JPH0646851A - 血栓溶解酵素 - Google Patents
血栓溶解酵素Info
- Publication number
- JPH0646851A JPH0646851A JP4247057A JP24705792A JPH0646851A JP H0646851 A JPH0646851 A JP H0646851A JP 4247057 A JP4247057 A JP 4247057A JP 24705792 A JP24705792 A JP 24705792A JP H0646851 A JPH0646851 A JP H0646851A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bonito
- salted
- enzyme
- thrombolytic
- thrombolytic enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 この発明は新規の血栓溶解醇素とその取得
法、及び該血栓溶解酵素を血栓予防剤に応用しようとす
るものである。 【構成】 カツオ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓からの酵
素の抽出、精製方法とその物理化学的性質、及び血栓溶
解効果の高い飲食品あるいは腸溶カプセル等を調整す
る。
法、及び該血栓溶解酵素を血栓予防剤に応用しようとす
るものである。 【構成】 カツオ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓からの酵
素の抽出、精製方法とその物理化学的性質、及び血栓溶
解効果の高い飲食品あるいは腸溶カプセル等を調整す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はカツオ塩辛（酒盗）又は
カツオ内臓から抽出された新規な血栓溶解酵素、その取
得法及び該血栓溶解酵素を含有する飲食品又は血栓溶解
剤に関する。
カツオ内臓から抽出された新規な血栓溶解酵素、その取
得法及び該血栓溶解酵素を含有する飲食品又は血栓溶解
剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】血栓症は末梢動静脈血栓症、肺塞栓症、
心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈
血栓症をはじめ最近では老人性の痴呆症など、種々の疾
患に関連し病原因子として大きな問題となっている。現
在血栓症の治療にはこれまで微生物由来のストレプトキ
ナーゼ（ＳＫ）、ヒト尿から得られるウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ），プロウロキナーゼ（Ｐｒｏ−ＵＫ）或いはメラノ
ーマ培養液から得られる組織プラスミノーゲンアクチベ
ータ−（ＴＰＡ）などが点滴剤として用いられていた。
しかし、いずれも血中での半減期が２０分以内と極めて
短く、従って一時的な効果しか期待できなかった。又、
いずれも静注されるため高純度である必要上極めて高価
であった。
心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈
血栓症をはじめ最近では老人性の痴呆症など、種々の疾
患に関連し病原因子として大きな問題となっている。現
在血栓症の治療にはこれまで微生物由来のストレプトキ
ナーゼ（ＳＫ）、ヒト尿から得られるウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ），プロウロキナーゼ（Ｐｒｏ−ＵＫ）或いはメラノ
ーマ培養液から得られる組織プラスミノーゲンアクチベ
ータ−（ＴＰＡ）などが点滴剤として用いられていた。
しかし、いずれも血中での半減期が２０分以内と極めて
短く、従って一時的な効果しか期待できなかった。又、
いずれも静注されるため高純度である必要上極めて高価
であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】我々は１９８０年以
降、経口線溶療法の開発を試み、ある種の薬剤を口から
飲むことで極めて長時間血中の血栓溶解酵素の活性を高
める、いわゆる“経口線溶療法”に成功した（Ｈ．Ｓｕ
ｍｉら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｒｅｓ．２０：７１１，１
９８０；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：１２１
２，１９８５）。またその後、こうした療法に適した酵
素を飲食品あるいは 天然素材中に検索することを鋭意
努力してきた。本発明は、そうした検索で約２００種類
の、主に日本の伝統的発酵食品の中から、経口用血栓溶
解剤としての要望に答えるために得られた極めて強力な
線溶酵素に関するものである。
降、経口線溶療法の開発を試み、ある種の薬剤を口から
飲むことで極めて長時間血中の血栓溶解酵素の活性を高
