JPH03172198A - 安定化酵素組成物およびそれを用いた酵素アッセイ用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上のｆリ用分野） 本発明は、酵素の安定化に関する。さらに詳しくは、ク
レアチンキナーゼイソ酵素を含有する診断アッセイ用安
定化酵素組成物に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）心臓
組織が虚血障害を被った後、大量の酵素が血流中に放出
される。これらの酵素の１種または２種以上の存在また
は量の増大の検出は、一般に急性心筋梗塞が起こったこ
との確認に用いられている。この目的のため３種の主要
な酵素、すなわちクレアチンキナーゼ（ｃＫＸクレアチ
ンホスホキナーゼとも呼ばれる）、血清グルタミン酸オ
キザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）および乳酸
脱水素酵素（Ｌ　Ｄ　Ｈ）が用いられる。これらの酵素
の放出速度は異なるので、放出の経時パターンが診断に
重要である。血清中のＧＫレベルは、胸の痛みが始まっ
てから４〜６時間以内に上昇し始める。ＣＫレベルのピ
ークは！２〜２４時間以内にみられ、ついで７２〜９６
時間以内に急速に正常範囲に戻っていく。これに対して
、血清ＳＧＯＴレベルのピークは２４〜４８時間で起こ
り、ＬＤＨレベルのピークは２〜４日で起こる。従って
、血液中のＣＫ酵素の量の増大を検出することにより、
心筋梗塞の早期指摘が可能となる。

クレアチンキナーゼはＭサブユニットまたはＢサブユニ
ットからなるダイマーであり、このためヒト組織では３
種の主要なクレアチンキナーゼイソ酵素が存在する。Ｃ
ＫＢＢイソ酵素（またはＣＫ．）は、主として脳および
消化管組織中に存在する。ＣＫＭＢイソ酵素（またはＣ
Ｋｔ）は、主として心筋中、および横隔膜および食道（
平滑筋）中に存在する。ＣＫＭＭイソ酵素（またはＣＫ
．）は、すべての組織、とりわけ骨格筋中に存在する。

ＣＫＭＢイソ酵素は心臓組織にのみ認められるものでも
ないし、心臓組織中に存在する主要なＣＫイソ酵素でも
ない。しかしながら、全体のＣＫパーセントからみた場
合、心臓は池の組織に比べると多くのＣＫＭＢを含んで
いるといえる。それゆえ、筋肉に主立った外傷がない場
合、血清中にＣＫＭＢが現れることは心臓障害の臨床的
兆候として用いられる。

急性心筋梗塞の診断のためにＣＫＭＢレベルを迅速に分
析することは、治療および経済の上から重要な意味合い
を有する。胸の痛みを有する患者の多くは、冠状疾患集
中治療病棟に入れられ、広範かつ費用のかさむ評価を受
けることになる。血清または血漿のＣＫＭＢ分析におい
て胸の痛みから１２〜２４時間後にＣＫＭＢレベルの上
昇が認められない場合には、患者を集中治療病棟から移
動させることができる。

ＣＫのイソ酵素間での区別が臨床的に重要であるので、
これらイソ酵素の有効かつ識別可能なアッセイが望まし
い。ＣＫイソ酵素を分離および測定するために、幾つか
の異なる方法が従来より用いられてきた。電気泳動法お
よびカラムクロマトグラフィー法は、一般にイソ酵素を
物理的に分離するのに用いられ、ついで分離したものを
測定することができる。しかしながら、電気泳動法およ
びカラムクロマトグラフィー法のいずれも時間がかかり
、しかもかなりの熟練を要する。

ＣＫイソ酵素の測定に用いられる他の分析法は、免疫抑
制法およびイムノアッセイ法である。これらの方法は、
ＣＫイソ酵素とＣＫイソ酵素特異的抗体との相互反応に
依存している。そのような方法は、自動化するかまたは
使捨て装置を含むように設計することができ、そうする
ことにより使用者に必要とされる時間および使用者の熟
練の必要性を減少させ、アッセイを行うスピードおよび
容易さを増大させることができる。

一般に診断キットには、アッセイ結果の正確さおよび一
貫性を確実にするため、既知量の酵素を含有する酵素調
製物か参照試料として用いられる。

たとえば、自動化ＣＫＭＢイムノアッセイでは、装置カ
リブレーターおよび／またはコントロールとして種々の
濃度のｃＫＭＢイソ酵素調製物を用いることができる。

長期にわたって行う別々のアッセイ間で正確さおよび均
一性を得るには、酵素調製物は安定でなければならない
。しかしながら、ＣＫイソ酵素のような酵素は熱に弱い
ため、安定化しなければならない。

酵素調製物を安定化するための従来法は、試薬を凍結乾
燥して再構成可能な粉末ま几は錠剤に形成することによ
り、酵素を固体マトリックス中に封じ込めることであっ
た。しかしながら、これらの方法は欠点を有する。凍結
乾燥では水が除かれるため、質コントロールサイクルの
部分が使用者による試薬の希釈および再構威にゆだねら
れることとなる。凍結乾燥した酵素試薬の他の欠点とし
ては、凍結乾燥する間の可変性で不可逆的な不活化、お
よび時間および／または温度依存性回復相が挙げられる
。加えて、凍結乾燥した酵素調製物は、一担再構成した
ら安定性は比較的短い。現在利用することのできる市販
のＣＫＭＢイソ酵素含有酵素イムノアッセイキットでは
、一般に凍結乾燥したカリブレーターおよびコントロー
ル参照試薬が用いられており、これらは再構或後、２〜
８℃で７〜１４日間安定である。

