JPH03112924A - ｐＨ感受性リポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はリポソームに関するものである。

（従来の技術） 従来、卵黄レシチン、卵黄ホスファチジルコリン、大豆
油レシチンとか、それらの構成成分であるリン脂質、さ
らには合成レシチンが水中で２５゜ｎｌ１１〜５ｐｒＢ
の大きさの閉鎖小胞体（ベシクル）、すなおち生体類似
の脂質二分子膜構造を有する構造体であるリポソームを
形成することが知られている。

このリポソームは、薬剤や酵素を封入した超マイクロカ
プセル材料としての用途を持ち、インシュリン、ヘパリ
ン、ビタミンＫ、コルチコステロイド及び各種の抗ガン
剤等の水溶性、油溶性各種薬剤をリポソームの内水相や
疎水性壁膜に封入し。

徐放性又はより効果的な治療薬の開発研究が進められて
いる。

化粧品の分野でも、室温に保存した場合に不安定なビタ
ミンＥ、アスコルビン酸等をリポソーム処方化すること
により、その保存期間の長期安定化を図ることが行われ
ている。

また、レシチンから成るリポソームは、肝ぞう、牌ぞう
、リンパ節などに集積する傾向があるが、スルファチド
の添加により血液脳関門透過性のリポソームも開発され
た。これにＤ−グルコースオキシダーゼを封入したもの
は、先天的酵素欠陥症の治療に有効であることが知られ
ている。また、ヘモグロビンや鉄（ＩＩ）ポルフィリン
をリポソームに封入した人工赤血球なども提案されてい
る。ガン細胞と反応するモノクロナール抗体をリポソー
ムの表面に結合させ、内部に抗ガン剤を保持させてガン
細胞への指向性を持つ新薬剤型のミサイル療法も研究さ
れている。さらに、リポソームの免疫学への応用も研究
され、リポソームを血清中の抗体価測定や診断薬などと
して使用することも試みられている。

（発明が解決しようとする問題点） リポソームに内包された医薬、化粧品等の各種薬剤は、
通常、静注、筋注、皮下性、経口投与、皮膚への塗布な
どの方法で使用されるのであるが、水分散リポソームの
保存過程での安定性は重要である。しかも−旦使用に供
した場合は人体の所定部位ですみやかに内容物が放出さ
れるようなインテリジェントな機能を持ったリポソーム
の開発が現在非常に望まれている。さらに、リポソーム
の形成材料としては当然無毒性のものが必須の条件とな
ってくる。本発明者らが開発しようとする機能性リポソ
ームはｐＨが中性に近い酸性側では安定に内部含有薬剤
をキープするがｐＨで６．２以上、特に７．２．８．２
とわずかにアルカリ性になると薬剤の放出が増加するよ
うな高機能をもったものである。

すなわち１人体での胃のｐＨは１〜６、多くの場合１〜
４であり、腸は胆汁などの分泌によりｐＨ７，０〜７．
２となる。又皮膚のｐＨは６．０〜６．５、涙液８．２
周辺であり、血液のｐＨは７．２〜７．４とされている
。これらｐＨの変化に対応した薬剤の放出を制御するこ
とを可能にするようなリポソームの製造開発はいまだな
されておらず、その開発が特に要望されている。

（問題を解決するための手段） このような事情に鑑み、本発明者らは従来の欠点を克服
した新規なリポソーム壁材を開発するため鋭意研究を行
なった結果、Ｎ−アシルホモセリン及び（又は）Ｎ−ア
シルホモセリンラクトンを、他の一般的なリポソーム壁
膜構成成分であるリン脂質とともに用いることにより、
安定なリポソームを形成させることができ、そして、こ
のリポソームに薬剤を封入したものはｐＨを変えること
により、内部薬剤の放出速度を調節し得ることを見出し
、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、壁膜がＮ−アシルホモセリン及び
（又は）Ｎ−アシルホモセリンラクトンを含有すること
を特徴とするリポソームを提供するものである。

本発明で用いるＮ−アシルホモセリン及びＮ−アシル−
ホモセリンラクトンにおけるアシル基としては、炭素数
８〜２２のものが用いられ、好ましくは炭素数１０〜１
８の飽和若しくは不飽和の高級脂肪酸由来のアシル基が
用いられる。

