JPH0296630A - 試料の調製方法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野］ 本発明は１例えば遺伝子診断や病原性生物の感染の診断
等の臨床検査に用いられる核酸を含んでなる試料の調製
法と、それによって得られる核酸を含んでなる臨床検査
用試料に関する。

［発明の背景］ 核酸は、生体内に於いて遺伝情報の保存、発現に関与す
る高分子物質であり、遺伝子を構成するデオキシリボ核
酸（以下、ＤＮＡと略記する。）及び遺伝子の形質発現
の担い手であるリボ核酸（以下、ＲＮＡと略記する。）
に大別される。

分子生物学の分野では、近年、生物体の機能や複製のメ
カニズムを解明するのに生物体の有する遺伝情報を明ら
かにすることが必須となり、それに伴い、組織或は体内
物質中に特定の遺伝情報を担う遺伝子（ＤＮＡ）或は遺
伝情報を発現するための特定のＲＮＡ等の核酸が存在す
るか否かを判定したり、更には目的とする遺伝子を選択
した後採取する等、所謂、遺伝子のスクリーニングが頻
繁に行われるようになってきている。

このような目的に利用するために、各種の試料から核酸
の分離が行われている。この核酸の分離方法としては、
　１）ホモジナイザー等による機械的な分離法、２）界
面活性剤や蛋白質変性剤による化学的な分離法、３）酵
素を用いる生物学的な分離法、４）これらを組み合わせ
た分離法等が挙げられるが、核酸は鎖状の高分子物質で
あるので機械的に切衛され易く、一般には２）、３）或
は４）の方法が好ましく用いられている。例えば、２）
の方法により核酸の分離を行う方法としては、例えばド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）、　Ｎ−ドデシルサル
コシン酸ナトリウム（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）等の陰イオン
界面活性剤、或は、例えばポリオキシエチレンオクチル
フェニルエーテル（商品名Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ−１００等
）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（商品名Ｂｒ１
ｊ　５８等）等の非イオン界面活性剤を含む溶液中に生
体試料を懸濁若しくは混合し、溶液中に核酸を遊離させ
た後、遊離した核酸を水飽和フェノール溶液、クロロホ
ルム溶液等を用いて精製する方法が一般に行われている
。また、陽イオン界面活性剤である臭化セチルトリメチ
ルアンモニウムが核酸と結合して沈殿性の複合体を形成
する性質を利用した植物のＤＮＡやファージのＤＮＡの
分離精製方法も知られている（Ｍ、Ｇ、阿ｕｒｒａｙ　
　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ
　　Ｒｅ５ｅａｃｈ。

８、４３２１頁、　１９８０；　Ｇ、Ｄｅｌ　Ｓａｌ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａａｉｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｃｈ、、１．１．１００４７頁、　１９８７：　Ｇ
、Ｍａｎｆｉｏｌｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｅｈ、　ｌｆｉ、　２
８７３頁。

１９８８等）。

一方、核酸のスクリーニングは、臨床診断上も重要な意
味を持っている。例えば、遺伝病の早期詮所、癌の分子
レベルでの診断或はウィルス等の病原性生物の検出等、
特定の遺伝子等の核酸の同定検査を行うことは大きな意
義があり、実用化に向けての研究が進められている。

上記した如き核酸の同定検査法の具体的な例として１例
えば、同定したい病原性生物をニトロセルロース膜上に
植苗し、寒天培地上で生育したものを試料として、プロ
テイナーゼに処理、ホルムアミド−３ＤＳ処理を順次行
った後、標識ＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼイ
ション法等により同定を行う方法（吉川、臨床検査、　
、ｌ！ｌｉ！、　１８２４頁、　１９８５等）、固定化
した生体組織を試料として、プロテイナーゼに処理、ポ
リオキシエチレンオクチルフェニルエーテル処理を順次
行った後、標識ＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼ
イション法等により癌遺伝子の検出を行う方法（守内ら
。

臨床科学、　ｎ、　１２５９頁、　１９８５等）、血清
を試料とし、プロテイナーゼに−５Ｄ　Ｓ処理１次いで
水飽和フェノール溶液、クロロホルム溶液等による抽出
を行うことにより得られる核酸溶液を、ニトロセルロー
ス膜上に固定化した後、ハイブリダイゼイション法等に
より血清肝炎ウィルスの検出を行う方法（Ｍ、Ｂｅｒｒ
＋ｉｎｇａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｅｄｉｃａｌ
　ＶｉｒｏｌＯｇＹ＋　Ｌ　５７頁、　１９８２；　Ｊ
、５ｃｏｔｔ、ｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｅｐａｔｏｌ’
ｇＶｔ　ｉｔ　２７９頁、　１９８３等）等が実施され
ている。

これらの方法のうち、培養した病原性生物や固定化した
生体組織を試料として用いる方法は、操作が煩雑で且つ
同定に時間を要するところからスクリーニングの目的で
実施するにはあまり実用的ではない。

一方、血清等の生体体液や生体組織等の試料から分離し
た核酸を、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の疎水性
の固相上に固定化したものを用いて、種々の核酸同定検
査を行う方法は、比較的操作が簡便で短時間で実施でき
るところから、遺伝子診断や病原性生物の感染の診断の
ための核酸同定検査の今後の主流となってくると考えら
れている。しかしながら、この方法に於いても、上記し
た如き従来から行われている分離方法により生体試料か
ら分離された核酸を試料として用いた場合には、ニトロ
セルロース膜、ナイロン膜等の疎水性の固相上に固定化
する際に、核酸の固定化率が著しく低下して、核酸の同
定に支障をきたす場合がしばしばあった。

［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので１例
えば遺伝子診断や病原性生物の感染の診断等の臨床検査
に用いられる核酸を含んでなる試料の効果的な調製法と
それによって得られた試料を用いた診断精度の高い遺伝
子診断法及び病原性生物の感染の診断法を提供すること
を目的とする。

［発明の構成］ 本発明は、生体試料を陽イオン界面活性剤を含有する溶
液と混合して生体試料中の核酸を陽イオン界面活性剤と
の複合体として沈殿させ１次いでこの沈殿物を分取して
高塩溶液に溶解し、然る後陽イオン界面活性剤を除去す
ることにより調製することを特徴とする。核酸を含んで
成る臨床検査用試料の調製方法及びそれによって得られ
る核酸を含んで成る臨床検査用試料の発明である。

また、本発明は、生体試料を陽イオン界面活性剤を含有
する溶液と混合して生体試料中の核酸を陽イオン界面活
性剤との複合体として沈殿させ、次いでこの沈殿物を分
取して高塩溶液に溶解し、然る後陽イオン界面活性剤を
除去することを特徴とする。生体試料からの脂質及び脂
質蛋白成分を実質的に含まない核酸の分離方法及びそれ
によって得られる脂質及び脂質蛋白成分を実質的に含ま
ない核酸の発明である。

