JP2771997B2 - グルタミン含有ペプチド及びそれらの製造方法 - Google Patents
グルタミン含有ペプチド及びそれらの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、次の式（Ｉ） Ｈ−A1−A2−A3−A4−Gln−A6−Lys−Val−A9−A10−
NH2 （Ｉ） （ただし式中、A1＝Val、Leu A2＝Gly、Ser A3＝Pro、Hyp A4＝Gly、Ser A6＝Gly、Ser A9＝Leu、Ileそして A10＝Gly、Ala） で示されるペプチドおよびそれらの塩、それらの製造方
法、およびそれらからなる凝血因子XIIIの基質に関す
る。これらのペプチドは凝血因子XIIIの基質として働
き、またこの酵素の定量に、および活性化凝血因子XIII
が生産され、消費されまたは阻害される反応の検出に使
用することができる。
NH2 （Ｉ） （ただし式中、A1＝Val、Leu A2＝Gly、Ser A3＝Pro、Hyp A4＝Gly、Ser A6＝Gly、Ser A9＝Leu、Ileそして A10＝Gly、Ala） で示されるペプチドおよびそれらの塩、それらの製造方
法、およびそれらからなる凝血因子XIIIの基質に関す
る。これらのペプチドは凝血因子XIIIの基質として働
き、またこの酵素の定量に、および活性化凝血因子XIII
が生産され、消費されまたは阻害される反応の検出に使
用することができる。
本発明は、様々な生理学的過程において、アミンアク
セプタとしてアミノ酸グルタミンを有するタンパク質へ
の一級アミンの取込みを生じるトランスグルタミナーゼ
F XIIIの作用様式に基づいている。凝血との観点におい
ては、不溶性血餅生産につながるこの反応においては、
アンモニアが副生物として形成される。検体中のF XIII
濃度を副生するアンモニアの測定により測定可能にする
方法が存在する。例えば、F XIIIが介在するアセチル化
β−カゼイン中へのエチルアミン取込みによつて連続的
に生成されるアンモニアは、NADH反応により測定するこ
とができる。このNADH反応において、生成されたアンモ
ニアは、酵素GLDHの作用の下にアルフア−ケトグルタレ
ート中に取込まれる。この結果、グルタミン酸が生じ、
同時にNADHが消費されてNAD+が形成される。NADHとNAD+
とは分光学的挙動が著しく異なつていることから、例え
ば340nmにおける吸光度減少を測定すればアンモニア濃
度の変化が得られ、またこれらの動力学からF XIII濃度
が測定される。
セプタとしてアミノ酸グルタミンを有するタンパク質へ
の一級アミンの取込みを生じるトランスグルタミナーゼ
F XIIIの作用様式に基づいている。凝血との観点におい
ては、不溶性血餅生産につながるこの反応においては、
アンモニアが副生物として形成される。検体中のF XIII
濃度を副生するアンモニアの測定により測定可能にする
方法が存在する。例えば、F XIIIが介在するアセチル化
β−カゼイン中へのエチルアミン取込みによつて連続的
に生成されるアンモニアは、NADH反応により測定するこ
とができる。このNADH反応において、生成されたアンモ
ニアは、酵素GLDHの作用の下にアルフア−ケトグルタレ
ート中に取込まれる。この結果、グルタミン酸が生じ、
同時にNADHが消費されてNAD+が形成される。NADHとNAD+
とは分光学的挙動が著しく異なつていることから、例え
ば340nmにおける吸光度減少を測定すればアンモニア濃
度の変化が得られ、またこれらの動力学からF XIII濃度
が測定される。
この方法の短所は、使用される基質が脱ホスホリル化
し、Ｎ−アセチル化しなければならないカゼイン、特定
的にはβ−カゼインである点である。アミンの取込みに
は、このタンパク質構造中の唯一のグルタミンしか用い
られないことから、比較的高い基質濃度が必要となる。
Clin.Chem.31/12,2044〜2045,1985には、ある種のグル
タミン含有ペプチドを用いると、一義的に規定される基
質がF XIIIに対して提供されるためにこれらの欠点が改
善される旨報告されている。このようなペプチド基質の
適切さは動力学的挙動から、すなわち光学密度の変化速
度（デルタOD/時間）から決定することができるが、比
