JPH03277279A

JPH03277279A - 血栓溶解酵素、その取得法、血栓溶解剤及び血栓溶解酵素含有飲食品

Info

Publication number: JPH03277279A
Application number: JP2074781A
Authority: JP
Inventors: Hiroki Hamada; 浜田　博喜; Nobuyoshi Nakajima; 中島　伸佳; Kazuhiko Suzuki; 和彦鈴木; Hiroyuki Sumi; 洋行須見
Original assignee: SODETSUKUSU KK
Current assignee: SODETSUKUSU KK
Priority date: 1990-03-23
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1991-12-09
Anticipated expiration: 2014-03-24
Also published as: JP2873041B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はテンペ、テンペ菌又はそのＩ＠豊液から抽出さ
れた新規な血栓溶解酵素、その取得法及び該血栓溶解酵
素を含有する飲食品又は血栓溶解剤に関する。

（従来の技術）血栓症は末梢動静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞症、冠
動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動瀞脈血栓症をはじめ
最近では老人性の痴呆症など、種々の疾患に関連し病原
因子として大きな問題となっている。

現在血栓症の治療にはこれまで微生物由来のストレプト
キナーゼ（ＳＫ）、ヒト尿から得られるウロキナーゼ（
ＵＫ）或いはメラノーマ培養液から得られる組繊プラス
ミノーデンアクチベーター（ＴＰ　Ａ、　）などが点滴
剤としで用いられていた。しかし、いずれも血中での半
減期が２０分以内と極めて短く、従って一時的な効果し
か期待できなかった。

又いずれも静注されるため＾純度である必要上極めて高
価であった。

我々は１９８０年以降、経口線溶療法の開発を試み、あ
る種の薬剤を口から飲むことで極めて長時間血中の血栓
溶解酵素の活性を＾めることに成功した（Ｈ，Ｓｕｍｉ
ら、　Ｔ　ｈｒｏ曽ｂｏｓ、　　Ｒｅｓ、　　２０：　
　７１１−７１４゜１９８０：　　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　
　Ｉｎｖｅｓｔ、　７５：　１２１２−１２２０゜１９
８５）、、その後、こうした療法に適した飲食品、薬品
の検索に鋭意努力を継続している。

（発明が解決しようとする課題）本発明の目的は更に新たな血栓溶解酵素、その取得法及
びそれを有効成分とする飲食品又は血栓溶解剤を提供す
ることにある。

（！Ｉ題を解決するための手段）本発明はテンペ、テンペ菌又はその培養液から抽出され
、下記の特性を有することを特徴とする血栓溶解酵素に
係る。

（、）分子量：約２０，０００−５０＋ＯＯＯ（Ｚ　ｙ
ｍｏｇｒａｐｈｙ法による）。

（ｂ）性状：白色粉末。

（ｃ）熱安定性：ｐＨ７，４で５０℃、１０分間保持し
ても安定。

（ｄ）基質特異性：フィブリンに対する強い分解活性と
共に、プラスミノーデン活性化能を有する。

又合成基質であるＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　
　ｐＮＡｙ　　Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ　　Ｐｉｐ−Ａｒｇ　　
ｐＮＡ、　　Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　ｐ
ＮＡに対する強い分解活性を有する。

（ｅ）阻害剤の影響ニジインプロピルフルオロホス７エ
ートで強く阻害される。

又、本発明は上記血栓溶解酵素の取得法及び該血栓溶解
酵素を含有する飲食品又は血栓溶解剤に係る。

本発明の血栓溶解酵素（以下、テンペキナーゼ又はＴＫ
と略称することがある）はテンペ或いはテンペ薗に水性
媒体を加えてホモデナイズし、適当な時間、適当な温度
に保持して抽出した抽出液、又はテンペ菌の培養液をそ
のまま、又は適当な時間、適当な温度に保持した後、濃
縮、透析又は乾燥した後、極性有機溶媒、塩析、限外濾
過、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルが過、
アフイニテイクロマトグラフイー又は等電、σ電気泳動
の１種類以上を組み合わせて処理することにより得るこ
とがで鰺る。ｊｌＩＩＩち、この新規なｌｌＡ１１！酵
素はテンペ、テンペ薗由未であり、強い線溶活性を有す
る。

