JP2999239B2 - 安定化酵素組成物およびそれを用いた酵素アッセイ用キット - Google Patents
安定化酵素組成物およびそれを用いた酵素アッセイ用キットInfo
- Publication number
- JP2999239B2 JP2999239B2 JP2295150A JP29515090A JP2999239B2 JP 2999239 B2 JP2999239 B2 JP 2999239B2 JP 2295150 A JP2295150 A JP 2295150A JP 29515090 A JP29515090 A JP 29515090A JP 2999239 B2 JP2999239 B2 JP 2999239B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- creatine
- group
- phosphate
- composition according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
クレアチンキナーゼイソ酵素を含有する診断アッセイ用
安定化酵素組成物に関する。
に放出される。これらの酵素の1種または2種以上の存
在または量の増大の検出は、一般に急性心筋梗塞が起こ
ったことの確認に用いられている。この目的のため3種
の主要な酵素、すなわちクレアチンキナーゼ(CK)(ク
レアチンホスホキナーゼとも呼ばれる)、血清グルタミ
ン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(SGOT)および乳
酸脱水素酵素(LDH)が用いられる。これらの酵素の放
出速度は異なるので、放出の経時パターンが診断に重要
である。血清中のCKレベルは、胸の痛みが始まってから
4〜6時間以内に上昇し始める。CKレベルのピークは12
〜24時間以内にみられ、ついで72〜96時間以内に急速に
正常範囲に戻っていく。これに対して、血清SGOTレベル
のピークは24〜48時間で起こり、LDHレベルのピークは
2〜4日で起こる。従って、血液中のCK酵素の量の増大
を検出することにより、心筋梗塞の早期指摘が可能とな
る。
ニットからなるダイマーであり、このためヒト組織では
3種の主要なクレアチンキナーゼイソ酵素が存在する。
CKBBイソ酵素(またはCK1)は、主として脳および消化
管組織中に存在する。CKMBイソ酵素(またはCK2)は、
主として心筋中、および横隔膜および食道(平滑筋)中
に存在する。CKMMイソ酵素(またはCK3)は、すべての
組織、とりわけ骨格筋中に存在する。CKMBイソ酵素は心
臓組織にのみ認められるものでもないし、心臓組織中に
存在する主要なCKイソ酵素でもない。しかしながら、全
体のCKパーセントからみた場合、心臓は他の組織に比べ
ると多くのCKMBを含んでいるといえる。それゆえ、筋肉
に主立った外傷がない場合、血清中にCKMBが現れること
は心臓障害の臨床的兆候として用いられる。
することは、治療および経済の上から重要な意味合いを
有する。胸の痛みを有する患者の多くは、冠状疾患集中
治療病棟に入れられ、広範かつ費用のかさむ評価を受け
ることになる。血清または血漿のCKMB分析において胸の
痛みから12〜24時間後にCKMBレベルの上昇が認められな
い場合には、患者を集中治療病棟から移動させることが
できる。
これらイソ酵素の有効かつ識別可能なアッセイが望まし
い。CKイソ酵素を分離および測定するために、幾つかの
異なる方法が従来より用いられてきた。電気泳動法およ
びカラムクロマトグラフィー法は、一般にイソ酵素を物
理的に分離するのに用いられ、ついで分離したものを測
定することができる。しかしながら、電気泳動法および
カラムクロマトグラフィー法のいずれも時間がかかり、
しかもかなりの熟練を要する。
制法およびイムノアッセイ法である。これらの方法は、
CKイソ酵素とCKイソ酵素特異的抗体との相互反応に依存
している。そのような方法は、自動化するかまたは使捨
て装置を含むように設計することができ、そうすること
により使用者に必要とされる時間および使用者の熟練の
必要性を減少させ、アッセイを行うスピードおよび容易
さを増大させることができる。
一貫性を確実にするため、既知量の酵素を含有する酵素
調製物が参照試料として用いられる。たとえば、自動化
CKMBイムノアッセイでは、装置カリブレーターおよび/
またはコントロールとして種々の濃度のCKMBイソ酵素調
製物を用いることができる。長期にわたって行う別々の
アッセイ間で正確さおよび均一性を得るには、酵素調製
物は安定でなければならない。しかしながら、CKイソ酵
素のような酵素は熱に弱いため、安定化しなければなら
ない。
乾燥して再構成可能な粉末または錠剤に形成することに
より、酵素を固体マトリックス中に封じ込めることであ
った。しかしながら、これらの方法は欠点を有する。凍
結乾燥では水が除かれるため、質コントロールサイクル
の部分が使用者による試薬の希釈および再構成にゆだね
られることとなる。凍結乾燥した酵素試薬の他の欠点と
しては、凍結乾燥する間の可変性で不可逆的な不活性、
および時間および/または温度依存性回復相が挙げられ
る。加えて、凍結乾燥した酵素調製物は、一担再構成し
たら安定性は比較的短い。現在利用することのできる市
販のCKMBイソ酵素含有酵素イムノアッセイキットでは、
一般に凍結乾燥したカリブレーターおよびコントロール