酵素を安定化する池の試みとしては、セルロース粒子な
どの有機担体物質に酵素を結合させること、およびメー
Ｊシング（Ｍｅｓｓｉｎｉ）の米国＠詐填３５５６．９
４５号明細書に記載されているように、反応性のシラノ
ール基を有する無機担体物質に酵素を結合させることが
挙げられる。別法としてモドロビッチ（Ｍｏｄｒｏｖｉ
ｃｈ）　：）は、米国特許第４，６５２，５２４号明細
書において、ポリアクリル酸やポリメタクリル酸などの
担体ボリマー上のペンダント（ｐｅｎｄａｎｔ）基に酵
素（たとえばクレアチンキナーゼ）を共有結合させて酵
素を安定化させることを記載していろ。これ与の方法で
は複雑な製造工程が必要であり、また酵素を担体に結合
させろことにより酵素の活性が抑制されることがある。

ＣＫＭＭイソ酵素を安定化させるためにアデノシンニリ
ン酸を添加することは、ホワイトナー（Ｗｈｉｔｎｅｒ
）らのＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　　２
　８　［１　］％　４Ｉ〜４４（＋９８２）に記載され
ている。

（課題を解決するための手段） 本発明は、安定化した酵素組成物を提供する。

本発明の組成物は、液体媒体中に混合した、安定化しよ
うとする所定量の酵素および酵素基質を含む。上記酵素
は非修飾形である、すなわち、担体物質やボリマー粒子
に結合したり複合体を形戚したりしていない。液体媒体
は、ヒト血清、動物血清または人工血清から選ばれ、バ
ッファーを含有していてもよい。本発明の安定化した酵
素組成物はまた、ｌ種または２種以上の他の酵素基質、
酵素生成物またはそれらの類似体を任意に含んでいてよ
い。さらに、本発明の安定化した酵素組威物は、酵素ア
クチベーターを任意に含んでいてよい。

本発明はまた、ＣＫＭＢアッセイに有用な安定な診断酵
素試薬の調製法をも提供する。本発明はさらに、ＣＫＭ
Ｂアッセイにおいてカリブレーターおよび／またはコン
トロールとして用いるための試薬溶肢のキットをも包含
する。

本発明に従い、酵素を液体媒体中で酵素基質と、酵素基
質および酵素生成物と、または一対の酵素生成物と混合
して酵素紐成物とすることにより酵素を有効に安定化す
ることかできることがわかった。本発明の安定化酵素組
成物はまた、ＩＮまたは２種以上の他の酵素基質、およ
び酵素アクチベーターを任意に含んでいてよい。加えて
、酵素基質類似体および酵素生成物類似体を用いること
もてきる。

定義 本明細書では下記定義を用いる。

本明細書において「安定化」とは、一般的な出荷、貯蔵
および使用に充分な期間、酵素の不活化を防止または減
少させることにより酵素の触媒能または反応能を保護す
ることをいう。

本明細書において「触媒」とは、それ自体は消耗したり
永久的な変化を蒙ったりすることなく、また化学反応の
平衡定数を変えることなく、特定の化学反応の速度を増
加させる物質をいう。触媒反応か終わった時点では触媒
は実質的に変わっていないが、反応物質は新しい生成物
に変換されている。

本明細書において「基質」とは、触媒が作用する物質を
いう。

本明細書において「生成物」とは、触媒の基質への反応
により生成した物質をいう。

本明細書において「アクチベーター」とは、還元剤、二
価金属イオンおよびそれらの混合物をいう。

適当な金属イオンとしては、マグネンウム、マンガン、
カルシウムおよびコバルトイオンなどが挙げられるが、
これらに限られるものではない。適当な還元剤としては
、メルカプトエタノール、システイン、Ｎ−アセチルシ
ステイン（ＮＡＣ）、ノチオエリスリトール、Ｓ−（２
−アミノエチル）イソチオウロニウムブロマイド臭化水
素酸塩、グルタチオン、チオグリコール酸、ジチオスレ
イトールおよびそれらの類似体または等価物などのスル
フヒドリル化合物が挙げられるが、これらに限られるも
のではない。スルフヒドリル結合試薬は、スルフヒドリ
ル酸化または分子内ジスルフィド結合の生成により酵素
活性を抑制する。スルフヒドリル化合物などのアクチベ
ーターとともに酵素をインキユベートすることにより、
酵素の反応性を実質的に完全に保存することができる。

特に好ましいアクチベーターとしては、β−メルカプト
エタノールおよびＮＡＣが挙げられる。

本発明に従えば、有利な酵素試薬溶液を製造することが
可能となる。そのような試薬溶液は既知量の酵素を含有
しており、酵素の反応性は長期間にわたって安定である
ことがわかった。本発明は、１種または２種以上の酵素
基質および／または酵素生成物からなる試薬マトリック
ス中に目的の酵素を封し込めることにより、そのような
酵素試薬溶液の安定化を供するものである。加えて、本
発明の試薬マトリックスは１種または２ｗｉ以上の酵素
アクチベーターを含んでいてよい。従って、本発明は、
非修飾酵素、すなわち有機らしくは無機担体に固定化さ
れていないかまたはボリマーに共有結合されていない酵
素の安定化を達成するものである。

