JPH0276599A - 生産的にアミノ酸を生じる微生物の菌株をスクリーニングする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フィード−パッチ−（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ−
ン醗酵で使用するための、生産的にアミノ酸を生じるｇ
Ｌ住物の菌株ｔスクリーニング（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
する方法に関する。

〔従来の技術〕

これは−設面に使用可能でＴｏり、次の文献にに、コリ
ネバクテリウム・グルタミクム（Ｏｏｒｙｎｅｂａａｔ
ｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉａｕｍ　）のリシン生産性
菌株のスクリーニングに関して開示されている。

必須アミノ酸Ｌ　−１７ゾンに、食料品−及び飼料添加
物並びに医薬品の作用物質及び有効成分として工業的Ｉ
／ｃＮ要でおる。

Ｌ　−ＩＪシンの製造のためには、フィード−パッチ−
醗酵が最も１喪な方法である。特に、コリネバクテリウ
ム及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　）属のコリネフォルム細菌は、この生産に使用さ
れる。突然変異にエフ、この菌株のりシン生合成の調整
は、これらかりシンｔ％有の需要を越えて生産し、この
培地中に析出するよりに変えている。

この工うな過剰産物に、アミノ酸代謝の個々の工程をブ
ロックする突然変異体（例えばＨｓｅ−又はＴｈｒ−栄
養要求株）（これは、リシンの類縁体１種以上に抵抗す
るか又は他の突然変異体を有する）の追求に工９得られ
る。高性能菌株は、多種の栄養要求株、類縁体抵抗体又
扛突然変異体組合せｔ有する。リシン生産体の発生のた
めの遺伝学的方法の総合的開示ｉｄｏ、）サカ（Ｔｏｓ
ａｋａ　）及びに、タキナミ（Ｔａｋｉｎａｍｉ　）に
よ　る　Ｆｒｏｇ、工ｎｄ、ＭｉＯｒＯｂｉａし　　（
Ｂｉｏｔｅｏｈｎｏｌ、Ａｍ１ｎ。

Ａｃ１ｄｓ）２４．（１９８６）、１５２〜１７２に示
さｎている。

アミノ酸を生産する変異体のこの追求にスクリーニング
（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）と称される。このスクリーニン
グにおいては、出発菌株中で慣用の化学的又は物理的突
然変異原（例えばＭＮＮＧ又はＵＶ　）　ｉ用いて偶然
の突然変異ｔ−ｎ発させ、慣用の微生物学的方法で突然
変異体を選別する。

全ての選別された突然変異体がアミノ酸産生体であると
はかぎらないので、最後に所望のアミノ酸の存在に関す
る試験をする。

この試験は、通例、振動フラスコ（１０〜２０　Ｄ　Ｄ
ｙ）中で液中で実施さｎｌこの際、微生物に生長及び生
産のために、炭素源及びエネルギー源（例えばグルコー
ス、糖＠）並びに窒素源（例えば硫酸アンモニウム）、
ピタミ／（例えばビオチン、チアミン）及び種々の塩を
含有する無菌栄養液（５〜５０−）を必要とする。醗酵
に、２０〜４０℃の温度で、通気、振動（５０〜４００
　ｒ、ｐ、ｍ、）下に実施する。この栄養液の一一値は
５〜９である。振動フラスコを７２〜９６時間後に収穫
し、その都度のアミノ酸濃度を慣用の分析法で測定する
。この時間の後に、フラスコ中で達成される濃度を試験
変異体の評価の基準として使用する。前記のことは、多
くの特許例えば米国特許第３７３２４４１号、同３７３
２１４４号、同第３７０８３９５号、同第４２７５１５
７号明細書島びに、文献例えばＢ、に、サノ（８ａｎＯ
ン及び工、シイオ（ｓｈｔｉｏ）（１９６７）　Ｊ、Ｇ
ｅｎ、Ａｐｐｌ、ＭｉＯｒＯｂｉＯｌ、　１３．３４９
〜６５８及び（１９７０）　、Ｔ、Ｇｅｎ、Ａｐｐｌｌ
Ｍｉｏｒｏｂｉｏｌ。