参照試薬が用いられており、これらは再構成後、2〜8
℃で7〜14日間安定である。
などの有機担体物質に酵素を結合させること、およびメ
ッシング(Messing)の米国特許第3.556,945号明細書に
記載されているように、反応性のシラノール基を有する
無機担体物質に酵素を結合させることが挙げられる。別
法としてモドロビッチ(Modrovich)らは、米国特許第
4,652,524号明細書において、ポリアクリル酸のポリメ
タクリル酸などの担体ポリマー上のペンダント(pendan
t)基に酵素(たとえばクレアチンキナーゼ)を共有結
合させて酵素を安定化させることを記載している。これ
らの方法では複雑な製造工程が必要であり、また酵素を
担体に結合させることにより酵素の活性が抑制されるこ
とがある。CKMMイソ酵素を安定化させるためにアデノシ
ン二リン酸を添加することは、ホワイトナー(Whitne
r)らのClinical Chemistry、28[1]、41〜44(198
2)に記載されている。
の組成物は、液体媒体中に混合した、安定化しようとす
る所定量の酵素および酵素基質を含む。上記酵素は非修
飾形である、すなわち、担体物質やポリマー粒子に結合
したり複合体を形成したりしていない。液体媒体は、ヒ
ト血清、動物血清または人工血清から選ばれ、バッファ
ーを含有していてもよい。本発明の安定化した酵素組成
物はまた、1種または2種以上の他の酵素基質、酵素生
成物またはそれらの類似体を任意に含んでいてよい。さ
らに、本発明の安定化した酵素組成物は、酵素アクチベ
ーターを任意に含んでいてよい。
試薬の調製法をも提供する。本発明はさらに、CKMBアッ
セイにおいてカリブレーターおよび/またはコントロー
ルとして用いるための試薬溶液のキットをも包含する。
基質および酵素生成物と、または一対の酵素生成物と混
合して酵素組成物とすることにより酵素を有効に安定化
することができることがわかった。本発明の安定化酵素
組成物はまた、1種または2種以上の他の酵素基質、お
よび酵素アクチベーターを任意に含んでいてよい。加え
て、酵素基質類似体および酵素生成物類似体を用いるこ
ともできる。
蔵および使用に充分な期間、酵素の不活化を防止または
減少させることにより酵素の触媒能または反応能を保護
することをいう。
り永久的な変化を蒙ったりすることなく、また化学反応
の平衡定数を変えることなく、特定の化学反応の速度を
増加させる物質をいう。触媒反応が終わった時点では触
媒は実質的に変わっていないが、反応物質は新しい生成
物に変換されている。
をいう。
応により生成した物質をいう。
二価金属イオンおよびそれらの混合物をいう。適当な金
属イオンとしては、マグネシウム、マンガン、カルシウ
ムおよびコバルトイオンなどが挙げられるが、これらに
限られるものではない。適当な還元剤としては、メルカ
プトエタノール、システイン、N−アセチルシステイン
(NAC)、ジチオエリスリトール、S−(2−アミノエ
チル)イソチオウロニウムブロマイド臭化水素酸塩、グ
ルタチオン、チオグリコール酸、ジチオスレイトールお
よびそれらの類似体または等価物などのスルフヒドリル
化合物が挙げられるが、これらに限られるものではな
い。スルフヒドリル結合試薬は、スルフヒドリル酸化ま
たは分子内ジスルフィド結合の生成により酵素活性を抑
制する。スルフヒドリル化合物などのアクチベーターと
ともに酵素をインキュベートすることにより、酵素の反
応性を実質的に完全に保存することができる。特に好ま
しいアクチベーターとしては、β−メルカプトエタノー
ルおよびNACが挙げられる。
が可能となる。そのような試薬溶液は既知量の酵素を含
有しており、酵素の反応性は長期間にわたって安定であ
ることがわかった。本発明は、1種または2種以上の酵
素基質および/または酵素生成物からなる試薬マトリッ
クス中に目的の酵素を封じ込めることにより、そのよう
な酵素試薬溶液の安定化を供するものである。加えて、
本発明の試薬マトリックスは1種または2種以上の酵素
アクチベーターを含んでいてよい。従って、本発明は、
非修飾酵素、すなわち有機もしくは無機担体に固定化さ
れていないかまたはポリマーに共有結合されていない酵
素の安定化を達成するものである。
るが、本明細書に開示の教示に従い、基質および/また
は生成物に関して必要な通常の変更を加え、さらに試験
を行うことにより、当業者により実質的にあらゆる酵素
の安定化を行うことができるであろう。従って、本明細
書に記載の概念および技術は、所定の酵素に対して適当
な基質および/または生成物の選択および添加を行え
ば、たとえばリパーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスア
ミナーゼ、ホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、グルコ
シダーゼ、ラクタマーゼなどを安定化するのに用いるこ
とができる。
は、3つの一般的な標題(加水分解酵素、酸化還元酵素
および転移酵素)のもとにまとめることができる。加水
分解酵素にはタンパク質分解酵素が含まれ、該酵素はタ
ンパク質、炭水化物、エステル、ヌクレアーゼおよびア
ミンを加水分解する。酸化還元酵素は、酸化反応および
還元反応を触媒する。転移酵素は、1つの分子から他の
分子へ基を転移させる。特に、本発明の試薬マトリック
スにより安定化することのできる特別の酵素を第1表に
示した。安定化酵素組成物を調製するための適当な酵素
基質および酵素生成物も示してある。
