いずれの 化合物も、　Ｓ−２２２２のＸａ因子による切断に対して阻害効果を全く示さな かった。

不可逆的阻害剤としてのハロメチルケトン誘導体は、Ｙにおけるへロメチル基に 、好ましくはＣＩの代わりにＦが入っていることを除くと、置換基については、 クロロメチルケトン誘導体について先に述べたのと同様である。

当該技術分野でよく知られているように、ペプチドのホスホンアミデート誘導体 は、セリンプロテアーゼを阻害し得る。

本発明のこのような誘導体も、■／■ａ因子の触媒部位に密着結合することによ って［ＴＦ　：■／■ａ〕のタンパク分解油で、Ｙ２はアミノ酸、ペプチドもし くはその塩、好ましくはイソロイシン、バリンもしくはアラニンのような疎水性 アミノ酸）で構成されていることを除いて、クロロメチルケトン誘導体について 先に記載した前記化合物および置換基に基づいたものである。これらの化合物は 下記一般式■で表される。

その他の基の置換は、クロロメチルケトン類と可逆ペプチド化合物について記載 したのと同様である。

本発明のホウ酸誘導体は、■／■ａ因子の触媒部位に密着結合することによる。

　　［：ＴＦ：■／■ａ］のタンパク分解活性の密着阻害剤である。これらの誘 導体は＋ＰｌのＹと結合カルボニル基、ＣＯとがＱで置換されている。一般式Ｖ において。

Ｑはホウ酸の−Ｂ［ＯＨ］、である。その他の基の置換は、クロロメチルケトン 類と可逆的なペプチド化合物について記載したのと同じである。

本発明の化合物の薬学的に許容される塩の例としては、有機もしくは無機の酸、 もしくは塩基で形成される非毒性の塩が包含される０例えばナトリウム、カリウ ムもしくはリチウムのようなアルカリ金属の塩；カルシウムもしくはマグネシウ ムのようなアルカリ土類金属の塩；シクロヘキシルアミン。

エチルアミン、ピリジン、エタノールアミンもしくはピペラジンのような有機ア ミンの塩；および塩素、フッ素、臭素。

コハク酸もしくは酢酸塩のようなアニオンで形成される塩である。上記の塩は通 常の方法で調製される。

一般式Ｉで表される本発明の化合物は、タンパク分解性二成分複合体１：ＴＦ　 ：■／■ａ〕中の■／■ａ因子の触媒部位の阻害剤であり５表１の脚注に記載し たようにして検定されるＸａ因子発生を阻害する性能によって証明された。その 阻害活性によって、これらの化合物とその塩は、血栓症の凝固の細胞活性化、汎 発性脈管向凝固症１敗血症性ショック、細胞免疫応答症、類肉腫症、および炎症 応答の一部分として凝固経路が活性化される関連疾病の治療に有用である。

本発明を実施する際には２式Ｉの化合物および薬学的に許容されるそれらの塩は 、単独で用いるかまたは薬学的に許容される担体と混合してもよい。このような 化合物もしくは塩は、非経口で患者に投与することができる。例えば皮下、静脈 もしくは腹腔内投与が可能である。このような化合物は。

鼻腔内への点滴注入；または口の舌下部の粘膜もしくは鼻や気管支の粘膜のよう な粘膜に、スプレー、乾燥粒子の懸濁液あるいは水または食塩水の溶液として塗 布することによって投与することができる。

ここに示すデータは、　　（ＴＦ：■／■ａ〕の■／■ａ因子部分の活性触媒部 位と結合して阻害することによって、　　［：ＴＦ：■／■ａ〕のタンパク分解 活性を阻害する本発明の代表的化合物の活性を、Ｘ因子のタンパク分解活性化の インビトロでの検定法と血漿の凝固時間検定法で証明する。患者の治療条件は、 さらに、当該技術分野で公知の原理にしたがって、半ビボおよび実験動物で活性 を定量することによって最適化することができる。阻害剤を、活性な形態で、か つ生理学的に適合した形態で投与するための、薬学的に許容される担体。

希釈剤および賦形剤の開発は、公知の原理に基づいて行われる。実用上、阻害投 与量は、患者の血液中、　　３００−より少なく、好ましくは３０−より少なく なければならず、このことは薬学的に有効な阻害剤は、　３００ＪＭより小さい Ｋ１５０値がまたは。

２．０以上のに、５値を持っていなければならないことを意味する。

さらに阻害剤は（ＴＦ　：■／■ａ〕に対して特異的でなければならない。多く の非特異的なセリンプロテアーゼ阻害剤が当該技術分野で知られている。これら はここでは関連がない。

なぜならば、これらの阻害剤は、多くの酵素を阻害するので有効投与量で有毒で あり得るからである。本発明の阻害剤は。

（ＴＦ　：■／■ａ〕の■／■ａ因子部分に対し高度に選択的である。本発明の 阻害剤は１例えば、　　３００−という高い投与量で、同種のセリン形プロテア ーゼであるＩＸａ因子もしくはトロンビンに対する阻害効果を持っていない０本 発明の好ましい化合物は、高いＫｉＳ値（Ｆｌｕ）と低いに、５０値（ＩＭ）を 有する化合物であり、その理由は、このような化合物は、少ない投与量で有効で あり、副作用の可能性が減少するからである。

本発明は２本願で開示した特別な教示事項を、当該技術分野で公知の種々の技術 や手段と組合わせている。手段の選択は、ペプチドの長さの選択、活性部位との 結合を限定する反応性基の選択、各アミノ酸残基内の修飾の程度、活性部位の安 定化／不安定化に影響するアミノ酸配列の操作＋ｈとＰ３の部位の適確な形態と 反応性を反映するアミノ酸の挿入、結合親和性を将来利用するための化学配位子 の付加と修飾などのような変化によって決まる。新規な、天然および合成のペプ チド基質と阻害剤分子が発見され評価され、活性部位の結合性と反応性の増強に 寄与する配列と配位子が明確になれば。

当業者は、所望の生物学的活性を有する“改良された”合成ペプチジル類似体を 産性する要素を、上記の要°素から選択することができる。本発明の主要な局面 は、新規なペプチジル化合物を利用して、　　（ＴＦ：■／■ａ〕のタンパク分 解活性を阻害することができることである。このことは、ペプチジル化合物を、 ■／■ａ因子の触媒部位に対して選択的にかつ高い親和性を、持って結合するよ うに設計することにより達成される。

（以下余白） 実施例 以下の実施例は本発明の実施態様を例示するために提供される。これらの実施例 は本発明の範囲を限定することはなく。

その範囲は特許請求の範囲によって決定される。

本発明のペプチジル阻害剤の化合物は、当該技術分野で用いられている数多くの 化学合成法のいずれかを用いて容易に合成することができる（Ｆｒｉｄｋｉｎ　 ａｎｄ　Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ　（１９７４）。

好ましい方法は、（ａ）均一系（溶液）もしくは不均一系（液体／固体相）での 合成と（ｂ）フラグメント縮合反応もしくは段階的縮合反応を包含する方法（Ｂ ｏｄａｎｓｋｙ　ａｎｄ　０ｎｄｅｔｔｉ　　（１９６５）Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ ｙｎｔｈｅｓｉｓ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）であ る。所望のペプチドのハロメチルケトンとその他の種類の誘導体（例えば、′ホ スホンアミデート類、ホウ酸類、アリールスルホニルフルオリド類など）の合成 は、当業者に周知の方法で容易に実施され得る。（Ｐｏｗｅｒｓ　ａｎｄ　Ｔｕ ｈｙ　（１９７３）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７６０−３７６７　；　Ｉｍ ｐｅｒｉａｌｉ　ａｎｄ　Ａｂｅｌｅｓ　　（１９８６）　　Ｔｅｔｒａｈｅｄ ｒｏｎＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５７　：　５０７７〜５０８４参照）。

この化合物の代表的な固相合成は、　ｔ−Ｂｏｃ基で保護された誘導体であるＮ −α−Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン、　　Ｎ−Ｂｏｃ−０−Ｂｚｌ−Ｌ−トレオニ ンおよびトシル−Ｌ−アルギニンで誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）したＰＡ Ｍ樹脂を支持体として用い、かつメーカーの標準プロトコルを用いて、　Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａ型ペプチド合成装置で行った。トリ ペプチドを、脱保護化処理し、標準プロトコルに従い、ＨＦ解離剤〔アニソール ：樹脂：ＨＦ（１：１：１０）〕を含有する試薬で６０分間０℃で処理してＰＡ Ｍ支持体から解離させる。生成物を、０．１％（Ｖ／Ｖ）のＴＦＡを含有する１ ０〜４０％（Ｖ／Ｖ）アセトニ）　ＩＪル水溶液の匂配液で溶出するバイダック （Ｖｙｄａｃ）　Ｃ−１８カラムで精製し、減圧乾燥する。生成物は水あるいは 所望の水溶液に溶解して分析に使用される。

実施例２　：　Ｈ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇの合成この類似体の合 成は、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０　Ａ型ペプチド合成装 置で、トシル−し−アルギニンでデリバタイズされたＰＡＭ樹脂カー）　＋３ツ ジに結合させるための非対称の無水物形成の標準プロトコルを用いて満足すべき 状態で行なわれる。

すなわち、まず上記のトシル−し−アルギニンにＮ−Ｂｏｃ−０−Ｂｚ　Ｉ−Ｌ −）レオニンを結合させ、そのｔ−Ｂｏｃ基を除去し９次いでＮ−Ｂｏｃ−Ｌ− アスパラギン酸−β−ベンジルエステルを活性化して非対称の無水物とし、トレ オニル基に結合させる。得られたトリペプチドを脱保護化し、標準の）ＩＰプロ トコルを用いてＰＡＭ樹脂から解離させ、上記（実施例１）したのと同様にして 調製した。

