JPH03123483A

JPH03123483A - カルボキシル基の修飾方法

Info

Publication number: JPH03123483A
Application number: JP26090189A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiko Hirose; 広瀬　芳彦; Seiji Sasaki; 佐々木　征治
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1989-10-05
Filing date: 1989-10-05
Publication date: 1991-05-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、遊離のアミノ基と遊離のカルボキシル基との
比率が０．５以下であるタンパク質のカルボキシル基に
縮合剤を用いてアミドを形成する修飾方法に関し、更に
詳細にはヒドロキシルアミン類を０゜５当量以上存在さ
せ酸性の緩衝液中で行うことを特徴とするカルボキシル
基の修飾方法に関する。

［従来技術］従来、ペプチド合成を含むカルボキシル基の修飾方法は
、−ｉに有機溶媒中（ジメチルホルムアミド、テトラヒ
ドロフランなど）で行われ、縮合剤としては主にジシク
ロへキシルカルボジイミド。

１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒ
ドロキノリン、カルボニルジイミダゾールなどが用いら
れている。

近年、タンパク質の修飾が活発に行われるようになり、
有機溶媒中に代わって水溶液中でタンパク質のカルボキ
シル基の修飾を行うことが必要となってきた。その対象
となるタンパク質としては特に遊離のアミノ基と遊離の
カルボキシル基との比率が０．５以下のものである。し
かしながら、縮合剤として水溶性カルボジイミドを用い
る場合、副反応としてＮ−アシルウレアを生ずることが
知られており、その抑制法が問題となっていた。

水溶液中でのタンパク質の修飾法に関してはこれまでに
も数例の報告がある。

例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋｏｓｈｌａｎｄ、Ｊｒ、らは、リボ
ヌクレアーゼのカルボキシル基にグリシンメチルエステ
ルを導入する場合、７．５Ｍウレア存在下、大過剰のグ
リシンメチルエステルを用いて行うことを報告している
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、　２４２巻、　２４
４７−２４５３（１９５７））　、　　（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５巻、６１６（１
９７２）’）。この場合大過剰のグリシルメチルエステ
ルを必要とするばかりでなく、タンパク質の種類によっ
てはウレア存在下では反応がうまく進行しないことがあ
る。

また、Ｍｉｃｈａｅｌ　５ｅｌａらは、リボヌクレアー
ゼにグリシンを結合させる場合、縮合剤を約１５０当量
、グリシン誘導体を約１５００当量用い１１個すべての
カルボキシル基にグリシンを導入している（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、　６巻、　２４７−２５２（１９６７
）　）。

さらに、Ｆｒａｎｋ、Ｅ、Ｆｒｅｒｍａｎ　らはアシル
ＣｏＡデヒドロゲナーゼに、リン酸緩衝液中それぞれタ
ウリン、グリシルエチルエステル、エチレンジアミンの
導入を試みたが酵素活性の失活が見られ、その失活の原
因として副生ずるＮ−アシルウレアの存在を示唆してい
る［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５５巻、　２１９９
−２２０２（１９８０）　）。

上記に述べた報告では、副生ずるＮ−アシルウレア生成
の抑制については詳しく調べられておらず、用いる試薬
類も大過剰であり、実用性に欠は不経済である。

低分子について水溶系におけるカルボキシル基の反応を
調べてみると、次の報告がなされている。

Ｍａｒｉａｎ　Ｅ、Ａｄｄｙらは、塩酸濃度が０．１ト
の時、Ｎ−アシルウレアは生じることなく目的とするＬ
ｅｕ−Ｌｅｕのジペプチドが生じると報告している（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　、
　５２３巻、　１０３４−１０３８（１９７３）　）。

また、Ｈｏｒｓｔ　Ｋｕｎｚらは、水系の反応を均一条
件下で行うため、アミノ酸のＮ−保護基に２−ホスホニ
オエトキシカルボニル基を用い、Ｎ−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール存在下、縮合剤としてＮシクロへキシル−
Ｎ゛−モルホリノエチルカルボジイミド・メトパラトル
エン（以下、ＣＭＣという。）硫酸塩を用いた反応を水
中で行い、収率よくジペプチドを得ている（Ａｎｇｅｗ
、Ｃｈｅｍ、　Ｉｎｔ、Ｅｄ。