当な液体媒体としては、正常ヒト血清(NHS)、正常ウ
マ血清および正常ヤギ血清が挙げられる。酵素および組
成物の他の成分が可溶であるかまたは可溶化することの
できる通常のあらゆる液体媒体を用いることができ、そ
の例としては、たとえば生理学的診断ベース(physiolo
gical diagnostic base)、ウシ血清アルブミン(BS
A)、ウシガンマグロブリン(BGG)、人工血清およびタ
ンパク質溶液(すなわち、疑似血清溶液)を挙げること
ができる。作業当事者による特定の液体媒体の選択は、
その特定の媒体が診断アッセイにおいて許容し得る性能
を有するかどうかに依存するであろう。たとえば、液体
媒体の許容し得る性能特性としては、該媒体に添加した
酵素を適切に回収し得ること、長期間の貯蔵後に沈澱が
生じないこと、およびアッセイを妨害する物質が存在し
ないことなどが挙げられるが、これらに限られるもので
はない。
ば用いられるのでモデル酵素として選んだ。たとえば、
CKMBアッセイにおいてCKMBイソ酵素の溶液が参照試薬
(すなわち、アッセイカリブレーターおよびコントロー
ル)としてしばしば用いられる。そのような酵素試薬
は、出荷、貯蔵または通常の使用の間に熱不活化されな
いのが望ましい。
蔵形の前駆体として体内で合成される化合物である。ク
レアチンキナーゼは、クレアチンとアデノシン三リン酸
との間の反応を触媒することにより高エネルギークレア
チンリン酸を生成する反応のための酵素触媒である。下
記反応式に示すように、生成物であるアデノシン二リン
酸(ADP)およびクレアチンリン酸(ホスホクレアチン
とも呼ばれる)の生成において、クレアチンおよびアデ
ノシン三リン酸(ATP)の両方ともが基質である。アデ
ノシン一リン酸は、AMPとして示す。
たって、酵素基質添加物はATPまたはATP類似体から選ば
れ、該ATP類似体としては、アデノシン−5′−O(3
−チオ三リン酸)、アデニリル−イミド二リン酸およに
アデニリル−(β,γ−メチレン)二リン酸などが挙げ
られる。酸化型ATP、並びに酸化型ATP類似体、およびCK
イソ酵素の活性部位に不可逆的に結合して酵素分子を安
定させる他のATP親和性類自体を用いることもできる。
安定化クレアチンキナーゼ組成物は、クレアチンまたは
クレアチン類似体の形態の第二の酵素基質を任意に含ん
でいてよい。クレアチン類似体の例としては、β−グア
ニジノプロピオン酸、1−カルボキシメチル−2−イミ
ノイミダゾリジンクレアチン、N−メチル−3−グアニ
ジノプピオネート、N−アミジノ−N−エチルグリシ
ン、1−カルボキシエチル−2−イミノイミダゾリジン
およびN−(2,3−エポキシプロピル)−N−アミジノ
グリシンなどが挙げられる。
ばクレアチン/ADPの組合わせまたはATP/ホスホクレアチ
ンの組合わせなどを安定化試薬マトリックスに用いるこ
とができる。酵素生成物は、クレアチンリン酸、ADPお
よびそれらの類似体から選ばれる。ADP類似体の例とし
ては、アデノシン−イミド二リン酸、アデノシン−5′
−O(2−チオ二リン酸)およびアデニリル−(α,β
−メチレン)二リン酸などが挙げられるが、これらに限
られるものではない。酸化型ADP、並びに酸化型ADP類似
体または他のADP親和性類似体を用いることができる。
ホスホクレアチン類似体としては、1−カルボキシメチ
ル−2−イミノ−3−ホスホノイミダゾリジンホスホク
レアチン、N−メチル−3−グアニジノプロピオネート
リン酸、N−アミジノ−N−エチルグリシンリン酸、1
−カルボキシエチル−2−イミノ−3−ホスホノイミダ
ゾリジンホスホクレアチン、N−メチル−N−(β−ヒ
ドロキシエチル)グアニジンおよびO−リン酸(クレア
チノールO−リン酸)などが挙げられるが、これらに限
られるものではない。
質が沈澱する可能性をなくすため、ある種の液体媒体、
たとえば正常ヒト血清溶液を熱不活化するのが望まし
い。血清中にATPが含まれていると血清タンパク質のリ
ン酸化が起こり、その後それらタンパク質が溶液から沈
澱すると考えられる。ADPもまたアデニレートキナーゼ
により酵素的にATPに変換されるので、ADPも血清媒体中
で沈澱を引き起こし得る。低レベルのATPまたはADPでは
沈澱を生成することはないかもしれないが、安定化クレ
アチンキナーゼイソ酵素試薬マトリックスの調製におい
て液体媒体を熱不活化することは一般に行なわれる。
澱を防ぐため、正常ヒト血清溶液などのある種の液体媒
体をアルカリ処理(alkaline−shock)することが望ま
しい。アルカリ処理することによりリポタンパク質が脂
質とタンパク質成分に加水分解されるが、これらは長期
間の溶解性がはるかに大きい。ウシアルブミン溶液など
の非血清ベースの液体媒体はアルカリ処理を行う必要が
ない。
用いて試薬マトリックスのpHを約6〜約9とすることが
できる。使用可能な緩衝化剤としては、トリス(ヒドロ
キシメチル)アミノメタン(Tris)、2−(N−モルホ
リノ)エタンスルホン酸(MES)、およびN−(2−ヒ
ドロキシエチル)ピペラジン−N′−(2−エタンスル
ホン酸(HEPES)などが挙げられるが、これらに限られ
るものではない。
が好ましい基質添加物である。使用するATPの量は、ATP
がCKMBに飽和結合する濃度が好ましい。約0.1ミリモル
(mM)〜約100mMのATP濃度を用いることができる。約0.
5mM〜約50mMのATP濃度が好ましく、約2.0mM〜約10mMの
濃度が最も好ましい。試薬マトリックスに使用するクレ