める、いわゆる“経口線溶療法”に成功した（Ｈ．Ｓｕ
ｍｉら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｒｅｓ．２０：７１１，１
９８０；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：１２１
２，１９８５）。またその後、こうした療法に適した酵
素を飲食品あるいは 天然素材中に検索することを鋭意
努力してきた。本発明は、そうした検索で約２００種類
の、主に日本の伝統的発酵食品の中から、経口用血栓溶
解剤としての要望に答えるために得られた極めて強力な
線溶酵素に関するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明はカツオ塩辛（酒
盗）又はカツオ内臓から抽出される血栓溶解酵素に係わ
る。いま、その特徴を説明すると、 （イ） 分子量：約２０，０００〜５０，０００（Ｚｙ
ｍｏｇｒａｐｈｙ法による）。 （ロ） 等電点：５．０±０．５ （ハ） Ｎ末端アミノ酸配列：Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｅ
−Ｑ−Ｚ−Ａ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｈ−Ｑ−Ｖ−Ｌ−Ｎ−
Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｈ−Ｆ−というこれまでに報告のないＮ末
端アミノ酸配列を持つ。 （ニ） 熱安定性：ｐＨ７．４で５０℃、１０分間保持
しても安定。 （ホ） 基質特異性：フィブリンに対する強い分解活性
と共に、合成基質であるｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｌｐ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ、Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対する
強い分解活性を有する。 （ヘ） 阻害剤の影響：ジイソプロピルフルオロホスフ
ェート、大豆トリプシンインヒビター、牛膵臓トリプシ
ンインヒビター、又はアプロチニンで強く阻害される。 又、本発明は上記血栓溶解酵素の取得法及び該血栓溶解
酵素を含有する飲食品又は血栓溶解剤に係わる。本発明
の血栓溶解酵素（以下、カツオキナーゼ又はＫＫと略称
することがある）はカツオ塩辛又はカツオ内臓に水性媒
体を加えてホモジナイズし、適当な時間、適当な温度に
保持して抽出した抽出液をそのまま、又は適当な時間、
適当な温度に保持した後、濃縮、透析又は乾燥した後、
極性有機溶媒、塩析、限外濾過、吸着、イオン交換クロ
マトグラフイー、ゲル濾過、アフイニテイクロマトグラ
フイー又は等電点電気泳動の一種類以上組み合わせて処
理することにより得ことができる。この線溶酵素はカツ
オ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓を凍結乾燥するなどして
そのまま用いることもできるが、線溶活性を一定にし、
投与を容易にするため、カツオ塩辛やカツオ内臓より水
もしくは塩類水溶液のような水性媒体で抽出る。抽出は
ｐＨ６ないし１１で、６０℃以下で行なうのがよい。ま
た、用いるカツオは一般の硬骨魚綱スズキ目サバ科に属
するカツオ（Ｋａｔｓｕｗｏｎｕｓ ｐｅｌａｎｌｓ）
の他、その近縁種のスマ（別名ヤイト）属（Ｅｕｔｈｙ
ｎｎｕｓ）とソウダガツオ属（Ａｕｘｉｓ）などがある
がいずれに限定されるものではない。これらの抽出液を
そのまま用いてもよいが、アセトンやエタノールを加え
て析出する蛋白を除去したり、或いはゲル濾過して精製
するすることができる。ゲル濾過には、例えば、セフア
デックスＧ−１００，同１５０を用いることもできる。
また、前記の抽出液や上清は水や緩衝液を用いて透析
し、酵素を含む透析内液を得ることもできる。これらの
精製法は単独もしくは組み合わせて行なうことがある。
上記のようにして得られる粗製若しくは精製酵素はその
まま又は減圧乾燥、凍結乾燥などにより乾燥又は濃縮物
として用いることができる。本発明で用いられるカツオ
塩辛は日本では昔から伝統的に食用されている一種の発
酵食品であり、安全性に問題がなく人体に無害である。
従って本発明の飲食品又は血栓溶解剤は毒性を示さず、
有効である。摂取量は線溶酵素の精製の程度にもよる
が、一般に０．０５ないし２０ｇ、好ましくは０．２な
いし１０ｇを１日１ないし３回程度摂取するのが良く、
この用量単位に分割調製するのが好ましい。本発明の飲
食品又は血栓溶解剤は経口摂取することも可能であり、
又、酵素が吸収される前に分解するのをなるべく防ぐた
め、腸溶製剤は既知の方法により、例えば酵素含有粉末
ないし顆粒をエンテリックコーティングし、或いは腸溶
カプセルに充填することにより行なうことができる。
盗）又はカツオ内臓から抽出される血栓溶解酵素に係わ
る。いま、その特徴を説明すると、 （イ） 分子量：約２０，０００〜５０，０００（Ｚｙ