更にまた、本発明は、生体試料より核酸を分離し１分離
された核酸を疎水性の固相上に固定化した後、固定化さ
れた核酸中に特定の遺伝子或は核酸由来のものが含まれ
ているか否かを検査することにより行う、遺伝子診断法
又は病原性生物の感染の診断法に於いて、生体試料を陽
イオン界面活性剤を含有する溶液と混合して生体試料中
の核酸を陽イオン界面活性剤との複合体として沈殿させ
。

次いでこの沈殿物を分取して高塩溶液に溶解し。

然る後陽イオン界面活性剤を除去することにより得られ
る核酸を含んで成る試料を疎水性の固相上に固定化する
ことを特徴とする遺伝子診断法又は病原性生物の感染の
診断法の発明である。

本発明者らは、遺伝子或は核酸診新法又は病原性生物の
感染の診断法に於いて、生体試料から分離された核酸を
ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の疎水性の固相上に
固定化する際に、その固定化が阻害され目的の核酸の検
出効率が低下する場合があるところから、その原因につ
き鋭意研究の結果、その原因が生体試料から核酸と共に
分離されてくるトリグリセライド、リポ蛋白、コレステ
ロール等の脂質及び脂質蛋白成分であることを見出した
。そこで本発明者らは、生体試料より核酸を分離する際
に脂質及び脂質蛋白成分が混入するのを防止し得る核酸
の分離方法につき鋭意研究の結果、生体試料を陽イオン
界面活性剤を含有する溶液（以下、分離溶液と略記する
。）と混合し、生体試料中に含まれる核酸を陽イオン性
界面活性剤との複合体として沈殿させ、この沈殿物を分
離して高塩溶液に溶解し、然る後に陽イオン界面活性剤
を除去すれば、生体試料に由来する脂質及び脂質蛋白成
分を実質的に含まない核酸が得られることを見出し本発
明を完成するに至った。

本発明に於いて用いられる陽イオン界面活性剤としでは
、一般に陽イオン界面活性剤として知られているもので
あれば特に限定されることなく挙げられるが、例えばオ
クタデシルアミン＃酸塩。

テトラデシルアミン酢酸颯、ステアリルアミン酢酸塩、
ラウリルアミン酢酸塩、ラウリルジェタノールアミン塩
酸塩等のアルキルアミン塩、例えば猛化オクタデシルト
リメチルアンモニウム、＠化ドデシルトリメチルアンモ
ニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチ
ルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルア
ンモニウム、メチル硫酸ラルリルトリメチルアンモニウ
ム。

塩化ベンザルコニウム、塩化テトラデシルジメチルベン
ジルアンモニウム、＠化オクタデシルジメチルベンジル
アンモニウム、塩化ラウリルジメチルベンジルアンモニ
ウム等の第４級アンモニウム塩、例えば塩化ラウリルピ
リジニウム、塩化ステアリルアミドメチルピリジニウム
等のアルキルピリジニウム塩等が好ましく挙げられる。

これらの陽イオン界面活性剤は、生体試料より核酸を遊
離させ且つその核酸と複合体を形成し得る濃度範囲で分
離溶液中含有されていればよく、特に限定されないが、
分離溶液中の濃度として、通常０．００１〜５％１／Ｖ
％の範囲で、好ましくは０．Ｏ１〜２　Ｗ／Ｖ％の範囲
で用いられる。また、これら陽イオン界面活性剤を、単
独で或は２種以上組み合わせて用いる等は任意である。

本発明に於いて用いられる分離溶液（Ｗ４イオン界面活
性剤を含有する溶液）の成分としては、上記した如き陽
イオン界面活性剤以外に、例えば硼酸、リン酸、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）　、グ
ツド（Ｇｏｏｄ’ｓ）等の緩衝剤、例えばエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のＤＮａｓｅの阻害剤、例え
ばジエチルピロカーボネート、ヒト脂質由来ＲＮａｓｅ
インヒビター等のＲＮａｓｅの阻害剤等が挙げられる。

また、要すれば、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム
、塩化マグネシウム。

塩化リチウム等の塩類等、更に要すれば、核酸の分離効
率を良くする目的で添加される、例えばプロテア−ゼ類 や、例えば子牛肝臓ＤＮＡ、サケ精子ｔＲＮＡ。

酵母ＲＮＡ等の担体用核酸類等が添加されていてもよい
。これらの分離溶液中の濃度としては、核酸と陽イオン
界面活性剤との複合体の形成を妨げない範囲であれば特
に限定されないが、緩衝剤は通常１〜５００　ｍ凡の範
囲が好ましく用いられ、阻害剤は、阻害剤の種類により
異なるため一概には規定できないが、例えばＥＤＴＡを
用いる場合には通常１〜２００ｍＭの範囲が好ましく用
いられる。また、塩類は通常１〜５００ｍＭの範囲で、
プロテアーゼ類は通常１μｇ／ｍｌ及至ｌｏｎｇ／ｍｌ
の範囲で、担体用核酸類は通常１〜５０μｇ　／　ｍ　
１．の範囲で夫々必要に応じて添加される。また、分離
溶液のｐＨとしては。

核酸と陽イオン界面活性剤との複合体の形成を妨げない
範囲であれば特に限定されないが、通常２〜１２の範囲
、好ましくは７〜・９の範囲が選択される。

本発明に於いて核酸と陽イオン界面活性剤との複合体を
溶解するために用いられる高塩溶液としては、核酸と陽
イオン界面活性剤との複合体を元の核酸と陽イオン界面
活性剤とに完全に解離させ得るものであれば、含まれて
いる塩の種類やその濃度は特に限定されないが、例えば
塩化ナトリウム、酢酸アンモニウム、＃酸ナトリウム等
の０．６〜２Ｍの溶液が好ましく用いられる。

本発明に於いて、核酸と陽イオン界面活性剤との複合体
を溶解した高塩溶液（以下、核酸高塩溶液と略記する。

）中から陽イオン界面活性剤を除去する方法としては、
例えば核酸高塩溶液に、エチルアルコール、イソプロピ
ルアルコール等のアルコール類を添加し、核酸を特異的
に沈殿させることにより陽イオン界面活性剤と分離する
方法や核酸高塩溶液中の陽イオン界面活性剤をクロロホ
ルム、ジエチルエーテル等の有機溶媒により抽出する方
法等が挙げられる。尚、界面活性剤を分離した後、必要
に応じて、再溶解→再沈澱等の精製操作を繰り返す等は
任意である。