１６．３７３〜３９１及び（１９７１）　Ｊ、Ｇｓｎ。

ＡｐｐｌｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１７．９７〜１１３
）、ｏ、ｈサカ、Ｋ、タキナミ及びＹ、ヒロセ（１９７
８）Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、　４２．７４５
〜７５２）及びＭ、ジョン７エルド（５ｃｈｏｎｆｅｘ
ａｔ　）及びＴ、ワトンｙ　（Ｗａｔｓｏｎ　）　（１
９８２）　５ｏｕｔｈ　ＡｆｒｉｃａｎＦＯＯａ　Ｒｅ
ｖ、　９．１１１〜１１２）に記載されている。最大濃
度を有するクローンか最良であると評価される。

このようなスクリーニングの結果は、多数の誘導変異体
の中で最も好適なものを知るか否かに決定的に依存する
。この評価のためには、技術水準によれは、この振動フ
ラスコ試験が決定的なラスタ（Ｒａａｔ、ｅｒ　）でお
る。この場合、前記の工うに、７２〜９６時間後に培地
中で増加し次アミノ酸の濃度は通例基準として役立つ。

この時点までに、本発明の結果によれば、揚動フラスコ
ビタでの生産は停止している（　Ｋ、Ｎａｋａｙａｍａ
。

Ｏｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ＢｉＯｔ８Ｑｈｎ０１０
ｇ７３．６９７、（５２［］　；　］Ｍ、Ｍｏｏ−Ｙｏ
ｕｎｇ：　ＰｅｒＢａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ（１９８５）
）。

次いで、振動フラスコ内で予め定められた条件下で多量
の所望のアミノ酸を生じる菌株全選別する。

このスクリーニング法は一般に使用される。

それというのも、これはそれぞれ供給される変異体の多
くにおいて比較的迅速な選別上可能とし、方法技術的に
簡単に実施できるからである。

醗酵の間の生長速度を測定するような他の方法は、当業
者にとって、検査子べき多くの菌株数においては経費が
かかると思え、１菌株のアミノ酸生産性に関して必ずし
も明確ではない。

一般民、前記方法で生産菌株のスクリーニングが行なわ
ｎるとしても、特定の欠点を無視することはできない。

公知のスクリーニング法で選別された、同じか又に匹敵
しうる変換率を示す菌株がフィード−バッチ法での使用
の際に、培地中で明確に異なりかつ５Ａ質的に相互に区
別しうるアミノ酸濃度ｔもたらすことが認められている
。

〔発明の解決しようとする昧題〕

不発明の目的は、当該微性物の接種された培地中で生産
的にアミノ酸を生じるｂ微生物の菌株をスクリーニング
する万であり、これは、生産相の初めと終点との間で、
少なくとも１回所望のアミノ酸の濃度を測定し、この時
点までに最多量のこのアミノ酸を生じる変異体をスクリ
ーニングすることよりなる。

生産相の間で１回のみの測定を行なう場合、その時点と
しては、一般に醗酵時間の半分の経過時点を選択する。

本発明方法のためには、アミノ酸ｔ−産生ずるすべての
微生物殊にコリネバクテリウム及びブレビバクテリウム
の属のものが使用される。

本発明の方法の優秀性は、例えば、コリネバクテリウム
・グルタミクム（Ｏｏｒｙｎｅｂａａｔｓｒｉｕｍｇｌ
、ｕｔａｍｉｃｕｍ　）のＬ−リシン生産性微生物で立
証される。

フィード−バッチ−法とは、慣用の用語に相当し、醗酵
の間に栄養物質例えば炭素源及び窒素源が後で添加され
る醗酵法を称する。

実施例が示している：うに、不発明の方法では慣用の振
動フラスコ試験によるものとは異なる突然変異体か選別
される。

生産相の間でのＬ−Ｌｙｓ−増加を測定するために、２
４時間振動インキュベーション後にＬ−Ｌｙｓ−濃度？
測定し、Ｌ−Ｌｙｓ−最終濃度の測定のために生産終了
後４８時間後に測定した。実施例にコリネバクテリウム
・グルタミクムの突然変異体に関する。

