JPH0326964A - 固相上に固定化された生物学的活性物質の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は担体（固相）上に固定化される生物学的活性物
質の安定化方法、および本発明の方法で安定化される生
物学的活性物質がその上に固定化されている免疫化学的
検出法を実施するための担体に関する。

治療的および／または診断的に重要な物質の定量的およ
び定性的分析のための免疫化学的検出法の多くは水に不
溶性の担体（固相）が生物学的活性物質で被覆されてい
る、すなわち生物学的活性物質が担体上に固定化されて
いる固相原理に基づくものである。これが被検物質の非
結合分画から結合型の分離を、そしてサンプル中のすべ
ての妨害因子からの結合被検物質の分離を極めて容易に
する。適当な固相の例には合戊まＩ；は天然ポリマー例
えばポリスチレン、ボリプロビレン、ＰＶＣまたはラテ
ックスがあり、様々な態様の形状例えばチューブ、ビー
ズまたはマイクロタイタープレートとすることができる
。

しかしながら、被覆された担体にはある程度の長期間の
保存後には、生物学的活性物質の活性が低下するという
欠点がある。これらの活性低下は、製造時にある限界ま
では被覆物質の使用量を増加させることによって埋め合
わせることができる。また、この欠点を回避するために
、生物学的活性物質を安定化（処理）することもできる
。

生物学的活性物質の安定化に関しては様々な方法が報告
されている。すなわち、ＤＥ−Ｂ　２９　１０　７０７
号における糖の使用、ＥＰ−Ａ　０　　１４０　４８９
号における糖およびタンパク質の使用、ＥＰ−Ａ　０　
　１７０　９８３号における加水分解オバルブミンの使
用、ＥＰ−Ａ　Ｏ　　１３３　９７６号における糖酸お
よびその塩の使用等である。しかしながら、連或される
安定性は多くの点でまだ満足できるものではなく、それ
は検出すべき被検物質に対する結合能の低下一任意の所
望の標準の結合と総活性の比によって表される、および
保証できなくなる測定値の再現性一変異係数ＣＶとして
表される、から明白になる。

すなわち、本発明の目的は、固定化された生物学的活性
物質の改良された安定性および測定値の満足できる再現
性を保証する安定化物質の発見を基盤とするものであっ
た。とくに本発明は、被覆された固相の長期間にわたる
または不適当な保存ののちにも測定値の再現性を保証す
ることを目的とするものである。

驚くべきことに、ポリアネトールスルホン酸の単独でま
たはそれと他の安定化物質を一緒に用いて処理すると、
固定化された生物学的活｛生物質の高度な安定性と測定
値の優れた再現性を生じることが明らかにされた。

したがって、本発明は安定化すべき生物学的活性物質が
固定化されｔ；固相をポリアネトールスルホン酸および
またはその塩を含有する溶液と接触させることからなる
担体上に固定化された生物学的活性物質の安定化方法に
関する。

ボリアネトールスルホンＩＩ　（ＰＡＳＡ）は式（１）
のア不トールスルホン酸の重合体であり、分子量は約８
，０００〜１２，０００である。本発明に使用するには
分子量９，０００〜１　１　，　０００のＰＡＳＡが推
奨される。遊離のポリアネトールスルホン酸のほかに、
本発明ではその塩を使用することもできる。使用が好ま
しいポリアネトールスルホン酸の塩はアルカリ金属塩で
あり、その中でもとくにナトリウムおよび／またはカリ
ウム塩である。

適当な担体（固相）は水に不拵性であり、その例には天
然および合或、有機および無機重合体、例えばボリスチ
レン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリド、ポリビニ
リデンフルオリド、ラテックス、ポリアクリルアミド、
マグネタイトまたは多孔性ガラス粉末がある。担体は例
えば、試験管、タイタープレート、キューペット、ロン
ドまたはビーズの形に作ることができる。

生物学的活性物質のために特に適当な担体は、ポリスチ
レンチューブおよびポリスチレンビーズまｔこはラテッ
クスビーズである。目的によっては、担体は磁性材料も
しくは磁化できる材料で構成させるかまたは少なくとも
磁化できる材料を含有させることができる。これらの担
体には磁石を使用して他の系から容易に取り出すことが
できるという利点がある。

適当な免疫学的測定法は放射免疫検定法（ＲＩＡ）、酵
素免疫検定法（ＥＩＡ）または化学発光免疫検定法（Ｃ
ＩＡまたはＬＩＡ）がある。

担体を被覆する生物学的活性物質は、例えば抗原、抗体
またはハグテンである。好ましい抗体は癌胎児性抗原（
ＣＥＡ）に対する抗体である。

特に好ましい抗体はＣＥＡに対するモノクローナル抗体
であり、これはそれ自体公知の方法で製造される。

担体上に固定化された生物学的活性物質を安定するのに
最もよい方法は、生物学的活性物質により公知方法で被
覆した担体を、ポリアネｉ・一ルスルホン酸および／ま
たはその塩、ならびに所望により他の安定化剤（処理剤
）も含有する溶液と接触させるものである。ＰＡＳＡお
よび／またはその塩に加えて使用できる他の処理剤とし
ては、ポリメチル水素シロキサン、ポリエチレングリコ
ール（特に分子量２０．０００〜５０，０００のもの）
、ポリアクリル酸、ポリビニルビロリドン、ポリビニノ
レポリビロリドン、ポリビニノレアルコール、ホリブロ
ピレングリコーノレ、レシチン、ンノレビトーノレ、チ
ロース、スクロース、カゼイン、ゼラチン、ウシ血清ア
ルブミンを挙げることができる。処理溶液のｐＨは５〜
９でなければならず、特に７〜８が好ましい。このｐＨ
を達成するには、ＰＡＳＡおよび／またはその塩の１種
もしくは２種以上、ならびに所望により１種もしくは２
種以上の他の処理剤を、所望のｐＨに調整された緩衝溶
液に溶解する。適当な緩衝剤の例には、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン、クエン酸、クエン酸三ナト
リウム、ナトリウムアジド、塩酸もしくは水酸化ナトリ
ウム溶液、またほかに任意のこれらの物質の所望の混合
物がある。そのまま使用される緩衝化処理溶液はＰＡＳ
Ａおよび／またはその塩１種もしくは２種以上を０．Ｏ
１〜５０９／ｆｆの濃度で（処理溶液に対して）、好ま
しくは０．１〜２０９／α、特に好ましくは１〜１０９
／１２含有する。そのまま使用される緩衝化処理溶液が
また他の処理剤も含有する場合には、これは０．１〜４
０９／Ｑ、好ましくは１−２０９／Ｑ、特に好ましくは
５　−　１５ｇ／　Ｑ（Ｍ　理溶液に対して）の濃度で
添加される。

処理は被覆表面を処理溶液と接触させることによって行
われる。被覆された担体の形態的な設計によって担体を
処理溶液に完全に浸し（例えばビーズ、ロッド等の形状
の場合）、また担体の内側に処理溶液を入れる（例えば
内側から被覆されるチューブ、キューペット等の形状の
場合）。ｌｌｌ露時間は５〜５０時間、好ましくは１０
〜３０時間、特に好ましくはｌ５〜２５時間である。

処理は１８〜２８℃、好ましくは２０〜２６°Ｃの温度
で行われる。次いで処理溶液を除去し、被覆後処理され
た担体を好ましくは真空中、例えば室温５〜２Ｑｍｂａ
ｒで１〜５時間乾燥することにより、乾燥する。本発明
によって処理された担体は室温で保存できる。慣用の処
理が行われた担体、例えばウシ血清アルブミン、スクロ
ースまたはソルビトールで処理された担体に比べて、本
発明によって処理された担体は改良された安定性と測定
値の優れた再現性を示す。

実施例 実施例　１ 処理緩衝液の製造： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン６９、クエン
酸３．２ｇ、クエン酸三ナトリウムニ水和物１０９およ
びナトリウムアジド１ｇを１１２の脱イオン水に溶解し
、ｐＨをＨＣＩ２またはＮａＯＨで７．５に調整する。

実施例　２ 処理溶液の製造： ボリアネ！・−ルスルホン酸ナトリウム塩ＮａＰＡＳＡ
　（Ｓｉｇ＋＋＋ａ，　　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｅ，
　　ＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎまＩ；はＦＬＵＫＡ，　Ｆ
ｅｉｎｅｈｅｎｉｋａｌｉｅｎ　ＧｍｂＨ，　Ｎｅｕ−
Ｕｌｍ）の所望量を処理緩衝液に溶解する。以下のＮａ
　ＰＡＳＡ含量の溶液を製造しＩ；。

実施例番号　　　Ｎａ　ＰＡＳ＾重量％２　ａ　　　　
　　　　Ｏ．１ ２　ｂ　　　　　　　　Ｏ．２ ２　ｃ　　　　　　　　Ｏ．５ ２　ｄ　　　　　　　　ｌ．０ ０．５％Ｎａ　　ＰＡＳ＾と０．５％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳ＾）を含有する処理溶液（実施例２ｅ）も製造
した。

実施例　３ ボリスチレンチューブ（長さ７５ｍｍ、径１２ｍｍ）の
内側の高さ約５開までを（約２００μ０、常法によりＣ
Ｅ＾に対するモノクローナルマウス抗体で被覆する。例
２ａの処理溶液３００μＱをこれらのチューブ内Ｊこ入
れ、室温Ｉこ２０時間放置してチューブを被覆する。次
いで処理溶液を吸引除去し、チューブを室温、圧力ＩＱ
ｍｂａｒで３時間乾燥させる。

実施例　４ 被覆ポリスチレンチューブを実施例３と同様にして実施
例２ｂの処理溶液で処理する。

実施例　５ 被覆ポリスチレンチューブを実施例３と同様にして実施
例２Ｃの処理溶液で処理する。

実施例　６ 被覆ボリスチレンチューブを実施例３と同様にして実施
例２ｄの処理溶液で処理する。

実施例　７ 被覆ポリスチレンチューブを実施例３と同様にして実施
例２ｅの処理溶液で処理する。

安定性と再現性の測定 実施例３〜７の処理チューブを熱負荷（ｈｅａｔｓｔｒ
ｅｓｓ）に付した。このためにはチューブをそれぞれ冷
室（４゜Ｃ１湿度６０％）に６日間、次いで加温室（４
０゜Ｃ１湿度８０％）に６日間、次に空調室（交互に４
０’Ｏ、湿度８０％に１２時間、５°Ｃ１湿度６０％に
１２時間）にさらに６日間保存した。

次に、結合値（Ｓ．／Ｔ，％）および変動係数（ＣＶ　
，％）を実施例３〜７の処理チューブのすべてについて
測定した。結合値Ｓ．／Ｔは最高の標準を用いた場合の
結合トレーサーのシグナル（　ＲＩＡ−ｇｎｏｓＬＣＥ
Ａのｓｉ）と各チューブに使用したトレーサー量でのシ
グナル（総活性Ｔ）の比から得られ、変動係数Ｃｖ（％
）は１０の測定値の標準偏差（ＳＤ）とこれらの１０の
測定値の平均（ｍｅａｎ）から（ＳＤ／ｍｅａｎ）×ｌ
００として計算される。得られた結果を第ｌ表（負荷：
空調室、および場合により加温室）および第１図に示す
。比較のために慣用の処理を行ったチューブ（スクロー
ス、ソルビトール、ウシ血清アルブミンおよびこれらの
化合物の混金物を用い実施例３に記載したようにして調
製）についての結果も第ｉ図に掲げる。第１表には比較
例どしてｌ％ＢＳＡ処理チューブも包含する。

本発明に従って処理したチューブでは、慣用の処理を行
ったチューブに比較して、優れた安定性と、従って測定
値の優れた再現性を示しｔこ。

第１表 熟負荷後のチューブの安定性 （ＲＩＡ−ｇｎｏｓｔ　ＣＥＡ　ｌ−工程）（比較例） Ｏ．ｌ％Ｎａ　ＰＡＳＡ （実施例３） 初期結合 保存条件 負荷後のＳｓ／Ｔ （１０の測定値） 結合％ ４６％ １９日 ４６ ２．１ ０．２％Ｎａ　ＰＡＳＡ （実施例４） ４６％ １９日 ４５ １．７ ０．５％Ｎａ　ＰＡＳ＾ （実施例５） ４７％ １９日 ４５ ２．３ ｌＯ％Ｎａ　ＰＡＳＡ （実施例６） ４７％ ■９日 ４ｌ ｌ７ ｌ．０％ＢＳ＾ （比較例） ４７％ ６日 ６日 ２２ １１．０ １．０％Ｎａ　ＰＡＳＡ （実施例６） ３８％ ６日 ６日 ４２ ２．０

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法で処理されたチューブの熱負荷
による保存（冷室６日間、空調室６日間、加熱室６日間
）後の結合値（Ｓ＠／Ｔ，保存前の値に対する％）およ
び変動係数（ＣＶ）を、慣用の処理を行った場合の結果
と比較して示した図面である。 第 ｌ 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）安定化すべき生物学的活性物質が固定化された固相
   をポリアネトールスルホン酸およびまたはその塩を含有
   する溶液と接触させる 担体上に固定化された生物学的活性物質の安定化方法。 ２）溶液は他の処理剤も含有する請求項１記載の方法。 ３）溶液は緩衝剤を含有する請求項１または２記載の方
   法。 ４）固相はついで乾燥させる請求項１〜３の１または２
   以上に記載の方法。 ５）生物学的活性物質は抗体である請求項１〜４の１ま
   たは２以上に記載の方法。 ６）生物学的活性物質はモノクローナル抗体である請求
   項１〜４の１または２以上に記載の方法。 ７）生物学的活性物質は抗原である請求項１〜４の１ま
   たは２以上に記載の方法。 ８）固相はラテックス粒子から構成されるかまたはポリ
   スチレンチューブである請求項１〜７の１または２以上
   に記載の方法。 ９）固相は磁気的に引き付けられうるものである請求項
   １〜７の１または２以上に記載の方法。 １０）固相は合成ポリマーである請求項１〜７の１また
   は２以上に記載の方法。 １１）生物学的活性物質が担体上に固定化されている、
   免疫化学的検出法を実施するための担体を製造する方法
   において、固定化された生物学的活性物質を請求項１〜
   １０の１または２以上に記載の方法で安定化する方法。 １２）請求項１１に記載のようにして得られる免疫化学
   的検出法を実施するための担体。１３）請求項１１記載
   の担体の放射免疫検定法、酵素免疫検定法または化学発
   光免疫検定法における使用。