較的低いF XIII濃度であつても十分な正確さをもつて測
定可能とするには、高い値である方が好ましいことは勿
論である。
し、Ｎ−アセチル化しなければならないカゼイン、特定
的にはβ−カゼインである点である。アミンの取込みに
は、このタンパク質構造中の唯一のグルタミンしか用い
られないことから、比較的高い基質濃度が必要となる。
Clin.Chem.31/12,2044〜2045,1985には、ある種のグル
タミン含有ペプチドを用いると、一義的に規定される基
質がF XIIIに対して提供されるためにこれらの欠点が改
善される旨報告されている。このようなペプチド基質の
適切さは動力学的挙動から、すなわち光学密度の変化速
度（デルタOD/時間）から決定することができるが、比
較的低いF XIII濃度であつても十分な正確さをもつて測
定可能とするには、高い値である方が好ましいことは勿
論である。
本発明の目的は、従来技術のものよりも優れた性質、
すなわち高い転化速度および従つて高いデルタOD/時間
値を有するグルタミン含有ペプチドを提供することにあ
る。
すなわち高い転化速度および従つて高いデルタOD/時間
値を有するグルタミン含有ペプチドを提供することにあ
る。
今般、驚くべきことに、前記式Ｉを有するペプチドが
この条件を特に適切に満たすことを見出した。従来技術
との本質的な差、従つて新規性は、３位にプロリンまた
はヒドロキシプロリンが存在する点である。
この条件を特に適切に満たすことを見出した。従来技術
との本質的な差、従つて新規性は、３位にプロリンまた
はヒドロキシプロリンが存在する点である。
すなわち、本発明は関連の定義を伴う前記式Ｉで示さ
れたペプチドに関する。
れたペプチドに関する。
それらペプチドの構築に用いられるアミノ酸は、Ｄ型
およびＬ型のいずれであつてもよいがＬ型が好ましい。
Ｎ末端にはＤ−アミノ酸を取り込むのが有益であること
が判つている。何故ならばこれにより基質の望ましくな
い酵素分解を防止することができるからである。
およびＬ型のいずれであつてもよいがＬ型が好ましい。
Ｎ末端にはＤ−アミノ酸を取り込むのが有益であること
が判つている。何故ならばこれにより基質の望ましくな
い酵素分解を防止することができるからである。
特に適しているのは、次のペプチド（一般に、特に断
りのない限りアミノ酸はＬ型である）： これに関連して、本発明によるペプチドはそれらの塩
の形、例えばクロリド、アセテート、ホルメート、ブロ
ミド、またはメタンスルホネートの形であつてよい。
りのない限りアミノ酸はＬ型である）： これに関連して、本発明によるペプチドはそれらの塩
の形、例えばクロリド、アセテート、ホルメート、ブロ
ミド、またはメタンスルホネートの形であつてよい。
これらのペプチドは、自体知られた方法により製造で
き、例えば溶液中で行われる古典的方法によつて行われ
るが、その場合、個々の保護されたアミノ酸、またはペ
プチドセグメントの縮合が行われ、また所望のペプチド
は保護基を除去した後に得られる。この目的のためのア
ルフア−アミノ基に用いられる保護基の例は、Boc、
Ｚ、Ddz、BpocまたはFmoc（後述の略語参照）である。
リジンのための側鎖保護基としてはBoc、Ｚ、ｏ−ClZ、
ｏ−BrZまたはTFAが、セリンに対してはBzlまたはｔ−B
uが用いられる。
き、例えば溶液中で行われる古典的方法によつて行われ
るが、その場合、個々の保護されたアミノ酸、またはペ
プチドセグメントの縮合が行われ、また所望のペプチド
は保護基を除去した後に得られる。この目的のためのア
ルフア−アミノ基に用いられる保護基の例は、Boc、
Ｚ、Ddz、BpocまたはFmoc（後述の略語参照）である。
リジンのための側鎖保護基としてはBoc、Ｚ、ｏ−ClZ、
ｏ−BrZまたはTFAが、セリンに対してはBzlまたはｔ−B
uが用いられる。
本発明によるペプチドの製造には、後で最終配列の構
築に用いられるペプチドセグメントを用いるのが適して
おりまた好ましい。ペプチドセグメントA1−A2−A3−A4
をセグメントGln−A6−Lys−Val−A9−A10−NH2に結合
するのが有益であることが判つている。A1のアミノ基は
保護基を備えていなければならないが、前記の記載に従
つて、BocまたはＺが格別に好ましい。A3がヒドロキシ
プロリンである場合には、そのヒドロキシル基をｔ−Bu