〔実施例〕

例１：振動フラスコテストＤＭ１８０−１変異体ＤＭ１
８０−１に超厚試験管からカコープイヨン（０ａＯＯ−
ＢＯｕｉｌｌＯｎ　）　４　ｗ中に接種し、振動下に５
０℃で１６時間培養し、引続き、１：６−希釈の後に、
試験培地（９ｍ）ｔ−含有する栓付き１００ｇＪエーレ
ンマイヤーフラスコ中に接種（１ｍ）する。この試験培
地は糖蜜２４０１／ｌ、大豆粉−加水分解物１００ｔｄ
／／ｌ、硫ｆｌ　７　、Ｑ／　ミニラム１２ｇ／１３及
び炭酸力／ｌ／　シウム１０９／ｌｌｋ含有する。６０
℃で２４時間振動（３００ｒ、ｐ、ｍ　）の後に、この
培地は、Ｌ−ＬｙｓｘＨａＡ’　１９．ＯＦ／＃ｋ、４
８時間後ｉＣＵ　Ｌ−ＬｙｓＸｕａＡ３２．２ｇ／ｌを
含有する。

例２：振動フラスコ試験ＤＭ２９０−２例１の記載と同
様に菌株ＤＭ２９０−２を取り出し、振動フラスコ中で
インキュベートする。

２４時間後に、この培地はＬ−ＬｙｆｌＨｃｌ　１８．
１９／１ＷｒｔＨし、４８時間後にＬ−Ｌｙｓ　Ｘ　Ｈ
Ｏ１１５４，４’ｌｌｌを含有する。

例６：振ｗＪ７ラスコ試験ＤＭ２８２−２例１の記載と
同様に菌株ＤＭ２８２−２に取り出し、振動フラスコ中
でインキュベートする。

２４時間後に、この培地はＬ−Ｌｙｅ　ｘ　Ｈｃ１２４
．９ｇ／＃に含有し、４８時間後にはＩＩ−Ｌ７ｓｘ　
ＨＯ１３３０，１９／　ｌ（＋−含有し１こ。

例１〜乙の結果を第１表にまとめる： 第１表 １１°　　　　　　（ｇ／ＩＩ） Ｄ　Ｍ　１８０−１　　　　　１９．０　　　　　３２
．２ｎｕ２９０−２　　　　　１８．１　　　　　３４
．４Ｄ　！　２８２−２　　　　２４．９　　　　　３
０．１スチュデントーｔ−テスト（Ｂｔｕａｅｎｔ−ｔ
−ｔｅｓｔ）によるこのデータの統計的評価は、これら
菌株のＬ　−ＩＪシン産生は２４時間及び４８時間後に
有意に相互に異なることを示している。

慣用の方法では、この変異体で、最大最終濃度を有する
もの即ちＤＭ２９０−２ｅスクリーニングするが、本発
明方法では、２４時間後に最大Ｌ−リシン濃度を有する
ＤＭ２８２−２？Ｉ−スクリーニングする。

菌株力このフィード−バッチ−醗酵でいかに作動するか
ケ例４〜６で示す。

例４：フイードーパツチー醗酵ＤＭ１８０−１カン（Ｃ
！ａｓｏ　）−ブイヨン０．Ｉ　Ｊ　ｋ栓付き２１−エ
ーレンマイヤーフラスコ中に入ｆＬ、振動インキュベー
ト（３０℃、２４時間、１５０ｒ、ｐ、ｍ、　）する。

この細ｊ＠ｓＮ６液を培地Ｍ１（糖９！６０９／）、硫
酸アルミニウム１０９７１１大豆粉加水分解物１２０ｄ
／＃、燐酸１耐／ｌ　）Ｂ１１を有する予＠醗酵檜に接
種し、攪拌下に９時間（６３℃）培養及び通気の後に、
細胞懸濁液１．６ノを主醗酵檜培地ｎ１（１３Ｊ）に移
す。６時間（３６℃、８００　ｒ、ｐ、ｍ。

ｐ）１７．０、通気１．５　ｖ、ｖ、ｍ、　）の後に、
培地Ｍ２（糖蜜１２４５ＩＩ／Ｊ、硫酸アンモニウム６
４ｇ／）、３０℃、ｒ、ｐ、ｍ、／ｖ、ｖｏｍ　ｗ　ｆ
　（ｐｏ２−３０％）；ｐ）１７．５）の添加（２００
５＋／ｈ）ｋ開始する。７２時間後に、Ｌ−’Ｌｙｓ　
ｘ　Ｈｏｇ　４１１／ノが収穫される。