ｍｏｇｒａｐｈｙ法による）。 （ロ） 等電点：５．０±０．５ （ハ） Ｎ末端アミノ酸配列：Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｅ
−Ｑ−Ｚ−Ａ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｈ−Ｑ−Ｖ−Ｌ−Ｎ−
Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｈ−Ｆ−というこれまでに報告のないＮ末
端アミノ酸配列を持つ。 （ニ） 熱安定性：ｐＨ７．４で５０℃、１０分間保持
しても安定。 （ホ） 基質特異性：フィブリンに対する強い分解活性
と共に、合成基質であるｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｌｐ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ、Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対する
強い分解活性を有する。 （ヘ） 阻害剤の影響：ジイソプロピルフルオロホスフ
ェート、大豆トリプシンインヒビター、牛膵臓トリプシ
ンインヒビター、又はアプロチニンで強く阻害される。 又、本発明は上記血栓溶解酵素の取得法及び該血栓溶解
酵素を含有する飲食品又は血栓溶解剤に係わる。本発明
の血栓溶解酵素（以下、カツオキナーゼ又はＫＫと略称
することがある）はカツオ塩辛又はカツオ内臓に水性媒
体を加えてホモジナイズし、適当な時間、適当な温度に
保持して抽出した抽出液をそのまま、又は適当な時間、
適当な温度に保持した後、濃縮、透析又は乾燥した後、
極性有機溶媒、塩析、限外濾過、吸着、イオン交換クロ
マトグラフイー、ゲル濾過、アフイニテイクロマトグラ
フイー又は等電点電気泳動の一種類以上組み合わせて処
理することにより得ことができる。この線溶酵素はカツ
オ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓を凍結乾燥するなどして
そのまま用いることもできるが、線溶活性を一定にし、
投与を容易にするため、カツオ塩辛やカツオ内臓より水
もしくは塩類水溶液のような水性媒体で抽出る。抽出は
ｐＨ６ないし１１で、６０℃以下で行なうのがよい。ま
た、用いるカツオは一般の硬骨魚綱スズキ目サバ科に属
するカツオ（Ｋａｔｓｕｗｏｎｕｓ ｐｅｌａｎｌｓ）
の他、その近縁種のスマ（別名ヤイト）属（Ｅｕｔｈｙ
ｎｎｕｓ）とソウダガツオ属（Ａｕｘｉｓ）などがある
がいずれに限定されるものではない。これらの抽出液を
そのまま用いてもよいが、アセトンやエタノールを加え
て析出する蛋白を除去したり、或いはゲル濾過して精製
するすることができる。ゲル濾過には、例えば、セフア
デックスＧ−１００，同１５０を用いることもできる。
また、前記の抽出液や上清は水や緩衝液を用いて透析
し、酵素を含む透析内液を得ることもできる。これらの
精製法は単独もしくは組み合わせて行なうことがある。
上記のようにして得られる粗製若しくは精製酵素はその
まま又は減圧乾燥、凍結乾燥などにより乾燥又は濃縮物
として用いることができる。本発明で用いられるカツオ
塩辛は日本では昔から伝統的に食用されている一種の発
酵食品であり、安全性に問題がなく人体に無害である。
従って本発明の飲食品又は血栓溶解剤は毒性を示さず、
有効である。摂取量は線溶酵素の精製の程度にもよる
が、一般に０．０５ないし２０ｇ、好ましくは０．２な
いし１０ｇを１日１ないし３回程度摂取するのが良く、
この用量単位に分割調製するのが好ましい。本発明の飲
食品又は血栓溶解剤は経口摂取することも可能であり、
又、酵素が吸収される前に分解するのをなるべく防ぐた
め、腸溶製剤は既知の方法により、例えば酵素含有粉末
ないし顆粒をエンテリックコーティングし、或いは腸溶
カプセルに充填することにより行なうことができる。
【０００５】
【作用と実施例】次に本発明を実施例に方法とその製品
の実験結果を例にあげて説明する。
の実験結果を例にあげて説明する。
【０００６】第１例 市販のカツオ塩辛（枕崎市斉藤角市商店、高知市かつお
船（株）、高知市福辰（株）、福岡市壱岐の島（株））
の上清液をマイルズ社の牛フィブリノーゲン及び持田製 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４０；３４６〜３５
６，１９５２）で調製したフィブリン（人工血栓）平板
上に直接３０μｌのせ、３７℃で１８時間インキュペイ
ションした結果、カツオ塩辛の上清液のまわりが明瞭に
溶解され、強い活性のあることがわかった。５種類の試
料を用いて、その溶解面積（平均値）は２２±７ｍｍ２
であった。
船（株）、高知市福辰（株）、福岡市壱岐の島（株））
の上清液をマイルズ社の牛フィブリノーゲン及び持田製 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４０；３４６〜３５
６，１９５２）で調製したフィブリン（人工血栓）平板
上に直接３０μｌのせ、３７℃で１８時間インキュペイ