で保護するのが有利である。Ｃ末端ヘキサペプチドのエ
プシロン−アミノ基も同じく保護される。ここに述べた
個々のペプチドセグメントは、溶液中で個々の保護され
たアミノ酸を用いて構築されるが適切で好ましい溶媒は
ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンおよびジ
メチルスルホキシドである。カルボキシル基活性化工程
は、好ましくは、ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは
ヒドロキシスクシンイミドの存在下にカルボジイミド、
特に好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミドを用い
て行われる。そのpH値は、カツプリング工程において４
〜10の範囲に維持されるが、６〜８のpHが得られるよう
に塩基例えばＮ−メチルモルホリンを用いるのが好まし
い。個々のペプチドセグメント、および保護されたデカ
ペプチドは既知の方法によつて精製される。それらペプ
チドは好ましくは、ペプチドに対する溶媒として適して
いることの知られていて完全には水と混和し得ない有機
溶媒、例えば酢酸エチルまたはブタノールに溶解し、そ
してペプチド溶液を水、1M重硫酸カリウムおよび1M重硫
酸ナトリウムで洗浄する。式（Ｉ）に相当する本発明に
よるペプチドは、好ましくは、ゲル浸透クロマトグラフ
イ、好ましくは１％強度（容量）酢酸を用いたRSephade
x G25によつて精製される。
築に用いられるペプチドセグメントを用いるのが適して
おりまた好ましい。ペプチドセグメントA1−A2−A3−A4
をセグメントGln−A6−Lys−Val−A9−A10−NH2に結合
するのが有益であることが判つている。A1のアミノ基は
保護基を備えていなければならないが、前記の記載に従
つて、BocまたはＺが格別に好ましい。A3がヒドロキシ
プロリンである場合には、そのヒドロキシル基をｔ−Bu
で保護するのが有利である。Ｃ末端ヘキサペプチドのエ
プシロン−アミノ基も同じく保護される。ここに述べた
個々のペプチドセグメントは、溶液中で個々の保護され
たアミノ酸を用いて構築されるが適切で好ましい溶媒は
ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンおよびジ
メチルスルホキシドである。カルボキシル基活性化工程
は、好ましくは、ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは
ヒドロキシスクシンイミドの存在下にカルボジイミド、
特に好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミドを用い
て行われる。そのpH値は、カツプリング工程において４
〜10の範囲に維持されるが、６〜８のpHが得られるよう
に塩基例えばＮ−メチルモルホリンを用いるのが好まし
い。個々のペプチドセグメント、および保護されたデカ
ペプチドは既知の方法によつて精製される。それらペプ
チドは好ましくは、ペプチドに対する溶媒として適して
いることの知られていて完全には水と混和し得ない有機
溶媒、例えば酢酸エチルまたはブタノールに溶解し、そ
してペプチド溶液を水、1M重硫酸カリウムおよび1M重硫
酸ナトリウムで洗浄する。式（Ｉ）に相当する本発明に
よるペプチドは、好ましくは、ゲル浸透クロマトグラフ
イ、好ましくは１％強度（容量）酢酸を用いたRSephade
x G25によつて精製される。
更に、本発明によるペプチドの製造には固相法が適し
ている。これは、適宜のアンカー（anchor）を備えたマ
トリクス例えば架橋ポリスチレン、ポリアクリルアミド
などでペプチドを構築しそしてそこから選択的に脱離さ
せることから成る。
ている。これは、適宜のアンカー（anchor）を備えたマ
トリクス例えば架橋ポリスチレン、ポリアクリルアミド
などでペプチドを構築しそしてそこから選択的に脱離さ
せることから成る。
従つて、本発明は固相ペプチド合成法による本発明ペ
プチドの製造方法にも関する。従来技術によれば、固相
には、アミド誘導体の形でペプチド脱離を可能にするい
わゆるアンカー分子を備える必要がある。かかるアンカ
ー化合物の例は固定化されたベンズヒドリルアミン誘導