本発明はクレアチンリン酸モデルで態様を説明している
が、本明細書に開示の教示に従い、基質および／または
生成物に関して必要な通常の変更を加え、さらに試験を
行うことにより、当業者により実質的にあらゆる酵素の
安定化を行うことができるであろう。従って、本明細書
に記載の概念および技術は、所定の酵素に対して適当な
基質および／または生成物の選択および添加を行えば、
たとえばリパーゼ、ベルオキシダーゼ、トランスアミナ
ーゼ、ホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、グリコノダ
ーゼ、ラクタマーゼなどを安定化するのに用いることが
できる。

本発明に従って安定化することのできる適当啄酵素は、
３つの一般的む標題（加水分解酔素、酸化還元酵素およ
び転移酵素）のらとにまとめることができる。加水分解
酵素にはタンパク質分解酵素が含まれ、該酵素はタンパ
ク質、炭水化物、エステル、ヌクレアーゼおよびアミン
を加水分解する。酸化還元酵素は、酸化反応および還元
反応を触媒する。転移酵素は、１つの分子から他の分子
へ基を転移させる。特に、本発明の試薬マトリックスに
より安定化することのできる特別の酵素を第１表に示し
た。安定化酵素組成物を調製するための適当な酵素基質
および酵素生成物も示してある。

第１表 酵素 γルカリ性本スフＴターゼ 乳酸脱水素酔素 本スネリパーゼＡ２ アスパラギン酸トランス７ミｔ−ゼ β グルクＵニダーゼ リボスクレ１−ゼ］ β−ラクタ７−ゼ 西洋７ｆビベルｔキンダーゼ ヘキソキｔ−ゼ クレ７ｆ冫キナーゼ 基質 二｝０７Ｘニル本ス７ｘ一ト ７ル今ルネスフｚ−｝ １リル本スフ１−ト ７エニル本ス７１−ト 乳酸　　　　　　　ピルビン酸 ニコチン７ミ　ドー７デニン　　還元型二ゴチン７ミド
ジヌクレオｆド　　　　　　　７デニンジヌクレオチド
ネスｈｆジルコリン ７スパラギン酸 α−ケトグルタル酸 末端グル］一ス成分 を有する炭水化物 ビリミジンヌクレオｆドの ３′結合を有するリボ 核酸 ベニノリン 七フＴＯスボリン ピａガａ−ル グルコース １デノノン三リン酸 生成物 オキザ０酢酸 グルタミン酸 グルコース−６−リン酸 還元型二コｆ冫１ミド ７デニンジヌクレオｆド クレ７ｆ冫リン酸 １デノシンニリン酸 クレアチン ７デノシン三リン酸 試薬マトリックスを生成するために本発明で有用な適当
た液体媒体としては、正常ヒト血清（ＮＨＳ）、正常ウ
マ血清および正常ヤギ血清が挙げられろ。酵素および組
成物の他の成分が可溶であるかまたは可溶化することの
できる通常のあらゆる液体媒体を用いることができ、そ
の例としては、たとえば生理学的診断ベース（＋）ｈｙ
ｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｂａｓ
ｅ）、ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）、ウシガンマ
グロプリン（ＢＧＧ）、人工血清およびタンパク質溶液
（すなわち、疑似血清溶液）を挙げることができる。作
業当事者による特定の液体媒体の選択は、その特定の媒
体が診断アッセイにおいて許容し得る性能を有するかど
うかに依存するであろう。たとえば、液体媒体の許容し
得る性能特性としては、該媒体に添加した酵素を適切に
回収し得ること、長期間の貯蔵後に沈澱が生じないこと
、およびアッセイを妨害する物質が存在しないことなど
が挙げられるが、これらに限られるものではない。

本明細書では、クレアチンリン酸がアッセイでしばしば
用いられるのでモデル酵素として選んだ。

たとえば、ＣＫＭＢアッセイにおいてＣＫＭＢイソ酵素
の溶液が参照試薬（すなわち、アツセイカリブレークー
およびコントロール）としてしばしば用いられる。その
ようＧ酵素試薬は、出荷、貯蔵または通常の使用の間に
熱不活化されないのが望ましい。

クレアチンは、高エネルギーリン酸化合物の重要な貯蔵
形の前駆体として体内で合成される化合物である。クレ
アチンキナーゼは、クレアチンとアデノシン三リン酸と
の間の反応を触媒することにより高エネルギークレアチ
ンリン酸を生成する反応のための酵素触媒である。下記
反応式に示すように、生成物であるアデノシンニリン酸
（ＡＤＰ）およびクレアチンリン酸（ホスホクレアチン
とも呼ばれる）の生成において、クレアチンおよびアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）の両方ともが基質である。ア
デノシンーリン酸は、ＡＭＰとして示す。