本発明に於いて用い得る生体試料としては、同定したい
核酸が含まれていると考えられるものであれば特に限定
することなく挙げられるが、具体的には１例えば血液、
血清、血漿、Ｍ液、精液。

唾液、涙、尿、糞便１組織（生検、側体材料）。

末梢血の白血球分画等が挙げられるが１本発明の調製方
法或は分離方法は、特に脂質及び脂質蛋白成分を多く含
む血液、血清、血漿、ｗ液、精液等の生体試料からの核
酸を含んで成る臨床検査用試料の調製、或は核酸の分離
に特に効果的である。

本発明のｖＲｉｇ方法により調製された核酸を含んでな
る試料或は本発明の分離方法により分離された核酸は、
核酸同定検査用、ポリメラーゼチエイン　リアクシコン
法（ＰＣＲ法）用等の核酸として利用し得るが、特に核
酸同定検査の目的に用いた場合には、脂質及び脂質蛋白
成分が殆ど含まれていない点が大きな利点となる。即ち
、先にも述べたように、核酸の同定検ｉを行う際には１
通常ニトロセルロース膜、ナイロン膜、酵素免疫測定法
（ＥＩＪＳＡ）用のプラスチックプレート等の疎水性の
固相上に試料の核酸を固定化するが、この際に脂質及び
脂質蛋白成分が共存していると、上記した如き固相への
核酸の固定化が妨げられ、目的の核酸の検出精度が著し
く低下する場合があるが、本発明のｌＪＲ製方法により
調製した核酸を含んで成る試料或は本発明の分離方法に
より分離した核酸中には、脂質及び脂質蛋白成分が殆ど
含まれていないので、このような現象は殆ど生じない。

本発明の詮所方法は、本発明のｍ製方法により調製した
核酸を含んで成る試料を、核酸同定検査のために用いる
点が大きな特徴であり、それ以外の核酸同定検査を行う
ための操作法や、そのために用いられる試薬類、或は操
作時の温度ｙＰＨ等の諸条件は自体公知の方法に従って
これを行うことで足りる。即ち、本発明の方法によりａ
ｌ製された試料をニトロセルローズ膜、ナイロン膜、酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）用のプラスチックプレート
等の疎水性の固相上に固定化する場合にはドントプロツ
ター等を用いる自体公知の固定化方法（Ｃ，Ｋａｆｔｏ
ｓ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
、、Ｚ、　１５４１頁、１９７９；　Ｓ、Ｔｏｍａｓ、
Ｐｒｏ、Ｎａｊ：、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７、
５２０１頁、１９８０等）或はＥＬＩＳＡ法に於いて行
われる自体公知の固定化方法（酵素免疫測定法、北用常
廣ら編、共立出版（株）、　１９８７等）に準じて行え
ば足りるし。

固定化された核酸中に目的の核酸が含まれているか否か
の検出は、目的の核酸と相補的なＤＮＡプローブを用い
る自体公知のハイブリダイゼンション法（Ｎ、　Ｒｅｎ
ｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅ４ｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、、　ｆｇ。

３４３５頁、１９８４；Ａ、Ｄ、Ｎｙｅｇａａｒｄ　ａ
ｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ。

ｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｓｕｎ、、、ｕ、　９８頁、
　１９６３等）ｔｅｌ、は目的の核酸に特異的な抗体を
用いる免疫学的測定法（酵素免疫測定法、北用常廣ら編
、共立出版（株）、１９８７等）等に準じてこれを行え
ば足りる。

ハイブリダイゼンション法に於いて用いられるＤＮＡプ
ローブは、目的とする核酸に応じて、それと相補的なり
ＮＡに自体公知のＤＮＡのｗ識法（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ　ｅｔ　ａｌ＋、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ
ｚ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２等）に準じて適当なＷ＊を
行ったものを用いれば足りる。

ＤＮＡプローブに用いられる、目的の核酸に相補的なり
ＮＡは自体公知のＤＮＡのｍｉａ方法（Ｔ、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ
ｎｚ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ（Ｈａｒｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２等）に準じて調
製したものを用いれば足りる。

また、上記のハイブリダイゼイション法に於いては、ハ
イブリダイゼイシゴン用の市販試薬である、ラベザイム
ーＰＯＤセット（和光純薬工業（株）陽）　、ニックト
ランスレイジョンキット（ベセスダ　リサーチラボラト
リーズ社ｍｌ）　、ブルーシーンキット（ベセスダリサ
ーチラボラトリーズ社Ｉ！１）等を利用して実施するこ
とも当然可能である。

本発明の、核酸を含んで成る試料の調製方法は、生体試
料を陽イオン界面活性剤で処理する点に大きな特徴を有
するが、陽イオン界面活性剤の代りに陰イオン界面活性
剤や非イオン界面活性剤を用いても本発明の如き効果、
即ち、本発明の調製法で調製した核酸を含んで成る試料
中には、脂質及び脂質蛋白成分を多く含む生体試料から
調製した場合でも、これら脂質及び脂質蛋白成分が殆ど
混入されてこないという効果は得られない。

尚、陽イオン界面活性剤は、植物のＤＮＡや培養された
ファージのＤＮＡの分離精製等の目的で用いられている
例はあるが、本発明の如く、生体試料、とりわけ脂質及
び脂質蛋白成分を多く含む血液、血清、血漿、髄液、精
液等の生体試料からの核酸の分離に利用された例はこれ
までにない。

以下に実験例及び実施例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明するが１本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。

［実施例］ 実験例１゜ 新鮮ヒト血清に、Ｂ型肝炎ウィルス（以下、　ＨＢＶと
略記する。）由来（７）ＤＮＡ　（ｔＦ、）ＩＢＶＤＮ
Ａと略記する。）を添加したものを、プロテイナーゼＫ
及びＳ　Ｄ　Ｓを含む溶液で処理した後、水飽和フェノ
ール溶液処理、クロロホルム処理をして試料溶液を得た
。これをニトロセルロース膜上に常法に従って固定化し
、ハイブリダイゼイション法によりＨＢＶＤＮＡの検出
を行ったところ、検出感度が著しく低下する試料が見出
された。そこでこのような現象が生じる原因について検
討を行った。

（試料） 上記の実験時に、ＨＢＶＤＮＡの検出感度が著しく低下
したヒト血清（）ＩＢＶＩ）ＮＡは未含有、）を試料と
した。

（核酸溶液） 試料１００μｌと、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液［ｐ
Ｈ６，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１．０％ＳＯＳ、５．
０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（メルク社製）含有。以
下、　ＳＡ緩街液と略記する。コにＨＢＶＤＮＡ　（武
田薬品工業（株）社中央研究所より入手）を２００μｇ
／ｍｌとなるように添加した溶液１００μｌとを混合し
、６５℃で１時間保温した。