体であり、次にそれに対して、配列における最初のアミ
ノ酸をカツプルさせる。この目的に対して用いられる好
ましい溶媒は、ジクロロメタン、Ｎ−メチルピロリドン
であるが、ジメチルホルムアミドが格別に好ましい。そ
れらアミノ酸は例えば活性エステル、混合または対称無
水物またはカルボジイミド活性化を介して活性化され
る。支持体からのペプチドの脱離は好ましくは酸分解に
よつて行われ、同時に側鎖保護基も除去される。次にそ
れらペプチドを自体既知の方法により、特に好ましくは
ゲル浸透クロマトグラフイにより精製する。
プチドの製造方法にも関する。従来技術によれば、固相
には、アミド誘導体の形でペプチド脱離を可能にするい
わゆるアンカー分子を備える必要がある。かかるアンカ
ー化合物の例は固定化されたベンズヒドリルアミン誘導
体であり、次にそれに対して、配列における最初のアミ
ノ酸をカツプルさせる。この目的に対して用いられる好
ましい溶媒は、ジクロロメタン、Ｎ−メチルピロリドン
であるが、ジメチルホルムアミドが格別に好ましい。そ
れらアミノ酸は例えば活性エステル、混合または対称無
水物またはカルボジイミド活性化を介して活性化され
る。支持体からのペプチドの脱離は好ましくは酸分解に
よつて行われ、同時に側鎖保護基も除去される。次にそ
れらペプチドを自体既知の方法により、特に好ましくは
ゲル浸透クロマトグラフイにより精製する。
架橋アミノ−官能化ポリスチレンを（ポリスチレン10
0gあたり架橋剤1g）使用するのが固相ペプチド合成には
好ましい。Ｃ末端アミノ酸はベンズヒドリルアミン誘導
体を介してポリマー支持体に結合させるのが特に好まし
く、Fmoc−アミノ酸（４−カルボキシメトキシフエニル
−４−メトキシフエニル）メチルアミドをマトリクスの
アミノ基に対してカルボジイミド介在反応を介して結合
させるのが特に好ましい。
0gあたり架橋剤1g）使用するのが固相ペプチド合成には
好ましい。Ｃ末端アミノ酸はベンズヒドリルアミン誘導
体を介してポリマー支持体に結合させるのが特に好まし
く、Fmoc−アミノ酸（４−カルボキシメトキシフエニル
−４−メトキシフエニル）メチルアミドをマトリクスの
アミノ基に対してカルボジイミド介在反応を介して結合
させるのが特に好ましい。
Fmoc基を除去し、そしてDMF−イソプロパノール洗浄
工程を経た後、固相上の検出可能アミノ基量に基づき３
倍モル過剰の、配列上次位の保護されたアミノ酸、およ
び4.5倍過剰のHOBtを添加する。3.3倍過剰（前記アミノ
基に基づく）のジイソプロピルカルボジイミドまたはジ
シクロヘキシルカルボジイミドを添加後、カツプリング
を１時間行う。次に、DMFおよびイソプロパノールで洗
浄することにより過剰の試剤を除去する。
工程を経た後、固相上の検出可能アミノ基量に基づき３
倍モル過剰の、配列上次位の保護されたアミノ酸、およ
び4.5倍過剰のHOBtを添加する。3.3倍過剰（前記アミノ
基に基づく）のジイソプロピルカルボジイミドまたはジ
シクロヘキシルカルボジイミドを添加後、カツプリング
を１時間行う。次に、DMFおよびイソプロパノールで洗
浄することにより過剰の試剤を除去する。
本発明のペプチドは、好ましくは４容量部のトリフル
オロ酢酸と１容量部のメチルフエニルスルフイドおよび
ジメルカプトエタンの3:1（容量：容量）混合物との混
合物を用いた酸分解処理により固相から除去される。粗
製ペプチドは、エーテル、好ましくはジエチルエーテル
の添加により沈殿し、また自体既知の常法により精製工
程により精製される。好ましいのは、例えば0.5ml/100m
l酢酸を溶出液として用いたRSephadex G−25でのイオン
交換クロマトグラフイまたはゲル透過（gel permeatio
n）である。
オロ酢酸と１容量部のメチルフエニルスルフイドおよび
ジメルカプトエタンの3:1（容量：容量）混合物との混
合物を用いた酸分解処理により固相から除去される。粗
製ペプチドは、エーテル、好ましくはジエチルエーテル
の添加により沈殿し、また自体既知の常法により精製工
程により精製される。好ましいのは、例えば0.5ml/100m
l酢酸を溶出液として用いたRSephadex G−25でのイオン
交換クロマトグラフイまたはゲル透過（gel permeatio
n）である。
トランスグルタミナーゼF XIIIの基質としてのペプチ