アチンの量は、約1.0mM〜約200mMの濃度範囲である。約
5.0mM〜約160mMのクレアチン濃度が好ましく、約15mM〜
約50mMの濃度が最も好ましい。CKMB試薬マトリックスが
ADPなどの酵素生成物をも含むときは、有用なADP濃度範
囲はATPの濃度範囲に匹敵するものであり、また有用な
クレアチンリン酸の濃度範囲はクレアチンの濃度範囲に
匹敵するものである。本発明の試薬マトリックスの一態
様を挙げると、5mM ATP、30mMクレアチン、0.2%アジ化
ナトリウムおよび20mM NACを含有する、熱不活化(56℃
で1時間)しアルカリ処理(pH11、2〜8℃で3日間、
ついでpHを8.0に調節し、濾過する)した正常ヒト血清
が挙げられる。本発明に従って調製したそのような安定
化酵素試薬は、2〜8℃で5箇月、または室温で27日間
後も10%未満のCKMB濃度の損失を示した。
においてカリブレーターおよびコントロール参照試薬と
して酵素アッセイにおいて容易に用いることができ、そ
の結果得られる酵素試薬溶液は他の市販の酵素アッセイ
参照試薬に比べて幾つかの利点を有する。本発明の安定
化酵素組成物は、従来の酵素試薬調製物に比べて比較的
長い貯蔵寿命および活性の保持を有している。本発明の
酵素試薬組成物は、室温にて数週間貯蔵した場合、アッ
セイ条件により繰り返し暴露した後で実質的に一定レベ
ルの酵素活性を示す。本発明の試薬はまた、貯蔵能をさ
らに高めるため凍結することができる。
するが、本発明はこれらに限られるものではない。
成方法、並びに該組成物の安定性を決定するために行っ
た試験を記載したものである。第2表は、下記実施例に
特に記載の本発明により製造した異なる酵素試薬組成物
の幾つかを示したものである。
常ヒト血清(NHS)(ギブコ:グランドアイランド、N
Y)を56℃で1時間、熱不活化した。ついで、このNHS液
体媒体を室温に冷却し、水酸化ナトリウムでpH11.0に調
節し、2〜8℃で5日間貯蔵した。貯蔵後、塩酸を用い
て媒体をpH8.0に調節した。下記試薬(シグマ)を加え
て試薬マトリックスを完成させた:2つのCK酵素基質とし
てATP(5mM)およびクレアチン(30mM);保存剤として
アジ化ナトリウム(0.2%);およびアクチベーターと
してNAC(20mM)。得られた試薬マトリックスを最終孔
径0.22μmで滅菌濾過し、使用するときまで凍結した。
体: NACをマトリックスから省いた他は実質的に実施例1
に記載の手順に従って試薬マトリックスBを調製した。
的に実施例1および2に記載の手順に従って酵素基質お
よび酵素生成物の両方を含有するマトリックスを製造
し、試薬マトリックスCおよびDとした。
マ)を用いた他は実質的に実施例1、2および3に記載
の手順に従い、試薬マトリックスE〜Hを調製した。
工タンパク質溶液を用いた他は実質的に実施例1、2、
3および4に記載の手順に従って試薬マトリックスを調
製した。使用した動物血清には、正常ウマ血清および正
常ヤギ血清が含まれていた。人工血清には、生理学的診
断ベース(アーマー(Armour);タリータウン、NY)、
BSAおよびBGGが含まれていた。
トリックス中に存在するようにして、実質的に実施例2
および3に記載の手順に従って試薬マトリックスを調製
した(第2表に示すように、試薬マトリックスBおよび
D)。ついで、クレアチンをマトリックスから省いた他
は同様の2つの試薬マトリックスを調製した。第五の試
薬マトリックスは、クレアチン、ATPおよびADPを省いて
調製した(すなわち、該マトリックスはNHS、NACおよび
アジ化ナトリウムのみを含有する)。0日目に既知量の
精製CKMBイソ酵素(アールト(Aalto);エスコンディ
ド、CA)を上記5つの異なる試薬マトリックスに加え
た。室温で貯蔵した後、各マトリックスのCKMB濃度を定
期的に定量した。CKMBの濃度は、IMx自動免疫診断アナ
ライザー(アボット・ラボラトリーズ、アボットパー
ク、IL)を用いて測定した。使用したアッセイは、IMx
−CKMBアッセイ(アボット・ラボラトリーズからアッセ
イキットとして入手可能)、すなわち固相抗CKMB抗体お
よび抗CKMMアルカリ性ホスファターゼ結合体を用いた2
工程サンドイッチアッセイであった。第3表は、経時的
にマトリックス中に残存した「第0日目の」CKMB濃度の
%としてアッセイ結果を表す。このアッセイ結果は、本
発明に従って調製したATPかADPのいずれかを含有する試
薬マトリックスが優れたCKMB安定性を示すこと、および
クレアチンをも含有するマトリックスにおいて安定性は
さらに大きくなることを示していた。
の試薬マトリックス調製物を調製した。すなわち該試薬
ロットは定常ヒト血清、ATPおよびクレアチンを含有し
ており、またNACを含有するか省いたかのみが異ってい
た。種々の濃度のCKMBイソ酵素を各試薬マトリックス調
製物に加え、ついで、これら調製物に8日間にわたって
37℃で熱を加えた。経時的に残存したCKMB%濃度を実施
例6に記載のようにして測定した。第4表の結果は、試
薬マトリックスの短期高温安定性が、マトリックスにNA
Cを添加することにより増大することを示していた。
リックスを調製した。ついで、精製CKMBイソ酵素を種々
の量で加えて、最終CKMB濃度が0.0、3.0、30.0、100.0
および300.0ng/mlのCKMBアッセイカリブレーターを調製
した。精製CKMBイソ酵素を種々の量で加えて、最終CKMB