この溶液に水飽和フェノール２００μｌを加え、５分間
激しく振盪した後、更にクロロホルムとイソアミルアル
コールとの混合液（２４：１）　２００μｌを加えて、
５分間激しく振盪した。この混合液を１２．０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心後、上層（水７１１１）を分取し、こ
れに３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）５０μｌ
を加えてよく混合した。この混液に冷エタノール（−２
０℃）５００μｌを加えて混合し、−２０℃で１５分間
静置した。これを１２，０ＯＯｒｐ＋ｍで２０分間遠心
した後、上清を除き、沈殿を真空中で乾燥した。この沈
殿を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ′ａｌｉ液（ＰＨ８，０，１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ含有。

以下、　ＴＥ緩衝液と略記する。）１００μｌに溶解し
て。

核酸溶液とした。

尚、　ＨＢＶＤＮ、Ａを含まないＳＡ緩街液を用いて同
様の操作を行って、対照溶液を得た。

（■り定操作） 分光光度計（ベックマン社製、ＤＯ−４０型）を用いて
、核酸溶液及び対照溶液の吸取曲線を測定した。

澗定結果を第２図−ａ及びｂに示す。尚、第２図のａは
核酸溶液により得られた結果を、ｂは対照溶液により得
られた結果を夫々示す。

第２図−ａの吸取曲線に於いては、ＨＢＶＤＮＡ由来の
ピーク（２８０ｎｍ）以外の夾雑物があることを示すシ
ョルダー（２７Ｏｎｍ付近）が観察され、そのショルダ
ーの位置は、第２図−すの吸収曲線の２７０ｎｎ＋付近
のピーク位置とほぼ一致した。また、図には示していな
いが、試料として、精製水を用いて対照溶液のａＩ調製
法同様に処理することにより得られた溶液では、２４０
〜２８０ｎｎにかけてのピークは観察されなかった。

このことから、本実験例の核酸溶液の調製法によれば、
ヒト血清から核酸以外の成分も抽出されてくることが判
る。

ヒト血清中の成分のうち、　２７Ｏｎｍ付近に吸取を持
ち、本実験例の核酸溶液のａ製法により抽出される可能
性があるものとして、脂質並びに脂質蛋白成分が予想さ
れた。

そこで、ヒト血清の代りにヒト由来β−リボ蛋白（和光
純薬工業（株）製、以下−ＬＰと略記する。

）の５０ＯＢ／ｍｌ溶液と、ニワトリ卵黄由来トリグリ
セライド（和光純薬工業（株）製、以下、ＴＧと略記す
る。）の１００＋ａに／＋ａｌ溶液を試料として、対照
溶液の調製法により、ＬＰ対照溶液とＴＧ対照溶液を陽
製し、各々の吸収曲線を採取した。結果を第３図−ａ及
びｂに示す。尚、第３図−ａはＬＰ対照溶液により得ら
れた結果を、第３図−ｂはＴＧ対照溶液により得られた
結果を夫々示す。

この結果から明らかな如＜、ＬＰ溶液やＴＯ温溶液試料
とした場合、本実験例の調製法により得られる溶液中に
は、　２７Ｏｎｍ付近にピークを有する成分が抽出され
ていることが判る。また、ＬＰ溶液やＴＯ温溶液組成か
ら考えて、このピークはＬＰやＴＧ等の脂質並びに脂！
ｆｆｌ白成分に由来するものと考えられた。

実験例２６ 実験例１の結果から、実験例１の調製方法により核酸溶
液を調製した場合には、試料である血清から核酸以外の
成分が抽出されてくることが判明し、それが脂質並びに
脂質蛋白成分である可能性が示唆された。

そこで、核酸のニトロセルロース膜への固定化を妨害す
る物質が、脂質並びに脂質蛋白成分であるか否かについ
て検討を行った。

（試料） 以下のものを試料とした。

・１００Ｂ／ｄｌ　グルコース溶液 ・１　ｍｇ／ｄｌ　　ヘパリン溶液 ・１ｍ区／ｄｉ　　グリコーゲン溶液 ・４００Ｂ／ｄｉ　Ｌ　Ｐ溶液（和光純薬工業（株）製
）・１００ｍｇ／ｄｌ　Ｔ　Ｇ溶液（和光純薬工業（株
）製）（操作法） ｉ）核酸溶液のｍｇ！ 上記の試料と所定の）ＩＢＶＤＮＡを含むＳＡ緩街液を
用いた以外は、実験例１と同様の操作により核酸溶液を
得た。

尚、試料の代りに滅菌水を用いて同様の操作を行い対照
溶液を得た。

ｉ　ｉ　）　核１１１のニトロセルロース膜への固定化
核酸を一本鎖とするために、上記の方法により得られた
核酸溶液に、ＩＮ　ＮａＯＨ溶液５０μｌを添加し、１
０分間静置後、ＩＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８，０，１゜
５ＭＮａＣ１含有）１００μｌと０．５Ｎ　ＨＣＩ溶液
（２，５Ｍ　ＮａＣ１含有）１００μｍを添加して中和
した。

得られた溶液全量を直ちに、ドツトプロッターにセット
しておいたニトロセルロース膜［シュライヒ＆シュエル
社ｍ−ａｘｓｓｃ溶液（０，９Ｍ　ＮａＣ１及び９０ｍ
Ｍクエン酸二ナトリウム　含有）で予め＠潤済］上に、
サンプルウヱルを通じて乗せた後、アスピレータ−によ
り吸引して、膜を完全に通過させた。膜をプロッターか
ら取り出し、風乾した後、８０℃で２時間加熱し、−本
ｔＲＤＮＡをニトロセルロース膜上に固定化した。

ｆｉｉ）ＤＮＡプローブの調製 陽　Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａとハイブリダイズし得るＤＮＡ
プローブとして、以下のものを調製した。

ＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ＾を、ニックトランスレイジョンキッ
ト（ベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ社１１ｆｆ）
の現品説明書に記載の方法に従ってビオチンｗ識したも
のをＤＮＡプローブとして用いた。

ｊｖ）ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼイションｉｉ
で得た一本鎖ＤＮＡを固定化したニトロセルロース膜を
、５０％ホルムアミド、１０Ｘデンハルト溶液（０，２
％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン。

０．２％牛血清アルブミン含有）　、　０．１％ＳＤＳ
を含む４ＸＳＥＴ緩債液（１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ緩衝液、Ｐ）１８．０．６００ｍＭ　ＮａＣ１，４ｍ
Ｍ　ＥＤ丁Ａ含有）　２０＋ａｌに浸潤し、３７℃で１
時間静置した。その後、５０％ホルムアミド、２×デン
ハルト溶液（０，０４％フィコール、０．０４％ポリビ
ニルピロリドン、０．０４％牛血清アルブミン含有）、
６％ポリエチレングリコール６０００．０．１％ｓｏｓ
、　ｉ、。

