JPH0296569A - 新規生理活性物質ロイヒスチン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗アミノペプチダーゼＭ作用を有する新規な生
理活性物質ロイヒスチン及びその製造法に関するもので
ある。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕微生物
の生産する生理活性物質の中で、これまでにアクチノニ
ン（Ａｃｔｉｎｏｎｉｎ）、プロベスチン（Ｐｒｏｂｅ
ｓｔｉｎ）およびプロスタチン（Ｐｒｏｓｔａｔｉｎ）
などがアミノペプチダーゼＭを阻害することが報告され
ている（　ｒＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｓＪ第３８巻１６２９−１６３０頁（１９
８５）、特願昭６２−２４０６００号〕。しかし、これ
らの阻害物質はアミノペプチダーゼＭを阻害するととも
に、ロイシンアミノペプチダーゼをも阻害するため、こ
れら２種の酵素の分類、同定などをするうえで、アミノ
ペプチダーゼＭ（ＡＰ−Ｍ）を阻害するがロイシンアミ
ノペプチダーゼ（Ｌｅｕ−ＡＰ）を阻害しない阻害物質
が望まれている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上述の期待に応える入くアミノペプチダ
ーゼＭに対し阻害作用を有する物質の探索を続けたとこ
ろ、バチルス属に属する細菌菌株の培養液中にアミノペ
プチダーゼＭを強く阻害する物質が生産されていること
を見出した。その有動物質を単離精製することに成功し
、ロイヒスチン（［、ｃｕｈｉｓｔｉｎ）と命名した。

さらにロイヒスチン（Ｌｅｕｈｉｓｔｉｎ）の理化学的
及び生物学的性状を確定することにより本発明を完成し
た。

従って、第一の本発明は次式 で表される構造を有する新規生理活性物質ロイヒスチン
を提供するものである。ロイヒスチンの理化学的性質は
下記の通りである。

１）　ロイヒスチンの理化学的性状 （１）色及び形状：白色粉末 （２）分子式：Ｃ工、１１□、Ｎ３０゜（３）分　　子
　　量：　　２４１　　ＳＩ−ＭＳ　　ｍ／ｚ（４）融
　　　点：　１７８−１８０℃（５）比旋光度：　（α
３”−３２，０°（ｃｌ、メタノール）（６）紫外線吸
収スペクトル：　１ｍｇ／＋ｎＱメタノール溶液中で２
１０〜３５Ｏｎｍ間に特異的な吸収を示さない。

（７）赤外線吸収スペクトル：添付図面の第１図に示す
。

（８）水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の第２図
に示す。

（９）炭素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の第３図
に示す。

（１０）呈色反応ニジリカゲル薄層上でニンヒドリン試
薬、パウリ試薬に陽性。

（１１）溶解性：水、メタノール、ジメチルスルホキシ
ドに可溶であり、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム
、ヘキサンに不溶である。

（１２）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：　０．３９
シリカゲル（メルク社製　Ａｒｔ、　５７１５）薄層を
用い展開溶媒としてｎ−ブタノール−酢酸−水　（２：
ｌ：１）を用いた。

（１３）塩基性、酸性、中性の区分：塩基性本発明のロ
イヒスチンとプロベスチン、プロスタチンおよびアクチ
ノニンの抗アミノペプチダーゼ活性（ＩＣ，ｏ値）は次
の第１表に示すとおりである。

第１表 第１表でＡＰ−ＡはアミノペプチダーゼＡを、ＡＰ−８
はアミノペプチダーゼ■３を意味する。

ロイヒスチンは、他の３種の阻害物質と比較すると、抗
アミノペプチダーゼＭ活性は同等かもしくは弱いがロイ
シンアミノペプチダーゼには全く阻害作用を示さない。

さらに本発明のロイヒスチンはマウスの免疫能を増強す
る物質であると認められた。従って、本発明により得ら
れた化合物は、免疫増強剤として有用である。また抗腫
よう免疫増強剤としての用途も期待される。