濃度が5.0、20.0および120.0ng/mlのCKMBアッセイコン
トロールを調製した。
CKMB安定性の比較: NACを省き、所定のマトリックスに対して使用する液
体媒体をNHS、ウマ血清、ヤギ血清または生理学的診断
ベースから選択した他は実施例2に記載の手順に実質的
に従って試薬マトリックスを調製した。ついで、0日目
に所定量のCKMBイソ酵素を各試薬マトリックスに加え
た。室温にて貯蔵した後、マトリックスのCKMB濃度を定
期的に定量した。CKMB濃度の測定は実施例6に記載のよ
うにして行った。第5表は、経時的に残存した[0日目
の」CKMB濃度の%として測定結果を示す。このアッセイ
結果は、ヒト、動物または人工タンパク質媒体を用いて
調製した試薬マトリックスでは、室温で60日間貯蔵した
場合でもCKMB濃度の82〜100%が保持されることを示し
ていた。
て、それぞれ試薬マトリックスB、DおよびHを調製し
た。ついで、基質/基質マトリックス(ATP+クレアチ
ン、マトリックスB)、生成物/基質マトリックス(AD
P+クレアチン、マトリックスC)および生成物/生成
物マトリックス(ADP+ホスホクレアチン、マトリック
スH)の安定化効果を比較するため、室温にて安定化研
究を行った。加えて、正常ヒト血清媒体中にADPもしく
はATPのいずれかのみ(5mM)を含有する比較マトリック
スも調製した。
た。第6表は、経時的にマトリックス中に残存した「0
日目の」CKMB濃度の%として測定結果を示す。第6表の
結果は、ATP単独の方がADP単独よりも安定性が大きいこ
と、およびATPもしくはADPのいずれかにクレアチンを添
加すると安定性が増大することを示していた。ADPおよ
びクレアチンリン酸を含有する試薬マトリックスの安定
性は最も低かったが、それでも生成物/生成物マトリッ
クスを用いて得られる酵素安定性は酵素単独の場合に比
べると実質的に大きかった。
実質的に従ってそれぞれ調製したATP/クレアチン試薬マ
トリックス、ATP/ホスホクレアチン試薬マトリックスお
よびADP/ホスホクレアチン試薬マトリックスの安定化効
果を比較した。CKMB濃度の測定は実施例6に記載のよう
にして行った。第7表は、経時的にマトリックス中に残
存した「0日目の」CKMB濃度の%として測定結果を示
す。これらのアッセイ結果は、ATP/ホスホクレアチン試
薬マトリックスおよびADP/ホスホクレアチン試薬マトリ
ックスがほぼ同じ安定化効果を有することを示してい
た。
それらの組合わせを他の酵素またはイソ酵素の安定化の
ために適用し得ることは当業者には評価されるであろ
う。従って、記載した態様および好ましい態様は例示と
してのみ示すものであって、本発明に限定するものでは
ない。それゆえ、本発明の記載は、開示した特定の態様
に本発明を限定することを意図するものではなく、本発
明の範囲内ですべての等価物を包含することを意図する
ものである。
Claims (11)
- 【請求項1】(a)所定量のクレアチンキナーゼ酵素、 (b)アデノシン三リン酸、酸化型アデノシン三リン酸
およびアデノシン三リン酸類似体よりなる群から選ばれ
た少なくとも1種の酵素基質、および (c)液体媒体 からなることを特徴とする、安定化した非凍結乾燥酵素
組成物。 - 【請求項2】クレアチンおよびクレアチン類似体よりな
る群から選ばれた第二の酵素基質をさらに含み、該クレ
アチン類似体がβ−グアニジノプロピオン酸、1−カル
ボキシメチル−2−イミノイミダゾリジンクレアチン、
N−メチル−3−グアニジノプロピオネート、N−アミ
ジノ−N−エチルグリシン、1−カルボキシエチル−2
−イミノイミダゾリジンおよびN−(2,3−エポキシプ
ロピル)−N−アミジノグリシンよりなる群から選ばれ
たものである、請求項(1)に記載の組成物。 - 【請求項3】酵素基質がアデノシン三リン酸およびクレ
アチンであり、液体媒体が熱不活性化しアルカリ処理し
た正常ヒト血清である、請求項(2)に記載の組成物。 - 【請求項4】クレアチンリン酸およびクレアチンリン酸
類似体よりなる群から選ばれた酵素生成物をさらに含
み、該クレアチンリン酸類似体が1−カルボキシメチル
−2−イミノ−3−ホスホノイミダゾリジンホスホクレ
アチン、N−メチル−3−グアニジノプロピオネートリ
ン酸、N−アミジノ−N−エチルグリシンリン酸、1−
カルボキシエチル−2−イミノ−3−ホスホノイミダゾ
リジンホスホクレアチン、N−メチル−N−(β−ヒド
ロキシエチル)グアニジンおよびO−リン酸(クレアチ
ノールO−リン酸)よりなる群から選ばれたものであ
る、請求項(1)に記載の組成物。 - 【請求項5】(a)所定量のクレアチンキナーゼ酵素、 (b)アデノシン二リン酸、酸化型アデノシン二リン酸
およびアデノシン二リン酸類似体よりなる群から選ばれ
た第一の酵素生成物、およびクレアチンリン酸およびク
レアチンリン酸類似体よりなる群から選ばれた第二の酵
素生成物を含む、少なくとも2種の酵素生成物、および (c)液体媒体 からなることを特徴とする、安定化した非凍結乾燥酵素
組成物。 - 【請求項6】(a)所定量のクレアチンキナーゼ酵素、 (b)アデノシン二リン酸、酸化型アデノシン二リン酸
およびアデノシン二リン酸類似体よりなる群から選ばれ
た酵素生成物、 (c)クレアチンおよびクレアチン類似体よりなる群か
ら選ばれた酵素基質、および (d)液体媒体 からなることを特徴とする、安定化した非凍結乾燥酵素
組成物。 - 【請求項7】液体媒体がヒト血清、動物血清、人工血清