Ｏｕｇ酵母ＲＮＡを含む４ＸＳＥＴ緩暫液２ｍｌと共に
ポリ袋中に密封し、３７℃で１時間静置し、プレハイブ
リダイズさせた。次いで、これに、上記ｉｉｉで調製し
たＤＮＡプローブ１０μｍを１００℃、５分間処理によ
り変性させ、氷上で４℃に急冷したものを添加し、３７
℃で４時間ハイブリダイゼイション反応を進行、させた
。

ハイブリダイゼイション反応終了後、ニトロセルロース
膜を取り出し、６５℃で、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ緩衝液（ＰＨ７，５，３％牛血清アルブミン及び０．
１５ＭＮａＣ１含有）　１００ｍ１を用いて１時間連続
洗浄し、未反応のＤＮＡプローブを除去した。

ｖ）ＨＢＶＤＮＡの検出 ｉｖで得たＤＮＡプローブでハイブリダイゼイションさ
せたニトロセルロース膜を、ブルーシーンキット（ベセ
スダ　リサーチ　ラボラトリーズ社製）の現品説明書に
記載の方法に従って処理し、染色を行った。

（結果） 結果を第４図に示す。

この結果から明らかな如く、グルコース、ヘパリン及び
グリコーゲンの各溶液を試料として得られた核酸溶液で
は核酸のニトロセルロース膜への固定化に影響は見られ
なかったが、ＬＰ及びＴＧの各溶液を試料として得られ
た核酸溶液では核酸のニトロセルロース膜への固定化が
妨げられていることが判る。特にＬＰ溶液を試料として
得られた核酸溶液に於いては、　ＤＮＡプローブのニト
ロセルロース膜への非特異的な吸着が観察され、核酸溶
液中にＬＰが共存した場合には、特定の核酸の検出に特
に影響が大きいことが判った。

実験例３．陽イオン界面活性剤を用いた核酸溶液のＩＪ
Ｒ製 核酸と反応して沈殿性の複合物を生ずることが知られて
いる陽イオン界面活性剤を使用して核酸の精製を行い、
試料中の脂質並びに脂質蛋白成分が分離できるか否かを
検討した。

（試料） 実験例１で用いたヒト血清（ＨＢＶＤＮＡは未含有。）
及びＬＰ溶液（５００ｍｇ／ｄｉ）を試料とした。

（核酸溶液） 試料５０μｍ、２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液［
ＰＨ８，０，１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２％臭化セチ
ルトリメチルアンモニウム（陽イオン界面活性剤。以下
、ＣＴＡＢと略記する。）　、　１０ｍＭ　ＮａＣ１含
有。以下、ＴＣＥｆｉＷ液と略記する。　３１００μｍ
、及び子牛肝臓ｔ、ＲＮ＾を５０μ２／耐含むＴＥ緩衝
液５０μｍとを混合し、室温で１０分間静置した。この
溶液を１２，０ＯＯｒｐ＋ｎで１０分間遠心後、上清を
除去し、得られた沈殿を１．２Ｍ　ＮａＣ１溶液２００
μｍに溶解した９これにイソプロピルアルコール５００
μｌを加えて混合後、１０分間室温で静置した。この混
液を１２．０００ｒｐｍで２０分間遠心した後、上清を
除き、沈殿を真空中で乾燥した。この沈殿をＴＥ緩衝液
１００μｍに溶解して、核酸溶液とした。

尚、試料としてＬＰ溶液を用い、子牛肝臓由来ｔＲＮＡ
を含まないＴＥ緩賃液を用いて同様の操作を行って、対
照溶液を得た。

（１！ｌ定操作） 実験例１と同様の操作により行った。

（結果） 結果を第５図−ａ、ｂ及びＣに示す。尚、第５図−ａは
ヒト血清を試料として調製した核酸溶液により得られた
結果を、第５図−ｂはＬＰ溶液を試料として調製した核
酸溶液により得られた結果を、第５図−Ｃは対照溶液に
より得られた結果を夫々示す。

この結果から明らかな如く、陽イオン界面活性剤ＣＴＡ
Ｂを用いる本実験例の方法により核酸を分離した場合に
は、ニトロセルロース膜或はナイロン膜への核酸の固定
化を阻害する脂質並びに脂質蛋白成分が核酸と共に分離
されてくるのを防止できることが示唆された。

実験例４゜ 実験例３の結果に基づき、陽イオン界面活性剤であるＣ
ＴＡＢを用いた方法により生体試料から核酸を分離した
場合の、ニトロセルロース膜或はナイロン膜への核酸の
固定化効率を調べ、従来法であるＳＤＳ或はポリオキシ
エチレンオクチルフェニルエーテル（ＰＯＰＥ）を界面
活性剤として用いる方法により核酸を分離した場合のそ
れとの比較を行った。

（試料） 実験例１で用いたヒト血清（ＨＢＶＤＮＡは未含有。）
を試料とした。

（核酸溶液の調製） ｆ）ＣＴＡＢを用いた方法（ＣＴＡＢ法）試料５０μｍ
、４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｆｌ　Ｎ液（ｐＨ８，
０，２００ｍＭ　ＥＤＴＡ含有）５０μｌ、１ｏｏｏｐ
、　ｔｏｏｐｇ又は１０ｐｇの１１ＢＶＤＮＡ　ヲ含ｔ
７ＴＥ緩街液５０μｌ及び、１００　ｐ　ｇ／ｍｌ　子
牛肝臓ｆｌＲＮＡ、　０．４％　ＣＴＡＢ及び４０ｍＭ
　ＮａＣｌを含む溶液５０μｌとを混合し、室温で１０
分間静置した。この溶液を１２．ＯＯＯｒｐｍで１０分
間遠心後、上滑を除去し、得られた沈殿を１．．２Ｍ　
ＮａＣ１溶液２００μｍに溶解した。

これにイソプロピルアルコール５００μｍを加えて混合
後、１０分間室温で静置した。この混液を１．２，００
０ｒｐｍで２０分間遠心した後、上清を除き、沈殿を再
び１．２Ｍ　ＮａＣ１溶液２００μ■に溶解した。これ
に水飽和フェノール溶液２００μｍを加え５分間激しく
渦動した後、更にクロロホルムとイソアミルアルコール
の混Ｍ（２４：１）２００μｍを加え５分間激しく渦動
した。この混合液を１２．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心
した後、上ＮＩ（水Ｎ）を分取し、冷エタノール（−２
０℃）５００μｍを加えてよく混合し、−２０℃で一夜
放置した。これをを１２，０００ｒｐ＋ｏ、２０分間、
４℃で遠心し。