本発明におけるリポソームの形成方法は特に制限されな
いが、従来より公知の方法を採用できる。

このような公知の方法の詳細については、例えば菊池室
、井上圭三、「細胞工学」ス、１１３６（１９８３）、
石井文由、佐々木一部、「フレグランスジャーナル」旦
、１００（１９８８）、野呂俊−１石井文由、「薬局Ｊ
、３５，１１９３；１３２９（１９８４）等に詳述され
ている。

本発明におけるリポソームのリン脂質壁材料は、水中で
ラメラ液晶を形成するような二鎖型界面活性剤で、条件
により二分子膜構造を有する閉鎖小胞体を安定に生成す
るもの、例えば、リン脂質分子とＮ−アシルホモセリン
及び（又は）Ｎ−アシルホモセリンラクトンとの混合物
を用いる。またこの混合物には、二分子膜を補強するた
めにコレステロールを添加することができる。さらに荷
電物質としてリン酸ジセチルやステアリルアミン等を添
加してもよい。リン脂質としては、一般に使用されてい
るものを単独又は混合物の形で用いることができる。Ｎ
−アシルホモセリン及び（又は）Ｎ−アシルホモセリン
ラクトンの使用量は、全壁膜に対するモル２で、５〜３
０％、好ましく　１０−２０％の割合である。

次に具体的に本発明のリポソームの製造法について説明
すると、　１００＋ｎ１ｌｌのナス型フラスコにモル比
で７０：２０：１０又は５０：：４０：１０などの割合
で卵黄レシチン：コレステロール二Ｎ−アシルホモセリ
ン及び（又は）Ｎ−アシルホモセリンラクトンを秤量す
る。

これを低沸点の良溶媒ならば何でも使用できるが、通常
クロロホルム、ジクロロメタン、エーテル、メタノール
、エタノールなどやそれらの混合溶媒を用いて溶解する
６油溶性の薬剤を包含させる時はこの段階で薬剤を添加
して溶解する。その後、エバポレーターで溶媒を除き減
圧乾燥する。この中に蒸留水又はｐＨ５，２又はそれ以
下の緩衝液を適当量加えて、ポルテックスミキシング法
又は超音技法により振動を与えてリポソームの水分散液
を作り、リポソームの疎水脂質部に油溶性薬剤や化粧品
となるべき油溶性物質をトラップする。トラップされて
いない薬剤はゲル濾過法、透析法、遠心分離法などで取
除く。又水溶性の薬剤をリポソームに内包させる場合に
は、前記と同様に卵黄レシチン：コレステロール二Ｎ−
７シルホモセリン及び（又は）Ｎ−アシルホモセリンラ
クトンを秤量、溶解、乾燥した後、蒸留水又はＰ）１５
．２又はそれ以下の緩衝液に薬剤を溶解して加え、以下
同じ手法でリポソームを形成し、外水相に存在する薬剤
を除くためにゲル濾過法、遠心分離法、透析法などの処
理を施す、これにより、内水相に薬剤を含むリポソーム
を得る。リポソーム壁材の重量は水に対し０．１〜３重
量％である。本発明のリポソームはｐＨ感受性があるた
め、ｐＨ６以上の中性及び弱アルカリ性でも、内包され
た薬剤がリポソームの崩壊によりゲル濾過、遠心分離な
どの過程で流出してしまうので、リポソームの製造に際
しては、ｐＨ５，２以下の緩衝液を用いるのが望ましい
。

本発明者らの実験においてはリポソームに内包された薬
剤の流出速度が非常に精密に測定できるように、蛍光物
質のカルセインを薬剤の代替物として用いた。本発明の
リポソームはｐＨ６以下の環境においては内包した薬剤
を安定に保持しつづけるが、Ｐ）ｌが６以上になった時
に薬剤の放出をはじめる機能を有するものである。

次に、Ｎ−アシルホモセリンの合成に関して説明すると
、原料となるホモセリンは脂肪酸と反応する活性基とし
て水酸基、アミノ基があり、更には脂肪酸クロリドと反
応するカルボキシル基があるので、アミノ基だけに脂肪
酸を反応させる為には特殊な方法が必要である。すなわ
ち、１，３−チアゾリジン−２−チオンと、希望する脂
肪酸クロリドとの反応によりＮ−アシルチアゾリチン−
２−チオンを得、ついでこの物質とホモセリンとの反応
により目的物のＮ−アシルホモセリンを得る。この反応
はすべて室温で進行するため副反応が少なく収率は非常
に良い。Ｎ−アシルホモセリンラクトンはＮ−アシルホ
モセリンの脱水により得られる。Ｎ−アシルホモセリン
ラクトンは、これをエチルアルコールに溶解させ、緩衝
液によりＰＨを４〜１０まで変えると。