さらに、第二の本発明は、バチルス属に属するロイヒス
チン生産菌を培養し、その培養液からロイヒスチンを採
取することを特徴とする生理活性物質ロイヒスチンの製
造法を提供するものである。

本発明に使用されるロイヒスチン生産菌の一例としては
、本発明者らにより東京都文京区の土壌より新たに分離
された細菌であってＢＭｌｌ、５６−１４Ｆの菌株番号
を付された菌株がある。８Ｍ１１５６−１４Ｆ株の菌学
的性状は次の通りである。

■、形態 （１）細胞は桿菌、大きさは、０．６〜１．ＯＸ２〜４
．５ミクロンである。

（２）不規則な繭形は観察されない。

（３）周鞭毛を有し、運動性を示す。

（４）胞子を有する。その形は卵円形、大きさは、０．
８　Ｘ　１．０〜１．６ミクロン、位置は中立（ｃｅｎ
ｔｒａｌ）、菌体は膨隆している。芽胞は、その側部に
クリスタルバイオレットでカヌーの形によく染まる部分
（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ　ｂｏｄｙ）を有し、耐熱性で
ある。

（５）ダラム染色は不定である。

（６）非抗酸性である。

２、各種培地における生育状態 肉汁ゼラチン穿刺培養以外は、すべて３０℃で試験した
。

（１）肉汁寒天平板培養 コロニーは、やや光沢のある不透明な円形で、辺縁は不
規則、色はうす黄（ｐａｌｅｙｅｌｌｏｔｍ）〜うす茶
（ｐａｌｅ　ｂｒｏｗｎ）を示す。培養後３日目頃より
、コロニーの表面はしわ状を呈する。拡散性色素は認め
られない。

（２）肉汁寒天斜面培地 接種線に沿って一様に生育し、不透明で光沢がなく、う
す黄（ｐａｌｅ　ｙｅｌｌｏす）からうす茶（ｐａｌｅ
　ｂｒｏｗｎ）を示す。

拡散性色素は詔められない。

（３）肉汁液体培養 培養後１日で試験管底部に菌体が沈澱し、２日目に培地
が濁り、培地表面に菌膜をつくる。３日目には培地表面
を菌膜がおおう。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ２０℃培養では、穿刺腺に沿って菌の生育が認められ、
培養後４日目頃より、液化がはじまった。その型は層状
である。３０℃培養の場合は、培地中に全体的に生育を
認め、２日目で表面に菌膜を形成する。ゼラチンの液化
は培養後３日目頃より始まり、１４４日目ほぼ完了した
。

（５）ミルク ミルクおよびＢＣＰミルクのいずれの培地においても、
培養後７日目頃に試験管壁にリング状に生育し、培地表
面に菌膜を形成する。

培養後１００日目頃凝固が観察され、完了後直れにペプ
トン化が始まった。反応は酸性ではなかった。

３、生理的性質（特に記さない限り、培養温度はすべて
３０℃） （１）硝酸塩の還元：陽性 （２）脱窒反応（駒形らの方法：長谷用武治編著；「微
生物の分類と同定」２２３頁、東京大学出版会、１９７
５年）：陰性 （３）　Ｍｒｌテスト（ブドウ糖ペプトン培地；ブドウ
糖５ｇ、ペプトン１０ｇ、精製水１０００ｆｆ＋ｕ、　
ｐＨ７，６）：陰性 （４）　Ｖ−Ｐテスト（ブドウ糖ペプトン培地；ブドウ
糖５ｇ、ペプトン１０ｇ、精製水１０１００Ｏ，ｐＨ７
，６）　：陰性 （５）インドールの生成：培養後１〜３日の観察で陰性
、その後４〜１０日の観察では判定困難のため、疑わし
い。

（６）硫化水素の生成：陰性 （７）デンプンの加水分解：陰性 （８）クエン酸の利用：　Ｋｏｓｅｒの培地では生育せ
ず、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地では生育するが斜面
部の赤変を認めず陰性であった。