実施例３　：　Ｈ−Ｌ−１１ｉｓ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇの合成最終のアミノ 酸結合反応にＮ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−ｉｍ−Ｃｂｚ−Ｌ−ヒスチジンを代わりに用 いて、実施例２に記載しであるのと基本的に同様にしてペプチドを合成した。

実施例４　：　ＩＩ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇの合成最終のアミノ 酸結合反応にＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシンを使用すること以外、実施例２に記載し であるのと基本的に同様にして合成を行った。

実施例５　：　Ｈ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇの合成最終のアミノ酸 結合反応にＮ−Ｂｏｃ−０−Ｂｚｌ−Ｌ−）レオニンを代わりに用いて、実施例 ２に記載したのと基本的に同様にして合成を行った。

実施例６　：　ｌ（−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇの合成最終のアミノ 酸結合反応にＮ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミンを代わりに用いて、実施例１に記 載したのと基本的に同様にして合成を行った。

実施例７　：　Ｈ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇの合成最終のアミノ酸結合反応を省 略して実施例１に記載したのと基本的に同様にして合成を行った。

この方法がより好ましい方法であり、以下のようにして実施され得る。

１５、６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＩＩＰ）　（２００ｍｆ）に溶解 し。

Ｎ−メチルモルホリン（１，７２ｍｆ、　１５．６ｍｍｏｌ）の存在下、クロル ギ酸イソブチル＜２．０６　ｇ　、　１５．６ｍｍｏ　Ｉ）で、０℃にて１０分 間処理した。得られた混合無水物の調製物を濾過し、その濾液を。

エーテル性ジアゾメタン〔ダイアザルト（口１ａｚａｌｄ）　（５，４ｇ　。

２５ｍｍｏ１）から調製された１２０ｍ１）に５分間かけて添加した。

反応液を０℃で４５分間攪拌した後、酢酸（０，５ｒｎｌ）を添加して過剰のジ アゾメタンを失活させた。生成物は反応混合物から結晶化した。溶媒を除去し、 残渣をクロロホルム（２５ｍＮ）で希釈した。結晶生成物であるＢｏｃ−Ｌ−Ａ ｒｇ（ＮＯ２）Ｃ）ｌＮ２を濾過し、減圧乾燥させた。Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｎ ｏ２）Ｃ）ｌＮ＊　（３，９７ｇ、　１１．５ｍｍｏｌ）をエタノール（２３ｍ ｆ）に溶解し、０℃に冷却した。ＨＣＩ　（１０％エタノール溶液１２．５ｍ１ ）を、２０分間かけて滴下した。反応混合物を室温（ＲＴ）で１時間攪拌後、こ れをジエチルエーテル（４００ｍｌ）に注入した。得られた溶液を２時間、５℃ で静置し。

窒素中で濾過し、減圧デシケータ−中で乾燥させて、　１．７２ｇのＨ−Ｌ−Ａ ｒｇ　（ＮＯａ）ＣＨ２Ｃ１・ＨＣＩを白色粉末として得た。３６０Ｍ１（ｚの ’ＨＮＭＲで生成物の特性を決定した。

２．６６ｇ　、　０．　Ｏｌｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１ ，５３ｇ、　０．Ｏｌｍｏｌ＞の氷冷ＴＨＦ　（４０ｍｌ）溶液に、（トｔ−ブ チル）−トレオニンメチルエステルＨＣＩ　（２，２６ｇ、　０．Ｏｌｍｏｌ） 、　Ｎ−メチルモルホリン（１，ｌｏｍｆ、　０．　Ｏｌｍｏｌ）、およびジシ クロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　（２，１６ｇ　、　　Ｏ，Ｏｌｍｏｌ ）含有Ｔ）ＩＰ（５ｍｌ）を続けて添加した。添加が完了した後、溶液を０℃で １時間１次いでＲＴで１６時間攪拌した。得られた反応混合物を水浴で冷却し、 過剰のＤＣＣを酢酸（０，５０ｍ１）で失活させた。１時間後。

得られた溶液を濾過し、得られたジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）の沈澱を酢酸 エチル（２５ｄ）で洗浄した。得られた濾液から溶媒を除去し、残渣を酢酸エチ ル＜２５ｍ１）に溶解した。得られた溶液を３時間５℃で静置し、残留するＤＣ Ｕの沈澱を濾過して除去した。濾液を酢酸エチルで希釈して１００ｍ１とし、１ ０％のクエン酸、水、飽和ＮａＨＣＯ３および食塩水（飽和ＮａＣ１溶液）（各 々１５ｍ１ずつ）で洗浄し、　ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減 圧下で除去して、　　Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯ Ｍｅ　（４，０２ｇ、　８９％）を得た。Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ− ブチル）−ＴｈｒＯＭｅ　（４，０２ｇ、　８．９ｍｍｏｌ）の、水冷メタノー ル／ジオキサン（１：　１）（２５ｍＡ’）溶液に、　ＮａＯＨ（１，ＯＮ溶液 １２ｍｆ、　１２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液をＲＴで３時間攪拌した 。メタノールとジオキサンを減圧下で除去した。得られた水溶液を水（５０ｒｒ Ｌ１．）で希釈し、酢酸エチルで２回（各２５−ずつ）洗浄し、１ＭのＮａＨＳ Ｏ，溶液でｐＨ２に酸性化した。水層を５０ｒｒＬｌずつの酢酸エチルで２回抽 出した。得られた有機層を合わせて９食塩水で３回（各１０１ｎＩ！ずつ）洗浄 し、　ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去して、　　（Ｊｚ−Ｌ−八５ｎ− Ｌ−（０−１−ブチル）−Ｔｈｒ［ｌｌｌ　　（２，１４ｇ。

５５％）を得た。６０ＭＨｚの’ＨＮＭＲで生成物の特性を決定した。

Ｈ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＣＭＫの調製　予め調製しておいた。保護化ジペ プチドであるＣｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨ（０， ８８ｇ。

２、０ｍｍｏｌ）を、Ｎ−メチルモルホリン（０，２４ｍ１．２．　Ｉｍｍｏｌ ）の存在下、クロＪＬ／ギ酸イソブチル（０，２９ｍｆ、　２．１ｍｔｎｏ　Ｉ ）と０℃で２０分間反応させた。ＨＬ　Ａｒｇ（Ｎ０２）ＣＨｚＣＩ・）ＩＣＩ （０，６０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（４ｍｊり溶液を滴下 した。０℃で２０分間攪拌後、Ｎ−メチルモルホリン（０，２２＋＋＋１．　２ ．０ｍｍｏｌ）含有のＴＨＦを添加した。得られた溶液を、０℃でさらに４０分 間。

次いでＲＴで１時間攪拌した。得られた反応混合物を水と食塩水（各々２５−ず つ）で希釈し、酢酸エチルで２回（各々２５Ｗ１１ずつ）抽出した。有機層を合 わせて、１０％クエン酸、飽和ＮａＨＣＯ，および食塩水（各々１５ｒｎ１ずつ ）で洗浄し、　１ｇ３口４で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、　　Ｃｂｚ−Ｌ −Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ　（ＮＯ２）　Ｃｆ１ ａＣ１を得た。生成物をｌ（Ｐ（７ｍｌ）とアニソール（０，５ｍｆ）とで０℃ にて２０分間処理した。ＨＦを除去した後。

残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで２回（各々５−ずつ）洗浄した。有機 揮発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製Ｈ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ− Ａｒｇ−ＣＭＫ　・２ＨＰを凍結乾燥させて粉末とした。得られた物質を、０〜 １．０ＮＨＣＩの段階的匂配液を用いるセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　 ５Ｐ−Ｃ２５（Ｈ＋形）カラムで粗精製し、　　１２４ｍｇのトし一へｓｎ−Ｌ −Ａｒｇ−ＣＭＫ・２１ＩＣ１を得た。生成物を。

１０〜５０％（Ｖ／Ｖ）のヘキサン／イソプロパツール（１０％メタノール）匂 配液で溶出するスベルコ　（Ｓｕｐｅｌｃｏ）　ＬＣＮＨ２カラムでさらに精製 し減圧乾燥させた。３６０ＭＨｚの’ＨＮＭＲによって生成物の特性を決定した 。生成物を、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解し９分析もしくは他の 用途に用いた。

（ｂ）固相法を用いるペプチドの合成 Ｈ−Ａｒｇ（ＮＯ□）Ｃ）ＩｚＣＩ−ＨＣＩの調製　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ＮＯｚ） ＤＨ（５，Ｏｇ。

１５、６ｍｍｏｌ）を６０ｍ１のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、　Ｎ −メチルモルホリン（１，７２−、１５，６ｍｍｏｌ）の存在下、クロルギ酸イ ソブチル（２，０６ｍ１．１５．６ｍｍｏｌ）と−２０ｔ’で１ｏ分間反応させ た。得られた混合無水物の調製物を濾過し、濾液を１２０ｍ１のエーテル性ジア ゾメタンに添加した。反応溶液を３０分間０℃で攪拌した後、　８０ｍ／のエー テルを添加した。生成物は、冷時に９反応溶液から結晶化した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ 　（Ｈ［］２）　Ｃ）ＩＮ＋（２生成物を最小堆積のＴＩＩＰに溶解し、エタノ ールＩＣＩ　（２０ｍｍｏ　Ｉ）と、窒素放出がなくなるまで室温で反応させた 。