ションした結果、カツオ塩辛の上清液のまわりが明瞭に
溶解され、強い活性のあることがわかった。５種類の試
料を用いて、その溶解面積（平均値）は２２±７ｍｍ２
であった。
【０００７】第２例 １ｋｇの市販カツオ塩辛（高知市福辰（株））に生理食
塩水を加え、２ｌに合わせ室温で１時間攪拌した後、ガ
ーゼで濾過し得られた抽出液の３０μｌを第１例と同条
件でフィブリン平板にのせた結果、３７℃で１８時間の
インキュベイションにより７２±１９ｍｍ２（５回の実
験の平均値）の溶解面積が確認された。尚、カツオ塩辛
抽出液に１ｍＭ濃度のジイソプロピルフルオホスフェー
ト（和光純薬）、５ｍｇ／ｍｌ濃度の大豆トリプシンイ
ンヒビター（シグマ社、タイプＩ−５）、牛膵臓トリプ
シンインヒビター（シグマ社、タイプＩ−Ｐ）、或いは
アプロチニン（シグマ社）を加えた場合、そのフィブリ
ン分解活性は完全に阻害された。
塩水を加え、２ｌに合わせ室温で１時間攪拌した後、ガ
ーゼで濾過し得られた抽出液の３０μｌを第１例と同条
件でフィブリン平板にのせた結果、３７℃で１８時間の
インキュベイションにより７２±１９ｍｍ２（５回の実
験の平均値）の溶解面積が確認された。尚、カツオ塩辛
抽出液に１ｍＭ濃度のジイソプロピルフルオホスフェー
ト（和光純薬）、５ｍｇ／ｍｌ濃度の大豆トリプシンイ
ンヒビター（シグマ社、タイプＩ−５）、牛膵臓トリプ
シンインヒビター（シグマ社、タイプＩ−Ｐ）、或いは
アプロチニン（シグマ社）を加えた場合、そのフィブリ
ン分解活性は完全に阻害された。
【０００８】第３例 第２例と同様の方法でカツオ全内臓からの生理食塩水で
粗酵素を第１例と同様に調整したフィブリン平板の上に
１０μｌのせた結果、３７℃で１８時間のインキュベー
ション後３１±１１ｍｍ２の溶解面積（５回の実験の平
均値）が確認された。
粗酵素を第１例と同様に調整したフィブリン平板の上に
１０μｌのせた結果、３７℃で１８時間のインキュベー
ション後３１±１１ｍｍ２の溶解面積（５回の実験の平
均値）が確認された。
【０００９】第４例 第２例で行なった生理食塩水に変えて、蒸留水或いは
０．０１〜０．１５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４を抽
出に用いてそのフィブリン平板及びカゼイン寒天平板に
よる溶解面積を比較してみたが、その結果は生理食塩水
で抽出した場合とほぼ同様であった。また、これら粗酵
素に０．１Ｍ塩酸あるいはカセイソーダを加えてｐＨを
変させ、３７℃で３０分放置した結果、ｐＨ１０以上で
初めて失活すること、また、ｐＨ７．４で温度を変化さ
せ１０分間放置したところ０〜５０℃までは活性が残る
ことがわかった。
０．０１〜０．１５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４を抽
出に用いてそのフィブリン平板及びカゼイン寒天平板に
よる溶解面積を比較してみたが、その結果は生理食塩水
で抽出した場合とほぼ同様であった。また、これら粗酵
素に０．１Ｍ塩酸あるいはカセイソーダを加えてｐＨを
変させ、３７℃で３０分放置した結果、ｐＨ１０以上で
初めて失活すること、また、ｐＨ７．４で温度を変化さ
せ１０分間放置したところ０〜５０℃までは活性が残る
ことがわかった。
【００１０】第５例 第２例と同様にして得たカツオ塩辛抽出液をＫＫ酵素液
として各種合成アミド基質に対する分解能を調べた。反
応系は１ｍｌで、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４を
用い、基質濃度は５×１０−４Ｍ、３７℃による分解速
度を測定した結果を第１表に示す。即ち、ＫＫはｐｙｒ
ｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対する分解能が
高く、基質特異性の上からウロキナーゼ性に似ているこ
とがわかった。そしてまたＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡとかＨ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ
ＮＡなど一般的にトロンビンとかＴＰＡ基質とされるも
のへの分解能も確認できたが、プラスミン基質であるＨ
−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、トリプシン基
質であるＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、キモトリプシン基
質であるＢｚ−Ｌ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ、白血 球エラスターゼ基質であるｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−ｐＮＡなどに対しては殆んど活性を示さなかっ
た。
として各種合成アミド基質に対する分解能を調べた。反
応系は１ｍｌで、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４を