（９）無機窒素源の利用：窒素源が硝酸ナトリウムでは
生成せず、硫酸アンモニウムの場合は生育する。

（■０）色素の生成（キングＡおよびキングＢ培地。

栄研化学）：キングＡおよびキングＢ培地ともに、わず
かに黄色味を帯び、Ｕｖ下できわめてわずかに蛍光色を
発する。

（１１）ウレアーゼ（尿素培地、栄研化学）：陰性（１
２）オキシダーゼ：陽性 （１３）カタラーゼ：陽性 （１４）生育の範囲：　ｐ＋１５．７〜ｐＨ９，０の範
囲で生育を認め最適ｐＨは６．０〜８．０である。また
、２０℃〜４５℃の範囲で生育を認め、最適温度は、３
０℃〜３７℃である。

（１５）酸素に対する態度二連性嫌気性（１６）　０−
Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ法による。ただし
、培地に酵母エキス０．１％添加）二発酵型である。

（１７）糖類からの酸およびガスの生成〈酸の生成〉 糖加アンモニウム塩培地（リン酸２アンモニウム１ｇ、
塩化カリウム０．２ｇ、塩化マグネシウム０．２ｇ、酵
母エキス０．２ｇ、寒天２０ｇ、精製水１０１００Ｏ、
ブロムクレゾールパープル０．２％溶液４ｍＱを基礎培
地とし、糖を最終濃度が１％となるように加え、斜面と
する）を使用の場合： 〈ガスの生成〉 ｕＢｈ−Ｌｅ、１ｆｓｏｎ培地を使用し、上記１５種の
糖類で試験： いずれの糖においても生成しない。

（１８）リゾチーム感受性： 基礎培地（ペプトンｌｏｇ、牛肉エキス１０ｇ、ＮａＣ
１５ｇ、精製水１０１００Ｏ，ｐＨ７，０）にリゾチー
ムを０．００１％加え、本菌株を接種し、ロータリー・
シェーカー（１８０ｐｐｍ）で３０℃２４時間振どう培
養を行い、菌の増殖を認めた。

（１９）カゼインの加水分解：陽性 以上の性状を要約すると、ＢＭＩ］、５６−１４Ｆ１株
は、通性嫌気性の有芽胞桿菌で、ダラム染色は不定であ
る。又１周鞭毛を有し、運動性を示す。芽胞は卵円形で
中立（ｃｅｎｔｒａｌ）、側部にクリスタルバイオレッ
トでカヌーの形によく染まる部分を有し、耐熱性である
。菌体は膨隆し、非抗酸性である。

寒天培地での生育は不透明で、辺縁は不規則、コロニー
表面はしわ状を呈する。ゼラチンを液化し、ミルクを凝
固、ペプトン化する。硝酸塩を還化し、脱窒反応は陰性
、ＭＲテストは陰性、ｖ−Ｐテストは陰性である。イン
ドールは検出されず、硫化水素を生成しない。デンプン
を分離せず、クエン酸を利用しない。又、ウレアーゼ反
応は陰性、オキシダーゼ反応は陽性、カタラーゼ反応は
、陽性であった。ｐＨ５，７〜９．０の範囲で生育し、
最適ｐｌ＋は６．０〜８．０である。又、２０℃〜４５
℃の範囲で生育を認め、最適温度は：３０℃〜３７℃で
ある。ブドウ糖を発酵的に分解して酸を生成するが、ガ
スは生成しない。なお、Ｄ−マンノース、Ｄ〜フラクト
ース、マルトース、トレハロース、Ｄ−マンニトール、
グリセリンからも、それぞれ酸を生成し、ガスを生成し
ない。リゾチームには、抵抗性であり、カゼインを分解
する。

以−ヒの性状をもとに、ｌ’３Ｍ１１５６−１４株をｒ
ｌｌｅｒｇｅｙ’　ｓＭａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｄｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｊ、ｏｌ、ｏｇ
ｙ　　８ｔｈｅｄｊｔｉｏｎＪ　　（Ｉｔ、　Ｅ、　１
ｌｕｃｈａｎａｎ　＆　Ｎ、　Ｅ、　Ｇｉｂｂｏｎｓ著
。