酸性側でラクトン、アルカリ側でカルボキシル基のアル
カリ金属塩となり、ｐＨの変化で分子の化学構造が変化
する。

本発明によりＰＨ感受性リポソームができる主な原因は
、Ｎ−アシルホモセリンがｐＨの酸性においてもホモセ
リンラクトン型となり、水に殆んど不溶性で、バルキー
な分子となり、アルカリ性において５分子内に存在する
カルボキシル基がアルカリ金属塩となり、水にかなり溶
解し界面活性を有することに起因するものと考えられる
。

本発明において使用されるリン脂質としては、例えば、
卵黄レシチン、卵黄ホスファチジルコリン、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィ
ンゴミエリン、ジセチルリン酸、ホスファチジルグリセ
ロール、ホスファチジン酸、アゾレクチン、Ｌ−α−ジ
パルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルイ
ノシトール及びこれらの混合物をあげることができる。

要はリポソームを形成することのできるリン脂質であれ
ば何でも用いることができ、さらに、ショ糖エステル、
ラムツリピッド、スピクルスポール酸アルキルアミン塩
、ジオクタデシルジメチルアンモニウムプロミドなど天
然や人工ベシクル形成材料も用いることができる。

（発明の効果） 本発明のリポソームは天然由来及び（又は）人工の物質
からなる壁膜を有し、生体安定性が高く、ＰＨ６以下で
保存した場合、卵黄レシチン等の通常の標準的材質から
なるリポソームと同様に安定で、内包する薬剤は放出さ
れず、化学的、コロイド化学的に長期安定である。

一方、本発明のリポソームにおいては、リポソームの外
水相の環境がｐＨ６以上になると、リポソームに内包さ
れた薬剤は徐々に放出され、ｐＨ値が７〜８となるにつ
れて放出の速度が増大する。リポソームに封入する薬物
としては油溶性、水溶性のいずれも使用され、本発明の
リポソームは、薬剤等を封入した徐放性、機能性の新薬
剤型リボソ−ムとして好適なものである。

本発明のリポソームは消化液のｐｌ（６以下では安定に
薬剤を保持し、ｐＨ６以上において徐々に薬剤が放出さ
れるので、胃内安定保護に好適である。

また、腸内に到達し、ｐＨが６．２−７に達した時に薬
剤の放出がはじまる機能を有しているので、経口投与に
も、経皮投与にも好適である。化粧品用リポソームとし
ては、ビタミンＣ，Ｅなどを内包したものを挙げること
ができる。

本発明で用いるＮ−アシルホモセリン及び（又は）Ｎ−
アシルホモセリンラクトンは、生体由来の無毒性アミノ
酸と脂肪酸を用いて、アシル化反応により得られたもの
で、安定性及び安全性の高い物質である。また１本発明
のリポソームも安全性の高いものである。

（実施例） 次に本発明を実施例に基づき、さらに詳細に説明する。

参考例Ｉ Ｎ−アシルホモセリン及びＮ−アシルホモセリンラクト
ンの合成は以下の手順で行なった。

ＩＱの三ツロ丸底フラスコに１，３−チアゾリジン−２
−チオン２６ｇ、トリエチルアミン４４．１２ｇ、ジク
ロロメタン５００ｄを秤量する。反応系を撹拌しながら
塩化バルミトイル６５．９１ｇを分液ロートから滴下す
る。反応系に水分が入らないように塩化カルシウム管で
シールし、室温で３日間反応を行なった。

反応過程で反応系から少量のサンプルを取り、薄層クロ
マトグラフにより反応物、未反応物の点検を行ない、反
応率の点検を行なった。反応終了後、反応系に生成した
トリエチルアミン・塩酸塩を濾別し、濾液をアルカリ性
水溶液で洗い、ジクロロメタン層に溶解しているＮ−バ
ルミトイル１，３−チアゾリチン−２−チオンを溶媒の
蒸発とアセトンによる再結晶で取得した。収量６５ｇ、
融点６０．５〜６１．０℃、収率８３％。