Ｅｎｇｌ、、１７巻、　６７−６８（１９７８）　：ｌ
。

これらの例では、修飾にともなって変動するｐ）Ｉに対
する配慮がなされていない。つまり高分子化合物である
タンパク質の修飾への応用を考える場合にはタンパク質
の変性を抑制するために緩衝液の使用は不可欠である。

また、後者の例では、Ｇｅｉｇｅｒ−Ｋｏｎｉｇ反応の
変法として水系でＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを
用いる理由等については言及していない。

［発明が解決しようとする問題点］従来技術においては、水溶系において効率よくカルボキ
シル基を修飾する方法は殆ど例がなく、タンパク質の修
飾への応用を考えた場合、すぐれた方法はないといって
よい。さらに、副反応のＮ−アシルウレアの生成を抑制
する必要があるなどの問題点があった。

［問題点を解決するための手段］本発明者らは、まずタンパク質について直接検討するに
先立ち、アミノ酸誘導体を用いて検討した。

タンパク質の修飾を目的とした場合、上記に述べたよう
に縮合反応を緩衝液中で行うことは不可欠である。反応
系の液性を検討した結果、酸性域で行うことが必要であ
ることが判明した。そのために使用する緩衝液としては
、反応系に影響を与えない緩衝液であれば数々の緩衝液
が使用できるが、酸性域で用いるグツト緩衝液（Ｇｏｏ
ｄ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒ）がより好ましいことが判った。

更に酸性域で反応を行うのみでは、遊離のカルボキシル
基がアミドに修飾される割合は２０〜３０％であり、副
反応生成物としてＮ−アシルウレアが生成し、満足な結
果を得られなかった。

よって、本発明者らはこの副反応を抑え、修飾の割合を
高めるための反応条件を検討した結果、ヒドロキシルア
ミン類を添加して反応を行うことによってＮ−アシルウ
レアの生成を完全に防ぐことができた。ヒドロキシルア
ミン類としては、Ｎヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、ＨＯＢ　ｔという。）あるいはＮ−ヒドロキシ
サクシンイミド（以下、ＨＯ３ｕという。）などが好適
に使用できる。

これらの検討結果をもとに、数々のタンパク質の修飾方
法について検討した結果、上記で述べた合成アミノ酸類
の修飾の検討結果を高分子であるタンパク質を対象とす
る修飾方法についても同様に再現することができ本発明
を完成した。

具体的に本発明について述べる。本発明は水溶液中でタ
ンパク質のカルボキシル基とアミン類を縮合剤の存在下
で反応させて、アミド化する方法である。

本発明の対象とするタンパク質としては、種々のタンパ
ク質が対象となるが、本発明をより好適に実施できるの
は、タンパク質の構成アミノ酸の種類として一定の比率
を有するタンパク質である。

遊離のアミノ基を有するアミノ酸としてはリジン（以下
、Ｌｙｓという。）とＮ末端アミノ酸が挙げられ、遊離
のカルボキシル基を有するアミノ酸としてはアスパラギ
ン酸（以下、Ａｓｐという。）。

グルタミン酸（以下、Ｇｌｕという。）及びＣ末端アミ
ノ酸が挙げられるが、本発明での好適な対象となるタン
パク質は遊離のアミノ基が遊離のカルボキシル基と比較
して少ない構成となっているタンパク質で、換言すれば
その比率が０．５以下であるタンパク質である。具体的
には、わさび由来のパーオキシダーゼ、ヒト由来のりゾ
チーム、サーモライシン、ウシ由来のカゼイン、ヒト由
来の血清フルブミン及びビリルビンオキシダーゼ等は第
１表に示したようにその構成アミノ酸の比率（Ｌｙｓ／
　（Ａｓｐ＋Ｇ１ｕ）　）が０．５以下であり本発明を
好適に利用できる。

第１表反応液の液性を酸性に調整するための緩衝液としては反
応を阻害しないもので有れば使用できるが、より好まし
くはグツド緩衝液をｐＨ３，０〜７．０で使用する。

更に反応時にヒドロキシルアミン類を添加することによ
り副反応であるＮ−アシルウレアの生成を抑制すること
ができる。ヒドロキシルアミン類として、好ましくはＨ
ＯＢｔあるいはＨＯ３ｕが使用できる。その使用量は、
その効果が発揮される量で有れば良いが、より好適には
通常タンパク質のカルボキシル基に対して０．５当量以
上が使用される。