およびタンパク質溶液よりなる群から選ばれたものであ
る、請求項(1)〜(6)のいずれか一つに記載の組成
物。 - 【請求項8】スルフヒドリル化合物、二価金属イオンお
よびそれらの組合わせよりなる群から選ばれた酵素アク
チベーターをさらに含み、該スルフヒドリル化合物がメ
ルカプトエタノール、システイン、N−アセチルシステ
イン、ジチオエリスリトール、S−(2−アミノエチ
ル)イソチオウロニウムブロマイド臭化水素酸塩、グル
タチオン、チオグリコール酸、ジチオスレイトールおよ
びそれらの類似体よりなる群から選ばれたものであり、
該二価金属イオンがマグネシウム、マンガン、カルシウ
ムおよびコバルトイオンよりなる群から選ばれたもので
ある、請求項(1)〜(7)のいずれか一つに記載の組
成物。 - 【請求項9】請求項(1)〜(8)のいずれか一つに記
載の安定化した酵素組成物からなることを特徴とする、
酵素アッセイ用カリブレーターまたはコントロール試
薬。 - 【請求項10】請求項(1)〜(9)のいずれか一つに
記載の安定化した酵素組成物からなることを特徴とす
る、酵素アッセイ用キット。 - 【請求項11】被験試料中の酵素の存在または量を検出
するアッセイ法であって、被験試料中の酵素を検出し、
ついで請求項(1)〜(10)のいずれか一つに記載の安
定化酵素組成物中の酵素の存在または量を検出する、こ
とを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US42959189A | 1989-10-31 | 1989-10-31 | |
US429591 | 1989-10-31 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03172198A JPH03172198A (ja) | 1991-07-25 |
JP2999239B2 true JP2999239B2 (ja) | 2000-01-17 |
Family
ID=23703892
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2295150A Expired - Lifetime JP2999239B2 (ja) | 1989-10-31 | 1990-10-30 | 安定化酵素組成物およびそれを用いた酵素アッセイ用キット |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5496716A (ja) |
EP (1) | EP0426100B1 (ja) |
JP (1) | JP2999239B2 (ja) |
CA (1) | CA2028593C (ja) |
DE (1) | DE69015119T2 (ja) |
ES (1) | ES2075112T3 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2165808A1 (en) * | 1994-05-06 | 1995-11-16 | Carrie J. Lu | Liquid stable thiol activator |
JP3625503B2 (ja) * | 1994-11-11 | 2005-03-02 | 旭化成ファーマ株式会社 | 臨床検査用複合酵素含有組成物 |
US5817467A (en) * | 1995-11-16 | 1998-10-06 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for quantitatively determining creatinine kinase and a reagent therefor |
JP3750955B2 (ja) * | 1997-04-18 | 2006-03-01 | 富士写真フイルム株式会社 | クレアチンキナーゼまたはそのmbアイソザイムの定量用乾式分析素子 |
DE19755079A1 (de) * | 1997-12-11 | 1999-06-17 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilisiertes Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Creatin-Kinase |
US5981249A (en) * | 1998-02-05 | 1999-11-09 | Spectral Diagnostics, Inc. | Single-chain polypeptides comprising creatine kinase M and creatine kinase B |
EP0989191B1 (en) * | 1998-09-22 | 2002-11-27 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase or its MB isozyme |
WO2006034586A1 (en) * | 2004-09-29 | 2006-04-06 | Aplodan Formulations Ltd. | Nutritional composition for promoting muscle performance and acting as hydrogen (h+) blocker |