）１−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＣＭＫの調製　ペプチドのＢｏｃ−Ａｓｎ−０ −Ｂｚｌ−Ｔｂｒ−Ｏ１１を、当該技術分野で公知の方法と、標準の装置プロト コルによるＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａ型ペプチド合成装 置とでＳｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｇ、　Ｒ，Ｍａｒｓｈａ１１編集、　ＥＳ［：Ｄ Ｍ　Ｌｅｉｄｅｎ、　２５９頁参照）、そのＩｍｍｏｌを、５ｍｌのＴＨＦ中の Ｎ−メチルモルボリン（ｌ　ｍｍｏｌ）と−２０℃で１ｏ分間反応させた。。冷 却したＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド５ｍｌに溶解した）ｌ−Ａｒｇ（Ｎ［］２ ）Ｃ）１２［：ｌ・）ＩｃＩ　（１ｍｍｏｌ）を上記の混合無水物の調製物に添 加した。１５分後にトリエチルアミン（Ｉｍｍｏｌ）含有の冷却Ｔ）ＩＰ　（２ ０ｒｎＩりを添加した。−２０℃で１時間１次いで室温で２時間攪拌後１反応混 合物を濾過し、その濾液を酢酸エチル中に懸濁させ、酢酸エチル層を水で洗浄し ９次いで蒸発乾固した。粗生成物をＩＩＰ解離剤〔アニソール：粗生成物：ｌｌ Ｐ　（１：１　：１０）　’］で０℃で６０分間処理して脱保護化し、粗生成物 の水性懸濁液を、エーテルで３回洗浄し９次いでクロロホルムで３回洗浄した。

有機層を合わせて、　　０．ＩＮ　ＨＣＩ、水、　　ＩＭ　Ｋ２ＣＯ，および飽 和ＮａＣ１で順に洗浄し、　ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧で除去した。生 成物を。

０．１％（Ｖ／Ｖ）　ＴＦＡ　ヲ含有スルアセトニトリルノ１０〜４０％（Ｖ／ Ｖ）水溶液の匂配液で溶出するバイダックＣ−１８カラムで精製し。

減圧下で乾燥させた。生成物を水に溶解するか、または適切な水溶液に溶解して 分析もしくはその他の用途に用いた。

まったく同じ方法を用いて、　Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ　（ＮＯ２）　ＤＨを最初に ３ｏｃ−Ｌ　Ａｒｇ　（ＮＯ２）　ＣＮＩ（２に変換し１次いでｔ（Ｌ　Ａｒｇ （ＮＯ□）ＣＨ２Ｃ１・ｔｌＣｌに変換した。

を、　Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＭｅ（０，Ｏｌｍｏｌ）に結合させて 、　Ｎ−ａ−ｃｂｚ−β−ｔ−ブチルエステル−Ｌ−ＡｓＰ−Ｌ−（０−ｔ−ブ チル）−ＴｈｒＯＭｅを形成させ、これを、　　ｃｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０ −ｔ−ブチル）−Ｔｈｒｉｌｌの調製について実施例８で略記した方法を用いて 、脱エステル化し、　Ｎ−α−ｃｂｚ−β−ｔ−ブチルエステル−Ｌ−Ａｓｐ− Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ叶を得た。

Ｈ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫの調製　予め調製した保護化 ジペプチドであるＮ−α−ｃｂｚ−β−ｔ−ブチルエステル−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ　 （０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨ（２，Ｏｎ＋ｍｏｌ）を、Ｎ−メチルモルホリ ン（２，ｉｍｍｏｌ）の存在下、０℃で２０分間クロルギ酸イソブチル（２，１ ｓｓｏｌ）と反応させた。Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｎｏ□）Ｃ）ＩｚＣｌ・ＨＣｌ　（ ２−Ｏｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（４ｙｄ）溶液を滴下した。０℃で２ ０分間攪拌後。

Ｎ−メチルモルホリン＜２．０ｓｓｏｌ）のＴ）ＩＦ溶液を添加した。得られた 溶液を、０℃でさらに４０分間１次いでＲＴで１時間攪拌した。得られた反応混 合物を水と食塩水（各２５ｒｒｉｌずつ）で希釈し、酢酸エチルで２回（各２５ ｍ１ずつ）抽出した。合わせた有機層を１０％クエン酸、飽和ＮａＨＣＯ３およ び食塩水（各１５ｍｆずつ）で洗浄して、　Ｍｇ５Ｏ＜で乾燥させ１次いで減圧 下で溶媒を除去してＮ−ａ−ｃｂｚ−β−ｔ−ブチルエステル−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ −（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯ２）ＣＬＣＩを得た。生成物 をＨＰ　（７ｍｆ）とアニソール（０，５ｒｒＬ１）とで０℃にて２０分間処理 した。肝を除いた後。

残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで２回（各５ｒｎｉずつ）洗浄した。有 機揮発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製の）ｌ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｔｈｒ −Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ・２ＨＦを凍結乾燥させて粉末とした。生成物の粗精製を 、０〜１．ＯＮ　ｌｌＣｌの段階的匂配液を用いるセファデックス５Ｐ−Ｃ２５ （Ｈ＋形）カラムで行い、　Ｈ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ ・２ＨＣ１を得た。さらに生成物を、１０〜５０％（Ｖ／Ｖ）のヘキサン／イソ プロパツール（１０％メタノール）匂ス崖■刊：　Ｈ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ｔｈｒ −Ｌ−＾ｒ−ＣｈＫの人配液で溶出するスペルコＬ（：ＮＨ２カラムで精製し、 減圧乾燥させた。生成物は３６０Ｍｆｌｚの’■ＮＭＲによって特性決定された 。生成物を、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解して分析もしくはその 他の用途に用いた。

Ａｓｐ−０−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ−ＤＨ（１ｍｍｏｌ）を、　　５ｍ７！のＴＩＰ中 のＮ−メチルモルホリン（１ｓｓｏｌ）と−２０℃で１０分間反応させた。５ｒ ｎ１の冷却したＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解したＨ　Ａｒｇ（ＮＯ２） ＣＨ２Ｃ１・ＨＣＩ　（ｌ　ｍｍｏｌ）を、前記の混合無水物の調製物に添加し た。

１５分後にトリエチルアミン（１ｓｓｏｌ）を含有する冷却ＴＨＦ　（２０ｍｌ ）を添加した。−２０℃で１時間１次いで室温で２時間攪拌後１反応混合物を濾 過し、濾液を酢酸エチル中に懸濁させ。

酢酸エチル層を水で洗浄し次いで蒸発乾固した。得られた粗生成物をＨＰ解離剤 〔アニソール：粗精製物：ＨＦ　（１：　１　：１０）］でＯ０にて６０分間処 理して脱保護を行い、粗生成物の水性懸濁液をエーテルで３回洗浄し９次いでク ロロホルムで３回洗浄した。合わせた有機層を、　　０−ＩＮ　ＨＣＩ、水、　 　ＩＭ　Ｋ２ＣＯ，および飽和ＮａＣ１で順に洗浄し、　Ｍｇ５Ｏｎで乾燥させ 、溶媒を減圧除去した。生成物を、０．１％（Ｖ／Ｖ）のＴＦＡを含有する１０ 〜４０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル水溶液の匂配液で溶出するバイダックＣ−１ ８カラムで精製し、減圧乾燥させた。生成物を、水もしくは適切な水溶液に溶解 して分析もしくは他の用途に用いた。

各々２５ｄずつ）で希釈し、酢酸エチルで２回（各２５ｄずつ）ａ″″　　　い るペプチドＡ Ｈ−Ｌ−Ａｒ　　Ｎｏ　　ＣＩ　Ｃｌ−ＨＣｌのｆ　′１　実施例８に記載した のと全く同じ方法を用いて、　Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）Ｏ）ｌを最初にＢ ｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）ＣＮ）１ｚに変換し９次いでｌｌ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｎ Ｏｚ）ＣＨｚＣｌ−ＦＩＣＩに変換した。

Ｎ−α−ｃｂｚ−Ｎ−ｉｍ−トシルーＬ−Ｈｉｓ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔ ｈｒＯＨの８１Ｎ−α−Ｃｂｚ−Ｎ−ｉ＋＊−トシルーＬ−ＦＩｉｓＯＨ（０， ０１ｓｏｌ）をＬ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＭｅ　（０，０１ｓｏｌ）に 結合させて、　Ｎ−ｃｒ−ｃｂｚ−Ｎ−ｉｓ−トシル−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−（０− ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＭｅを形成させ、　ｃｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ −ブチル）−Ｔｈｒｏｌ（の調製について実施例８に概略説明した方法を用いて 、カップリング工程でのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールの使用を省略して９ 上記のＮ−α−ｃｂｚ−Ｎ−ｉｍ−トシルーＬ−Ｈｉｓ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル ）−ＴｈｒＯＭｅを脱エステル化して、　Ｎ−α−ｃｂｚ−Ｎ−ｉｓ−トシルー Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨを得た。

Ｈ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒ　−ＣＭＫの量　　予め調製した保護化 ジペプチドであるＮ−ｃｒ−ｃｂｚ−Ｎ−ｉｍ−トシル−し−旧５−Ｌ−（０− ｔ−）゛チル）−ＴｈｒＯＨ（２，０＋＊ｍｏｌ）を、Ｎ−メチルモルホリンの 存在下，クロルギ酸イソブチル（０．２９ｍ．２．１ｓｓｏｌ）と、ｏ℃テ２０ 分間反応させた，　Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｎｏｔ）ＣＨｘＣｌ−ＨＣＩ（０．６０ｇ ，２．０ｓｓｏｌ）のジメチルホルムアミド（４ｍ）溶液を滴下した。０″Ｃで ２０分間攪拌した後，Ｎ−メチルモルホリン（０．２２ｍ，　２．０ｍｍｏｌ） のＴＨＦ溶液を添加した。得られた溶液を０℃でさらに４０分間撹拌し。