次にホモセリン０．９１６ｇ、　Ｎ−バルミトイル１，
３−チアゾリチン−２−チオン２．５ｇ、トリエチルア
ミン１．０６ｇを、テトラヒドロフランと水の１：１混
合溶媒３００ｄに溶解し、室温で４８時間撹拌反応させ
た。反応後溶媒を除き１弱塩酸水溶液を加え、系を酸性
とした後酢酸エチルを加え白濁したＮ−バルミトイルホ
モセリンを得た。これをエタノールで再結晶した。収量
１．３７ｇ、収率５４．８ｇ、融点１２６〜１２７℃。

上記と同じ方法により、脂肪酸塩化物をラウロイルクロ
リド、カプリロイルクロリドに変えて反応させることに
より、それぞれに相当するＮ−ラウロイルホモセリン、
Ｎ−カプリロイルホモセリンを得た。

各Ｎ−アシルホモセリンラクトンは、Ｎ−アシルホモセ
リンをキシレンに溶解し、９５℃において脱水しながら
エバポレーターで水とキシレンを除去することにより、
１００％の収率で得られた。

実施例１ 卵黄レシチン２６．１ｍｇ、コレステロール３　、９ｍ
ｇ、参考例１で合成したＮ−バルミトイルホモセリン１
．７９ｍｇ　（モル比７：２：１）を５０−容ナス型フ
ラスコに秤量し、ジクロロメタン・メタノール混合溶媒
（容積比３：２）５ｍ１２を加えて溶解させた。

次にこのナス型フラスコをロータリーエバポレーターに
接続して溶媒を除き、フラスコ内壁に薄膜を張り、更に
デシケータ−に入れて減圧下１時間乾燥した。この後４
　Ｘ　１０−’ｍｏｆｆｉ／１２の濃度になるようにｐ
ＦＩ５．２の緩衝液を用いて溶解したカルセイン（蛍光
塗料）溶液５ｍ１２を加え、ポルテックスミキサーで２
０分間振動し、いくらか白濁した黄色の懸濁液を得た。

この液をｐｉ（５，２の緩衝液を用いて、セファデック
スＧ−５０のカラム（径２０ｍｍ、高さ２５０ｍｍ）に
よりゲル濾過し、フラクションコレクターに分取し、各
フラクションにつき蛍光強度を測定した。

はじめに流出するカルセイン内包リポソームと外水相に
あるカルセインは完全に分離し、蛍光強度は二つのピー
クに分離した。はじめに流出したフラクションのピーク
部分がカルセイン内包リポソームで、内包されないカル
セインとは完全に分離して後のフラクションとして流出
した。カルセイン内包リポソームは、コールタ−Ｎ−４
サブミクロンパーチクルアナライザーにより、レーザー
光を用いて粒子径分布を測定したところ、平均粒径２９
３ｎｍであった。蛍光測定は４８０ｎｍを励起光とし、
５２０ｎｍでのカルセインの極大エミッション波長での
強度を測定した。リポソーム内水相にカルセイン蛍光色
素が封入されたことを確認するため、リポソーム分散液
３．５−をとり、これに１０％トリトンＸ−１００（ポ
リオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル）水溶
液１００μＱを加えた試料の蛍光強度は、水を加えて同
じ容積としたリポソーム溶液に比較して２倍以上の強度
を示した。この事実により蛍光色素がリポソーム内に封
入されていることが確認された。この実験の原理は、リ
ポソーム内水相に封入された蛍光色素は、はじめから濃
厚な状態にあるため、５２０ｎｍのカルセインの特性吸
収が濃度消光の性質により、わずかしかａ察されないの
に対し、リポソームがトリトンＸ−１００により破壊さ
れ、カルセインが外水相に流出し、そして外水により希
釈されることにより５２０ｎｍの蛍光が強度を増大させ
てｗｔ察されるという高濃度自己消光を利用したもので
ある。

さらに前記リポソーム懸濁液は室温に放置して、毎日２
回づつ蛍光強度測定を行なったが、経時的な強度の変化
は３週間みられなかった。

又リポソームの懸濁液を遠心分離機で水の部分とリポソ
ーム部分とに分離し、リポソームだけを減圧乾燥して赤
外吸収スペクトルを測定した。吸収スペクトル中には１
７８０ｃｍ−”にラクトン環特有のカルボニル吸収が存
在した。この事はＮ−バルミトイルホモセリンが減圧乾
燥によって容易にラクトンを生成し、Ｎ−バルミトイル
ホモセリンラクトンに変換すること、およびリポソーム
の壁膜にＮ−バルミトイルホモセリンが組込まれている
事実を実証するものである。