WO2006073073A1 (ja) * | 2005-01-07 | 2006-07-13 | Yamasa Corporation | 安定化されたオルニチントランスカルバミラーゼ及びそれを用いたオルニチントランスカルバミラーゼの免疫学的測定法 |
CN103981080B (zh) | 2010-01-20 | 2016-07-06 | 希乐克公司 | 分散原料和加工物料 |
CN103224974A (zh) * | 2013-01-31 | 2013-07-31 | 浙江清华长三角研究院 | 一种复合转氨酶校准物质的制备方法 |
US20170056352A1 (en) * | 2015-08-25 | 2017-03-02 | Rgenix, Inc. | PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS OF beta-GUANIDINOPROPIONIC ACID WITH IMPROVED PROPERTIES AND USES THEREOF |
CN116656661A (zh) * | 2023-06-01 | 2023-08-29 | 河北艾欧路生物科技有限责任公司 | 一种稳定而准确的复合生化校准品及其制备方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3556945A (en) * | 1968-02-05 | 1971-01-19 | Corning Glass Works | Enzyme stabilization |
US4310625A (en) * | 1976-03-17 | 1982-01-12 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized liquid enzyme compositions for diagnostic determinations |
US4339533A (en) * | 1980-07-30 | 1982-07-13 | Technicon Instruments Corporation | Stabilization of creatine kinase (CK) and its application as a reference standard |
US4652524A (en) * | 1980-10-02 | 1987-03-24 | Ivan E. Modrovich | Soluble stabilized enzymes |
US4547461A (en) * | 1983-01-18 | 1985-10-15 | Eastman Kodak Company | Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase |
JPS62104598A (ja) * | 1985-11-01 | 1987-05-15 | Yatoron:Kk | クレアチンキナ−ゼ測定用試薬 |
DE3540076A1 (de) * | 1985-11-12 | 1987-05-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur stabilisierung von creatinkinase |
US4994375A (en) * | 1988-07-11 | 1991-02-19 | Baxter International Inc. | Stable human serum based control and/or calibrant |
-
1990
- 1990-10-25 CA CA002028593A patent/CA2028593C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-30 EP EP90120781A patent/EP0426100B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-30 JP JP2295150A patent/JP2999239B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-30 DE DE69015119T patent/DE69015119T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-30 ES ES90120781T patent/ES2075112T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-10 US US08/240,794 patent/US5496716A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69015119D1 (de) | 1995-01-26 |
CA2028593A1 (en) | 1991-05-01 |
US5496716A (en) | 1996-03-05 |
EP0426100A1 (en) | 1991-05-08 |
ES2075112T3 (es) | 1995-10-01 |
EP0426100B1 (en) | 1994-12-14 |
DE69015119T2 (de) | 1995-07-27 |
JPH03172198A (ja) | 1991-07-25 |
