JPH03220200A - ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童膚−ヒ外泗」づト」 本発明は、単純ヘルペスウィルス（以下、Ｈ８Ｖと略称
）の表面抗原ｇＢとｇＤとの融合蛋白遺伝子を組換えＤ
ＮＡ技術を用いて真核生物で発現させ、免疫学的に活性
なＨ３Ｖ表面抗原融合蛋白を製造し、Ｈ８Ｖワクチンの
免疫原として利用する技術に関する。

灸米叫技監 社会環境や生活様式の変化によってヘルペス脳炎、性器
ヘルペスなどのＨ８Ｖ感染症が問題化してきている。

ほとんどのＨ３Ｖ感染は不顕性感染であるが、免疫機能
が十分に発達していない新生児などでは全身感染を起こ
し重症化する場合がある。また感染したウィルスは神経
節に潜伏し、時としてこれが再活性化して回帰発症を起
こす。今日、この発症を予防したり、潜伏化を予防する
ためのワクチンの開発が望まれている。

Ｈ５Ｖには潜伏感染という性質や発癌性の疑いもあるた
めに、生ワクチンや不活化ワクチンは不適当であり、成
分ワクチンが望ましいと考えられている。Ｈ８Ｖ粒子や
Ｈ３Ｖ感染細胞から部分精製された糖蛋白ｇＢとｇＤは
Ｈ８Ｖ−１と一２型に共通のエピトープを持っており、
ワクチンの免疫原として有望である。事実、Ｈ５Ｖ−１
感染ＶｅｒＯ細胞から精製されたｇＢを用いる成分ワク
チンはＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスにおけるＨ５Ｖ急
性感染と、それに続く三叉神経節での潜伏感染をも防御
しうろことが報告されている〔城野洋一部：臨床とウィ
ルス、　１２，４４１（１９８４））　。

最近、遺伝子工学的手法によってｇＢやｇＤが調製され
、ワクチン免疫原としてのそれらの可能性が調べられて
いる。すなわち、ｐ　、Ｉｄ　、　１３ｅｒｍａｎら〔
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７．１４９０（１
９８４））はチャイニーズハムスター卵巣細胞で産生さ
れたｇＤがモルモットにおけるＨ８Ｖ−２型の膣内感染
を防御することを報告している。また、Ｃ，Ｎｏｚａｋ
ｉら〔ウィルス・リサーチ（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、）、
４，１０７（１９８５））は酵母で産生されたｇＢがマ
ウスにおけるＨ８Ｖ−１型の腹腔内感染を防御すること
を証明している。さらに、最近Ｙ、Ｋｉｎｏら〔ワクチ
ン（Ｖａｃｃｉｎｅ　、　７　。

１．５５（１９８９））は、このｇＢがマウスにおける
Ｈ８Ｖ−１型の角膜感染およびモルモットにおけるＨ８
Ｖ−２型の膣内感染を防御すると報告している。

さらに、組換えｇＢおよびｇＤの混合物をワクチンの免
疫原とする試みも行われている（特表平１−５００９９
９号）。

日が解決すべき課 アシクロビア、Ａ　ｒ　ａ　−Ａなどの抗ウィルス剤の
開発によってＨ５Ｖ急性感染の治療は可能になりつつあ
るが、−旦潜伏感染が成立してしまうと抗ウィルス剤や
中和抗体では体内よりウィルスを排除することは極めて
困難であり、また耐性ウィルスの出現を考えると抗ウィ
ルス剤の長期使用はできるだけ避けるべきである。従っ
て、免疫原の強いワクチンを用いた新たな戦略による、
再発。

回帰発症の予防や治療が試みられるべきである。

を　　するための ヘルペスウィルスの初感染部位が多くの場合、口腔粘膜
や生殖器粘膜局所であり、また回帰発症もこれら局所に
おいてしばしば起こることが知られている。そこで本発
明者らは、これらの局所において強い免疫応答を誘導で
きる抗原を作製することを目的に研究を進めた結果、Ｈ
８Ｖ表面蛋白のｇＢとｇＤとを融合した蛋白が、この目
的を達成し得ることを見出し１本発明に到達したもので
ある。

すなわち、本発明は、（１）単純ヘルペスウィルス表面
抗ＲｇＢとｇＤとの融合蛋白、（２）上記（１）記載の
融合蛋白をコードする塩基配列を含有する組換えＤＮＡ
、（３）上記（２）記載の組換えＤＮＡを保持する形質
転換体、（４）上記（３）記載の形質転換体を培養し、
培養物中に上記（１）記載の融合蛋白を生成蓄積せしめ
、これを採取することを特徴とする該融合蛋白の製造法
を提供するものである。