クレアチン アデノノン三リン酸（ＡＴＰ） クレアチンリン酸 アデノシンニリン酸（ＡＤＰ） 本発明の安定化クレアチンキナーゼ組成物の調製にあた
って、一酵素基質添加物はＡＴＰまたはＡＴＰ類似体か
ら選ばれ、該ＡＴＰ類似体こしては、アデノソン−５゜
−０（３−チオ三リン酸）、アデニリルーイミドニリン
酸およびアデニリルー（β，γ−メチレン）ニリン酸な
どが挙げられろ。酸化型ＡＴＰ、並びに酸化型ＡＴＰ類
似体、およびＣＫイソ酵素の活性部位に不可逆的に結合
して酵素分子を安定させる他のＡＴＰ親和性類似体を用
いることらできろ。安定化クレアチンキナーゼ組成物は
、クレアチンまたはクレアチン類似体の形態の第二の酵
素基質を任意に含んでいてよい。クレアチン類似体の例
としては、β−グアニジノブロピオン酸、！−カルボキ
シメチル−２−イミノイミダゾリジンクレアチン、Ｎ−
メチル−３−グアニジノブロビオネート、Ｎ−アミジノ
−Ｎ＝エチルグリシン、ｌ一カルボキシエチル−２−イ
ミノイミダゾリジンおよびＮ−（２．３−エポキシプロ
ピル）−Ｎ−アミジノグリシンなどが挙げられる。

さらに、酵素基質と酵素生成物との組合わせ、たとえば
クレアチン／ＡＤＰの組合わせまたはＡＴＰ／ホスホク
レアチンの組合わせなどを安定化試薬マトリックスに用
いることができる。酵素生成物は、クレアチンリン酸、
ＡＤＰおよびそれらの類似体から選ばれる。ＡＤＰ類似
体の例としては、アデノシンーイミドニリン酸、アデノ
シンー５゜−Ｏ（２−チオニリン酸）およびアデニリル
ー（α．β−メチレン）ニリン酸などが挙げられるが、
これらに限られるものではない。酸化型ＡＤＰ，並びに
酸化型ＡＤＰ類似体または他のＡＤＰ親和性類似体を用
いることができる。ホスホクレアチン類似体としては、
１−カルボキシメチル−２−イミノ−３−ホスホノイミ
ダゾリジンホスホクレアチン、Ｎ−メチル−３−グアニ
ジノブロピオネートリン酸、Ｎ−アミンノーＮ一エチル
グリンンリン酸、ｌ一カルポキンエチル−２−イミノ−
３ホスポノイミダゾリジンホスホクレアチン、Ｎメチル
ーＮ−（β−ヒドロキシエチル）グアニノンおよびＯ−
リン酸（クレアチノールＯ−リン酸）などが挙げられる
が、これらに限られるものではない。

試薬マトリックスにＡＴＰを加えたときに血清タンパク
質が沈澱する可能性をなくすため、ある種の液体媒体、
たとえば正常ヒト血清溶液を熱不活化するのが望ましい
。血清中にＡＴＰが含まれていると血清タンパク質のリ
ン酸化が起こり、その後それらタンパク質が溶液から沈
澱すると考えられる。ＡＤＰらまたアデニレートキナー
ゼにより酵素的にＡＴＰに変換されるので、ＡＤＰら血
清媒体中で沈澱を引き起こし得る。低レベルのＡＴＰま
たはＡＤＰでは沈澱を生成することはないかもしれない
が、安定化クレアチンキナーゼイソ酵素試薬マトリック
スの調製において液体媒体を熱不活化することは一般に
行なわれる。

加えて、血清タンパク質の経時的な非ＡＴＰ依存性の沈
澱を防ぐため、正常ヒト血清溶液などのある種の液体媒
体をアルカリ処理（ａｌｋａｌ　ｉｎｅ　−　ｓｈｏｃ
ｋ）することが望ましい。アルカリ処理することにより
リボタンパク質が脂質とタンパク質成分に加水分解され
るが、これ与は長期間の溶解性がはるかに大きい。ウシ
アルブミン溶液などの非血清ベースの肢体媒体はアルカ
リ処理を行う必要がない。

本発明により調製した肢体媒体は、適当な緩衝化剤を用
いて試薬マトリックスのｐ｝｛を約６〜約９とすること
ができる。使用可能な緩衝化剤としては、トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、およびＮ−
（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エ
タンスルホン酸）（Ｈ　Ｅ　Ｐ　ＥＳ）などが挙げられ
るが、これらに限られるものではない。

Ｃ　Ｋ　Ｍ　Ｂ酵素試薬安定化の場合は、ＡＴＰおよび
クレアチンが好ましい基質添加物である。使用するＡＴ
Ｐの量は、ＡＴＰがＣＫＭＢに飽和結合する濃度が好ま
しい。約０．１ミリモル（＠Ｍ）〜約１００ｍＭのＡＴ
Ｐ濃度を用いることができる。

約０．５ｍＭ〜約５Ｏｎ＋ＭのＡＴＰｉ１１度か好まし
く、約２．０ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度が最ら好ましい。