CA2028593C (en) | 2007-08-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2999239B2 (ja) | 安定化酵素組成物およびそれを用いた酵素アッセイ用キット | |
Grisolia | The catalytic environment and its biological implications | |
EP0049475B1 (en) | Soluble stabilized enzymes | |
EP0072581B1 (en) | The stabilization of working reagent solutions containing enzymes, and the use of such stabilized reagents in enzyme or substrate assays | |
US4883762A (en) | Stabilized isoenzyme control products | |
DK151920B (da) | Middel og fremgangsmaade til bestemmelse af creatinkinase-mb samt anvendelse af midlet | |
Sies et al. | Hormones, glutathione status and protein S-thiolation | |
MIZUTANI et al. | Guanidino compounds in hyperargininemia | |
JP2930277B2 (ja) | クレアチンキナーゼおよびクレアチンキナーゼイソ酵素の酵素活性および免疫反応性を安定させるための組成物 | |
Brown et al. | Role of metal cofactors in enzyme regulation. Differences in the regulatory properties of the Escherichia coli nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-specific malic enzyme, depending on whether magnesium ion or manganese (2+) ion serves as divalent cation | |
US4339533A (en) | Stabilization of creatine kinase (CK) and its application as a reference standard | |
JP3619865B2 (ja) | 液体の安定なチオール活性化剤 | |
US4684615A (en) | Stabilized isoenzyme control products | |
JP3696267B2 (ja) | 生理活性蛋白質の安定化方法 | |
Balcom et al. | A method for the kinetic analysis of progress curves using horse serum cholinesterase as a model case | |
JP2909316B2 (ja) | 酵素含有組成物及び酵素活性の安定化方法 | |
KLEIN et al. | 2-Fluoro-L-histidine, an inhibitor of enzyme induction | |
Shapiro | Enzymatic formation of glycerophosphorylcholine | |
Whitner et al. | Stability of creatine kinase-3 in lyophilized materials. | |
JPS59166084A (ja) | 安定な酵素試薬の製造法 | |
Brown et al. | Urea cycle enzymes after portacaval shunting | |
Mullan | Studies in clinical enzymology | |
EP0721986A2 (en) | Creatine kinase reagent | |
Karachaliou et al. | An increase in creatine kinase secondary to acute pancreatitis: a case report | |
Scott | Crystalline insulin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071105 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081105 Year of fee payment: 9 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091105 Year of fee payment: 10 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091105 Year of fee payment: 10 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101105 Year of fee payment: 11 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |