JPH03173881A - 逆転写酵素阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 成る種のウィルス、例えばエイズウィルス、ＡＴＬウィ
ルス、ＨＢウィルス算は逆転万酵素を有している。そこ
で、逆転写醇素阻害剤作用物質はこれらの抗ウィルス剤
として期待しうる。本発明はこの逆転写酵素阻害剤を提
供するものである。

〔従来の技術〕

従来知られている逆転写酵素阻害剤にはフオスカネット
（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ、　Ｇｅｒ、　０ｆｆｅｎ、　Ｄ
Ｅ３６０１１３６　Ａ１．２３　Ｊｕｌ　１９８７）、
ストレプトニグリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ、　
Ｊ、ａｎｔｉｄｔｏｔ、、３９，３０６．１９８９）、
デキストランサルフエ−）　（Ｇｅｔ、０ｆｆｅｎ、Ｄ
Ｅ　３６０１１３６Ａ１．２３．Ｊｕｌ　１９８７）、
３’−アジシー３”−デオキシチミジントリホスフェー
ト（３°−Ａｚｉｄｏ−３’−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄ
ｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａ　ｔｅｌＡｎ　ｔ　１ｍ１
ｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎ　ｔ％Ｃｈｅｍｏ　ｔｈｅｒ、　
ｒ　３１゜１９７２．１９８７）、３”−アジシー３゛
−デオキシチミジン（３゛−ａｚ　１ｄｏ−３’　−ｄ
ｅｏｘｙ　ｔｈｙｍ　１ｄｉｎｅ、　ＢｉｏｃｈｅＩＩ
ｌ、　Ｂ　１ｏｐｈｙ、　Ｒｅｓ　。

Ｃｏｍｍｕｎ、　＋　１４５．１３５６．１９８７）、
クロモスチンＣｃｈｒｏｔｍｏｓｔｉｎ、Ｊ、Δｎｔｉ
ｄｉｏｔ、、３８，５１９．１９８５）、レトロスタチ
ン（ｒｅｔｒｏｓｔａｔｉｎ、Ｊ、Ａｎｔｉｄｉｏｔ、
、３６．７６１．１９８３）等がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

これらは逆転写酵素阻害活性か弱がったり、ＤＮＡポリ
メレースαやＲＮＡボリメレースＨに対し阻害活性を有
する場合など特異的な逆転写酵素阻害剤とは言えず、医
薬などに応用した場合、毒性の点で問題があり新しい逆
転写酵素阻害剤の出現が望まれている。本発明の目的は
、特異性の高い新しい逆転写酵素阻害剤を提供する車に
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は逆転写酵素阻害活性を有する物質の検索を
目的に広く微生物の培養物、植物体の抽出物、カイメン
の抽出物について種々検索した結果、カイメンに属する
Ｘｅｓｔｏｓｐｏｎｇｉａ　５ａｐｒａの抽出物のなか
にトリ赤芽球性由来の逆転写酵素反応を強く阻害する物
質が存在することを見いだした。

そして、この逆転写酵素阻害作用物質が下記の構造式（
１）を有するものであることを確認した。

但し、 Ｍは陽イオンを示す。

本物質はナトリウム塩が１９８５年に初めて見いだされ
たが、その生理活性については、はとんど検討されてお
らず報告もない（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、３
３．１３９５．１９８５）。

本物質はそれを含有するカイメンから抽出することがで
きる。そのようなカイメンの一例としてＸｅｓｔｏｓｐ
ｏｎｇｉａ　５ａｐｒａがある。これは日本近ン毎をは
じめカイメンの生息する場所で採取される。

カイメンより本物質を分離採取する方法はメタノール、
エタノール、ブタノール、等のアルコールによる抽出法
、シリカゲル、セルロース等の吸着剤を用いる吸着クロ
マトグラフィー、ゲルろ適法、各種溶媒に対する溶解度
差を利用する方法等の公知の分離・精製法を適宜組み合
わせて行なわれる。

本物質はトリ赤芽球性由来逆転写酵素の阻害剤であり、
レトロウィルスに起因する各種ウィルス疾病の治療薬と
して利用される。かかる本物質は構造式（Ｉ）で示され
る基本骨格を有していればよく、逆転写酵素阻害活性を
有していれば種々の誘導体の形をとることができる。Ｍ
は水素イオン、ナトリウムイオン、カリウ１、イオン等
の種々の陽イオンのなかから選択することができる。ウ
ィルス疾病の例としてはヒトに包含されるレトロウィル
スの関与するウィルス疾患、は乳動物を治療するウィル
ス病がある。投与形態は経口投与として錠剤、カプセル
剤またはエリキシル剤のような調剤で、または非経口投
与として無菌溶液剤、懸濁液剤で行なえばよく、これに
よって生体中のレトロウィルスの増殖に関連する逆転写
酵素を阻害しウィルスの増殖を抑制せしめることができ
る。物質の投与量はかかる治療を必要とする患者（動物
、およびヒト）にたいして患者あたり０．１〜５００ｍ
ｇの容量範囲で一般に数回に分けて従って１日あたり１
〜２００■程度が一般に適当である。用量は病気の重さ
、患者の体重および当業者が認める他の因子によって変
化させる。製剤にあたって、本物質は生理学的に認めら
れる塩または混和物とすることができ、生理学的に認め
られるベヒクル、担体、賦形剤、結合剤、防腐剤、安定
剤、香味剤等と共に一般に認められた製薬実施に要求さ
れる単位用量形態で混和される。これらの組成物または
製剤における活性物質の量は指示された範囲の適当な用
量が得られるようにするものである。