以下この新規線溶酵素について詳述する。

（、）分子量：約２０，０００−５０，０００　（Ｚ　
ｙｍｏｇｒａｐｈｙ法による）。

（ｂ）性状：白色粉末。

（ｃ）熱安定性：　ｐＨ７，４で５０℃、１０分間保持
しでも安定。

（ｃｌ）基質特異性：フィブリンに対する強（１分解活
性と共に、プラスミ７−デン活性化能を有する。

又合成基質であるＨ−Ｄ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙ
ｓ　　ｐＮＡｖ　　ＨＤ　　Ｐｈｅ−Ｐｉｐ　　Ａｒｇ
−ｐＮＡ、　　Ｈ−Ｄ　　Ｖａｌ−Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　
　ｐＮ　Ａに対する強−分解活性を有する。

（ｅ）阻害剤の影響ニジイソプロピルフルオロホス７二
−トで強く阻害される。

線溶酵素はテンペ、テンペ菌又はそのＪ＠寮物中に含ま
れる。これらはそのまま用いでも良ν１が、線溶活性を
一定にし、投与を容易にするため、テンペやテンペ薗は
水もしくは塩類水溶液のような水性媒体で抽出する。抽
出はｐＨ６ないし１１で、６０℃以下で行うのがよい。

又テンペ菌のｔ＠寮物が液体培養物である場合は濾過し
て上清をとる。これらの抽出液や上溝はそのまま用いて
も良いが、アセトンやエタ／−ルを加えて析出する蛋白
を除去したり、或いはデル枦遇して精製することができ
る。ゲルろ過には、例えば、セファデックスＧ−１００
、同１５０を用いることもできる。又、前記の抽出液や
上清は水や緩衝液を用いて透析し、酵素を含む透析内液
を得ることもできる。これらの精製法は単独もしくは組
み合わせで行うことができる。

上記のようにして得られる粗要若しくは精製酵素はその
まま又は減圧乾燥、凍結乾燥などにより乾燥又は濃縮物
として用いることができる。

本発明で用いられるテンペはインドネシアで昔から伝統
的に食用されている大豆、ピーナツ、油カスなどから得
られる食品であり、安全性に問題がなく人体に無害であ
る。ｆ：つて本発明の飲食品又は血栓溶解剤は毒性を示
さず、有効である。Ｗｆ取量は線溶酵素の精製の程度に
もよるが、一般に０．０５ないし２０ｇ１　好ましくは
０．２ないし１０．を１日１ないし３回程度摂取するの
が良く、この用量単位に分割調製するのが好ましい。

本発明の飲食品又は血栓溶解剤は経口摂取することも可
能であり、又、酵素が吸収される前に分解するのをなる
べく防ぐため、腸溶製剤の形で摂取するのも望ましい、
ＩＩｌ溶製剤は既知の方法により、例えば酵素含有粉末
ないし顆粒をエンテリツクコーティングし、或いは腸溶
カプセルに充填することにより行うことができる。

（発明の効果）本発明の新規な線溶酵素は前記したように、テンペ、テ
ンペ菌又はその培養液からはじめて得られた物質であり
、従米より１！められているヒト血漿中のプラスミン或
いはウロキナーゼよりも分子量が小さい、また基質特異
性も特徴的でフィブリンに対し非常に強い分解活性を持
つ、即ち本発明の新規線溶酵素は本発明者が初めてテン
ペ、テンペ菌又はその培養液から得た物質であり、優れ
た線溶活性を持つことからマイクロカプセル化などして
直接静注することにより、一般に線溶酵素が用いられて
いる血栓症、塞栓症の治療へ応用することができる。ま
たウロキナーゼで最近性われているように経口投与を行
うことによって、特に長時間投与して害のないことから
血栓症などの治療のみならず、その予防薬としても有用
である。