次いでＲＴで１時間攪拌した．反応混合物を水および食塩水（抽出した。酋わせ た有機層そ，ｌυ％クエン殻．妃和ＮａＨＣＵ，および食塩水（各１５ｄずつ） で洗浄し，　　ＭｇＳＯ４で乾燥させ．そして溶媒を減圧下で除去してＮ−αー ｃｂｚーＮーｉ＋ｍートシルーＬ−Ｈｉｓ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ− Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）ＣＨｚＣｌを得た。生成物を，　８Ｆ（７ｄ）とアニソー ル（０．５ｍ）とで、０℃にて２０分間処理した。

ＩＰを・除去した後．残渣を冷水で希釈し．ジエチルエーテルで２回（各５ＩＩ ｉずつ）洗浄した．有機揮発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製のＨ−Ｌ− Ｈｉｓ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ−２ＨＦを凍結乾燥させて粉末とした 。生成物の粗精製を．Ｏ〜１，Ｏ　ＮＨＣＩの段階的勾配液を用いるセファデッ クスｓｐ−ｃ２５（ＩＩ”形）カラムで行い，　Ｈ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ｔｈｒ− Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ−２ＨＣＩを得た。得られた生成物を，さらに、１０〜５０ ％Ｖ／Ｖヘキサン／イソプロパツール（１０％メタノール）勾配液で溶出するス ペルコｔ，ｃＮｎｚカラムで精製し，減圧乾燥させた。生成物は３６０ＭＨｚの ′ＨＮＭＲで特性決定された．生成物は，水．メタノールもしくは適切な水溶液 に溶解させて，分析もしくはその他の用途に用いた。

法を　いるペプチド人 Ｈ−Ｌ−Ａｒ　（ＮＯ　）ＣＩ　ＣＩ−ＨＣＩの量　　　実施例８（口）参照。

ＩＩ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒ−ＣＭＫの１　　予め調製したペプチドであるＮ− 　αーＢｏｃーＮーｉｓーＣｂｚ−Ｈｉｓ−０−Ｂｚｌ−ＴｈｒＯＨ（ｌｓｍｏ ｌ）を、　ＴＩｉＦ　Ｓｄ中のＮ−メチルモルホリン（１ｓｓｏｌ）と−２０℃ で１０分間反応させた。

冷却したＮ．Ｎ−ジメチルホルムアミド５Ｉ１１に溶解したＨ−Ａｒｇ　（ＮＯ ｘ）ＣＩＩＣＩ　−ＨＣｌ　（１−■ｏｌ）を前記混合無水物の調製物に添加し た．１５分後に、トリエチルアミン（１＋ｕ＋ｏｌ）を含有する冷却ＴＨＦ　（ ２０ｄ）を添加した。−２０°Ｃで１時間１次いで室温で２時間攪拌した後１反 応混合物を濾過した。その濾液を酢酸エチル中に懸濁させ、酢酸エチル層を水で 洗浄し、蒸発乾固した。粗生成物を、ＨＦ解離剤〔アニソール：粗生成物：　１ （Ｆ（１：１：１０）　）で、６０分間、０°Ｃで処理して脱保護化し、粗生成 物の水性懸濁液をエーテルで３回洗浄し１次いでクロロホルムで３回洗浄した。

合わせた有機層を、　Ｏ，ｌＮ　　ＨＣＩ　、水、　ＩＭ　Ｋ、Ｃｏ３および飽 和ＮａＣ１で順番に洗浄し、　　Ｍｇ５Ｏ，で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し た。生成物を、０．１％（Ｖ／Ｖ）のＴＦＡを含有するアセトニトリルの１０〜 ４０％（Ｖ／Ｖ）水溶液の勾配液で溶出するバイダックＣ−１８カラムで精製し 、：＄ｉ圧乾燥させた。生成物を水もしくは適切な水溶液に溶解して２分析もし くはその他の用途に用いた。

実施■旦：　Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒ　−ＣＭＫの４（ａｒ”　 法を　いるペプチド人 ）！−Ｌ−Ａｒ　（Ｎｏ２）ＣＨｚＣ１４１Ｃ１の二　＋　実施例８に記載した のと全く同じ方法を用いて、　Ｂｏｃ−Ｌ−＾ｒｇ−（ＮＯｘ）ＯＨを最初にＢ ｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−（Ｎ（ｈ）ＣＮＨｚに変換し１次いでＨ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｎ（ ｈ）ＣＨｚＣｌ・ＨＣｌに変換した。

Ｃｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯ）ｌのＱ　　Ｃｂｚ− Ｌ−ＬｅｕＯ）１（０，０１ｓｏｌ）をＬ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＭｅ （０，０１ｓｏｌ）に結合させて。

Ｃｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＭｅを形成させ、これ を、　Ｃｂｚ−Ｌ−＾５ｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨの調製につい て実施例８で概略説明した方法を用いて脱エステル化して、　Ｃｂｚ−Ｌ−Ｌｅ ｕ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨを得た。

Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒ　−ＣＭＫの８１　予め調製した保護化 ジペプチドであるＣｔ＋ｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯ） ！　（２，Ｏｎ＋ｍｏｌ）を。

Ｎ−メチルモルホリン（０，２４１ｄ、２．１ｗａ＋ｏｌ）の存在下、クロルギ 酸イソブチル（０，２９ｄ、２．１ｍｓ＋ｏｌ）と、０°Ｃで２０分間反応させ た。Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）ＣＨｚＣｌ・ＨＣＩ　（０，６ｇ、２．０＋＋＋ ｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（４ｄ）溶液を滴下した。０°Ｃで２０分間攪 拌した後。

Ｎ−メチルモルホリン（０，２２Ｉ１１．２．０ｍｓ＋ｏｌ）含有のＴ）ＩＦを 添加した。得られた溶液を０°Ｃでさらに４０分間攪拌し９次いでＲＴで１時間 撹拌した。反応混合物を水と食塩水で希釈しく各２５ｄずつ）、酢酸エチルで２ 回（各２５Ｍ１ずつ）抽出した。合わせた有機層を、１０％クエン酸、飽和Ｎａ ＨＣＯ３および食塩水（各１５ｄずつ）で洗浄し、　　Ｍｇ５Ｏ，で乾燥させ、 溶媒を減圧下で除去して、　Ｃｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔ ｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）ＣＨｚＣｌを得た。生成物をＨＦ（７Ｉ１１りとア ニソール（０，５Ｉｎｌ）とで、０″Ｃで２０分間処理した。ＩＦを除去した後 、残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで２回（各５ｄずつ）洗浄した。有機 揮発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−ｔｈｒ−Ｌ− Ａｒｇ−ＣＭＫ−２ＨＦを凍結乾燥させて粉末とした。生成物の粗精製を、０〜 １．ＯＮ　）ＩｃＩの段階的勾配液を用いるセファデックス５Ｐ−Ｃ２５（）ｌ 　”形）カラムで行い、　Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ− ２ＨＣ１を得た。生成物を、１０〜５０％（Ｖ／Ｖ）のヘキサン／イソプロパツ ール（１０％メタノール）勾配液で溶出するスベルコＬＣＮＨｚカラムでさらに 精製し、減圧下で乾燥させた。３６０ＭＨｚの’ＨＮＭＲによって生成物の特性 を決定した。生成物を、水、メタノールまたは適切な水溶液に溶解して２分析も しくはその他の用途に用いた。

Φ　　法を　いるペプチド人 ）１−Ａｒ　（Ｎ（ｈ）ＣＨｚＣＩ−）ＩＣＩの１０′１　予め調製したペプチ ドであるＢｏｃ−Ｌｅｕ−０−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ−０）１　（１ｍｏ＋ｏｌ）を、 Ｔ）ＩＦ５ｄ中のＮ−メチルホリン（１，ｍｍｏｌ）と−２０°Ｃで１０分間反 応させた。５ｄの冷却したＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解したＨ−Ａｒｇ 　（Ｎ（ｈ）ＣＨｚＣｌ　−ＨＣＩ（Ｉｍｍｏｌ）を前記混合無水物の調製物に 添加した。１５分後にトリエチルアミン（Ｉｍｍｏｌ）を含有する冷却Ｔ）ＩＦ （２０ｄ）を添加した。−２０°Ｃで１時間２次いで室温で２時間攪拌した後２ 反応混合物を濾過した。その濾液を酢酸エチル中に懸濁させ。

酢酸エチル層を水で洗浄し１次いで蒸発乾固した。得られた粗生成物をＨＦ解離 剤〔アニソール：粗生成物：　ＩＦ（１：１：１０）　）で０°Ｃで６０分間処 理して脱保護化し、粗生成物の水性懸濁液をエーテルで３回洗浄し１次いでクロ ロホルムで３回洗浄した。有機層を合わせて、　０．１Ｎ　ＨＣＩ、水、　ＩＭ 　ＫｚＣＯ３および飽和ＮａＣ］で順に洗浄し、　Ｍｇ５Ｏ，で乾燥させ、溶媒 を減圧下で除去した。生成物を、０．１％（Ｖ／Ｖ）　ＴＦＡを含有するアセト ニトリルの１０〜４０％（Ｖ／ν）水溶液の勾配液で溶出するバイダックｃ−１ ８のカラムで精製し、減圧下で乾燥させた。生成物を水もしくは適切な水溶液に 溶解して１分析もしくはその他の用途に用いた。

実ｈ」比１Ｈ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒ　−ＣＭＫのＡａ′六Ｓ　′ 　　いるペプチド人 Ｈ−Ｌ−Ａｒ　（Ｎｏ　　ＣＨＣ１−ＨＣｌのｉ、′「Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｎ ｏｔ）０）１を、実施例８に記載したのと全く同様の方法を用いて、最初にＢｏ ｃ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）ＣＮＨｚに変換し１次いで、　Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯ ｘ）ＣＨｚＣｌ−ＨＣｌに変換する。