用い、基質濃度は５×１０−４Ｍ、３７℃による分解速
度を測定した結果を第１表に示す。即ち、ＫＫはｐｙｒ
ｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対する分解能が
高く、基質特異性の上からウロキナーゼ性に似ているこ
とがわかった。そしてまたＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡとかＨ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ
ＮＡなど一般的にトロンビンとかＴＰＡ基質とされるも
のへの分解能も確認できたが、プラスミン基質であるＨ
−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、トリプシン基
質であるＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、キモトリプシン基
質であるＢｚ−Ｌ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ、白血 球エラスターゼ基質であるｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−ｐＮＡなどに対しては殆んど活性を示さなかっ
た。
【００１１】第６例 第２例と同様にして得たカツオ塩辛抽出液中のＫＫの分
子形態を調べるため、Ｊ．Ｄ．Ｔｉｓｓｏｔらの方法に
よるＺｙｍｏｇｒａｐｈｙ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓ
ｔ．７０：１３２０，１９８２）を行なった。同方法に
用いたフィブリン調製にはマイルズ社製の牛フィブリノ
ーゲンを最終濃度０．４％として使用した。その結果、
標準として使用した高分子量ＵＫ（分子量約５．３万）
及び低分子ＵＫ（分子量約２．２万）の間の泳動位置に
明瞭なフィブリン溶解帯が認められ、ＫＫが分子量約２
〜５万であることがわかった。また、同じカツオ塩辛抽
出液をＶｅｓｔｅｒｂｅｖｇ ＆ Ｓｖｅｎｓｓｏｎの
方法（Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．２０：８２
０，１９６６）で等電点電気泳動にかけた結果は図に示
すようにフィブリン平板法でみた一つの主要ピーク（ｐ
Ｉ５．０±０．５）を示した。
子形態を調べるため、Ｊ．Ｄ．Ｔｉｓｓｏｔらの方法に
よるＺｙｍｏｇｒａｐｈｙ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓ
ｔ．７０：１３２０，１９８２）を行なった。同方法に
用いたフィブリン調製にはマイルズ社製の牛フィブリノ
ーゲンを最終濃度０．４％として使用した。その結果、
標準として使用した高分子量ＵＫ（分子量約５．３万）
及び低分子ＵＫ（分子量約２．２万）の間の泳動位置に
明瞭なフィブリン溶解帯が認められ、ＫＫが分子量約２
〜５万であることがわかった。また、同じカツオ塩辛抽
出液をＶｅｓｔｅｒｂｅｖｇ ＆ Ｓｖｅｎｓｓｏｎの
方法（Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．２０：８２
０，１９６６）で等電点電気泳動にかけた結果は図に示
すようにフィブリン平板法でみた一つの主要ピーク（ｐ
Ｉ５．０±０．５）を示した。
【００１２】第７例 市販カツオ塩辛（高知市福辰働）３ｋｇに４倍量の水を
加え攪拌抽出し、透析脱塩したもの（１２ｌ）を遠心分
離し不溶物を除いた後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で平衡にしたＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｒｏｓｅ
（１０×３０ｃｍ）イオン交換クロマトグラフィーより
緩衝液中のＫＣｌ濃度を変化させ、０．３ＭＫＣｌを含
む同緩衝液で溶出した酵素活性画分をさらに、アミコン
ＰＭ−１０限外濾過膜で濃縮後、ＤＥＡＥ−Ｔ０ｙｏｐ
ｅａｌ ６５０Ｍ（３×２０ｃｍ）に吸収させ、緩衝液
中のＫＣｌ濃度を０〜０．５Ｍに変化させ、酵素蛋白を
溶出させた。それをＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｌ疎水
クロマトグラフィー（３×２０ｃｍ）により、緩衝液中
の硫安濃度を２Ｍ〜０Ｍに変化させ、酵素分画を得た。
さらに、これをＣｅｌｌｕｒｏｆｉｎｅ ＧＣＬ−２０
００（２×１００ｃｍ）によるゲル濾過、及び Ｍｏｎ
ｏ Ｑ（０．５×５ｃｍ）カラムを用いた高速クロマト
グラフィーにより、Ｄａｖｉｓ電気泳動法で単一蛋白帯
を示すまでに精製した。最終標品は蛋白量として０．５
ｍｇ、その比活性はフィブリン平板溶解活性で粗抽出液
約１４０倍であった。Ｗｅｂｅｒ ＆ Ｏｓｂｏｒｎ
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：４４０６，１９６