Ｔｈｅ　　Ｗｊｌ、ｌｉａｍｓ　　＆　　Ｗｉｌｋｉｎ
Ｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　　ｌｌａｌｔｊｍｏｒｅ。

＋９７４）で検索すると、５３１ページに示すバチルス
（Ｒａｃｊ　ｌ　Ｌｕ５）属にノ１すζすると考えられ
る。更に、種を検索すると、芽胞形成時の菌体の膨隆を
認め、グルコースから酸を生成しアセトインを生成せず
、カタラーゼ陽性を示す種、すなわちＢａｃｉｌｌｕｓ
與町ヨ二忠馴およびＢａｃｊｌｌｕｓ　ｂｒｃうｖｉｓ
が近縁の種としてあげられる。８Ｍ１１５６−１４Ｆ１
株の性状を上記２種の性状と比較すると、次の第２表の
ようになる。

第２表から明らかなように、８Ｍ１１５６−１４Ｆ１株
は芽胞側部にカヌーの形によく染色される部分（ｐａｒ
ａｓｐｏｒａｌ　ｂｏｄｙ）を有し、クエン酸を利用せ
ず。

又、嫌気培養で生育することから、１３ａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓと区別され、一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１
ａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓときわめて類似した性状を示し
ている。

従って、１３Ｍ１１５６−１４Ｆ　１株をバチルス・ラ
テロスボルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ａｔｅｒｏｓ　ｏ
ｒｕｓ）８Ｍ１１５６−１４Ｆ１と同定した。

なお、８Ｍ１１５６４４Ｆ　１株を工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託申請し、昭和６３年８月１２日に微
工研菌寄第１０１９３号として受託された。

８Ｍ１１５６−１４Ｆ株はほかの細菌の場合にみられる
ようにその性状が変化しやすい。たとえばＢＭＩ１５６
−１４Ｆ株の、またはこの株に由来する突然変異株（自
然発生または誘発性）、形質融合体または遺伝子組換え
体であっても、ロイヒスチンの生産能を有するバチルス
属の菌はすべて本発明の方法に使用することが出来る。

本発明の方法では、前記の菌を通常の微生物が利用しう
る栄養物を含有する培地で培養する。栄養源としては、
グルコース、水あめ、デキス１へリン、シュクロース、
でんぷん、糖蜜、動・植物油等を使用できる。また窒素
源として、大豆粉、小麦はい芽、コーンステイープ・リ
カー、綿実かす、肉エキス、ペプトン、ＩＳＦ母エキス
、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を利用できる
。その他、必要に応じ、ナトリウム、コバルト、塩素、
燐酸、硫酸、及びその他のイオンを生成することの出来
る無機塩類を添加することは有効である。また菌の生育
を助け、生理活性物質ロイヒスチンの生産を促進するよ
うな有機及び無機物を適当に添加することができる。

培養法としては、好気的条件での培養法、特に深部培養
法が適している。培養に適当な温度は１５〜３７℃であ
るが、多くの場合、２６〜：（０℃付近で培養する。生
理活性物質ロイヒスチンの生産は培地や培養条件により
異なるが、振どう培養、タンク培養とも通常１〜１０日
の間でその？？積が最高に達する。培養物中の生理活性
物質ロイヒスチンの蓄積置が最話になったときに培養を
停止し、培養液から目的物質を単離精製する。

本発明によって得られるロイヒスチンの培養液からの採
取にあたっては、その性状を利用した通常の分離手段を
適宜組み合わせて抽出して精製することができる。即ち
培養濾液を吸着樹脂５Ｐ−２０６（三菱化成株式会社製
）のカラムに通し、水で洗浄し、メタノールなどの有機
溶媒で溶離する。溶離液から有機溶媒を留去したのち、
陽イオン交換樹脂ＪＲＣ−５０（オルガノ社製）のカラ
ムに通し、水で洗浄し、アンモニア水などで溶離する。