（実　施　例）次に本発明を実施例にて詳細に説明する。

実施例１市販テンペを、マイルズ社の牛フィブリ／−テン及び持
出製薬製の牛トロンビンを使い、Ｔ、　Ａｓｔｒｕｐ＋
　　Ｓ、　ＭｕｌｌｅｒＬｚらの方法（Ａｒｃｌ＋ｓ。

Ｂｉｏｃｌ＋ｅｗ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　４０：　
　３４６−３５６．　１９５２）で調製したフィブリン
（人工血栓）平板上にのせ、３７℃で１８時間インキュ
ベイジョンした結果、テンペのまわりが明瞭に溶解され
た。尚、同条件下でフィブリン平板に蒸した大豆をその
ままのせでも全く溶解はみられなかった。

実施例２１ｋｇの市販テンペに２．５１の生理食塩水を加え、室
温で１時間撹拌した後、〃−ゼで枦遇し得られた抽出液
の３０μｌを実施例１と同条件でフィブリン平板にのせ
た結果、３７℃で１８時間のインキュベイジョンにより
６３±１５ｍ５’（５回の実験の平均値）の溶解面積が
確認された。尚、テンペ抽出液に１−Ｍ濃度のジイソプ
ロピルフルオロホス７二−ト（和光純薬）を加えた場合
、そのフィブリン分解活性は完全に阻害された。

実施例３フイプリンモ板の代り（二０．６％カゼイン、１％寒天
、＋　ｈ　ニ１０曽Ｍ　　ＣａＣ１２ヲ含ｂ１０＊Ｉ）
５ｓＭＴｒｉｓ　　ＨＣＩ緩衝液、ｐＨ７，４を用いて
調製したカゼイン寒天平板に実施例１と同方法で調製し
たテンペ抽出液を１０μＰのせた結果、３７℃で１８時
間のインキュペイジョン後４２±１２ｍ５２ノ面ＩＩＮ
　（６回の実験の平均値）と、溶解することが確認され
た。又、この平板ｌｌ！製にミドリ十字社製のヒト血漿
プフスミ７−ゲンを各々５ＣＵ及び２５ＣＵ加えたもの
を調製し、それに同量のテンペ抽出液をのせたところ、
溶解面積は５５±１１及び８１ｗ替２（６回の実験の平
均値）と増加した。

即ち、テンペ中には直接の血栓溶解活性と共にプラスミ
／−デンをプラスミンに活性化するというｌＷｌ接的な
作用（プラスミ／−デンアクチベーター）もあることが
わかった。

実施例４実施例２で行った生理食塩水に変えて、蒸留水或いは０
．０１〜０．１５Ｍのリン酸＊＊液、ｐＨ７，４を抽出
に用いそのフィブリン及ｖｆｊゼイン寒天乎板の溶解面
積を比較してみたが、その結果は生理食塩水で抽出した
場合とほぼ同様であった。

実施例５実施例２と同様にして得たテンペ抽出液をＴＫ酵素液と
して各種合成アミド基質に対する分解能を調べた。反応
系は１曽ｉで、０，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，４を眉
い、基質濃度は５　Ｘｌ０−’Ｍ、　３７℃による分解
速度を測定した結果を第１表に示す。