本発明では特に、（１）トランスメンブレンドメインの
除去されたｇＢとトランスメンブレンドメインの除去さ
れたｇＤとの融合蛋白（Ｉ）：（２）融合蛋白Ｎ）をコ
ードする塩基配列を含有する組換えＤＮＡ　（ｎ）：　
　（３）組換えＤＮＡ（ｎ）を保持する形質転換体；お
よび（４）組換えＤＮＡ　（ｎ）を保持する形質転換体
を培養し、培養物中に融合蛋白（１）を生成蓄積せしめ
、これを採取することを特徴とする該融合蛋白（Ｉ）の
製造法を提供するものである。

Ｈ５Ｖの表面蛋白遺伝子としては１例えばＨ３Ｖ−１型
深山株等、Ｈ８Ｖ−１型や２型の各種の株のｇＤ遺伝子
やｇＢ遺伝子を用いることができる。ｇＤ遺伝子として
は第１図のようなアミノ酸配列のもの（Ｈ５Ｖ−１型深
山株の表面蛋白ｇＤ、特願昭６３−３１７５４６号）が
例として挙げられるが、この中の必須の部分はＮｏ、２
６のｒ＝ｙＳからＮｏ、３０２のＡｌａである。このｇ
Ｄ遺伝子をコードする塩基配列を含有するＤＮＡとして
は第２図に示すものが一例として挙げられる。

そのＮｏ、１８６からＮ　ｏ　、　１０１６までがその
必須部分に相当する。またｇＢ遺伝子としては第３図（
ＨＳＶ−１型深山株の表面蛋白ｇＢ、平成１年６月２２
日出［）のアミノ酸配列のポリペプチドがその一例とし
て挙げられるが、この内必須の部分はＮｏ、１のＡｌａ
からＮ　ｏ　、　２９３のＡｓｐまでである。このｇＢ
遺伝子をコードする塩基配列を含有するＤＮＡとしては
第４図に示すものが一例として挙げられる。そのＮｏ、
３４１からＮ０１１２１９までがその必須部分に相当す
る。

更にｇＢ遺伝子の例として、第５図［ＨＳＶ−１型ＫＯ
３株の表面蛋白ｇ　Ｂ　、Ｄ、Ｊ、Ｂｚｉｋら、ヴイロ
ロジ−（Ｖｉｒｏｌ、　１３３．３０１（１９８４））
　、第６図〔ＨＳＶ−１型Ｆ株の表面蛋白ｇ　Ｂ　、　
Ｐ、Ｅ、Ｐｅ１ｌｅｔら、ジャーナル・オブ・ヴイロロ
ジ−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、組、２４３（１９８５））のよ
うな塩基配列、それから推定されるアミノ酸配列のもの
が例として挙げられる。これらの遺伝子、より好ましく
はトランスメンブレンドメインのコード領域を除去した
トランケイテッドｇＢ遺伝子に、トランスメンブレンド
メインのコード領域を除去したトランケイテッドｇＤ遺
伝子を結合させることによって融合蛋白遺伝子を構築す
ることができる。

本発明における融合蛋白（Ｉ）をコードする塩基配列を
含有する組換えＤＮＡ　（発現用プラスミド）は例えば
（イ）ＨＳＶ−１型深山株のｇＤまたはｇＢ遺伝子がク
ローン化されたプラスミドから、目的とするトランケイ
テッド遺伝子をそれぞれ切り出し、（ロ）必要により適
当なリンカ−を付加させた後、該ＤＮＡの３′末端側に
それぞれｇＢまたはｇＤ遺伝子を結合した融合遺伝子を
構築し、（ハ）該融合蛋白遺伝子を発現ベクター中のプ
ロモーターの下流に連結することにより、融合蛋白をコ
ードするＤＮＡを作製することができる。

本発明に用いるベクター（例、プラスミド）としては、
宿主である真核細胞に対応して複製可能なものであれば
何でもよい。宿主が酵母の場合には、例えばｐ　Ｓ　Ｈ
１９（Ｉ（ａｒａｓｉｍａ、Ｓ、ら、モレキュラー・セ
ルラー・オブ・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ
。