ドの適切さを試験するには、因子XIIIを含む検体溶液を
約30mmol/塩化カルシウムを含む緩衝混合物中、pH7.6
±0.5でトロンビンを用いて活性化する。次にペプチド
溶液、アミン誘導体、例えばグリシンエチルエステルま
たはグリシンメチルエステル、の溶液、ケトグルタレー
ト緩衝剤、グルタミンデヒドロゲナーゼ（glutamic deh
ydrogenase）およびNADH溶液などを添加する。次いで、
デカペプチドアミドからのアンモニア放出を340±15nm
における吸光度低下により測定し、そしてF XIIIの活性
が決定される。
ドの適切さを試験するには、因子XIIIを含む検体溶液を
約30mmol/塩化カルシウムを含む緩衝混合物中、pH7.6
±0.5でトロンビンを用いて活性化する。次にペプチド
溶液、アミン誘導体、例えばグリシンエチルエステルま
たはグリシンメチルエステル、の溶液、ケトグルタレー
ト緩衝剤、グルタミンデヒドロゲナーゼ（glutamic deh
ydrogenase）およびNADH溶液などを添加する。次いで、
デカペプチドアミドからのアンモニア放出を340±15nm
における吸光度低下により測定し、そしてF XIIIの活性
が決定される。
驚くべきことに、本発明によるペプチドは、F XIIIの
検出に極めて適していることが確認された。これらのペ
プチドは式中のA3としてプロリンまたは関連のアミノ
酸、例えばヒドロキシプロリンを有することが重要であ
る。驚くべきことに、比較研究において、単位時間あた
りの吸光度変化として測定される分解速度が既知の物質
を用いたときよりも大きいことを示すことができた。
検出に極めて適していることが確認された。これらのペ
プチドは式中のA3としてプロリンまたは関連のアミノ
酸、例えばヒドロキシプロリンを有することが重要であ
る。驚くべきことに、比較研究において、単位時間あた
りの吸光度変化として測定される分解速度が既知の物質
を用いたときよりも大きいことを示すことができた。
従つて、これら基質を用いれば、F XIIIの検出限界を
下げ、またより正確に測定を行うことができる。従つ
て、本発明は、式Ｉのペプチドの、グルタミナーゼ、好
ましくはF XIII、の測定方法への使用にも関する。
下げ、またより正確に測定を行うことができる。従つ
て、本発明は、式Ｉのペプチドの、グルタミナーゼ、好
ましくはF XIII、の測定方法への使用にも関する。
次に実施例を挙げて、本発明をより詳しく説明する。
実施例 １ Ｈ−Leu−Gly−Pro−Gly−Gln−Gly−Lys−Val−Leu−G
ly−NH2の合成 1gのアミノメチルポリスチレン（100gあたり1gの架橋
剤;0.49mmol NH2基/g）を15mlのDMF中で膨潤させ、そし
てRLabortec AG SP 640ペプチド合成装置で反応させ
た。Ｃ末端アミノ酸から開始して、常法による樹脂洗浄
工程を経た後に、15mlのDMFに溶解した1.5mmolのFmoc−
グリシン（４−カルボキシメトキシフエニル−４−メト
キシフエニル）メチルアミドおよび2.25mmolのHOBtを樹
脂に添加し、そして1.65mmolのジイソプロピルカルボジ
イミドを用いて活性化した。その反応混合物を室温で１
時間振盪し、次いでDMFおよびイソプロパノールによる
洗浄を行ない、過剰の試剤および副生物をポリマーから
除去した。20ml/100mlのピペリジンのDMF溶液と10分間
反応させることによりFmoc保護基を除去した。この反応
サイクルをＮ末端アミノ酸まで維持した。次のアミノ酸
誘導体を用いた:Fmoc−Leu、Fmoc−Val、Fmoc−Lys（Bo
c）、Fmoc−Gly、Fmoc−Gln、Fmoc−Pro、Boc−Leu（Ｎ
末端アミノ酸）。
ly−NH2の合成 1gのアミノメチルポリスチレン（100gあたり1gの架橋
剤;0.49mmol NH2基/g）を15mlのDMF中で膨潤させ、そし
てRLabortec AG SP 640ペプチド合成装置で反応させ
た。Ｃ末端アミノ酸から開始して、常法による樹脂洗浄
工程を経た後に、15mlのDMFに溶解した1.5mmolのFmoc−
グリシン（４−カルボキシメトキシフエニル−４−メト
キシフエニル）メチルアミドおよび2.25mmolのHOBtを樹
脂に添加し、そして1.65mmolのジイソプロピルカルボジ