溶離液を減圧下に濃縮乾固することにより粗粉末を得る
ことができる。

上述の方法に加え吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィーなどを適宜組み合わせあるいは繰り返
すことによってロイヒスチンを単離する。

ロイヒスチンの培養工程ならびに精製工程中での追跡は
抗アミノペプチダーゼＭ活性の４１す定に基づいて行っ
た（ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
Ｊ第３８巻。

１６２９−１６３０頁（１９８５））。

即ち、試験管に２ｍＭのし一ロイシンーβ−ナフチルア
ミド０．２５ｎ＋ｌｉｌ、０．１Ｍのトリス−塩酸緩衝
液（ｐｌ！７．０）０．５ｍｆｌ、検体を含む水溶液０
．２＋ｎＱを加えた混合溶液を３７℃、３分間加温した
後、４　Ｕ／ｍｇのアミノペプチダーゼＭ（ベーリンガ
ー・マンハイム社製）の溶液の０．０５ｒＩＩＱを加え
、３７℃で３０分間反応したのち、ツイーン（Ｔ讐ｅｅ
ｎ　２０）を１０％、ファーストガーネットＧＢＣ塩を
０．１％含むＩＭ酢酸ナトリウム緩ｗＢ液（ｐｆ１４　
、２）　１ｍＱを加え、室温に１５分放置後に、５２５
　ｎｍにおける吸光度（ａ）を測定した。同時にロイヒ
スチンを含まない緩衝液のみを用いた盲検反応液の吸光
度（ｂ）を８１１１定し、アミノペプチダーゼＭ　１１
＋１害率を（（ｂ−ａ）／ｂ）　Ｘ１００の式により計
算した。

（実施例） 次に実施例によって本発明のロイヒスチンの製造例を示
す。

実施例１ 種培地として、グリセリン３．０％、魚粉２．０％、炭
酸カルシウム０．２％を含む培地を用いた。なお殺菌前
の培地ｐＨはｐ＋！７．４に調整して使用した。

５００ｍＱ容三角フラスコに１１０ｍＱを分注した前記
種培地を１２０℃で２０分間殺菌し、これにバチルス・
エスピー・＋３Ｍｌ１．５６−１４Ｐ１株（ＦＥＲＭ　
Ｐ−１０１９３）の斜面培養の１〜２白金耳を接種し、
２７℃で２日間振どう培養し種培養とした。ついで生産
培地としてグリセリン３．０％、魚粉２．０％、炭酸カ
ルシウム０．２％、Ｌ−ロイシン０．５％、！、−ヒス
チジン塩酸塩０．５％を含む培地（ρ１１７．４）　を
５００ｍＱ容三角フラスコに１１０ｍＱずつ分注し１２
０℃で２０分間殺菌し、前記種培養液：３ｍｆｌずつを
接種し、２７℃で４日間振どう培養した。培養終了後、
濾過助剤として珪藻土を加え濾過し、固体を含む固形物
および培養濾液を得た。

実施例２ 実施例１で得られた培′！＃濾液８Ｑを吸着樹脂ダイア
イオン５Ｐ−２０６の１Ｑのカラムにかけ、水で洗浄し
、３０％、メタノール（４Ｑ）で溶離した。活性画分を
含む溶離液を減圧濃縮して容積をＩＱとした。

犬１直主 実施例２で得られた溶液をアンバーライトＩＲＣ−５０
（Ｉ！１型）　５００ｍ１２のカラムにかけ、水で洗浄
し、ＩＮのアンモニア水で溶離した。活性画分を含む溶
離液を減圧濃縮して容積を’７ｍＱとした。

火傭潰工 実施例３で得られた溶液を、あらかじめ水で充填したＭ
ＣＩ　ＧＩＥＬ　ＣＩＩＰ−２０Ｐ（三菱化成株式会社
″？）５００ｍＱのカラムにかけ、水で展開し、ｌ−０
ｇずつ分画した。活性分画Ｎα１０−１５を減圧濃縮し
、黄色粉末４５０ｍｇを得た。