試薬マトリックスに使用するクレアチンの量は、約１．
ＯｎＭ〜約２００＋ｎＭの濃度範囲である。約５　．　
０　ｍＭ〜約１６０ｓＭのクレアチン濃度が好ましく、
約１５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度が最も好ましい。ＣＫＭ
Ｂ試薬マトリックスがＡＤＰなどの酵素生成物をも含む
ときは、有用なＡＤＰ濃度範囲はＡＴＰの濃度範囲に匹
敵するものであり、また有用なクレアチンリン酸の濃度
紀囲はクレアチンの濃度範囲に匹敵するものである。本
発明の試薬マトリックスの一態様を挙げると、５＋ＭＡ
ＴＰ、３０＋Ｍクレアチン、０，２％アジ化ナトリウム
および２０ｍＭＮＡＣを含有する、熱不活化（５６℃で
１時間）しアルカリ処理（ｐＨ　１　１、２〜８℃で３
日間、ついでＩ）Ｈを８．０に調節し、濾過する）した
正常ヒト血清が挙げられる。本発明に従って調製したそ
のような安定化酵素試薬は、２〜８℃で５箇月、または
室温で２７日間後ら１０％未満のＣＫＭＢ濃度の損失を
示した。

本発明の方法により安定化した試薬は、診断アッセイに
おいてカリブレークーおよびコントロール参照試薬とし
て酵素アッセイにおいて容易に用いることができ、その
結果得られる酵素試薬溶液は他の市販の酵素アッセイ参
照試薬に比べて幾つかの利点を有する。本発明の安定化
酵素組戊物は、従来の酵素試薬凋製物に比べて比較的長
い貯蔵寿命および活性の保持を有している。本発明の酵
素試薬組成物は、室温にて数週間貯蔵した場合、アッセ
イ条件に繰り返し暴露した後で実質的に一定レベルの酵
素活性を示す。本発明の試薬はまた、貯蔵能をさらに高
めるため凍結することもできる。

つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られろものではないー なお、下記実施例は、本発明の新規な酵素組成物の合成
方法、並びに該組成物の安定性を決定するために行った
試験を記載したものである。第２表は、下記実施例に特
に記載の本発明により製造した異なる酵素試薬組成物の
幾つかを示したしのである。

第２表（ｃＫ酵素試薬マトリックス） マトリックス　　ＮｌｌＳ＊　　　ＮＡＣ＊＊　　　＾
ＴＰ　　　ＡＤＰ　　　クレ７チン　　ネスネクレ７チ
ンＡ　　　　　　　＋　　　　　　　＋＋　　　　　　
　　　　　＋Ｂ　　　　　　＋　　　　　　　　　　　
　＋　　　　　　　　　　＋Ｃ　　　　　　　＋　　　
　　　　＋　　　　　　　　　　　　＋＋Ｄ　　　　　
　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　
＋Ｅ　　　　　　＋　　　　　　＋　　　　　十　　　
　　　　　　　　　　　　　　　＋Ｆ　　　　　　＋　
　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　十Ｇ　　　　　　＋＋　　　　　　　　　
　　　＋　　　　　　　　　　　　　　＋Ｈ　　　　　
　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　
　　　　　　　　　＋（注）＊：　　ＮＨＳ＝正常ヒト
血清 ＊＊：ＮＡＣ＝Ｎ−アセチルーシステイン実施例Ｉ Ｎ−アセチルーシステインを用いた正常ヒト血清媒体： 下記手順を用い、試薬マトリックスＡを調製した。正常
ヒト血清（Ｎ　Ｈ　Ｓ　Ｘギプコ：グランドアイランド
、ＮＹ）を５６℃で１時間、熱不活化した。

ついで、このＮＨＳ液体媒体を室温に冷却し、水酸化ナ
トリウムでｐＨ１１．０に凋節し、２〜８℃で５日間貯
蔵した。貯蔵後、塩酸を用いて媒体をｐ＋−ｉｓ．ｏに
調節した。下記試薬（シグマ）を加えて試薬マトリック
スを完成させた．２つのＣＫ酵素基質としてＡＴＰ（５
＋ａＭ）およびクレアチン（３０ｍＭ）；保存剤として
アジ化ナトリウム（０．２％）；およびアクチベーター
としてＮＡＣ（２０＋ａＭ）。

得られた試薬マトリックスを最終孔径０．２２μＲで滅
菌濾過し、使用するときまで凍結した。

Ｘ髪鯉ｉ Ｎ−アセチルーシステインを用いない正常ヒト血清媒体
： ＮＡＣをマトリックスから省いた他は実質的に実施例１
に記載の手順に従って試薬マトリックスＢを調製した。

Ｘ髪鯉１ ＡＤＰを用いた正常ヒト血清媒体： ＡＴＰの代わりにＡＤＰ（５ｍＭ，シグマ）を用いた他
は実質的に実施例１および２Ｉこ記載の手順に従って酔
素基質および酵素生成物の両方を含有するマトリックス
を製造し、試薬マトリックスＣおよびＤとした。

実施例４ ホスホクレアチンを用いん正常ヒト血清媒体；クレアチ
ンの代わりにホスホクレアチン（３０＋ｎＭ、シグマ）
を用いた他は実質的に実施例！、２および３に記載の手
順に従い、試薬マトリックスＥ−Ｈを調製した。