アミン類としては、遊離のカルボキシル基を有しないも
のであれば、その目的に応じて適宜選択できる。例えば
、グリシンアミド、グリシンメチルエステル及びアミノ
メタンスルフォン酸等が挙げられる。その使用量は対象
とするタンパク質のカルボキシル基の量により適宜変動
できるが、通常はタンパク質のカルボキシル基に対して
５当量以上存れば良い。

縮合剤としては、水溶系で使用できるものならばいずれ
でも良いが、より好ましくはＮ−エチル−Ｎ’　−ジメ
チルアミノプロピルカルポジイミド（以下、ＥＤＣとい
う。）又はその塩、並びにＣＭＣ又はその塩等が使用さ
れる。贋の使用量は通常、タンパク質のカルボキシル基
に対して１〜２当量が使用される。

カルボキシル基とアミン類を縮合剤で反応させる条件と
して、好ましくは反応温度は０〜１０°Ｃ１反応時間は
２〜２０時間であり、条件により適宜変更できる。

次に、実験例、実施例で本発明を説明するが、本発明は
これらに限定されるものではないことは言うまでもない
。

試験例１　ヒドロキシアミン類の添加効果ベンジルオキ
シカルボニルグリシン（以下、Ｚ−Ｇｌｙという。）　
２０．９ｍ　ｇ、プトレッシン・２塩酸塩（以下、Ｐｕ
ｔ　　・２ＨＣ１という。）８０．５■、さらにヒドロ
キシアミン類として、ＨＯＢＥあるいはＨＯ３ｕを第２
表あるいは第３表に示す量を２０ｍＭヒドロキシエチル
ピペリジンエタンスルフォン酸（以下、ＨＥＰＥＳとい
う。）　（ｐＨ６，０）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ塩酸
塩２３ｍｇを加えて１時間撹拌後、さらに４°Ｃで１夜
撹拌した。

反応液をＨＰＬＣで分析し、原料、目的生成物及び副生
成物の比率を求めた。尚、ＨＰＬＣ分析の条件は下記に
よった。

カラム：：ＯＤＳカラム（４，６Ｘ２５０ｍｍ　）移動
相：：アセトニトリル：水＝２０７８０（０，０５％ト
リフルオロ酢酸含有）検出　：：ＵＶ法（２５４ｎｍ）第２表（以下余白）第３表以上より、ＨＯＢｔ及びＨＯ３ｕともに０．５当量以上
使用することによって、副生成物である転移体の生成を
完全に抑制することができることが判った。

試験例２Ｚ−Ｇｌｙを１．０５　ｇ　、グリシルメチルエステル
塩酸（以下、Ｇｌｙ−ＯＭｅ−ＨＣｌという。）７５３
■。

ＨＯＢｔ３３８ｍｇを２０ｍＭのＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（
ｐＨ６，０）２００−に溶解し、氷冷下でＥＤＣ塩酸塩
１．９１６　ｇを加え１時間撹拌後、４°Ｃでさらに一
夜撹拌した。

反応液をクロロホルム５０ｍ１で抽出し、クロロホルム
層を重炭酸ナトリウム、飽和食塩水、　ＩＮ−塩酸、最
後に飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、
クロロホルムを減圧下に留去した。

残渣をメタノール−水で再結晶し、ベンジルオキシカル
ボニルグリシルグリシンメチルエステル１．１２ｇを得
た。（収率８０，０％、融点６５〜６７°Ｃ）目的物が
収率段（得られ、転移体の生成は認められなかった。

試験例３ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニン（融点　１
１９−１１９．５°ＣＮ、５ｇを用い、試験例２に従っ
て反応を行い、析出する結晶をろ過、乾燥することによ
り、１．６７ｇのベンジルオキシカルボニルフェニルア
ラニルグリシンメチルエステルを得た。（収率９０．３
％）試験例２と同様の効果が認められた。

試験例４ｚ−Ｇｌｙを２１０　＋Ｔ１ｇ、　Ｇｌｙ−ＯＭｅ−Ｈ
ＣＩ　を１５１　ｍｇ、　　ＨＯＢｔ６７．６■を２０
ｍＭモルホリノエチルスルフォン酸緩衝液（ｐＨ５，０
）に溶解し、試験例２に従い反応を行い、ＨＰＬＣ分析
の結果、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＭｅが９９．０％生成
し、副生成物は認められなかった。