錠剤、カプセル剤等に混和する事のできる具体的な薬剤
は次、に示す物である。アラビヤゴム、コーンスターチ
またはゼラチンのような結合剤、微品性セルロースのよ
うな賦形剤、アルギン酸等のような膨化剤、ステアリン
酸マグネシュウムのような潤滑剤、シーＪ糖、乳糖のよ
うな甘味剤、ペパーミントのような香味剤、調剤単位形
態がカプセルである場合には上記タイプの材料に更に油
脂のような液状単体を含有する事ができる。種々の他の
材料は被覆剤としてまたは調剤単位の物理的形態を別な
方法で変化させるために存在させることができる。例え
ば錠剤はシェラツク、ショ糖またはその両方で被覆する
ことができる。シロップまたはエリキシルは活性化合物
、甘味剤としてショ糖、防腐剤としてメチルおよびプロ
ピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジ香味
のような香味剤を含有することができる。

注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中
の活性物質、ゴム油、ヤシ油、落花生油、綿実油等のよ
うな天然産出植物油またはエチルオレート等のような合
成脂肪ベヒクルを溶解または懸濁させる通常の製薬実施
にしたがって処方することができる。緩衝剤、防腐剤、
酸化防止剤等が必要に応じて結合することができる。

〔実施例〕

（１）逆転写酵素阻害物質の調製 鹿児島県口之良部西浦にて採取したＸｅｓｔｏｓｐｏｎ
ｇｉａ　５ａｐｒａ　１００ｇにメタノール３００ｄを
加え４°Ｃで２４時間放置した。ついで脱脂綿を用いて
濾過して濾液を得た。濾液（約３００ｍ）に２．７２の
水を加えた後、２５％メタノールで平衡化したダイヤイ
オンＨＰ−２０カラム（三菱化成工業製、３Ｘ２０ｃｍ
カラム）を通過させ、活性物質を吸着させた。カラムを
２５％メタノール１ｊ２で洗浄した後１００％メタノー
ルで活性物質を溶出した。溶出液をエバポレーターを用
いて４０°Ｃで濃縮、乾固した。これに１００ｄの水を
加えて溶解した。これに予め水で飽和させた、１００ｒ
ｄの酢酸エチルを加え振擾攪拌し、静置し分液分配した
。この操作を３回行い、酢酸エチル層を除去し水層を得
た。水層をエバポレーターを用いて濃縮、乾固した。こ
れを５ＩＩ１１のメタノールに溶解し、セファデックス
ＬＨ−２０（１，４Ｘ　４７ｃｍカラム）に負荷し、ゲ
ル濾過を行なって、７■の活性物質（Ｉ）を得た。

（２）物質の同定 本物質のＦ　Ａ　Ｂ　−’Ｍ　Ａ　Ｓスペクトル及びＵ
Ｖスペクトルを測定した。得られた特徴を表に示す。

表１ 形態 黄色粉末 分子量 ３６ １０ １０ また’Ｈ−ＮＭＲ，ＩＩｃ−ＮＭＲスペクトルを第１図
及び第２図にそれぞれ示す。これらの諸性質はＣｈｅｍ
、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、、　３３．１３０５．１９８
５に記載されているハレナキノール・サルフェートと一
致し本物質が構造式（１）を有するものであることが確
認された。

（３）逆転写酵素阻害活性の測定 溶液Ｒ（２５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）、５００ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭＭｇＣ１ｚ、２ｍＭジ
チオスレイトールを含有する溶液）、鋳型ブライマー溶
液（ｐｏｌｙ（ｒＡ）・（ｄＴ）　Ｉ　Ｚ〜Ｉ　ａ　（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ製品）を１０鋼トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，６）中に１２５μｇ／１ｒｄｌとなるように
加えた溶液〕、逆転写酵素溶液（ＡＭＶリバーストラン
スクリプターゼＸ　Ｌ　（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ製
品）を溶液Ｒに１００Ｕ／ｄとなるように加えた溶液）
及び０、５　ｍＭ　ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ溶液（１０ａｔ’の
滅菌水当り０．０２　ｕ　Ｃｉの（３Ｈ）　ｄ　ＴＴ　
Ｐ　（４０Ｃｉ　／ｍｍｏｌ）を含む溶液］をそれぞれ
調製した。