実施例２ Ｎ−バルミトイルホモセリン１０ｍｏｎ％、卵黄レシチ
ン７０ｍｏ１２％、コレステロール２０ａ＋ｏＱ％の組
成からなる、４　Ｘ　１０”’ｍｏＱ＃Ｉ濃度のカルセ
イン蛍光色素を含むリポソーム（Ａ）水分散体を実施例
１にならい作製した。

この場合、内水相も外水相もｐＨ５，２の緩衝液を用い
た。又同時にＮ−バルミトイルホモセリンを含まず、ジ
セチルホスフェート（ＤＣＰ）　１　、９３ｍｇ、卵黄
レシチン２６．１ｍｇ、コレステロール３．９ｍｇ（モ
ル比１ニア＝２）からなるカルセイン濃厚液（４Ｘ　１
０−’ｎｏΩ／１２）を内包するリポソーム（Ｂ）を実
施例１の方法で調製した。

このリポソーム（Ａ）および（Ｂ）につき外水相のｐ）
Ｉを水酸化ナトリウム、塩酸を滴下することにより幅広
＜　（ｐＨ４〜１０）変化させて、カルセインの流出速
度を蛍光強度の測定により３０分ごとに観察した。リポ
ソーム（Ａ）水分散体では外水相ＰＨが５．２及びそれ
以下ではカルセインの洩れは１週間以上熱＜ｐＨ６，２
の場合徐々に蛍光色素は流出し、５時間で内水相に閉じ
込められたカルセインの１２％、１０時間で２８％が外
水相に流出した。ｐＨ７，２の場合５時間で８０％。

１０時間で１００％が流出した。　ｐＨ８，２の場合は
５時間で９４％、８時間で１００％が流出した。この同
じ実験において、標準リポソーム（Ｂ）ではｐＨを２．
２〜８．２の間に変化させても、外水相へのカルセイン
の漏れは、−週間の測定ｗｌ祭を通じても認められなか
った。

実施例３ 実施例１において、卵黄レシチン−コレステロール−Ｎ
−バルミトイルホモセリンの配合を６：３：１モル比に
変え、その他はすべて同じ方法で調製したカルセイン含
有リポソームは実施例２に示したｐＨ感受性と同じ傾向
のｐ）ｌ感受性を示した。

実施例４ 実施例１において用いたＮ−バルミトイルホモセリンの
かわりにＮ−バルミトイルホモセリンラクトンを１０ｍ
ｏＱ％使用して調製したリポソームは実施例２に示した
ｐＨ感受性と同じ傾向のｐＨ感受性を示した。

実施例５ 実施例１において用いた卵黄レシチンのかわりにジパル
ミトイルホスファチジルコリン２１　、６ｍｇを用い、
他の成分は実施例１と同じにして、蛍光色素を内包する
リポソームを得た。実施例１においてポルテックスミキ
サーで振動するかわりに超音波発生装置を用い、温度を
５０℃付近に保ちながら。

超音波振動を１０分間与えることによりリポソームをｙ
４製した。ジパルミトイルホスファチジルコリンの相転
位温度が４５℃と高いため、リポソームの調製温度も相
転位温度以上の温度が必要とされているためである。得
られたリポソームは実施例２に示したｐＨ感受性と同じ
傾向のｐｏ感受性を示した。

コールタ−Ｎ−４型すブミクロンパーチクルアナライザ
ーによる粒子径分布は、平均粒子径３８０ｎｍであった
。

実施例６ 卵黄ホスファチジルコリン２０．４Ｂ、コレステロール
４．４ｍｇ、　Ｎ−ラウロイルホモセリンラクトン１．
１■を５０−容ナス型フラスコに秤量し、実施例１と同
じ方法でカルセイン濃厚液を内包するリポソームを調製
した。リポソーム水分散体をマイクロフルイダイザー中
に通し、加圧濾過することにより粒子径分布の狭い、中
心粒径１７８ｎｍが９５％、標準偏差値５３ｎｎ＋のリ
ポソームを得た。このリポソームも実施例２に示すｐＨ
感受性を示した。

復代理人 弁 理 士 池 浦 敏 明

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）壁膜がＮ−アシルホモセリン及び（又は）Ｎ−ア
   シルホモセリンラクトンを含有することを特徴とするリ
   ポソーム。
2. （２）薬剤を含有させた請求項１のリポソーム。