Ｃｂｚ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨの富、′Ｃｂｚ−Ｌ −Ｇ１ｎＯＨ（０，０１ｓｏｌ）を、　Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＭｅ 　（０，０１ｓｏｌ）に結合させて、　Ｃｂｚ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブ チル）−ＴｈｒＯＨを形成させ１次し１でこの生成物を、　Ｃｂｚ−Ｌ−＾５ｎ −Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨの調製について実施例８で概略説明した 方法を用いて脱エステル化し、　Ｃｂｚ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル） −ＴｈｒＯＨを得る。

Ｈ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒ−ＣＭＫのｉａ′　　予め調製した保護 化ジペプチドであるＣｂｚ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨ （２，０＋＋ｕｗｏｌ）を、Ｎ−メチルモルホリン（０，２４１Ｒ１，２，Ｉｍ ｍｏｌ）の存在下、クロルギ酸イソブチル（０，２９ｄ、２．１ｏｍｏｌ）と０ °Ｃで２０分間反応させる。Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｚ）ＣＨｚＣｌ−ＨＣＩ　（ ０，６０ｇ、２．Ｏｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（４ｄ）　溶液を滴下す る。０°Ｃで２０分間攪拌した後、Ｎ−メチルモルホリン（０，２２ｄ、２．抛 ｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を添加する。得られた溶液を、０°Ｃでさらに４０分間攪 拌し９次いでＲＴで１時間攪拌する。反応混合物を水と食塩水（各２５Ｍ１ずつ ）で希釈し、酢酸エチルで２回（各２５Ｊｄずつ）抽出する。

有機層を合わせて、１０％クエン酸、飽和ＮａＨＣＯ３および食塩水（各１５ｄ ずつ）で洗浄し、　　ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、　Ｃｂｚ −Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）ＣＨｚ Ｃｌを得る。生成物を、肝（７ｄ）とアニソール（ｏ、５１１Ｉ１．）とでｏ″ ｃにて２０分間処理する。）ＩＰを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチル エーテルで２回（各５ｄずつ）洗浄する。有機揮発成分を減圧下で除去し、得ら れた粗精製Ｈ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ・２）ＩＦを凍結 乾燥させて粉末とする。生成物の粗精製を、０〜１．０　Ｎ　ＨＣＩの段階的勾 配液を用いるセファデックス５Ｐ−Ｃ２５（Ｈ”形）カラムによって行ない、　 Ｈ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ−２ＨＣ１を得る。生成物を 、　１０〜５０％（Ｖ／ν）ヘキサン／イソプロパツール（１０％メタノール） 勾配液で溶出するスペルコＬＣＮＨ，カラムでさらに精製し、減圧乾燥させる。

生成物は３６０ＭＨｚのＩＨＮＭＲで特性決定させる。生成物を、水、メタノー ルもしくは適切な水溶液に溶解して１分析もしくはその他の用途に用いる。

伽　　法を　いるペプチド人 Ｆｌ−Ｌ−Ａｒ　（ＮＯｔ）ＣＩ　Ｃ１４Ｃ１のｔ、′「　　実施例８　（ｂ） 参照。

Ｈ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−＾ｒ−ＣＭＫのＵ　　予め調製したペプチドであるＢｏｃ −Ｇｉｎ−０−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ−ＯＨ（ＩＩＩＩｎ＋ｏｌ）を、　ＴＨＦ　ＳＩ ｄ中のＮ−メチルモリホリン（ＩＩＩＩＩｌｏｌ）と−２０°Ｃで１０分間反応 させる。５−の冷却したジメチルホルムアミドに溶解したＨ−Ａｒｇ（Ｎ（ｈ） ＣＨｚＣ１４Ｃ１（１＋ｉ＋＊ｏｌ）を、・前記混合無水物の調製物に添加する 。１５分後に。

トリエチルアミン（１ｍ＋５ｏｌ）含有の冷却したＴＨＦ　（２０ｄ）を添加す る。−２０℃で１時間２、次いで室温で２時間攪拌した後。

反応混合物を濾過した。その濾液を酢酸エチル中に懸濁させ。

酢酸エチル層を水で洗浄し９次に蒸発乾固する。粗生成物を。

在下、クロルギ酸イソブチル（０，２９ＩＩＩｌ、２−１ｎ＋ｍｏｌ）と０°Ｃ で２０ノｘｗｗ　Ｉ；ピー　−ＩＰ　　ＬＬ　フ　　　　１雷　　豐　　烏　　 −７−１八　　−ハ１１　　　＾１１瞥ｎ噛　　ｌ＾　　−＾　　@＾　八　　 　　　１＼　＾ 肝解離剤〔アニソール：粗生成物：　ＨＦ（１：１：１０）　）　テＯ’Ｃニテ ６０分間処理して脱保護化し、粗生成物の水性懸濁液をエーテルで３回洗浄し２ 次にクロロホルムで３回洗浄する。有機層を合わせて、　　０．１Ｎ　ＨＣＩ、 水、　　ＬＭ　Ｋ、ＣＯ，および飽和ＮａＣｌ　Ｔ：順に洗浄し、　　Ｍｇ５Ｏ ，で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去する。

生成物を、０．１％（Ｖ／Ｖ）のＴＦＡを含有するアセトニトリルの１０〜４０ ％（Ｖ／Ｖ）水溶液の勾配液で溶出するバイダックＣ−１８カラムで精製し、ｆ Ｉｉ圧下で乾燥させる。生成物を水もしくは適切な水溶液に溶解して２分析もし くはその他の用途に用いる。

Ｈ−Ｌ−Ａｒ　（ＮＯｘ）ＣＨｚＣｌ−ＨＣｌｏ）ｉｌ　’　　Ｂｏｃ−Ｌ−Ａ ｒｇ（ＮＯｘ）ＯＢを、実施例８に記載したのと全く同じ方法を用いて、最初に Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）ＣＮＨｚニ変換し１次イテＨ−Ｌ−Ａｒｇ　（Ｎ Ｏ２）ＣＨｚＣｌ　４Ｃ１に変換する。

Ｃｂｚ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）　−Ｔｈｒ ＯＨの：　１Ｃｂｚ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨ（０，０１ｍｏｌ） を、　Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＭｅ　（０，０１ｗｏｌ）に結合させ て、　Ｃｂｚ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）Ｔｈ ｒＯＭｅを形成させ１次いでこの生成物をＣｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ− ブチル）−ＴｈｒＯＨの調製について実施例８に概略説明し４た方、法を用いて 脱エステル化して、　Ｃｂｚ−Ｌ−ＣＯ−ｔ−ブチル）　４ｈｒ−Ｌ−（０−ｔ −ブチル）−ＴｈｒＯＨを得る。

Ｈ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒ　−ＣＭＫのＵ　　予め調製した保護化 ジペプチドであるＣｂｚ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ−Ｌ−（０−ｔ−ブ チル）−ＴｈｒＯＨ（２，０ｍｍ＋ｏｌ）を、Ｎ−メチルモルホリン（０，２４ ａｄ！、２．１ｗ＠ｏｌ）の存Ｈ−Ｌ−Ａｒ　（ＮＯ）ＣＨＣ１−）１ｃＩの− リ　実施例８（ｂ）参照。

分闇反沁させる。Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｎ（ｈンＣＪＩｚＣ１・、ＨＣＪ　（０，６ ０ｇ、２．Ｏｍａ＋ｏｌ）のジメチルホルムアミド（４ｊ１１）溶液を滴下する 。０°Ｃで２０分間攪拌した後、Ｎ−メチルモルホリン（０，２２ｍ　、　２． ０１１１１１０１）含有のＴＨＦ溶液を添加する。得られた溶液を、０℃でさら に４０分間。

次いでＲＴで１時間攪拌する。得られた反応混合物を水と食塩水（各２５ｄずつ ）で希釈し、酢酸エチルで２回（各２５ｄずつ）抽出する。合わせた有機層を、 　１０％クエン酸、飽和ＮａＨＣＯ，および食塩水（各１５ａｄずつ）で洗浄し 、　Ｍｇ５Ｏ，で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、　Ｃｂｚ−Ｌ−（０−ｔ− ブチル）−Ｔｈｒ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）Ｃ ＨｘＣｌを得る。生成物を、　ＨＦ（７ｄ）とアニソール（０，５ｄ）とで０℃ にて２０分間処理する。ＨＰを除去した後。

残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで２回（各５ｄずつ）洗浄する。有機揮 発成分を減圧下で除去し、得られた粗精製Ｈ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａ ｒｇ−ＣＭＫ−２ＨＦを凍結乾燥させて粉末とする。

生成物の粗精製を０〜１．０　Ｎ　ＨＣＩの段階的勾配液を用いるセファデック ス５Ｐ−Ｃ２５（Ｈ”形）カラムで行い、　Ｈ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ− ／ｌｒｇ−ＣＭＫ・２ＨＣ１を得る。生成物を、１０〜５０％（ｖ／ｖ）ヘキサ ン／イソプロパツール（１０％メタノール）勾配液で溶出するスペルコＬＣＮＨ ｚカラムでさらに精製し、減圧乾燥させる。生成物は、　３６０ＭＨｚの’ＨＮ ＭＲによって特性決定される。生成物を水。