イミドを用いて活性化した。その反応混合物を室温で１
時間振盪し、次いでDMFおよびイソプロパノールによる
洗浄を行ない、過剰の試剤および副生物をポリマーから
除去した。20ml/100mlのピペリジンのDMF溶液と10分間
反応させることによりFmoc保護基を除去した。この反応
サイクルをＮ末端アミノ酸まで維持した。次のアミノ酸
誘導体を用いた:Fmoc−Leu、Fmoc−Val、Fmoc−Lys（Bo
c）、Fmoc−Gly、Fmoc−Gln、Fmoc−Pro、Boc−Leu（Ｎ
末端アミノ酸）。
そのペプチド−ポリマーを16mlのTFA、3mlのチオアニ
ソールおよび1mlのエタンジチオールを用いて35℃で２
時間処理した。そのペプチド含有溶液を過した後ジエ
チルエーテルを添加し、そして結晶性ペプチドを別し
乾燥した。粗製ペプチドを20mlの0.5ml/100ml酢酸に溶
解し、そしてRSephadex G−25カラムで精製した。ペプ
チド画分を凍結乾燥した。収量:370mg。
ソールおよび1mlのエタンジチオールを用いて35℃で２
時間処理した。そのペプチド含有溶液を過した後ジエ
チルエーテルを添加し、そして結晶性ペプチドを別し
乾燥した。粗製ペプチドを20mlの0.5ml/100ml酢酸に溶
解し、そしてRSephadex G−25カラムで精製した。ペプ
チド画分を凍結乾燥した。収量:370mg。
実施例 ２ Ｈ−Leu−Ser−Hyp−Ser−Gln−Ser−Lys−Val−Leu−G
ly−NH2の合成 Fmoc−Ser（tBu）およびFmoc−Hyp（tBu）を除いては
実施例１と同様に同じアミノ酸誘導体を用いてこのペプ
チドを構築した。処理工程および量的データは実施例１
に相当する。
ly−NH2の合成 Fmoc−Ser（tBu）およびFmoc−Hyp（tBu）を除いては
実施例１と同様に同じアミノ酸誘導体を用いてこのペプ
チドを構築した。処理工程および量的データは実施例１
に相当する。
その他のペプチドも同様に合成される。
実施例 ３ 光度測定による因子XIII活性の測定 pH7.6に調整され、50ミリモル濃度HEPES、150ミリモ
ル濃度塩化ナトリウムおよび30ミリモル濃度CaCl2を含
有する50μの因子XIII（0.6U）含有溶液を25μのト
ロンビン溶液（30単位を1mlの生理学的食塩水に溶解し
たもの）と共に1mlのキユベツト中、37℃で10分間イン
キユベートした。133mgのNADH/、2.2gのアルフア−ケ
トグルタレート／、トリエタノールアミンより構成さ
れる緩衝溶液（pH8.0）700μを添加した。次にその検
体溶液を100μのデカペプチドアミド溶液（10mg/ml、
水中）、100μのグリシンエチルエステル（30mg/ml、
水中）、100mlのグリセロール、5mlのグルタミンデヒド
ロゲナーゼ（約120単位/mg）の溶液（pH7）25μと混
合した。吸光度低下を測定した。340nmにおける動力学
的測定結果は、以下の表にデルタOD/分値の形で示され
る。
ル濃度塩化ナトリウムおよび30ミリモル濃度CaCl2を含
有する50μの因子XIII（0.6U）含有溶液を25μのト
ロンビン溶液（30単位を1mlの生理学的食塩水に溶解し
たもの）と共に1mlのキユベツト中、37℃で10分間イン
キユベートした。133mgのNADH/、2.2gのアルフア−ケ
トグルタレート／、トリエタノールアミンより構成さ
れる緩衝溶液（pH8.0）700μを添加した。次にその検
体溶液を100μのデカペプチドアミド溶液（10mg/ml、
水中）、100μのグリシンエチルエステル（30mg/ml、
水中）、100mlのグリセロール、5mlのグルタミンデヒド
ロゲナーゼ（約120単位/mg）の溶液（pH7）25μと混
合した。吸光度低下を測定した。340nmにおける動力学
的測定結果は、以下の表にデルタOD/分値の形で示され
る。
ペプチド配列 デルタOD/分 Leu−Ser−Leu−Ser−Gln− Ser−Lys−Val−Leu−Gly−NH2 0.21 Leu−Gly−Gly−Gly−Gln− Gly−Lys−Val−Leu−Gly−NH2 0.12 Leu−Gly−Pro−Gly−Gln− Ser−Lys−Val−Leu−Gly−NH2 0.32 Leu−Gly−Hyp−Gly−Gln− Ser−Lys−Val−Leu−Gly−NH2 0.27 Leu−Gly−Pro−Gly−Gln− Ser−Lys−Val−Ile−Gly−NH2 0.35 略 記 法 NADH ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド、