実施例５ 非ＮＨＳ液体媒体を用いた試薬マトリックス：正常ヒト
血清の代わりに動物血清、人工血清または人工タンパク
質溶液を用いた他は実質的に実施例１，２、３および４
に記載の手順に従って試薬マトリックスを調製した。使
用した動物血清には、正常ウマ血清および正常ヤギ血清
が含まれていた。人工血清には、生理学的診断ベース（
アー？　−　（Ａ　ｒ崗ｏｕｒ）　；タリータウン、Ｎ
Ｙ）、ＢＳＡおよびＢＧＧが含まれていた。

実施例６ ＣＫＭＢ試薬溶液のクレアチン安定化：ＮＡＣをマトリ
ックスから省きＡＤＰかＡＴＰのいずれかがマトリック
ス中に存在するようにして、実質的に実施例２および３
に記載の手順に従って試薬マトリックスを調製した（第
２表に示すように、試薬マトリックスＢおよびＤ）。つ
いで、クレアチンをマトリックスから省いた他は同様の
２つの試薬マトリックスを調製した。第五の試薬マトリ
ックスは、クレアチン、ＡＴＰおよびＡＤＰを省いて調
製した（すなわち、該マトリックスはＮＨＳ，ＮＡＣお
よびアジ化ナトリウムのみを含有する）。０日目に既知
量の精製ＣＫＭＢイソ酵素（アールト（Ａａｌｔｏ）：
エスコンディド、ＣＡ）を上記５つの異なる試薬マトリ
ックスに加えた。

′室温で貯蔵した後、各マトリックスのＣＫＭＢ濃度を
定期的に定量した。ＣＫＭＢの濃度は、ＩＭＫ自動免疫
診断アナライザー（アボット・ラボラトリーズ、アボッ
トバーク、！Ｌ）を用いて測定した。使用したアッセイ
は、ＩＭＸ−ＣＫＭＢアッセイ（アボット・ラボラトリ
ーズからアブセイキットとして人手可能）、すなわち固
相抗ＣＫＭＢ抗体および抗Ｃ　Ｋ　Ｍ　Ｍアルカリ性ホ
スファターゼ結合体を用いた′２工程サンドイツチアッ
セイであった。第３表は、経時的にマトリックス中Ｉこ
残存した「第０日目のＪＣＫＭＢ濃度の％としてアッセ
イ結果を表す。このアッセイ結果は、本発明に従って調
製したＡＴＰかＡＤＰのいずれかを含有する試薬マトリ
ックスが優れたＣＫＭＢ安定性を示すこと、およびクレ
アチンをも含有するマトリックスにおいて安定性はさら
に大きくなることを示していた。

１３８（試薬マトリックス中のクレアチンとＣＫＭＢ安
定性） 十 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ６　　　　０　　　　　０　　　　　０７９　　　　５
１　　　　　３３　　　　　２０７６　　　　２７　　
　　　１７　　　　　１０９２　　　　Ｂ２　　　　　
８０　　　　　７０９２　　　　８２　　　　　７３　
　　　　５７Ｘ皇鮫Ｌ 酵素アクチベーターを用いたＣＫＭＨの安定性：実施例
ｌおよび２に記載の手順に実質的に従い、複数の試薬マ
トリックス調製物を調製した。すなわち該試薬ロットは
正常ヒト血清、ＡＴＰおよびクレアチンを含有しており
、またＮ　Ａ　Ｃを含有するか省いたかのみが異ってい
た。種々の濃度のＣＫＭＢイソ酵累を各試薬マトリック
ス調製物に加え、ついで、これら調製物に８日間にわた
って３７℃で熱を加えｆこ。経時的に残存したＣＫＭＢ
％濃度を実施例６に記載のようにして測定した。第４表
の結果は、試薬マトリックスの短期高温安定性が、マト
リックスにＮＡＣを添加することにより増大することを
示していた。

第４表（試薬マトリックス中のＮＡＣと３７℃で！−３ ２＋９ ３＋９ ４＋９ ５＋７ ６＋８ ４　　　　２１　　　　１３　　　　　０３　　　９５
　　　８８　　　８４　　　６６　　　９１　　　　９
１　　　　８６　　　７８　　　　９８　　　９６　　
　８８　　　５９　　　　６８　　　　６２　　　　４
７　　　　２９　　　８３　　　　７４　　　　６８　
　　３実施例８ アッセイカリブレーターおよびコントロール：実施例１
〜５に記載の手順に実質的に従って試薬マトリックスを
調製した。ついで、精製ＣＫＭＢイソ酵素を種々の量で
加えて、最終ＣＫＭＢａ度が０．０、３．０，３０．０
、１００．０および３０　０　．　Ｏ　ｎ９／ｚＱのＣ
ＫＭＢアッセイカリプレーターを調製した。精製ＣＫＭ
Ｂイソ酵素を種々の量で加えて、最終ＣＫＭＢ濃度が５
．０，２０．０およびＩ　２　０　．　Ｏ　ｎ９／ｚＱ
のＣＫＭＢアッセイコントロールを調製した。