例５：フイードーバッチー醗酵ＩＪＭ２９０−２カッ−
ブイヨン０．４１Ｊｋ栓付＠２１１−エーレンマイヤー
フラスコ中に接種し、振動インキュ（１υ ベート（６０℃、１３時間、１５０　ｒ、ｐ、Ｔｆｌ、
）する。この細胞懸濁液Ｊ望１酵槽（サツカロ−スフ、
５．９　／　７を有するカンーブイヨン招地１０））に
接種し、攪拌及び通気下に１２時間（３０℃ンインキユ
ペートする。細胞懸濁液１．４　ｌ　ｋ培地Ｍ１（糖Ｖ
　６０　ｇ／　Ｊ　Ｓｂ　ｉ！！’、　７　ルミニウム
１０９／ｌ、大豆粉加水分解物１２０ｍ、＃に燐酸１耐
／〕と共に含有）１１／’ｔｋ有するもの１つの′：ｓ
ｒ−備醗酵相中に移し、攪拌及び通気下に９時間培養（
６６℃）の後に、細胞懸濁液２．３１７を主醗酵ｍ（Ｍ
ｌ培地１．７１．４　／　）中に接和する。

６時間（６６℃、ｓ　ｏ　ｏ　ｒ、ｐ、ｍ、−７，０、
通気１．５　ｖ、ｖｌｍ、）の後に、ｊ＠：［ｌｈＭ２
（糖＠１１００９／ｌ、硫酸アンモニウム２２９／ｌ、
３０℃、ｒ、ｐ、ｍ、／ｖ、ｖ、ｍ、　＝　ｆ　（ｐ０
２−３０％）ｉｐ８７．５）の添加（２００，９’／ｈ
）ｉ−開始する。

７２時間後に、この培地ｉｊ　Ｌ−Ｌｙｅ　ｘ　Ｈｏｄ
　３７．５ｙ／ノを含有する。

例６：フイードーバクテー醗酵ＤＭ２８２−２カッ−ブ
イヨン０．４１３　ｋ栓付籾２１−エージンマイヤーフ
ラスコ中に接種し、振動インキユベートする（３０℃、
１０ｑ間、１５０　ｒ、ｐ、ｍ、）。

この細胞Ｗ＆濁ｇ、を予備醗酵槽り培地Ｍ１（糖蜜６０
ｇ／）、硫酸アン七ニウム１０１１／ノ、大豆粉加水分
解物１２０ｍ／ノ、燐酸１ｗ／１）８７）に接種し、攪
拌及び通気下に９時間培養（６６０℃）の後に細胞＠濁
液２！忙王醗酵檜（培地Ｍ１　１０１）中に移す。６時
間（６６℃、８００　ｒ、ｐ、ｍ、　ｐ）１７．０、通
気１．５　ｖｖｍ　）　俵に、培地Ｍ２（糖＠１２４５
＆／／、硫酸アンモニウム６４１１／１３，３０℃、ｒ
ｐｍ／ｖｖｍ　−ｆ　（Ｉ）ｏ２　”　３０％）ｐＪ（
７，５）２００ｇ／ｈの添加を開始する。

７２時間後に、この培地にＬ−ＬｙＢｘ　’ｋ１０１７
６１１／ｌ會含肩する。

例４〜６の結果を第２表に１とめる： 第２宍 ７２時間 ＤＭ１８０−１　　　　　　　　　　　　４１ＤＭ２９
０−２　　　　　　　　　　　　３７．５υＭ２８２−
２　　　　　　　　　　　　７６住産速度の本発明によ
る規準にエクスクリーニングされた菌株ＤＭ２８２−２
に、フィード−バッチ−法で慣用の規準による最終濃度
ぶりも選択的に優れている。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、微生物の接種された培地中で、生産的にアミノ酸を
   生じる微生物の菌株をスクリーニングする方法において
   、生産相の開始と終点との間で少なくとも１回所望のア
   ミノ酸の濃度を測定し、この時点までにこのアミノ酸の
   最大量を産生した突然変異体をスクリーニングすること
   を特徴とする、生産的にアミノ酸を生じる微生物の菌株
   をスクリーニングする方法。