９）の方法によるＳＤＳ−電気泳動法の結果、この純化
した酵素の分子量は３８，０００±５，０００と算出さ
れた。この純化した酵素のＮ末端アミノ酸配列を自動ェ
ドマン分解法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１：８
０，１９６７）によりプロテインシークェンサーＡＢＳ
を用いて調べた結果、Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｅ−Ｑ−Ｚ
−Ａ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｈ−Ｑ−Ｖ−Ｌ−Ｎ−Ｓ−Ｇ−
Ｙ−Ｈ−Ｆ−であることがわかった。
加え攪拌抽出し、透析脱塩したもの（１２ｌ）を遠心分
離し不溶物を除いた後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で平衡にしたＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｒｏｓｅ
（１０×３０ｃｍ）イオン交換クロマトグラフィーより
緩衝液中のＫＣｌ濃度を変化させ、０．３ＭＫＣｌを含
む同緩衝液で溶出した酵素活性画分をさらに、アミコン
ＰＭ−１０限外濾過膜で濃縮後、ＤＥＡＥ−Ｔ０ｙｏｐ
ｅａｌ ６５０Ｍ（３×２０ｃｍ）に吸収させ、緩衝液
中のＫＣｌ濃度を０〜０．５Ｍに変化させ、酵素蛋白を
溶出させた。それをＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｌ疎水
クロマトグラフィー（３×２０ｃｍ）により、緩衝液中
の硫安濃度を２Ｍ〜０Ｍに変化させ、酵素分画を得た。
さらに、これをＣｅｌｌｕｒｏｆｉｎｅ ＧＣＬ−２０
００（２×１００ｃｍ）によるゲル濾過、及び Ｍｏｎ
ｏ Ｑ（０．５×５ｃｍ）カラムを用いた高速クロマト
グラフィーにより、Ｄａｖｉｓ電気泳動法で単一蛋白帯
を示すまでに精製した。最終標品は蛋白量として０．５
ｍｇ、その比活性はフィブリン平板溶解活性で粗抽出液
約１４０倍であった。Ｗｅｂｅｒ ＆ Ｏｓｂｏｒｎ
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：４４０６，１９６
９）の方法によるＳＤＳ−電気泳動法の結果、この純化
した酵素の分子量は３８，０００±５，０００と算出さ
れた。この純化した酵素のＮ末端アミノ酸配列を自動ェ
ドマン分解法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１：８
０，１９６７）によりプロテインシークェンサーＡＢＳ
を用いて調べた結果、Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｅ−Ｑ−Ｚ
−Ａ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｈ−Ｑ−Ｖ−Ｌ−Ｎ−Ｓ−Ｇ−
Ｙ−Ｈ−Ｆ−であることがわかった。
【００１３】第８例 ３．７〜４．３ｋｇの家兎（雄）にゾンデで十二指腸よ
り、第２例と同様にして得たカツオ塩辛抽出液を、蒸留
水で透析し、さらに凍結乾燥したもの３．２ｇを１０ｍ
ｌ生理食塩水に溶解し投与した。経時的に採血し、その
血漿の希釈液を使ってトロンボェラストグラフィーパタ
ーンを調べた。その結果、投与前に比べてｋ値及びｒ値
に有意の変化はなかったが、投与３時間後のＭａ値は約
２９％（ｐ＜０．０５；ｎ＝５）減少しており、即ちＫ
Ｋ投与によって血中の線溶亢進の起こるとがわかった。
り、第２例と同様にして得たカツオ塩辛抽出液を、蒸留
水で透析し、さらに凍結乾燥したもの３．２ｇを１０ｍ
ｌ生理食塩水に溶解し投与した。経時的に採血し、その
血漿の希釈液を使ってトロンボェラストグラフィーパタ
ーンを調べた。その結果、投与前に比べてｋ値及びｒ値
に有意の変化はなかったが、投与３時間後のＭａ値は約
２９％（ｐ＜０．０５；ｎ＝５）減少しており、即ちＫ
Ｋ投与によって血中の線溶亢進の起こるとがわかった。
【００１４】第９例 第２例と同様にして得たカツオ塩辛抽出液を蒸留水で透
析し、さらに凍結乾燥したもの１ｇづつを腸溶カプセル
として、健常人３人に食後５カプセルづつ経口投与し
た。経時的に採血し、得られた血漿中の線溶活性をＭｉ
ｌｓｔｏｎｅの方法（Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．４２：１
０９，１９４１）によるユーグロブリン溶解時間法（Ｅ
ＬＴ）で測定したところ、投与前が平均値４３０分であ
ったのに対して、投与後１、２および４時間目にはそれ
ぞれ平均値３６２分、２３０分及び３１０分と、ＥＬＴ
の短縮傾向、即ち血中線溶冗進効果が認められた。
析し、さらに凍結乾燥したもの１ｇづつを腸溶カプセル
として、健常人３人に食後５カプセルづつ経口投与し
た。経時的に採血し、得られた血漿中の線溶活性をＭｉ
ｌｓｔｏｎｅの方法（Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．４２：１