υ−例盈 実施例４で得られた粉末を少量の水に溶解し、水で充填
したセファデックスＧ−１０（ファルマシアファインケ
ミカル社製）ＩＲのカラムにかけ、水を展開溶媒とする
クロマトグラフィーを行い、８にずつ分画した。活性分
画Ｎｏ２１〜２６を減圧濃縮すると、ロイヒスチンの白
色粉末２４０ｍｇが得られた。

このロイヒスチンは０．２０Ｐｇ／ｍＱの１度でアミノ
ペプチダーゼＭを５０％阻害した。

試験例１− 本例はロイヒスチンが免疫増強作用をもつことを例証す
るものである。

試験法は次の通りである。すなわち、ラット（Ｆｉｓｃ
ｈｅｒ系）の肺臓から常法で単離された肺細胞の浮遊液
を調製する。−回洗滌後に、１０％ＦＣ５添加のＲＰＭ
Ｉ１６４０培地に憩濁し、ナイロンウール塔にかける。

５％Ｃ０２条件下で３７℃で６０分間インキュベートし
た後に、ナイロンウールに付着しなかった肺細胞を回収
する。回収した肺細胞にコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　
Ａ　）を加えて５％ＣＯ□条件下で炭酸ガス培養器内で
３７℃で４時間反応させ、更にメチル・α−Ｏ−マンノ
ピラノシドを加えて反応を終了させた。

その後、十分量の培地液で肺細胞を洗滌し、得られた細
胞にロイヒスチンを種々の投与社で加えて、３７°Ｃで
５％Ｃ０２条件下に７２時間反応させた。

この反応終了の１６〜１８時間前にＪＨ−チミジンを加
え、細胞への３１１−チミジン取込み率を液体シンチレ
ーション・カウンターで１分間当りのカウント数（ｃｐ
ｍ）として測定する。評価は、ロイヒスチンを加えない
群のカウントを１００％とした基窄でＴ／Ｃ（％）を算
出し、ロイヒスチンによる肺細胞のチミジン取込み増加
率を評価した。有意差検定（Ｐ）はスチューデントし一
検定法で行った。

試験結果を第３表に要約して示す。

一般に、細胞中のＤＮ、Ａの合成にはチミジンが必要と
され、細胞の分裂の程度はＤＮＡの合成の強弱を８１と
して評価できる。マイトゲン（ｍｉｔｏｇｅｎ）の一種
であるＣａｎ　Ａで刺激された肺細胞がロイヒスチン無
添加の場合に比べてロイヒスチン添加群で３１１−チミ
ジンの取込み率を増加させたことは、肺細胞の細胞分裂
の頻度、すなわち増殖速度がロイヒスチンにより増加し
たことを示す。そして、牌細胞数の増加は免疫力が増強
したことを意味する。　第３表の結果から、６．２５〜
１００μｇ／ｍＱのロイヒスチンの添加はＣａｎ　Ａ処
理による活性化ｂ１．ａｓｔｓ細胞の３ＩＩ−チミジン
取込みを増加させたことが認められ、この細胞の細胞分
裂の頻度を増加させたものと認められる。

【図面の簡単な説明】

第１図はロイヒスチンの臭化カリウム錠内での赤外線吸
収スペクトルを示し、第２図はロイヒスチンの重メタノ
ール中で８１’ｌ定した４００ＭＨｚ水素核核磁気共鳴
スペクトルを示す。第３図はロイヒスチンの重メタノー
ル中で測定した１００Ｍ）Ｉｚ炭素核核磁気共鳴スペク
トルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物であることを特徴とする生理活性物質
   ロイヒスチンまたはその塩。 ２、バチルス属に属するロイヒスチン生産菌を培養し、
   その培養物からロイヒスチンを採取することを特徴とす
   る、生理活性物質ロイヒスチンの製造法。