核酸を沈殿として口取した。得られた沈殿に７０１の冷
エタノール溶液（−２０℃）５００μｍを加え、軽く渦
動して沈殿物を洗浄した後、　１２，０００ｒｐｉ、１
０分間、４℃で遠心した。得られた沈殿を真空中で乾燥
し、この沈殿をＴＥＪｉｌｆｆ液５０μｍに溶解して、
ＣＴＡＢ法による核酸溶液とした。

１ｉ）ＳＯ３を用いた方法（ＳＤＳ法）試料５０μｍ、
１１００Ｏｐ、　１１００ｐ又はＩＯｐｇ　ノ陽ＢＶＤ
ＮＡを含むＴＥ緩街液５０μｍ及び５０℃１Ｍ＃酸ナト
リウム緩衝液（ＰＨ６，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．０
％　５０Ｓ、　２５ｐｇ／ｍｌ子牛肝臓ＤＮＡ、５０　
ｐ　ｇ／ｒａ１子牛肝臓し陽Ｎ＾及び５ｍｚ＃ｎｌプロ
テイナーゼに含有）１００μｍを混合し、６５℃で１時
間静置した。これに水飽和フェノール溶液２００μｍを
加え５分間激しく渦動した後、更にクロロホルムとイソ
アミルアルコールの混液Ｃ２４：１）２００μＪを加え
５分間激しく渦動した。この混合液を１２．０００ｒｐ
陽＋で２０分間遠心した後、上ＮＩ（水＃）を分取し、
冷エタノール（−２０℃）５００μｍを加えてよく混合
し、−２０℃で一夜放置した。これをを１２，０００ｒ
ｐｍ、２０分間、４℃で遠心し、核酸を沈殿として口取
した。得られた沈殿に７０％の冷エタノール溶液（−２
０℃）　ＳＯＯμｍを加え、軽く渦動して沈殿物を洗浄
した後、　１２．ＯＯＯｒｐｍ、　１０分間、４℃で遠
心した。

得られた沈殿を真空中で乾燥し、この沈殿をＴＥ緩街液
５０μｍに溶解して、ＳＯ５法による核酸溶液とした。

ｊｉｉ）ＰＯＰＥを用いた方法（ＰＯＰＥ法）ｉｉで用
いた５０ｍに酢酸ナトリウム緩衝液に含まれる１、０％
ＳＯＳを１．０％ＰＯＰＥとした以外は、　ｉｉと同じ
試薬を用い同様の操作により、ＰＯＰＥ法による核酸溶
液を調製した。

ｉｖ）標準核酸溶液 ＴＥ緩街液５０μｍに、　ＨＢＶＤＮＡを１１０００ｐ
、　１１００ｐ又は１０ｐｇ含むようにｍ製したものを
標準核酸溶液とした。

（核酸の固定化法） 実験例２と同様の操作法によりニトロセルロース膜上に
固定化した。

（ＤＮＡプローブの調製） 実験例２と同様の操作法により調製した。

（ハイブリダイゼイシゴン及び染色） 実験例２と同様の操作法により行った。

（結果） 結果を第１図に示す。

この結果から明らかな如＜、５０５又はＰＯＰＥを用い
る方法により調製された核酸溶液を泪いた場合には、核
酸のニトロセルロース膜上への固定化が阻害されている
ことが判る。一方、本発明に係るＣＴＡＢ法により調製
された核酸溶液を用いた場合には、標準核酸溶液を用い
た場合と同等な結果が得られ、　１０ｐにのＨＢＶＤＮ
Ａを検出し得ることが判る。

実施例１．Ｂ型肝炎患者血清中の）ＩＢＶＤＮＡの検出
（試料） Ｂ型肝炎患者血清及び、陽ＢＶＤＮＡを含むプラスミド
（ｐＨＢＶ９３３）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断断片（約
３　、２００塩基対）をヒト正常血清（ＨＢＶＤＮＡ末
含有）５０μｌ当りに４００ｐに、　２００ｐに、　１
００Ｐにｔ　５０ｐｇとなるように添加したものを試料
とした。

ｉ）核酸溶液の調製 試料５０μｍ、滅菌水９４μｍ、４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ
緩街液（ｐＨ８，０，２００ｍＭ　ＥＤＴＡ含有）５０
μｍ、サケ精子しＲＮＡのｌ　ｍｇ／ａ＋１溶液２μｍ
及び５０％ＣＴＡＢ溶液（０，５ＭＮａＣ１含有）４μ
ｍをよく渦動（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）　Ｌ／た後、室温で
１０分間静置した。

これを、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られ
た沈殿物を１．２Ｍ　ＮａＣ１水溶液２００μｍに溶解
した。この溶液にイソプロピルアルコール５００μｍを
添加し。

室温で１０分間静置した後、１２　、０００ｒｐｍで１
０分間遠心した。得られた沈殿を１．２Ｍ　ＮａＣ１水
溶液２００μｌに溶解した。この溶液に水飽和フェノー
ル２００μｌを加え、５分間激しく振盪した後、更にク
ロロホルムとイソアミルアルコールとの混合液（２４：
１）　２００μｍを加えて、５分間激しく振盪した。こ
の混合液を１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心後、上層
（水層）を分取し、これに３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ６，５）　５０μｌを加えてよく混合した。この混
液に冷エタノール（−２０℃）５００μｌを加えて混合
し５−２０℃で１５分間静置した。これを１２，０００
ｒｐｍで２０分間遠心した後、上清を除き、沈殿を真空
中で乾燥した。この沈殿をＴＥ緩街液５０μｍに溶解し
て、核酸溶液とした。

ｉｉ）核９のニトロセルロース膜への固定化得られた核
酸を一本鎖とするために、ｉで得た核酸溶液に、ＩＮ　
ＮａＯＨ溶液５０μｌを添加し、１０分間静置後、ＩＭ
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８，０，１，５Ｍ　ＮａＣ１含有
）１００μｌと０．５Ｎ　陽ｃＩ溶液（２，５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１含有）１００μｍを添加して中和した。

得られた溶液全量を直ちに、ドツトプロッターにセット
しておいたニトロセルロース膜［シュライヒ＆シュエル
社製、６　Ｘ　ＳＳＣ溶液（０，９Ｍ　ＮａＣ１及び９
０ｍＭ　クエン酸三ナトリウム含有）で予め湿潤済］上
に、サンプルウヱルを通じて乗せた後、膜を完全に通過
させた。膜をプロッターから取り出し、風乾した後、８
０℃で２時間加熱し、−本領ＤＮＡをニトロセルロース
膜上に固定化した。