実施例９ ヒト血清媒体、動物血清媒体および人工血清媒体中での
ＣＫＭＢ安定性の比較： ＮＡＣを省き、所定のマトリックスに対して使用する液
体媒体をＮＨＳ、ウマ血清、ヤギ血清または生理学的診
断ベースから選択した他は実施例２に記載の手順に実質
的に従って試薬マトリックスを調製した。ついで、０日
目に所定量のＣＫＭＢイソ酵素を各試薬マトリックスに
加えた。室温にて貯蔵した後、マトリックスのＣＫＭＢ
濃度を定期的に定量した。ＣＫＭＢ濃度の測定は実施例
６に記載のようにして行った。第５表は、経時的に残存
した「００目のＪＣＫＭＢ濃度の％として測定結果を示
す。このアッセイ結果は、ヒト、動物または人工タンパ
ク質媒体を用いて調製した試薬マトリックスでは、室温
で６０日間貯蔵した場合でもＣＫＭＢ濃度の８２〜ｌＯ
ｏ％が保持されることを示していた。

築ｊレ１（ヒト、 ＫＭＢ安定性） 動物および合成液体媒体中でのＣ ３　　　１　００ ｌ　２　　　　８９ １　８　　　　９２ ３２　　　　８６ ３８　　　　８３ ４６　　　　８６ ６０　　　　８３ ８６　　　　　１００ ９４　　　　　１００ １００　　　　　　９２ １Ｉ１　　　　　１１６ ＋００　　　　　１１６ ８９　　　　　ｚｓ ８３　　　　　１１６ 実施例１０ ＣＫＭＢのホスホクレアチン安定化： 実施例２、３および４に記載の手順に実質的に従って、
それぞれ試薬マトリックスＢ％ＤおよびＨを調製した。

ついで、基質／基質マトリックス（ＡＴＰ＋クレアチン
、マトリックスＢ）、生成物／基質マトリックス（ＡＤ
Ｐ＋クレアチン、マトリックスＣ）および生成物／生成
物マトリックス（ＡＤＰ＋ホスホクレアチン、マトリッ
クスＨ）の安定化効果を比較するため、室温にて安定化
研究を行った。加えて、正常ヒト血清媒体中にＡＤＰも
しくはＡＴＰのいずれかのみ（５ｍＭ）を含有する比較
マトリックスら調製した。

上記実施例６に記載のようにしてＣＫＭＢＡ度を測定し
た。第６表は、経時的にマトリックス中に残存した「０
８目のＪＣＫＭＢ濃度の％として測定結果を示す。第６
表の結果は、ＡＴＰ単独の方がＡＤＰ単独よりも安定性
が大きいこと、およびＡＴＰもしくはＡＤＰのいずれか
にクレアチンを添加すると安定性が増大することを示し
ていた。

ＡＤＰおよびクレアチンリン酸を含有する試薬マトリッ
クスの安定性は最も低かったが、それでも生成物／生成
物マトリックスを用いて得られる酵素安定性は酵素単独
の場合に比べると実質的に大きかった。

艷ｉ表（ｃＫＭＢ安定化研究） ０　　　　　１００　　　　　１００　　　　　　　１
００　　　　　ｔｏｏ１　　　　　　９６　　　　　　
９８　　　　　　　１０４　　　　　　９８４　　　　
　９３　　　　　　９５　　　　　　　　８８　　　　
　８９７　　　　　９４　　　　　９１　　　　　　　
８２　　　　　９１ＩＩ　　　　　Ｉｆ）１　　　　　
９３　　　　　　　７７　　　　　９０１８　　　　　
９１　　　　　８５　　　　　　　５３　　　　　７４
２７　　　　　９１　　　　　８１　　　　　　　３８
　　　　　６５３５　　　　　８９　　　　　７６　　
　　　　　２９　　　　　６０４９　　　　８７　　　
　７５　　　　測定せず　　５２他の研究では、実施例
２、３および４に記載の手順に実質的に従ってそれぞれ
調製したＡＴＰ／クレアチン試薬マトリックス、ＡＴＰ
／ホスホクレアチン試薬マトリックスおよびＡＤＰ／ホ
スホクレアチン試薬マトリックスの安定化効果を比較し
た。Ｃ　Ｋ　Ｍ　Ｂ　ｓ度の測定は実施例６に記載のよ
うにして行った。第７表は、経時的にマトリックス中に
残存した「Ｏ日目のＪＣＫＭＢ濃度の％として測定結果
を示す。これらのアッセイ結果は、ＡＴＰ／ホスホクレ
アチン試薬マトリックスおよびＡＤＰ／ホスホクレアチ
ン試薬マトリックスがほぼ同じ安定化効果を有すること
を示していた。