溶液Ｒ１０ｕＲ１鋳型プライマー溶液５μｅ、逆転写酵
素溶液５　ｐｇ、０．５　ｍ１４　ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ溶液
１０μｇを合わせ、これに滅菌水と試料溶液を加えて最
終容量を５０ａｌｌとした。試料溶液としては前記の調
製例（１）で得られた物質〔１］を最終濃度が０．５．
１０．１５．２０又は５０μｇ／−になるように加えた
。それぞれを４２゛Ｃで１時間反応させた。反応後滅菌
水ＩＩｒｄｌあたリ２２．２μｇの仔牛胸腺ＤＮＡを０
．４！ＩＭ！加え、直ちに１０％（ｗ／ｖ）　　トリク
ロロ酢酸を０．５　ｍｌを加えて１０分間以上放置した
。次に、ワットマンＣＦ／Ｃグラスフィルター上に全内
容物を吸引して通過させた。３雄の５％軸／ν）トリク
ロロ酢酸でフィルターを３回洗浄し、つづいて９５％エ
タノールで２回洗浄した。フィルターを一晩放置して乾
燥させ、５−のトルエンシンチレータが入ったバイヤル
に沈め液体シンチレーションカウンターで放射活性を測
定して酵素反応の阻害率を求めた。結果を表２に示す。

表２ 本物質の逆転写酵素阻害活性 次にＤＮＡポリメレース活性に与える物質〔１〕の影響
を測定した。まず、イトマキヒトデ卵母細胞をＣａＦ水
溶液で３回洗浄し、ついで１Ｍグリセロールで１回洗浄
した。これに等量のＭ緩衝液（２５％蔗糖、０．２Ｍリ
ン酸カリウム（ｐＨ７，４）、ＩＭＮａＣＩ−１ｍＭエ
チレンジアミン４酢酸ナトリュウム、２ｍＭβメルカプ
トエタノール）を加え１０　ｍｌｌのホモジナイザーを
用いてホモジナイズした。このホモジネートを４　’Ｃ
で８００Ｘｇ、６０分間遠心した。上清を取りＤＮＡポ
リメレース酵素液として使用した。ＤＮＡボリメレース
活性は、反応液（５０ｐｅ中に５０ｍＭ　）リス塩素（
ｐＨ７，５）　７ｍＭＭｇＣ１ｔ、５０μＭｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、２０μＭｄＴＴＰ、４０ｍＭＮａ
ｃ１，０．２μＣｉ　（’Ｈ）　ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ　、　
６　ｐｇ仔牛胸腺ＤＮＡ、２４ａｇ牛血清アルブミンを
含む）５０Ｉｌｅに１０μｅの酵素溶液を加え、３７°
Ｃで６０分間インキュベートした。この場合、ポリメレ
ースαの阻害剤であるアフィディコリンを１０μｇ／ｄ
添加した場合と無添加の場合に付いて測定し、ポリメレ
ースα及びβ（アフィディコリン無添加）並びにポリメ
レースβに対する作用を調べた。測定結果を表３に示す
。

表３ 本物質のＤＮＡポリメレース阻害活性 アフィディコリン 無添加　　　　添　加 ０ ０ ５ １０　　　　　　　　８ ＳＣ−１（Ｍ）細胞は逆転写酵素を用いてＲＮＡを鋳型
にしてＤＮＡを合成し増殖するモロニーの白血病ウィル
スを放出する細胞である。この細胞をα−タイプのＭＥ
Ｍ培地で対数後期まで培養し、本物質（１）　１０μｇ
／ａｌｌを含む新しい培地に交換しさらに１２時間培養
した。培養後上清を回収して丹羽の方法（Ｊ、Ｖｉｒｏ
ｌ、１２．６８．１９７３）でつ・イルスを測定した結
果ウィルスは認められなかった。本発明の物質（Ｉ）を
加えない場合は２ｘｌＯ’のウィルスが培地中に放出さ
れていた。

〔発明の効果〕

構造式（１）で表わされる物質は逆転写酵素阻害活性を
有し、ＤＮＡポリメレースα及びβを阻害しない特異的
な逆転写酵素阻害剤であり、この酵素阻害剤はエイズウ
ィルス等の逆転写酵素を有しているウィルスの抗ウィル
ス剤として利用しうろことが期待される。

４図の簡単な説明 第１図は本逆転写酵素阻害ＣＩ）の’Ｈ−ＮＭＲスペク
トル図で第２図はｌ”Ｃ−ＮＭＲである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 但し、Ｍは陽イオンを示す。 で表わされる構造を有する物質を有効成分として含有す
   る逆転写酵素阻害剤