１ｉｉ）ＤＮＡプローブのＩＭ製 ＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａとハイブリダイズし得るＤＮＡプ
ローブとして、以下のものを調製した。

常法により調製したＨＢＶＤＮＡの長鎖を組み込んだＭ
１３ファージＤＮＡを１μｇ含む水溶液２０μｍを９５
〜１００℃の水浴中に５分間静置した後、ラベザイムー
ＰＯＤ　（和光純薬工業（株）製のラベザイムーＰＯＤ
セット中のＤＮＡ標識用試薬）２０μｍと錦グルタルア
ルデヒド６μｍを添加し、３７℃で約１０分間結合反応
させてＤＮＡプローブを得た。

１ｖ）ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼイションｉｉ
で得た一本鎖ＤＮＡを固定化したニトロセルロース膜を
、５０％ホルムアミド、１０×デンハルト溶液（０，２
％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン及び０．
２％牛血清アルブミン含有）を含むブロッキング溶液２
０ｍ１に浸潤し、３７℃で１時間静置した。

その後、ブロッキング溶液から取り出し、５０％ホルム
アミド、２ｘデンハルト溶液（０，０４％フィコール、
０．０４％ポリビニルピロリドン、　０．０４％牛血清
アルブミン）、４ＸＳＥＴ溶液（０，６Ｍ　ＮａＣ１及
び４ｍＭＥＤＴＡを含有する０、ＩＭ　ＴｒｉｓｔｌＮ
Ｉ液）を含むプレーハイブリダイゼイション溶液１ｍｌ
に移し換え、３７℃で１時間静置した。次いで、これに
、上記ｉｉｉで調製したＤＮＡプローブ全量を、調製後
直ちに添加し、３７℃で４時間ハイブリダイゼイション
反応を進行させた。

ハイブリダイゼイション反応終了後、ニトロセルロース
膜を取り出し、５０％ホルムアミド、０．４％ＳＯＳ、
１ｘＳＳＣ溶液（０，１５Ｍ　ＮａＣ１及び１５陽ＩＭ
クエン酸三ナトリウム）を含む洗浄液５０ｍ１で３０分
間洗浄する操作を２回繰り返し、更に、ｌＸ５ＳＣ溶液
（０，１５Ｍ　ＮａＣ１及び１５ｍＭ　クエン酸三ナト
リウム）　５０ｍ１で３０分間洗浄する操作を２回繰り
返し、未反応のＤＮＡプローブを除去した。

ｖ）ｔｌＢＶＤＮＡの検出 現品説明書の記載に従って、ラベザイムーＰＯＤセット
を以下のように使用してＨＢＶＤＮＡの検出を行った。

尚、発色液としては、３．３’、５．５’−テトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢＺ）　／エタノール溶液を用いた
。

ｉｖで得た、ＤＮＡプローブでハイブリダイゼイション
させたニトロセルロース膜を、酵素反応緩衝液２０腫１
に浸し、　ＴＭＢＺ／エタノール溶液１履１を添加して
よく攪拌した。次いで、３０％過酸化水素水ＩＯμｍを
添加して良く攪拌し、室温で２０分間発色させた。

この結果、Ｂ型肝炎患者血清からは全てＨＢＶＤＮＡを
検出し、ヒト正常血清では非特異的な発色は観察されな
かった。また、ヒト正常血清にＩｆ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　
Ａを添加した試料を用いた結果、ｓｏｐｇの）ＩＢＶＤ
ＮＡが検出可能であることが判った。

また、ニトロセルロース膜に代えて、ナイロン膜を用い
た場合にも同様の結果が得られた。

実施例２゜ （試料） Ｂ型肝炎患者血清２検体を試料とした。

（核酸溶液の調ｗＪ） 試料１００μｍに−２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩街
液（ｐＨｇ、ｏ。

１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、２５　ｐ　ｇ／ｍｌ子牛肝臓由
来ｔＲＮＡ、　０．２％ＣＴＡＢ、　ｌｏｍＭ　ＮａＣ
１含有）１００μｍを加えて混合後、室温に５分間静置
した。これを１２．０００ｒｐｍで５分間遠心し、得ら
れた沈殿を１．２Ｍ　ＮａＣ１溶液２００μｌに溶解し
た。これにエタノール５００μ］を加えて混合し、室温
に５分間静置した後、１２，０ＯＯｒｐ＋＊で５分間遠
心し、得られた沈殿に７０％エタノール溶液５００μｍ
を加えて軽く攪拌した。これを、再度１２，０００ｒｐ
ｍで５分間遠心し、得られた沈殿を真空中で乾燥した後
、　Ｂａ１−３１ヌクレアーゼにューイングランドバイ
オ　ラボラトリイズ社Ｉｔ）　１０単位（ｕｎｊｊｓ）
を含むＢａｌ緩衝液（２０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｌ
ｌｆｌ液、ｐＨ８゜０．１２ｄ　ＭｇＣｌ２．１２ｍＭ
　ＣａＣｌ２．６００ｍＭ　ＮａＣ１及び１ｍＭＥＤＴ
Ａ含有）２５０μｍを加え、沈殿を溶解した後、３７℃
で１時間静置した１次に、この溶液にエタノール５００
μｌを加え、室温で５分間静置後、１２，０００ｒｐ園
で５分間遠心した。得られた沈殿に７０％エタノール溶
液５００μｍを加えて軽く攪拌し、再度１２．００Ｏｒ
ｐｍで５分間遠心し、沈殿を真空中で乾燥した後。

ＴＥ緩衝液５０μｍに溶解して、Ｂａ１−３１処理核酸
溶液を得た。

また、　Ｂａ１−３１ヌクレアーゼを含まないＢａｌ緩
衝液を用いた以外は上記と同じ試薬を用い、同様の操作
法によりＢａ１−３１末処理核酸溶液を得た。

以下、実験例２と同様の処理により、ＨＢＶＤＮＡの検
出を行った。

（結果） 結果を第６図に示す。

この結果から明らかな如く、本発明のｔＭ製方法により
調製された核酸溶液中には、　ＤＮＡプローブと非特異
的に反応する成分は含まれていないことが判る。

［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明は、例えば遺伝子診断や病原性
生物の感染の診断等の臨床検査に用いられる核酸を含ん
で成る試料の効果的な調製法を提供するものであり、本
発明の調製法により生体試料から調製された核酸を含ん
でなる試料中には生体試料中に含まれる脂質及び脂質蛋
白成分が殆ど混入されていないので、例えばこれをニト
ロセルロース膜、ナイロン膜等の疎水性の固相上に固定
化したものを用いて、常法により種々の核酸同定検査を
行った場合には、核酸のニトロセルロース膜、ナイロン
膜等の疎水性の固相上への固定化率を向上し、遺伝子診
断や病原性生物の感染の診断を精度良く行うことが出来
る点に顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献する
ところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

ｆｆ１図は、実験例４に於いて得られた。各種核酸溶液
をニトロセルロース膜へ固定化した場合の、Ｂ型肝炎ウ
ィルスのデオキシリボ核酸（以下、　ＨＢνＤＮＡと略
記する。）の検出結果を示したものである。 第２図は、実験例１に於いて得られた吸収曲線を示すも
のであり、ａは核酸溶液により得られた結果を、ｂは対
照溶液により得られた結果を夫々示す。 第３図は、実験例１に於いて得られた吸収曲線を示すも
のであり、ａは対照β−リボ蛋白（以下、ＬＰと略記す
る。）溶液により得られた結果を、ｂは対照トリグリセ
ライド（以下、ＴＧと略記する。）溶液により得られた
結果を夫々示す。 第４図は、実験例２に於いて得られた、グルコ−ス、ヘ
パリン、グリコーゲン、ＬＰ又はＴＯの各溶液を試料と
して得られた核酸溶液をニトロセルロース膜へ固定化し
た場合の、ＨＢＶＤＮＡの検出結果を示したものである
。 第５図は、実験例３に於いて得られた吸収曲線を示すも
のであり、ａはヒト血清を試料として調製した核酸溶液
により得られた結果を、ｂはＬＰ溶液を試料として！Ｉ
Ｊ製した核酸溶液により得られた結果を、Ｃは対照溶液
により得られた結果を夫々示す。 第６図は、実施例２に於いて得られた、Ｂａ１−３１ヌ
クレアーゼにより処理した場合と処理しなかった場合の
核酸溶液をニトロセルロース膜へ固定化した場合の、陽
ＢＶＤＮＡの検出結果を示したものである。 雄羊 ＣＴＡＢ汰 ＳＤＳ滅 ＰＯＰＥ六 図面の浄Ｕ・ 第１図 ＨＢＶＤＮＡ ○ ■ ○ ○ ○ 本ＭＪ量（ｐｇ） ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 特許出願人　　和光純薬工業株式会社 図面の浄書 第４図 Ｈ［３ＶＤＮＡ添７陽ｉｒｃ■） ０．１　　０ ′Ａ滴 、スルコースジＶ琢之 ヘパリン簿ス ク゛ソコーγ゛゛ン序才（ ＬＰ浮べ ＴＧＪ！ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 図面の浄書 手 続 ン１−１１ 正 書 （方式） ： Ｂａｔ−３ｉ　又クレア？ビー拠理 ○ Ｂａ１−３１又クンア一申哩 ■ ○ ■ １、事件の表示 昭和６３年　特許塵　第２２２９２４号２、発明の名称 試料の調製方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 〒　５４１ 住所　大阪府大阪市中央区道峰町３丁目１番２号連絡先
　特許線（東京）ＴＥ’Ｌ０３−２７０−８５７１５、
補正の対象 図面。 ６、補正の内容 （１）第１図を別紙の如く補正する。 （２）第４図を別紙の如く補正する。 （３）第６図を別紙の如く補正する。 以 平成元年１２月４日 上

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）生体試料を陽イオン界面活性剤を含有する溶液と
   混合して生体試料中の核酸を陽イオン界面活性剤との複
   合体として沈殿させ、次いでこの沈殿物を分取して高塩
   溶液に溶解し、然る後陽イオン界面活性剤を除去するこ
   とにより調製することを特徴とする、核酸を含んで成る
   臨床検査用試料の調製方法。
2. （２）陽イオン界面活性剤が第４級アンモニウム塩であ
   る請求項１に記載の調製方法。
3. （３）第４級アンモニウム塩が臭化セチルトリメチルア
   ンモニウムである請求項２に記載の調製方法。
4. （４）生体試料を陽イオン界面活性剤を含有する溶液と
   混合して生体試料中の核酸を陽イオン界面活性剤との複
   合体として沈殿させ、次いでこの沈殿物を分取して高塩
   溶液に溶解し、然る後陽イオン界面活性剤を除去するこ
   とにより調製した核酸を含んで成る臨床検査用試料。
5. （５）陽イオン界面活性剤が第４級アンモニウム塩であ
   る請求項４に記載の臨床検査用試料。
6. （６）第４級アンモニウム塩が臭化セチルトリメチルア
   ンモニウムである請求項５に記載の臨床検査用試料。
7. （７）生体試料を陽イオン界面活性剤を含有する溶液と
   混合して生体試料中の核酸を陽イオン界面活性剤との複
   合体として沈殿させ、次いでこの沈殿物を分取して高塩
   溶液に溶解し、然る後陽イオン界面活性剤を除去するこ
   とを特徴とする、生体試料からの脂質及び脂質蛋白成分
   を実質的に含まない核酸の分離方法。
8. （８）陽イオン界面活性剤が第４級アンモニウム塩であ
   る請求項７に記載の分離方法。
9. （９）第４級アンモニウム塩が臭化セチルトリメチルア
   ンモニウムである請求項８に記載の分離方法。
10. （１０）生体試料を陽イオン界面活性剤を含有する溶液
    と混合して生体試料中の核酸を陽イオン界面活性剤との
    複合体として沈殿させ、次いでこの沈殿物を分取して高
    塩溶液に溶解し、然る後陽イオン界面活性剤を除去する
    ことにより得られた、脂質及び脂質蛋白成分を実質的に
    含まない核酸。
11. （１１）陽イオン界面活性剤が第４級アンモニウム塩で
    ある請求項１０に記載の核酸。
12. （１２）第４級アンモニウム塩が臭化セチルトリメチル
    アンモニウムである請求項１１に記載の核酸。
13. （１３）生体試料より核酸を分離し、分離された核酸を
    疎水性の固相上に固定化した後、固定化された核酸中に
    特定の遺伝子或は核酸由来のものが含まれているか否か
    を検査することにより行う、遺伝子診断法又は病原性生
    物の感染の診断法に於いて、生体試料を陽イオン界面活
    性剤を含有する溶液と混合して生体試料中の核酸を陽イ
    オン界面活性剤との複合体として沈殿させ、次いでこの
    沈殿物を分取して高塩溶液に溶解し、然る後陽イオン界
    面活性剤を除去することにより得られる核酸を含んで成
    る試料を疎水性の固相上に固定化することを特徴とする
    遺伝子診断法又は病原性生物の感染の診断法。
14. （１４）陽イオン界面活性剤が第４級アンモニウム塩で
    ある請求項１３に記載の診断法。（１５）第４級アンモ
    ニウム塩が臭化セチルトリメチルアンモニウムである請
    求項１４に記載の診断法。