０９，１９４１）によるユーグロブリン溶解時間法（Ｅ
ＬＴ）で測定したところ、投与前が平均値４３０分であ
ったのに対して、投与後１、２および４時間目にはそれ
ぞれ平均値３６２分、２３０分及び３１０分と、ＥＬＴ
の短縮傾向、即ち血中線溶冗進効果が認められた。
【００１５】
【発明の効果】本発明の新規な線溶酵素は前記したよう
に、カツオ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓からはじめて得
られた物質であり、従来より認められているヒト血漿中
のプラスミン或いはウロキナーゼよりも分子量が小さ
い。また基質特異性も特徴的でフィブリンに対し非常に
強い分解活性を持つ。即ち本発明の新規線溶酵素は本発
明者が初めてカツオ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓から得
た物質であり、すぐれた線溶活性を持つことからマイク
ロカプセル化などして直接静注することにより、一般に
線溶酵素が用いられている血栓症、塞栓症の治療へ応用
することもできる。またウロキナーゼで最近行なわれて
いるように経口投与を行なうことによって、とくに長時
間投与して害のないことから血栓症などの治療のみなら
ず、その予防薬としても有用である。
に、カツオ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓からはじめて得
られた物質であり、従来より認められているヒト血漿中
のプラスミン或いはウロキナーゼよりも分子量が小さ
い。また基質特異性も特徴的でフィブリンに対し非常に
強い分解活性を持つ。即ち本発明の新規線溶酵素は本発
明者が初めてカツオ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓から得
た物質であり、すぐれた線溶活性を持つことからマイク
ロカプセル化などして直接静注することにより、一般に
線溶酵素が用いられている血栓症、塞栓症の治療へ応用
することもできる。またウロキナーゼで最近行なわれて
いるように経口投与を行なうことによって、とくに長時
間投与して害のないことから血栓症などの治療のみなら
ず、その予防薬としても有用である。
カツオ塩辛抽出液の等電点電気泳動パターン
Claims (4)
- 【請求項１】 カツオ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓から
抽出され、下記の特性を有することを特徴とする血栓溶
解酵素。 （イ） 分子量：約２０，０００〜５０，０００ （Ｚ
ｙｍｏｇｒａｐｈｙ法による）。 （ロ） 等電点：５．０±０．５ （ハ） Ｎ末端アミノ酸配列：Ｉ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｅ
−Ｑ−Ｚ−Ａ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｈ−Ｑ−Ｖ−Ｌ−Ｎ−
Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｈ−Ｆ−というこれまでに報告のないＮ末
端アミノ酸配列を持つ。 （ニ） 熱安定性：ｐＨ７．４で５０℃、１０分間保持
しても安定。 （ホ） 基質特異性：フィブリンに対する強い分解活性
と共に、合成基質であるｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ、Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対する
強い分解活性を有する。 （ヘ） 阻害剤の影響：ジイソプロピルフルオロホスフ
ェート、大豆トリプシンインヒビター、牛膵臓トリプシ
ンインヒビター、又はアプロチニンで強く阻害される。 - 【請求項２】 カツオ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓を水
性媒体による抽出に付すことを特徴とする血栓溶解酵素
の取得法。 - 【請求項３】 得られた抽出液をそのまま、又は適当な
時間、適当な温度に保持した後、濃縮、透析又は乾燥し
た後、極性有機溶媒、塩析、限外濾過、吸着、イオン交
換クロマトグラフイー、ゲル濾過、アフイニテイクロマ
トグラフィー又は等電点電気泳動の操作を一種類以上組
み合わせて精製する請求項２に記載の取得法。 - 【請求項４】 カツオ塩辛（酒盗）又はカツオ内臓より
抽出される血栓溶解酵素を含有する飲食品又は血栓溶解