試験例５ｚ−Ｇ＋ｙを２１０　ｍｇ、　Ｐｕｔ　　・２８Ｃ１を
１９３　ｍｇ及びＨＯ３ｕ２３０ｎ１ｇを０．１　Ｍの
ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ６，０）４０ｍｌに溶解し、
試験例２に従って反応を行い、反応液をＨＰＬＣ分析し
たところ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｕｔが７６．１％生成し、副
生成物は認められなかった。

試験例６Ｚ−Ｇｌｙを２１０　ｍｇ、　Ｐｕｔ　　・２１１ＣＩ
　を８０５　ｍｇ及びＨＯＢ　ｔ　６７．６ｍｇを２０
ｍＭのＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ６，０）　４０ｍ１に
溶解し、試験例２に従って反応を行い、反応液をＨＰＬ
Ｃ分析したところ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｕｔが１００％生成
し、副生成物は認められなかった。

実施例１サーモライシン１０■を２０ｍＭのＨＥＰＥＳに？容解
し、ＨＯ３ｕ２２．１■、プトレッシン・硫酸塩（以下
、Ｐｕｔ　＋　８２ＳＯ４という。）　３５．８■を加
えた後、反応液のｐＨを６．５に合わせ、総量を１　ｍ
ｉｌとした。氷冷下、ＥＤＣ塩酸塩を７．４■加え、２
時間撹拌後、更に４°Ｃで一夜撹拌した。反応液をＧ−
２５カラムでゲルろ過後、ＴＮＢＳ法でアミノ基の数を
測定した結果、２２個のアミノ基が確認された。（サー
モライシンの修飾前のアミノ基の数は１１個）実施例２わさび由来のパーオキシダーゼ１０■を実施例１と同様
にしてカルボキシル基の修飾を行ったところ、８個のア
ミノ基が確認された。（パーオキシダーゼの修飾前のア
ミノ基の数は６個）実施例３ビリルビンオキシダーゼ３００■を２０ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ　（ｐＨ６，０）に？容解させ、ＨＯ３ｕを６６．４
ｍｇ、さらにＰｕｔ　−Ｈ２ＳＯ，とＥＤＣ塩酸塩を第
４表の様に変化させて加え、ｐＨ６，０で水冷下２時間
続いて４°Ｃで一夜撹拌した。反応液を２０ｍＭのホウ
酸塩（ｐＨ９，０）で平衡化したＧ−２５カラム（０，
７６ｘ　５ｃｍ）でゲルろ過後、修飾したビリルビンオ
キシダーゼのアミノ基をＴＮＢＳ法で測定したところ、
第４表に示す結果となった。

（以下余白）第４表本発明は、水溶系において効率よくタンパク質のカルボ
キシル基を修飾する方法を提供し、さらに、副反応のＮ
−アシルウレアの生成を抑制する方法を提供する。

実施例４ビリルビンオキシダーゼＬＯｍｇを２０１１１ＭのＨＥ
ＰＥＳ　（ｐＨ６，０）に溶解させ、ＨＯＳ　ｕ２．２
１ｍｇ、　Ｐｕｔ１１ｚｓＯ４３５，７ｍ　ｇ　、　　
ＣＭ　Ｃ硫酸塩１６．３ｍｇを加え実施例３に従って反
応を行いアミノ基を測定したところ４個であった。

実施例５ビリルビンオキシダーゼ１０ｍｇを２０ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ　（ｐＨ６，０）に溶解させ、ＨＯＳ　ｕ　２．２１
ｍｇ。

１．４−ブタンジオールビス（３−アミノプロピル）エ
ーテル硫酸塩５９．２ｍｇ、　　Ｅ：ＤＣ塩酸塩７．４
　ｍｇを加え実施例３に従って反応を行いアミノ基を測
定したところ８個が導入された。

［発明の効果］

Claims

【特許請求の範囲】

１　遊離のアミノ基と遊離のカルボキシル基との比率が
０．５以下であるタンパク質のカルボキシル基に縮合剤
を用いてアミドを形成する修飾方法において、ヒドロキ
シルアミン類を存在させ酸性の緩衝液中で行うことを特
徴とするカルボキシル基の修飾方法。