１、）、４．７７］（１９８４））、ｐｓＨ１９−１（
ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２３５４３０）な
どが挙げられ、これらにプロモーターを挿入することに
よって外来遺伝子発現用ビークルが得られる。宿主が動
物細胞の場合には、例えばｐＢＲ３２２にＳＶ４０由来
のプロモーター、レトロウィルスのプロモーターなどを
挿入することによって外来遺伝子発現用ビークルが得ら
れる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。宿主が酵母である場合は、ＧＬ
Ｄ（ＧＡＰＨ）プロモーターＰＨ０５ブ０−Ｆ−−９−
１ＰＧＫプＯモー９−１ＡＤＨプロモーター、ＰＨ０８
］プロモーターなどが好ましく用いられる。宿主が動物
細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レ
トロウィルスのプロモーターなどが挙げられる。

プロモーターは対応する遺伝子より酵素的に調製するこ
とができる。また、化学合成することもできる。

このようにして構築された組換えＤＮＡを含有するベク
ターを用いて、真核細胞を形質転換する。

宿主としては、酵母、動物細胞などが挙げられる。酵母
としては、たとえばサツカロマイセスセレビシェ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ａ
　Ｈ２２Ｒ”−、ＮＡ７４−３Ａ　（ρ−）、ＮＡ３７
−１１Ａ。

ＤＫＤ−５Ｄなどが挙られる。

動物細胞としては、たとえば付着細胞であるサル細胞Ｃ
ＯＳ　　７　＋　Ｖ　ｅ　ｒ　ｏ　ｒチャイニーズＡム
スター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウスＬ細胞、ヒトＦＬ細
胞、および浮遊細胞であるマウスミエローマ細胞５Ｐ２
１０，７つＸＹＡＣ−１細胞、マウスＭｅｔｈ−Ａ細胞
、マウスＰ３８８細胞、マウスＥＬ−４細胞などが挙げ
られる。

酵母を形質転換するには、たとえばプロシージンゲス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、
７５．１９２９（１９７８））に記載の方法に従って行
われる。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロ
ロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　５２，４５６（１９７３
）あるいはモレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ
ジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。

）６，７０３（１９８６）に記載の方法に従って行われ
る。

このようにして得られた形質転換体（組換え体）をそれ
自体公知の方法で培養する。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地［Ｂｏｓｔａｉｎ、　Ｋ、Ｌ、ら「プロシー
ジンゲス・オブ・ザ・ナシゴナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
１ＪＳＡ）、７７．４５０５（１，９８０）　Ｊが挙げ
られる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい
。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い
、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１２２゜５０
１（１９５２））、　ＤＭＥＭ培地〔ヴイロロジー（Ｖ
ｉｒｏ−］、ｏｇｙ）、８，３９６（１９５９））、　
ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・
アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍ
ｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）　１９９，５
１９（１９６７））、　１９９培地〔プロシージング・
オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル
・メディスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇｏｆ　ｔｈｅ　
５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ阿ｅｄｉｃｉｎｅ）７３．１　（１９５０））などが
挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要
に応じて通気や攪拌を加える。

本発明によれば、Ｈ８Ｖ表面抗原のｇＢとｇＤの両抗原
活性をもつ融合蛋白は、自体公知の分離・精製法を適切
に組み合わせて行うことができる。

これらの公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈殿
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオ
ン交換グロマトグラフイーなどの荷電の差を利用する方
法、アフィニティクロマトグラフイーなどの特異的親和
性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーな
どの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法など
の等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

作用及び効果 本発明で得られるＨ５Ｖ表面蛋白のｇＢとｇＤの融合蛋
白は、Ｈ８Ｖ感染細胞を原料にして製造されるＨ３Ｖ表
面蛋白と同様の生物活性を有し、Ｈ３Ｖウィルスの予防
のためのワクチンとして、用いることができる。

なお１本願明細書や図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｔｒ
ｒｍｉｓｉｏｎ　ｏｎ　８ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏ
＊ｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野にお
ける慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる
。またアミノ酸に関して光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ：アデニン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ　　ニゲリシン Ａ］、ａ：アラニン Ｖａｌ　　：バリン Ｌｅｕ　　：ロイシン １１ｅ　　：イソロイシン Ｓｅｒ　　：セリン Ｔｈｒ　　：スレオニン Ｃｙｓ　　ニジスティン １／２Ｃｙ　ｓ 　ｅ　ｔ ｌｕ ｓｐ ｙｓ ｒｇ ｉｓ ：ハーフシスチン ：チミン ：メチオニン ：グルタミン酸 ：アスパラギン酸 ：リジン ：アルギニン ：ヒスチジン Ｐｈｅ　　：フェニールアラニン Ｔｙｒ：チロシン Ｔｒｐ　　ニトリブトファン Ｐｒｏ　　ニブロリン Ａｓｎ　　：アスパラギン Ｇｉｎ　　：グルタミン Ａ　ｐ　ｒ　　：アンピシリン耐性遺伝子ＴＣｒ　：テ
トラサイクリン耐性遺伝子なお、本発明のペプチドにお
いては、そのアミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、
その他のアミノ酸への置換など）されていてもよい。

来月貫 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

後述の実施例２で得られたプラスミドｐＨ５ＢＤ１０６
ΔＴｔｈを保持する形質転換体サツカロマイセスセレビ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｏ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ｐＨ５ＢＤ１０６Δ
Ｔｔｈは、平成１年１１月２７日から通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−２６６６として寄託され、また該微生物は平
成１年１１月１７日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に受託番号ＩＦＯ１０４９２として寄託されている。

実施例Ｉ　　Ｈ５Ｖ−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　
Ｂとｔｒｕｎ（ａｔｅｄ　ｇ　Ｄとからなる融合蛋白質
遺伝子発現プラスミドの構築 単純ヘルペスウィルス深山株のウィルスＤＮＡを調製、
このものからＨ３Ｖ−１型深山株ＤＮＡ断片を含有する
プラスミドベクターＰ　ＨＳ　Ｂ　２００を得、このも
のから得られる約３．１ｋｂのＸｈｏｉ−ＢａｍＨＩ断
片と、プラスミドベクターｐＨ５Ｇ３９７のＸｈｏＩ−
ＢａｍＨＩ消化物と反応させ、サブクローニングプラス
ミドｐＨ５Ｇ３９７−ｇＢ１０６を作製した（特願平１
−１５８２３８号の実施例１〜３参照）。

このようにして得られたサブクローニングプラスミドｐ
　ＨＳ　Ｇ３９７−　ｇ　Ｂ　１０６を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化し、約３．１ｋｂのＤＮ
Ａ断片を得た。この断片を更に制限酵素Ｔ　ｔ　ｈ　１
１１１で消化し、約２．０ｋｂのＥｃｏＲｒ−Ｔｔｈ１
１１ｒ断片を得た。この断片にクレノーフラグメントを
作用させ、Ｘ、　ｂ　ａ　Ｉリンカ−（ｐＣＴＣＴＡＧ
ＡＧ）を反応させた後、制限酵素ＸｈｏＩとＸｂａＩｔ
’消化し、約２．０　ｋ　ｂ（７）Ｘｈ　ｏ　Ｉ　−Ｘ
ｂａｒＤＮＡ断片を得た。この断片をプラスミドベクタ
ーｐＨ５Ｇ３９７のＸｈｏｌとＸｂａＩ消化物と反応さ
せ、サブクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９７−ｇＢ
１０６ΔＴｔｈ　（Ｘｈ−Ｘｂ）を作製した。このプラ
スミドを制限酵素ｘｈＯＩとＸｂａｌで消化してｇＢ遺
伝子を含む約２゜０ｋｂのＸｈｏｌ−Ｘｂａｌ　　ＤＮ
Ａ断片を調製した。

次にプラスミドベクターＰＵＣ１８を制限酵素Ｈｉ　ｎ
　ｄ　ｍとＨｉ、　ｎ　ｃ　ｎで開環して得たベクター
とｇＤコード領域を含むＨ４ｎｄｍ−Ｎｒｕｌ断片を反
応させて得たプラスミドｐＵｃ１８ｇＤ（特原昭６３−
３１７５４６号明細書の実施例３−・２参照）を、制限
酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍとＢａｍＨＩで消化して約１．４
ｋｂのＤＮＡ断片を得、更に制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｆ　Ｉ
で消化して約０．９７ｋｂのＨｉ　ｎ　ｄｌＩ［−Ｈｉ
　ｎ　ｆ　Ｉ断片を得た。第７図に示すストップコドン
を有する１２ｂｐ　　ＤＮＡ断片を化学的に合成し、こ
れと上記Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ　−Ｈ１ｎｆｌ断片を反応さ
せ、制限酵素５ａｃＩとＨｉｎｄｎＩで消化し、約０．
９７ｋｂのＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　−５ａｃｌ断片を得
た。この断片をプラスミドベクターｐｔＪＣ１８のＨｊ
、ｎｄＩ［ｌ−８ａｃｌ消化物と反応させ、サブクロー
ニングプラスミドｐＵｃ１８　　ｇＤ１０６ΔＨｉ　ｎ
　ｆを作製し、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで
消化し、さらに制限酵素５ａｃＩＩで部分消化して、約
０．８３ｋｂのＥｃｏＲＩ−８ａｃｎ　　ＤＮＡ断片を
得た。この断片にＴ４ＤＮＡポリメラーゼを作用させた
後、ＸｂａＩリンカ−ＣｐＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡ）
を付加し、制限酵素５ａｃＩとＸｂａＩで消化し。

約０．８３ｋｂのＸｂａＩ−８ａｃｌ　　ＤＮＡ断片を
得た。この断片をプラスミドベクターｐＨ８Ｇ３９６の
Ｘｂａｌ−５ａｃｌ消化物と反応させ、サブクローニン
グプラスミドｐＨ５Ｇ３９６　　ｇＤ１０６ΔＨｉｎｆ
を作製し、このプラスミドを制限酵素５ａｃｌとＸｂａ
ｌで消化し、ｇＤ遺伝子を含む約０．８３ｋｂのＸｂａ
ｌ−３ａｃｌＤＮＡ断片を調製した。上記のｇＢ遺伝子
を含む約２．０に、ｂのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ　　ＤＮＡ
断片と、ｇＤ遺伝子を含む約０．８３ｋｂ　　ＸｂａＩ
−５ａｃｌ　　ＤＮＡ断片と特願昭６３−３１７５４６
号明細書の参考例１に記載のプラスミドｐＧＦＥ２１３
　（ＩＦＯ１０４６０，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０９５由
来）のＸｈｏＩ−３ａｃｌ消化物を反応させることによ
り発現プラスミドｐＨ８ＢＤ１０６ΔＴｔｈを得た（第
７図）。

また得られたｇＢ−ｇＤ融合蛋白遺伝子の塩基配列と推
定されるアミノ酸配列を第８図に示す。

実施例２ 公巳丈 実施例１において構築したプラスミドｐＨ５ＢＤ１０６
ΔＴｔｈで酵母サツカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｎ　Ａ
　７４−３Ａ（ρ−）を形質転換し、形質転換体サツカ
ロマイセスセレビシェＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／　ｐ　
Ｈ３ＢＤ１０６ΔＴｔｈを得た。

得られた形質転換体をヨーロッパ特許８願公開Ｅ　Ｐ　
−Ａ　−０２３５４３０の実施例１５に記載の培地で培
養した後、菌体を集めた。より具体的には、酵母形質転
換体を４ｍｌの培養液（ＩＱあたり、Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ
、グ／ｌ／Ｊ−ス３０ｇ、　７スパラギン４ｇｙＬ−ヒ
スチジン１００■、ＫＩｏ、１■、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，
０５００ｍｇ、　ＣａＣ１□・２Ｈ２０３３０ｍｇ。

ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ、　Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ，
・７　Ｈ，０２，５Ｈ１ｇ、　Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・４　
Ｈ２００，４ｍｇｔ　（ＮＨ４）３Ｐ○、・１２Ｍｏ○
３　・３　Ｈ２００，２ｍｇ、　Ｚ　ｎ　Ｓ　０４　・
７Ｈ，０３，１■、イノシトール１０■、チアミン０．
２■。

ピリドキシン０．２■、Ｃａ−パントテン酸０．２■。

ナイアシン０．２■、ビオチン０．００２■を含む〕中
で３０°Ｃ１３日間振どう培養した後、その０．５ｍｆ
ｌを上記同培地４．５ｍＡに移し、さらに３０℃で１日
間振とう培養を行う。次に、その２ｍＱを１８１１Ｑの
新鮮培地［ＩＱあたり、　Ｋ　Ｈ２Ｐ　０４３００ｍｇ
　、ショ糖８０ｇ。

アスパラギン４ｇｔＬ−ヒスチジン１００■、ＫＣｌ　
　２、Ｏｇ　、Ｋ　Ｉ　　Ｏ，ｌｌ１１ｇ、　Ｍ　ｇ　
Ｓ　０４・７Ｈ７Ｈ２Ｏ５００，Ｃａ　Ｃｌ　、　・２
　Ｈ２０３３０ｍｇ、グルコース１０ｇ＋トリスーマレ
イン酸（ｐ　Ｈ６，５）　２５ｍＭ、　Ｃｕ　Ｓ　Ｏ４
５Ｈ，００，４ｍ（、Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ，０２
，５ｍｇ＊Ｍｎ３Ｏ４・４Ｈ２００，４ｆｆｉｌ　（Ｎ
Ｈ，）、ＰＯ４−１２Ｍｏ　０３　・３　Ｈ２Ｏ０，２
ｍ＠、　Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２０３，１■、イノ
シトール１０　ｍｇ　ｒチアミン０．２■、ピ１ノドキ
シン０．２■、Ｃａ−パントテン酸０．２■、ナイアシ
ン０．２１１１ｇ　＋　ビオチン０．００２■を含む〕
に移し、さらに３０℃で３日間振どう培養を行ｔ）、菌
体を遠ノヒで集めた。

菌体約１５０■をリン酸ナトリウムノ曵ツファー〔１０
０ｎ＋Ｍリン酸ナトリウム（ｐ　Ｈ７，４）、　７．０
Ｍ尿素。

１、ＯｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐ　Ｈ８，０）　、　
　１　ｍＭ（ｐ−アミノジフェニル）メタンスルホニル
　フルオライドノ１イドロクロライド〕５００μｇに懸
濁し、ガラスピーズ１ｇを加え、　ｖｏｒｔｅｘで約３
０分間激しく撹拌した。

１０．０００ｒｐｍ、　５分間遠心分離にかけて、上澄
液を得た。この抽出液に１７３量の４倍濃度のしａｅｎ
ｕ＋＋１ｉｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃、１０分間加
熱した。冷却後、１０．０００ｒｐｍ、　５分間遠心分
離にかけ、上澄液を得た。

該抽出液８０μＱを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動にかけ、さらに電気的にニトロセルロースフィ
ルターにブロッティングした。このフィルターに、ＤＡ
ＫＯＰＡＴＴＳ社の抗Ｈｅｒｐｅｓ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙ
ｐｅｌ　（Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ）抗体（ｒａｂｂｉｔ）
を反応させ、次にｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅ標識抗ウサギ抗体を反応させ、ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ　ｒａｄ社）で発
色させると特異的なバンドが検出された。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨ８Ｖ−１型深山株の表面蛋白ｇＤ遺伝子のア
ミノ酸配列の一例を示す図であり、第２図は第１図のア
ミノ酸配列に対応する塩基配列の一例である。 第３図はＨ８Ｖ−１型深山株の表面蛋白ｇＢ遺伝子のア
ミノ酸配列の一例を示す図であり、第４図は第３図のア
ミノ酸配列に対応する塩基配列の一例である。 第５図はＨ３Ｖ−１型ＫＯ５株の表面蛋白ｇＢの塩基配
列の一例、それから推定されるアミノ酸配列を示す図で
あり、第６図はＨ５Ｖ−１型Ｆ株の表面蛋白の塩基配列
の一例、それから推定されるアミノ酸配列を示す図であ
る。 第７図はプラスミドｐＨ３ＢＤ１０６ΔＴｔｈの構築図
である。 第８図はｇＢ−ｇＤ融合蛋白遺伝子塩基配列と、それか
ら推定されるアミノ酸配列を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）単純ヘルペスウィルス表面抗原のｇＢとｇＤの融
   合蛋白。 （２）単純ヘルペスウィルス表面抗原が単純ヘルペスウ
   ィルス１型または２型のｇＤあるいはｇＢである請求項
   １記載の融合蛋白。 （３）ｇＤあるいはｇＢがトランスメンブレン領域の除
   外されたｇＤあるいはｇＢである請求項１または２記載
   の融合蛋白。 （４）単純ヘルペスウィルス表面抗原ｇＢをアミノ末端
   側に、ｇＤをカルボキシル末端側に配置した請求項１記
   載の融合蛋白。 （５）単純ヘルペスウィルス表面抗原ｇＤをアミノ末端
   側に、ｇＢをカルボキシル末端側に配置した請求項１記
   載の融合蛋白。 （６）請求項１記載の融合蛋白をコードする塩基配列を
   含有する組換えＤＮＡ。 （７）請求項４または５記載の融合蛋白をコードする塩
   基配列を含有する組換えＤＮＡ。（８）請求項６または
   ７記載の組換えＤＮＡを保持する形質転換体。 （９）請求項８記載の形質転換体を培養し、培養物中に
   請求項１記載の融合蛋白を生成蓄積せしめ、これを採取
   することを特徴とする該融合蛋白の製造法。