還元型 NAD+ ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド GLDH グルタミンデヒドロゲナーゼ nm ナノメートル Val バリン Leu ロイシン Gly グリシン Ser セリン Pro プロリン Hyp ヒドロキシプロリン Ile イソロイシン Ala アラニン Gln グルタミン Lys リジン Boc 第三級ブチルオキシカルボニル Z ベンジルオキシカルボニル ｏ−ClZ ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル ｏ−BrZ ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル TFA トリフルオロ酢酸またはトリフルオロアセチ
ル Bzl ベンジル ｔ−Bu 第三級ブチル HOBt ヒドロキシベンゾトリアゾール DMF ジメチルホルムアミド OD 光学密度
還元型 NAD+ ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド GLDH グルタミンデヒドロゲナーゼ nm ナノメートル Val バリン Leu ロイシン Gly グリシン Ser セリン Pro プロリン Hyp ヒドロキシプロリン Ile イソロイシン Ala アラニン Gln グルタミン Lys リジン Boc 第三級ブチルオキシカルボニル Z ベンジルオキシカルボニル ｏ−ClZ ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル ｏ−BrZ ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル TFA トリフルオロ酢酸またはトリフルオロアセチ
ル Bzl ベンジル ｔ−Bu 第三級ブチル HOBt ヒドロキシベンゾトリアゾール DMF ジメチルホルムアミド OD 光学密度
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/47 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】次の式（Ｉ） Ｈ−A1−A2−A3−A4−Gln−A6−Lys−Val−A9−A10−NH
2 （Ｉ） （ただし式中、 A1＝Val、Leu A2＝Gly、Ser A3＝Pro、Hyp A4＝Gly、Ser A6＝Gly、Ser A9＝Leu、Ileおよび A10＝Gly、Ala） で示されるペプチドまたはそれらの塩。 - 【請求項２】アミノ酸がＬ型である請求項１記載のペプ
チド。 - 【請求項３】A1がＤ型である請求項１記載のペプチド。
- 【請求項４】次の式 または で示される請求項１記載のペプチド。
- 【請求項５】次の式（Ｉ） Ｈ−A1−A2−A3−A4−Gln−A6−Lys−Val−A9−A10−NH
2 （Ｉ） （ただし式中、 A1＝Val、Leu A2＝Gly、Ser A3＝Pro、Hyp A4＝Gly、Ser A6＝Gly、Ser A9＝Leu、Ileおよび A10＝Gly、Ala） で示されるペプチド、および、場合によりその塩を製造
するにあたり、保護されたアミノ酸誘導体またはペプチ
ドセグメントを溶液中または固相上でカップリングし、
そして式（Ｉ）を有するペプチドを保護基の除去によっ
て、また固相の場合には支持体樹脂からの除去によって
得ることにより成る方法。 - 【請求項６】請求項１の式Ｉで示されるペプチドからな
る凝血因子XIIIの基質。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
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| EP0314023B1 (de) | 1994-05-11 |
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