メタノールまたは適切な水溶液に溶解して２分析もしくはその他の用途に用いる 。

いるペブチ゛４ ｎ−１１１ｒ−１１１１−−Ｌ−Ｍｒ　−Ｌｌ「ｌ轟Ｖ−丁６’Ｊ　１ｌｉｌ　 表Ｌ／　１こヘノア「ＣのΦＢｏｃ−０−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ−０−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ −ＯＨ（１ｍｍｏｌ）を、　ＴＨＦ　５１１ｄ！中のＮ−メチルモルホリン（１ ｍｍｏｌ）と−２０℃で１０分間反応させる。５戚の冷却したＮ、Ｎ−ジメチル ホルムアミドに溶解したＨ−Ａｒｇ（ＮＯ□）ＣＨＩＣＩ−ＨＣＩ　（１ｓｓ＋ ０１）を前記混合無水物の調製物に添加する。１５分後に、トリエチルアミン（ １ｍｍｏｌ）を含有する冷却したＴＨＦ（２０ｍ）を添加する。−２０℃で１時 間１次いで室温で２時間攪拌した後１反応混合物を濾過し、その濾液を酢酸エチ ル中に懸濁させ、酢酸エチル層を水で洗浄し１次いで蒸発乾固する。得られた粗 生成物をＩＰ解離剤〔アニソール：粗生成物：ＨＦ（１：　１：１０）〕でＯ℃ にて６０分間処理して脱保護化し、粗生成物の水性懸濁液をエーテルで３回洗浄 し２次いでクロロホルムで３回洗浄する０合わせた有機層を、　０．Ｉ　Ｎ　Ｈ ＣＩ、水、　　ＩＭ　　ＫｚＣＯｌおよび飽和ＮａＣｌで順に洗浄し、　Ｍｇ５ Ｏ，で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去する。生成物を、０．１％（Ｖ／Ｖ）　Ｔ ＦＡを含有するアセトニトリルの１０〜４０％（Ｖ／Ｖ）水溶液の勾配液で溶出 するバイダックＣ−１８カラムで精製し、減圧下で乾燥させる。生成物を水もし くは適切な水溶液に溶解して２分析もしくはその他の用途に用いる。

（以下余白） 実施例１４　：　ｔｌ−Ｌ、−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫの合成正確に同じ方 法を用いて、所望のクロロメチルケトンを調製することができる。

Ｈ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫの調製　Ｃｂｚ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル） −ＴｈｒＯＨ（２、Ｏｍｍｏｌ）を、Ｎ−メチルモルホリン（０，２４ｍＡ、　 　２．１ｍｍｏｌ＞の存在下で、クロルギ酸イソブチル（０，２９ｍ１．　２． １ｍｍｏｌ）と、０℃で２０分間反応させる。トＬ−Ａｒｇ（ＮＯ２）ＣＨ２Ｃ ｌ−ＨＣｌ　（０，６０ｇ、２．Ｏｍｍｏｌ＞のジメチルホルムアミド（４ｄ） 溶液を滴下する。０℃で２０分間攪拌した後、Ｎ−メチルモルホリン（０，２２ ｎｌ、　２．０＋ｎｍｏｆ）のＴＨＦ溶液を添加する。得られた溶液を、０℃で さらに４０分間次いでＲＴで１時間攪拌する。反応混合物を水と食塩水（各２５ ｒｄずつ）で希釈し、酢酸エチルで２回（各２５ｍ１．ずつ）抽出する。配合し た有機層を、１０％クエン酸溶液、飽和ＮａＨＣＯａ溶液および食塩水（各１５ ｒＩＬｌずつ）で洗浄し、　Ｍｇ５Ｏｎで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、　 Ｃｂｚ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｎ［１，）ＣＨ２Ｃｌ を得る。生成物を、肝（７蔵）とアニソール（０，５ｍ１）とで０℃にて２０分 間処理する。ＩＦを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで２回 （各５ｒｒＬｌずつ）洗浄する。

有機揮発成分を減圧下で除去し９次いで得られた粗精製のＨ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ− Ａｒｇ−ＣＭＫ−２１１Ｆを凍結乾燥させて粉末にする。生成物を。

０〜１．ＯＮ　）Ｉｔ：Ｉの段階的勾配液を用いるセファデックス５Ｐ−Ｃ２５ （Ｈ”形）カラムで粗精製して、　Ｈ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−４：ＭＫ・２ ＨＣＩを得る。生成物を、１０〜５０％（Ｖ／Ｖ）ヘキサン／イソプロパツール （１０％メタノール）勾配液で溶出するスペルコＬ　ＣＮ　ｔｌ□カラムでさら に精製し、減圧下で乾燥する。生成物を３６０ＭＨｚの’ＨＮ畦で特性決定をす る。生成物を、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解して分析もしくはそ の他の用途に用いる。

実施例１５　：　Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−り−Ａｒｇ−ＣＭＫの合成Ｃｂ ｚ−Ｄ−ＬｅｕＯＨをそのし一異性体の代わりに用いること以外は。

実施例１１に記載したのと同様にして、　Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａ ｒｇ−ＣＭＫを合成した。

く同じ方法を用いて、　Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｚ）叶をまずＢｏｃ−Ｌ−Ａ ｒｇ　（ＮＯ２）ＣＮＨ２に変換し９次いでＩ（−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｚ）Ｃｔ１ ２Ｃ１−ＨＣＩに変換した。

Ｃｂｚ−Ｄ−ＰｈｅＯＨ（０，Ｏｌｍｏｌ）をＬ−（Ｃ１−ｔ−ブチル）−Ｔｈ ｒＯＭｅ　（０，Ｏｌｍｏｌ）に結合させてＣｂｚ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−（０−ｔ −ブチル）−ＴｈｒＯＭｅを調製し１次いでこの生成物を、　Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｓ ｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｔｈｒ［ｌＨの調製について実施例８に概略説明 した方法を用いて脱エステル化してＣｂｚ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル ）−ＴｈｒＯＨを得た。

）１−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫの調製　予め調製した保護 化ジペプチドのＣｂｚ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯＨ（２ ，Ｏｍｍｏｌ）を。

クロルギ酸イソブチル（０，２９ｍｊ！、　２．１ｍｍｏｌ）と、Ｎ−メチルモ ルホリン（０，２４ｎｌ、　２．１ｍｍｏｌ）の存在下で、０℃で２０分間反応 させた。Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｎｏｗ）ＣＨ２Ｃｌ−ＨＣＩ　（０，６０ｇ、　２． Ｏｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（４ｍｌ）溶液を滴下した。０℃で２０分 間攪拌した後、Ｎ−メチルモルホリン（０，２２ｍ１２．２．　Ｏｍｍｏｌ）の ＴＨＦ溶液を添加した。得られた溶液を、０℃でさらに４０分間次いでＲＴで１ 時間攪拌した。反応混合物を水と食塩水（各２５ｍ１ずつ）で希釈し、酢酸エチ ルで２回（各２５ｒｎＩ！、ずつ）抽出した。有機層を合せて１０％のクエン酸 溶液、飽和ＮａｔｌＣＯ３および食塩水（各１５ｍ１ずつ）で洗浄し、　　Ｍｇ ５Ｏｉで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去してＣｂｚ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−（０−ｔ −ブチル）　Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯ２）（：Ｈ２Ｃ１を得た。

生成物をＨＦ（７１ｎｌ）とアニソール（０，５ｍｆ）とで、０℃にて２０分間 処理した。ＨＦを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチルエーテルで２回（ 各５−ずつ）洗浄した。有機揮発成分を減圧下で除去し１次いで得られた粗精製 のＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ・２１１Ｆを凍結乾燥させ て粉末とした。生成物を、　０〜１、ＯＮ　）ＨＣｌの段階的勾配液を用いるセ ファデックス　５Ｐ−Ｃ２５（］１゛形）カラムで粗精製を行い、　ｔｌ−Ｄ− Ｐｈｅ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−（１：ＭＫ’２Ｈ［：１を得た。生成物を、 １０〜５０％（Ｖ／Ｖ）ヘキサン／イソプロパツール（１０％メタノール）勾配 液で溶出するスペルコＬＣＮ）１２カラムでさらに精製し、減圧で乾燥させた。

生成物を３６０ＭＨｚの１ＨＮＭＲで特性決定を行った。生成物を、水、メタノ ールもしくは適切な水溶液に溶解して分析もしくはその他の用途に用いた。

実施例１７　：　Ａｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ、−Ｔｈｒ−Ｌ−八ｒｇ−ＣＭＫの合成 ｔｌ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫを実施例４に記載したのと 同様にして合成した。得られたＨ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭ Ｋの３６１．１ｍ０Ｉ（水でｌｄにした１６．４ｍｇ）に、１当量のＩＮ　Ｎａ ＯＨを添加し。

次いで３０％過剰の無水酢酸と、さらに１当量のＩＮ　ＮａＯＨとを加えた。得 られた溶液を２時間インキュベートし、凍結乾燥させて、セファデックス５Ｐ− Ｃ２５カラムで精製した。生成物を３６０ＭＨｚの’ＨＮＭＲで特性を決定した 。

Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫを実施例４に記載したのと同 様にして合成した。得られたＨ−Ｌ−Ｌｅｕ−１、−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−（： ＭＫの４３．ｃＩｒｎｏｌ（水で１ｒｎｌにした１９．８ｍｇ）に、１当量のＩ Ｎ　ＮａＯＨ、１，４当量のトシル（トルエンスルホニル）塩化物、　　２ｍｊ ２のアセトニトリルふよび追加の１当量のＩＮ　ＮａＯＨを順に添加した。得ら れた溶液を攪拌し９次いで６時間静置し９次いでアセトニトリルをロータリーエ ヴアボレーションさせて除去した。生成物をクロマトグラフィで精製し９次いで ３６０Ｍｔｌｚの’ＨＮＭＲで特性を決定した。

Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫを実施例４に記載したのと同 様にして合成した。得られたＨ−Ｌ−１、ｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭ Ｋの３７Ｊｓｏｌ（０，３−の水を添加した１７■）に、１当量のＩＮ　ＮａＯ Ｈ、１，４当量のダンシル（５−ジメチルアミノナフタレンスルホニル）塩化物 、０．５ｍｌのアセトニｌ−ＩＪルおよび追加の１当量のＩＮ　Ｎａ叶を順に添 加した。攪拌した後、得られた溶液をＲＴで６時間静置し９次いで一２０℃で１ ６時間インキュベートした。アセトニトリルを［］−タリーエヴアポレーション によって除去した。