第表Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　　　　　　
　３．７Ｈ−Ｄ　−Ｔ　Ｉｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　
ｐＮＡ　　　　　　　３．５Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−
Ａｒｇ−ｐＮＡ　　　　　　　Ｏ，８Ｂｚ　　Ｌ　　Ｔ
ｙｒ　　ｐＮＡ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，２ＴＫ
はＨ−Ｄ−Ｖｉｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ！：対する
分解能が高く、即ちプラスミンの基質特異性に最も似て
いることがわかった。そしてまたＨ−Ｄ−Ｉ　Ｉｅ　−
Ｐ　ｒｏ−’Ａ　ｒｇ−ｐＮ　Ａとかｐｙｒｏ　−Ｇ　
ｌｕ　−Ｇｙ−Ａｒｇ　ｐＮＡなど一般にプラスミ／−
デンアクチベーター基質とされるものへの分解能も確認
でき、ただ、トリプシン基質であるＨ−Ｄ　　１ｉｅ−
Ｐｒｏ　−Ａ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ　、白血球エラ入ターゼ
基質であるｐｙｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ−Ｐ　ｒｏ−Ｖ　ｍｌ
　−ｐＮ　Ａなどには殆ど活性を示さなかった。

実施例６実施例２と同様にして得たテンペ抽出液中のＴＫの分子
形態を調べるため、Ｊ、　Ｄ、　Ｔｉ５ｓｏｔらの方法
によるＺ　ｙ＠ｏｇｒａｐｈｙ（Ｊ　、　ＣＩ　ｉｎ、
　　Ｉ　ｎｖｅｓｔ。

７０：　１３２０〜１３２３．　１９８２）を行った。

同方法に用いたフィブリン調製にはマイルズ社製の牛フ
ィブリ７−デンを最終濃度０．４％として使用した。そ
の結果、標準として使用した高分子量ＵＫ（分子量的５
，３万）及び低分子量ＵＫ（分子量的２．２万）の間の
泳動位置に明瞭なフィブリン溶解帯が認められ、ＴＫが
分子量約２〜５万であることがわかった。

実施例７３．７〜４．３ｋｇの家兎（雄）の直腸より、実施例２
と同様にして得たテンペ抽出液を、蒸留水で透析し、凍
結乾燥したちの３．２ｇを１０−１の生理食塩水に溶解
し投与した。Ｍｒｆ的に採血し、その血漿の希釈液を使
ってトロンボエラストグラフィーパターンを調べた。そ
の結果、投与前に比べてに値及びｒ値に有意の変化はな
かったが、Ｍａ値は約２９％（ｐ＜０．０５　；　ｎ＝
　５　）高まっており、ＴＫ投与によって血中線溶亢進
の起こることがわかった。

（以　上）出　願　人　　ソデツクス株式会社代　理　人　　弁理士　１）村　　巌

Claims

【特許請求の範囲】

（１）テンペ、テンペ菌又はその培養液から抽出され、
下記の特性を有することを特徴とする血栓溶解酵素。（ａ）分子量：約２０，０００〜５０，０００（Ｚｙｍ
ｏｇｒａｐｈｙ法による）。（ｂ）性状：白色粉末。（ｃ）熱安定性：ｐＨ７．４で５０℃、１０分間保持し
ても安定。（ｄ）基質特異性：フイブリンに対する強い分解活性と
共に、プラスミノーゲン活性化能を有する。又合成基質であるＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ
ＮＡ，Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ，Ｈ−
Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対する強い分解
活性を有する。（ｅ）阻害剤の影響：ジイソプロピルフルオロホスフエ
ートで強く阻害される。
（２）テンペ、テンペ菌を水性媒体による抽出に付すこ
とを特徴とする血栓溶解酵素の取得法。
（３）テンペ、テンペ菌を慣用の増殖培地中で培養し、
血栓溶解酵素を含有する培養液を回収し得られた液より
精製する血栓溶解酵素の取得法。
（４）得られた抽出液及び培養液をそのまま、又は適当
な時間、適当な温度に保持した後、濃縮、透析又は乾燥
した後、極性有機溶媒、塩析、限外ろ過、吸着、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフイニテイクロ
マトグラフィー又は等電点電気泳動の操作を１種類以上
組み合わせて精製する請求項２又は３に記載の取得法。
（５）テンペ菌の生産する血栓溶解酵素を含有する飲食
品又は血栓溶解剤。