！Ｌ斐（ｃＫＭＢ安定化研究） ＣＫＭＢｉｌ度 ＋　　　−　　　＋　　　　　　−　　　　　９８　　
　９１　　　９１＋　　　−　　　−　　　　　　＋　
　　　　９９　　　８３　　　７０＋　　　−　　　　
　　＋　　　　１０７　　　８７　　　６７本明細書の
開示に従い、酵素生成物、酵素基質およびそれらの組合
わせを他の酵素またはイソ酵素の安定化のために適用し
得ることは当業者には評価されるであろう。従って、記
載した態様および好ましい態様は例示としてのみ示すも
のであって、本発明を限定するものではない。それゆえ
、本発明の記載は、開示した特定の態様に本発明を限定
することを意図するものではなく、本発明の範囲内です
べての等価物を包含することを意図するものである。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）所定量の酵素、 （ｂ）少なくとも１種の酵素基質、および （ｃ）液体媒体 からなることを特徴とする、安定化した非凍結乾燥酵素
   組成物。
2. （２）酵素がクレアチンキナーゼであり、酵素基質がア
   デノシン三リン酸、酸化型アデノシン三リン酸およびア
   デノシン三リン酸類似体よりなる群から選ばれたもので
   ある、請求項（１）に記載の組成物。
3. （３）クレアチンおよびクレアチン類似体よりなる群か
   ら選ばれた第二の酵素基質をさらに含み、該クレアチン
   類似体がβ−グアニジノプロピオン酸、１−カルボキシ
   メチル−２−イミノイミダゾリジンクレアチン、Ｎ−メ
   チル−３−グアニジノプロピオネート、Ｎ−アミジノ−
   Ｎ−エチルグリシン、１−カルボキシエチル−２−イミ
   ノイミダゾリジンおよびＮ−（２，３−エポキシプロピ
   ル）−Ｎ−アミジノグリシンよりなる群から選ばれたも
   のである、請求項（２）に記載の組成物。
4. （４）酵素基質がアデノシン三リン酸およびクレアチン
   であり、液体媒体が熱不活化しアルカリ処理した正常ヒ
   ト血清である、請求項（３）に記載の組成物。
5. （５）クレアチンリン酸およびクレアチンリン酸類似体
   よりなる群から選ばれた酵素生成物をさらに含み、該ク
   レアチンリン酸類似体が１−カルボキシメチル−２−イ
   ミノ−３−ホスホノイミダゾリジンホスホクレアチン、
   Ｎ−メチル−３−グアニジノプロピオネートリン酸、Ｎ
   −アミジノ−Ｎ−エチルグリシンリン酸、１−カルボキ
   シエチル−２−イミノ−３−ホスホノイミダゾリジンホ
   スホクレアチン、Ｎ−メチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエ
   チル）グアニジンおよびＯ−リン酸（クレアチノールＯ
   −リン酸）よりなる群から選ばれたものである、請求項
   （２）に記載の組成物。
6. （６）（ａ）所定量の酵素、 （ｂ）少なくとも２種の酵素生成物、および（ｃ）液体
   媒体 からなることを特徴とする、安定化した非凍結乾燥酵素
   組成物。
7. （７）酵素がクレアチンキナーゼであり、第一の酵素生
   成物がアデノシン二リン酸、酸化型アデノシン二リン酸
   およびアデノシン二リン酸類似体よりなる群から選ばれ
   たものであり、第二の酵素生成物がクレアチンリン酸お
   よびクレアチンリン酸類似体よりなる群から選ばれたも
   のである、請求項（６）に記載の組成物。
8. （８）（ａ）所定量の酵素、 （ｂ）酵素生成物、 （ｃ）酵素基質、および （ｄ）液体媒体 からなることを特徴とする、安定化した非凍結乾燥酵素
   組成物。
9. （９）酵素がクレアチンキナーゼであり、酵素生成物が
   アデノシン二リン酸、酸化型アデノシン二リン酸および
   アデノシン二リン酸類似体よりなる群から選ばれたもの
   であり、酵素基質がクレアチンおよびクレアチン類似体
   よりなる群から選ばれたものである、請求項（８）に記
   載の組成物。
10. （１０）液体媒体がヒト血清、動物血清、人工血清およ
    びタンパク質溶液よりなる群から選ばれたものである、
    請求項（１）〜（９）のいずれか一つに記載の組成物。
11. （１１）スルフヒドリル化合物、二価金属イオンおよび
    それらの組合わせよりなる群から選ばれた酵素アクチベ
    ーターをさらに含み、該スルフヒドリル化合物がメルカ
    プトエタノール、システイン、Ｎ−アセチルシステイン
    、ジチオエリスリトール、Ｓ−（２−アミノエチル）イ
    ソチオウロニウムブロマイド臭化水素酸塩、グルタチオ
    ン、チオグリコール酸、ジチオスレイトールおよびそれ
    らの類似体よりなる群から選ばれたものであり、該二価
    金属イオンがマグネシウム、マンガン、カルシウムおよ
    びコバルトイオンよりなる群から選ばれたものである、
    請求項（１）〜（１０）のいずれか一つに記載の組成物
    。
12. （１２）酵素がリパーゼ、ペルオキシダーゼ、トランス
    アミナーゼ、ホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、グリ
    コシダーゼおよびラクタマーゼよりなる群から選ばれた
    ものである、請求項（１）〜（１１）のいずれか一つに
    記載の組成物。
13. （１３）請求項（１）〜（１２）のいずれか一つに記載
    の安定化した酵素組成物からなることを特徴とする、酵
    素アッセイ用カリブレーターまたはコントロール試薬。
14. （１４）請求項（１）〜（１３）のいずれか一つに記載
    の安定化した酵素組成物からなることを特徴とする、酵
    素アッセイ用キット。
15. （１５）被験試料中の酵素の存在または量を検出するア
    ッセイ法であって、被験試料中の酵素を検出し、ついで
    請求項（１）〜（１４）のいずれか一つに記載の安定化
    酵素組成物中の酵素の存在または量を検出する、ことを
    特徴とする方法。