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4247057A JPH0646851A (ja) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | 血栓溶解酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4247057A JPH0646851A (ja) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | 血栓溶解酵素 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646851A true JPH0646851A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=17157784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4247057A Pending JPH0646851A (ja) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | 血栓溶解酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646851A (ja) |
-
1992
- 1992-07-31 JP JP4247057A patent/JPH0646851A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dubey et al. | Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources | |
| Kim et al. | Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish | |
| Sumi et al. | A unique strong fibrinolytic enzyme (katsuwokinase) in skipjack “Shiokara” a Japanese traditional fermented food | |
| Barrett et al. | [32] Thimet oligopeptidase and oligopeptidase M or neurolysin | |
| EP0100982A2 (en) | Novel purified plasminogen activator, process for its production and thrombolytic composition containing it | |
| US4996050A (en) | Fibrinolytic activity enhancer | |
| Devi et al. | Production, purification and stability studies on nattokinase: a therapeutic protein extracted from mutant Pseudomonas aeruginosa CMSS isolated from bovine milk | |
| JPH07143878A (ja) | 改善された繊維素溶解性及びトロンビン阻害作用を有する２官能性ウロキナーゼ変異体 | |
| US4550080A (en) | Process for the preparation of a plasminogen activator | |
| JPS61162184A (ja) | 新規な線溶酵素およびその取得法 | |
| JPH08208512A (ja) | 血栓形成阻害剤 | |
| EP0218479A2 (en) | Reagent and process | |
| JPH0647555B2 (ja) | フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体含有血栓溶解剤 | |
| JPH0646851A (ja) | 血栓溶解酵素 | |
| JPH0853364A (ja) | 注射用血栓溶解剤 | |
| EP0163751B1 (en) | Process for the preparation of a plasminogen activator | |
| JP2873041B2 (ja) | 血栓溶解酵素、その取得法、血栓溶解剤及び血栓溶解酵素含有飲食品 | |
| KR101106507B1 (ko) | 장수버섯 균사체 유래의 혈전분해효소 | |
| EP0151996A2 (en) | Process for the Preparation of a double-chain plasminogen activator | |
| Hijikata et al. | Some properties of the tissue plasminogen activator from the pig heart | |
| KR100320948B1 (ko) | 상표초로부터분리·정제한혈전용해성세린프로테아제및그의제조방법 | |
| KR100373395B1 (ko) | 신규한 혈전용해 단백질 및 그의 제조방법 | |
| JP3878668B2 (ja) | 血栓性疾患の治療 | |
| KR100419451B1 (ko) | 천연물로부터 유래한 혈전용해 단백질 | |
| JPH09182583A (ja) | プロ−ウロキナーゼ活性化酵素及びその取得法 |