生成物をクロマトグラフィで精製し１次に３６０ＭＨｚの’ＩＩ　ＮＭＲで特性 決定をした。

確に同じ方法を用いて、　Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ　（ＮＯ２）　ＯＨを最初にＢｏ ｃ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯ２）ＣＮＩＩ２に変換し９次にＨＬ−Ａｒｇ（ＮＯ２）Ｃ ＨｚＣｌ・ＨＣＩに変換した。

Ｃｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−（Ｑ−ｔ−ブチル）−ＳｅｔＯｆ（の調製　ＣＢｚ− Ｌ−Ｌｅｕ［ｌＨ（０，Ｏｌｍｏｌ）をＬ−（０−ｔ−ブチル）−ＳｅｒＯＭｅ （０，Ｏｌｍｏｌ）に結合させてＣｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル） −ＳｅｔＯｌｅを調製し９次に［：ｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル） −ＴｈｒＯＨの調製について実施例８に概略記載した方法を用いて、脱エステル 化してＣｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−３ｅｒＧｔｌを得た。

トＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫの調製　予め調製した保護化ジ ペプチドのＣｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−３ｅｒＯｆｌ　（２ ，０ＩＩ１ｍｏｌ）を、　Ｎ−メチルモルホリン（０，２４ｍ１．２．１ｍｍｏ ｌ）の存在下、０℃で２０分間、クロルギ酸イソブチル（０，２９ｒｒ１１．２ ．１ｍｍｏｌ）と反応させた。

ＨＬ−Ａｒｇ（ＮＯｘ）Ｃｆ１２ＣＩ−ＨＣＩ　（０，６０ｇ％２゜Ｏｍｍｏｌ ）のジメチルホルムアミド（４１ｒＬ１）溶液を滴下した。０℃で２０分間攪拌 した後。

Ｎ−メチルモルホリン（０，２２ｒＦ１１．２．Ｏｍｍｏｌ）のＴＩＦ溶液を添 加した。得られた溶液を０℃でさらに４０分間１次いでＲＴで１時間攪拌した。

得られた反応混合物を水と食塩水（各２５ｄずつ）で希釈し、酢酸エチルで２回 （各２５ｍｆずつ）抽出した。有機層を合せて、　１０％のクエン酸溶液、飽和 Ｎａ）ｌｃＯ＊および食塩水（各１５ｒｎｌずつ）で洗浄し、　　ＭｇＳＯ４で 乾煙させ、溶媒を減圧下で除去してＣｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル ）−Ｓｅｔ−Ｌ−Ａｒｇ　（ＮＯ２）ＣＨ，Ｃ１を得た。この生成物をｌ（Ｆ（ ７ｍｌｉりとアニソール（０，５ｍｆ）とで。

０℃にて２０分間処理した。ＩＦを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチル エーテルで２回（各５ｒ１１１ずつ）洗浄した。有機揮発成分を減圧下で除去し 、得られた粗精製のトＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−３ｅｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ・２ＨＰを 凍結乾燥させて粉末とした。生成物の粗精製を、　θ〜１．０　Ｎ　１（ＣＩの 段階的勾配液を用いるセファデックｘ　５Ｐ−Ｃ２５（Ｈ＋形）カラムによって 行って、　Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−３ｅｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ・２ＨＣ１を得た 。コノ生成物を、１０〜５０％（ｖ／ｖ）ノヘキサン／イソプロパツール（１０ ％メタノール）勾配液で溶出するスペルコＬＣＮＨ２カラムでさらに精製し、減 圧で乾燥させた。

生成物を３６０Ｍｔｌｚの’ＩＩ　ＮＭＲで特性を決定した。生成物を、水。

メタノールもしくは適切な水溶液に溶解し９分析もしくはその他の用途に用いた 。

全く同様にして、　Ｂｏｃ−Ｌ−八ｒｇ（Ｎｏ２）ＯＨを、まずＢｏｃ−Ｌ−Ａ ｒｇ　（ＮＯ２）ＣＮＩ（２に変換し１次にＨ−Ｌ　Ａｒｇ（Ｎｏｗ）ＣＨ２［ ：ｌ・Ｈｃｌに変換した。

Ｃｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−ＰｒｏＯＨの調製　Ｃｂｚ−Ｌ−ＬｅｕＯＨ（０，Ｏ ｌｍｏｌ）をＬ−ＰｒｏＯＭｅ　（０，Ｏｌｍｏｌ）に結合させて、　Ｃｂｚ− Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−ＰｒｏＯＭｅを調製し１次いでＣｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０ −ｔ−ブチル）−ＴｈｒＯｆ（の調製について実施例８に概略説明した方法を用 いて脱エステル化してＣｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−ＰｒｏＯＨを得た。

Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫの調製　予め調製された保護 化ジペプチドの、　Ｃｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｒｏｏｌ（（２，Ｏｍｍｏｌ） を、Ｎ−メチルモルホリン（０，２４ｒｎ１．２．１ｍｍｏｌ）の存在下、クロ ルギ酸イソブチル（０，２９ｎ＋１．　２．１ｍｍｏｌ）と反応させた。Ｈ−Ｌ −Ａｒｇ（ＮＯ２）Ｃ１１２Ｃ１−ＨＣＩ　（０，６０ｇ、２．Ｏｍｍｏｌ＞の ジメチルホルムアミド（４ｍｌ）溶液を滴下した。０℃で２０分間攪拌した後、 Ｎ−メチルモルホリン（０，２２ｍｊ？、　２．Ｏｍｍｏｌ）のＴＩＦ溶液を添 加した。得られた溶液を０℃でさらに４０分間９次いでＲＴで１時間攪拌した。

反応混合物を水と食塩水（各２５ｄずつ）で希釈し、酢酸エチルで２回（各２５ ｍ１ずつ）抽出した。有機層を合せて１０％のクエン酸溶液、飽和ＮａＨＣＯ， および食塩水（各１５ｄずつ）で洗浄し、　ＭｇＳＯ４で乾煙し、溶媒を減圧下 で除去して、　Ｃｂｚ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＮＯ２）［：１（２ Ｃ１を得た。生成物をＩＦ（７ｍｆ）とアニソール（０，５ｍｊｌりとで。

０℃にて２０分間処理した。ＨＰを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエチル エーテルで２回（各５ｒＩＬｌずつ）洗浄した。有機揮発成分を減圧下で除去し ９次いで得られた粗精製Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ・２ ＨＦを凍結乾燥させて粉末とした。生成物の粗精製を、０〜１．ＯＮ　ＨＣＩの 段階的勾配液を用いるセファデックス　５Ｐ−Ｃ２５（Ｉ（＋形）カラムによっ て行い、　Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ−２）ＩＣＩを得 た。コノ生成物を、１０〜５０％（ｖ／ｖ）ヘキサン／イソプロパツール（１０ ％メタノール）勾配液で溶出するスベルコＬＣＮＨ，カラムでさらに精製し９次 に減圧乾燥した。生成物を３６０ＭＨｚの’ＨＮＭＲで特性決定した。生成物を 、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解し９分析もしくはその他の用途に 用いた。

）１−Ａｒｇ（ＮＯ，）ＣＨ，Ｃ１−Ｈ［：ｔの調製　実施例８に記載したのと 全く同じ方法を用いて、　Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ　（ＮＯ２）口Ｈを、最初にＢｏ ｃ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯｉ）ＣＮｔ１２に変換し次にＨ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯ，）Ｃ ）１．ＣＩ・ＨＣｌに変換した。

Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−Ｓｅｒｏｌ（の調製　Ｃｂｚ− Ｌ−ＡｓｎＯｔｌ　（０、Ｏｌｍｏｌ＞をＬ−（０−ｔ−ブチル）−３ｅｒＯＭ ｅ　（０，Ｏｌｍｏｌ）に結合させてＣｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチ ル）−３ｅｒＯＭｅを形成させ１次いでＣｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブ チル）−ＴｈｒＯＨの調製について実施例８に概略説明した方法を用いて脱エス テル化して、　Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−ＳｅｒＯＨを得 た。

Ｈ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫの調製　予め調製した保護化 ジペプチドの、　Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−３ｅｒＯＨ（ ２，Ｏｍｍｏｌ＞を。

Ｎ−メチルモルホリン（０，２４ｍ１．２．１ｍｍｏｌ）の存在下、クロルギ酸 イソブチル（０，２９ｍｊ７．　２．１ｍｍｏｌ）と０℃で２０分間反応させた 。Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯ２）Ｃ１，ＣＩ・ｆｌＣｌ　（０，６０ｇ、２．Ｏｍｍ ｏｌ＞のジメチルホルムアミド（４ｍ１７）溶液を滴下した。０℃で２０分間攪 拌した後。

Ｎ−メチルモルホリン（０，２２−、２，０ｍｍｏ　１＞のＴＨＦ溶液を添加し た。得られた溶液を０℃でさらに４０分間１次にＲＴで１時間攪拌した。反応混 合物を水と食塩水（各２５ｍｆずつ）で希釈し。

酢酸エチルで２回（各２５−ずつ）抽出した。有機層を合せて１０％のクエン酸 溶液、飽和ＮａＨＣＯｓ溶液および食塩水（各１５ｍｊ２ずつ）で洗浄し、　Ｍ ｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し。

Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−（０−ｔ−ブチル）−３ｅｒ−Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯ２） （Ｊ１２Ｃ１を得た。生成物をＩＩＰ（７ｍｊりとアニソール（０，５ｍｆ）と で、０℃にて２０分間処理した。ＨＦを除去した後、残渣を冷水で希釈し、ジエ チルエーテルで２回（各５１ｎ１．ずつ）洗浄した。有機揮発成分を減圧下で除 去し９次いで得られた粗精製Ｈ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ ・２）ＩＦを凍結乾怪させて粉末とした。生成物の粗精製を、０〜１．ＯＮ　Ｈ ＣＩの段階的勾配液を用いるセファデックス　５Ｐ−Ｃ２５（）ｌ＋形）カラム で行いＨ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−３ｅｒ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＭＫ’２ＣＩを得た。生成 物を。

１０〜５０％（Ｖ／Ｖ）ヘキサン／イソプロパツール（１０％メタノール）勾配 液で溶出するスベルコＬＣＮＨ２カラムでさらに精製し。

減圧乾燥した。生成物を３６０Ｍｔｌｚの’ＩＩ　ＮＭＲで特性を決定した。

生成物を、水、メタノールもしくは適切な水溶液に溶解し。

分析もしくはその他の用途に用いた。

実施例２３：凝固阻害性 正常のヒトの血漿を、試験管中で、　０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム、　０． １４Ｍ　ＮａＣ１ｐ８７．４によって１＝３の容積比で希釈した。次いで希釈さ れた血漿（ＩＯＭ＞を、ｌＸ１Ｏ’細胞／ｒｎ１のＪ８２細胞１００ＡＬ１と、 　　１００ｄの阻害剤とを混合した。２０ｍＭの塩化カルシウム１００扉を添加 して濁り始めるのを肉眼観察することにより血漿の凝固時間を得た。結果を表４ に示す。ヒト血漿の凝固時間は、　（阻害剤が存在しないと仮定して）計算され たＴＦ活性のミリ単位で示した。データは、　ＬＴＲ−ＣＭＫが。

［ＴＦ　：■／■ａ〕複合体による凝固のタンパク分解活性化の有効な阻害剤で あることを示している。

（以下余白） 表４ 正常なヒトの血漿の凝固に対するＬＴＲ−ＣＭＫ”の比阻害性”ＬＴＲ−ＣＭＫ は、　Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｒｇ−りｏｏメチルケトンを示す。

Ｏ阻害剤が存在しないと仮定した場合の、試料中に存在する［ＴＦ　：■／■ａ ］活性のレベルを示す計算活性値。用いた換算係数は１００ＯミＩＪ単位（ｍｕ ）　−５０ｓである。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次式を有する化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで，Ｒ１はアルギニン側鎖−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＮＨＮＨ２，Ｒ２はト レオニン側鎖−ＣＨＯＨ−ＣＨ３，またはセリン側鎖−ＣＨ２ＯＨあるいはプロ リン側鎖−（ＣＨ２）３−であって，Ｐ３がＤ−フェニルアラニンである場合を 除いて，Ｐ２はプロリンであり，Ｒ３はアスパラギン−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２，ア スパラギン酸−ＣＨ−ＣＯＯ，ヒスチジン▲数式、化学式、表等があります▼ロ イシン−ＣＨ２−ＣＨ−［ＣＨ３］２，グルタミン−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ２ ，トレオニン−ＣＨＯＨ−ＣＨ３またはフェニルアラニン▲数式、化学式、表等 があります▼の側鎖であって，Ｐ３がＬ型またはＤ型のいずれかであるように配 列している；Ｙは，水酸基，もしくは１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分 枝状のアルコキシ基，ベンジルオキシ基，ＮＡｌＡ２基（ここで，Ａ１およびＡ ２の各々は，Ｈ，もしくは１〜４個の炭素原子を有するアルキル基である），ク ロロメチル基，フルオロメチル基または−ＮＨ−アリールスルホニルフルオリド 基であるか，あるいは▲数式、化学式、表等があります▼は，−Ｂ（ＯＨ）２， または一般構造ＰＯＯＨ−Ｙ２（ここで，Ｙ２は，アミノ酸，ペプチドまたはそ の塩である）で表されるホスホンアミデートで置き換えられている；Ｚは，Ｈ， 直鎖または分枝状のアルキル基，ＣＨまたはＣＨＯの環状基，１〜６個の炭素原 子を有し，非置換のＣＨＯ基であるか，あるいはホルミル基またはｔｅｒｔ−ブ チルオキシカルボニル基によって，もしくはダンシル基またはトシル基によって 置換されたＣＨＯ基である。 ２．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼は，クロロ メチルケトン，フルオロメチルケトン，ホウ素含有酸または一般構造ＰＯＯＨ− Ｙ２（ここで，Ｙ２は，アミノ酸，ペプチドまたはその塩である）で表されるホ スホンアミデートであり，そしてＺはＨである。 ３．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼は，クロロ メチルケトンであり，そしてＺはＨである。 ４．請求項１の化合物であって，Ｙは水酸基であり，そしてＺはＨである。 ５．請求項１の化合物であって，Ｙは水酸基であり，ＺはＨであり，そしてＲ３ は−ＣＨ２−ＣＨ−（ＣＨ３）２である。 ６．請求項１の化合物であって，１は水酸基であり，ＺはＨであり，そしてＲ３ は▲数式、化学式、表等があります▼である。 ７．請求項１の化合物であって，Ｙは水酸基であり，ＺはＨであり，そしてＲ３ は−ＣＨＯＨ−ＣＨ３である。 ８．請求項１の化合物であって，Ｙは水酸基であり，ＺはＨであり，そしてＲ３ は−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２である。 ９．請求項１の化合物であって，Ｙは水酸基であり，ＺはＨであり，そしてＲ３ は−ＣＨ２−ＣＯＯＨである。 １０．請求項１の化合物であって，Ｙは水酸基であり，ＺはＨであり，そしてＲ ３は−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ２である。 １１．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり，そしてＺはＨであり，Ｒ２は−ＣＨＯＨ−ＣＨ３または− ＣＨ２ＯＨまたは−（ＣＨ２）３−ドからなる群から選択され，Ｐ３がＤ−フェ ニルアラニンである場合を除いてＰ２はプロリンであり，そしてＲ３はＣＨ２− ＣＨ−（ＣＨ３）２，▲数式、化学式、表等があります▼，−ＣＨＯＨ−ＣＨ３ ，−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２，−ＣＨ２−ＣＯＯＨおよび−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ ２および▲数式、化学式、表等があります▼からなる群がか選択され，Ｐ３がＬ 型またはＤ型のいずれかであるように配列している。 １２．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり，ＺはＨであり，Ｒ２はトレオニン側鎖−ＣＨＯＨ−ＣＨ３ であり，そしてＲ３はロイシン側鎖−ＣＨ２−ＣＨ−（ＣＨ３）２である。 １３．請求項１２の化合物であって，Ｐ３位のアミノ酸はＤ異性体である。 １４．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり，Ｚはアセチル基，トシル基およびダンシル基からなる群か ら選択され，Ｒ２はトレオニン側鎖−ＣＨＯＨ−ＣＨ３であり，そしてＲ３はロ イシン側鎖−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である。 １５．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり，ＺはＨであり，Ｒ２はセリン側鎖−ＣＨ２ＯＨであり，そ してＲ３はロイシン側鎖−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である。 １６．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり，ＺはＨであり，Ｒ２はプロリン側鎖−（ＣＨ２）３−であ り，そしてＲ３はロイシン側鎖−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である。 １７．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり，ＺはＨであり，Ｒ２はセリン側鎖−ＣＨ２ＯＨであり，そ してＲ３はアスパラギン側鎖−ＣＨ２ＣＯＮＨ２である。 １８．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり，ＺはＨであり，Ｒ２はトレオニン側鎖−ＣＨＯＨ−ＣＨ３ であり，そしてＲ３はアスパラギン酸側鎖−ＣＨ２ＣＯＯ−である。 １９．請求項１の化合物であって，▲数式、化学式、表等があります▼はクロロ メチルケトンであり，ＺはＨであり，Ｒ２はトレオニン側鎖−ＣＨＯＨ−ＣＨ３ であり′そしてＲ３はヒスチジン側鎖▲数式、化学式、表等があります▼である 。 ２０．［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］阻害効力Ｋｉ５が少なくとも２．０ＭＵであ るか，あるいはＫｉ５０が３００μＭより低い，請求項１の化合物。 ２１．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ２２．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項２による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ２３．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項３による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ２４．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項４による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ２５．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項５による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ２６．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項６による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ２７．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項７による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ２８．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項８による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ２９．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項９による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３０．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１０による組成物またはその薬学的 に許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３１．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１１による組成物またはその薬学的 に許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３２．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１２による組成物またはその薬学的 に許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３３．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１３による組成物またはその薬学的 に許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３４．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組物であって，請求項１４による組成物またはその薬学的に 許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３５．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１５による組成物またはその薬学的 に許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３６．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１６による組成物またはその薬学的 に許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３７．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１７による組成物またはその薬学的 に許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３８．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１８による組成物またはその薬学的 に許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ３９．動物またはヒトにおける［ＴＦ：ＶＩＩ／ＶＩＩａ］の特異的なタンパク 分解活性を阻害する組成物であって，請求項１９による組成物またはその薬学的 に許容される塩と，薬学的に許容される担体とを含有する組成物。 ４０．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 ４１．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項２による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 ４２．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項３による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 ４３．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項４による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 ４４．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項５による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 ４５．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項６による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 ４６．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項７による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 ４７．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項８による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 ４８．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項９による化合物を該動物また はヒトに投与する工程を包含する方法。 ４９．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１０による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 ５０．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１１による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 ５１．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１２による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 ５３．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１３による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 ５４．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１４による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 ５５．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１５による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 ５６．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１６による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 ５７．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１７による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 ５８．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１８による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。 ５９．動物またはヒトにおける血栓形成，血管内凝固または関連する疾患を抑制 する方法であって，薬物学的に効果的な量の請求項１９による化合物を該動物ま たはヒトに投与する工程を包含する方法。