JPH06197779A - Ｌ−リシンを分泌する微生物のコリネ形菌株の効率向上のための方法及び発酵によるｌ−リシンの製法 - Google Patents

Ｌ−リシンを分泌する微生物のコリネ形菌株の効率向上のための方法及び発酵によるｌ−リシンの製法

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JPH06197779A
JPH06197779A JP5004777A JP477793A JPH06197779A JP H06197779 A JPH06197779 A JP H06197779A JP 5004777 A JP5004777 A JP 5004777A JP 477793 A JP477793 A JP 477793A JP H06197779 A JPH06197779 A JP H06197779A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 その菌株が親菌株より少ないクエン酸シンタ
ーゼ活性度を示す、Ｌ−リシンを分泌する微生物のコリ
ネ形菌株の効率向上のための方法及び発酵によるＬ−リ
シンの製法。 【構成】 Ｌ−リシンを分泌する微生物のコリネ形菌株
にＬ−アスパラギン酸−β−メチルエステルに対する耐
性を誘発させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−リシンを分泌する
コリネ形(coryneform)バクテリウムの効率向上のための
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】必須アミノ酸Ｌ−リシンは、食品添加剤
及び動物用飼料添加剤、並びに医薬品の作用物質及び成
分として工業的に大きな重要性を有する。
【０００３】Ｌ−リシンの製造については発酵が最も重
要な方法である。とりわけ、コリネバクテリウム(Coryn
ebacterium)属及びブレビバクテリウム(Brevibacteriu
m)属のコリネ形バクテリウムが生産に使用される。突然
変異によって上記菌株のリシン生合成の調節が、菌株が
リシンを固有の必要量を越えてを生産しかつ培地中に分
泌する程度に変化する。
【０００４】この種の過剰生産体は、１つもしくはそれ
以上のリシンの類似体に対して耐性を示すか又は別の突
然変異を有しているアミノ酸代謝の個々の過程が遮断さ
れている突然変異体（例えばＨｓｅ−もしくはＴｈｒ−
栄養要求性突然変異体）を選択することによって得られ
る。高効率菌株は通常、複数の栄養要求性突然変異体、
類似体耐性又は、突然変異の組合せを有している。リシ
ン生産体の開発については、トサカ(O. Tosaka)及びタ
キナミ(K. Takinami)（Progr. Ind. Microbiol.(Biotec
hnol. Amino Acids)２４（１９８６）、１５２〜１７
２；M. Hilliger、Biotec ２（１９９１）４０〜４４
に総括的に記載されている。
【０００５】Ｌ−リシンを生産する突然変異体の選択
は、スクリーニングと呼称される。
【０００６】スクリーニングの際には、出発菌株中で常
用の化学的もしくは物理的な突然変異原（例えばＭＮＮ
Ｇ又は紫外線）によって偶発的な突然変異が誘発され、
かつ常用の微生物による方法を用いて突然変異体が選択
される。スクリーニングを行なうには、選択方法の選択
及び該方法の適当な使用が重要である。
【０００７】リシン生産体の選択については、しばしば
リシンの構造類似体が使用される。成長を抑制する該類
似体の作用は、Ｌ−リシンによって中止される。従っ
て、類似体に対して耐性である突然変異体の中から、高
められたＬ−リシン生産を示す突然変異体が見出され
る。
【０００８】Ｌ−リシンのこのような構造類似体の公知
の例は、ＡＥＣ（Ｓ−［２−アミノエチル］−システイ
ン）である。ＡＥＣは、４位で炭素原子が硫黄原子１個
と置換されていることによってのみＬ−リシンと区別さ
れる。上記の類似体は久しく公知であり、かつＡＥＣ耐
性リシン生産体は文献に記載されている（H. Kase、K.
Nakayama；Agric. Biol. Chem. ３８（１９７４）、９
９３〜１０００；S.N.Kara-Murza他；Prikladnaya Biok
himiya Mikrobiologiya １６（１９８０）８６８〜８７
５；米国特許第３ ７０７ ４４１号明細書）。
【０００９】上記の突然変異体の効率は、別の突然変異
を導入することによって向上させることができる。当業
者に常用の方法で容易に誘発させることができる栄養要
求性突然変異体との組合せは公知である（米国特許第３
７０８ ３９５号明細書；米国特許第３ ８２５ ４７２
号明細書；J. Plachy、Acta Biotechnol. ９（１９８
９）３、２９１〜２９３；A. Sassi他；Biotechnol. Le
tter１２（１９９０）４、２９５〜２９８）。
【００１０】さらに、別の耐性との組合せは公知であ
る。例えば抗生物質に対する耐性については記載がある
（ドイツ連邦共和国特許出願公開第２７ ３０９６４号
明細書）。
【００１１】
【発明を達成するための手段】本発明の目的は、アミノ
酸、殊にＬ−リシンを分泌するコリネ形バクテリウムの
効率を適当な突然変異体によって向上させること並び
に、相応する菌株をスクリーニングによって見つけ出し
かつ特性決定することである。
【００１２】本発明の対象は、Ｌ−リシンを分泌する微
生物のコリネ形菌株にＬ−アスパラギン酸−β−メチル
エステル（ＡＭＥ）に対する耐性を誘発させることを特
徴とするＬ−リシンを分泌する微生物のコリネ形菌株の
効率を向上させるための方法である。
【００１３】
【作用】上記方法は、出発菌株が通常の化学的もしくは
物理的な突然変異原、例えばＭＮＮＧ：Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン又は紫外線にさ
らされる方法で行なわれる。有利にコリネバクテリウム
属及びブレビバクテリウム属、殊にコリネバクテリウム
グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)属に所属
する、適当なコリネ形バクテリウムの選択は一般に公知
の微生物学的方法で行なわれる。このようにして得られ
かつ見出された菌株は同様に本発明の対象である。
【００１４】Ｌ−アスパラギン酸の他の類似体とは対照
的にＡＭＥは成長、例えばコリネバクテリウム グルタ
ミクム（ＡＴＴＣ１３０３２）の野生型並びにこの野生
型から派生した突然変異体の成長を抑制する。
【００１５】使用される菌株は、さらに別の耐性又は栄
養要求性突然変異体を有していてよい。
【００１６】Ｌ−リシン製造のための発酵は、一般に公
知の方法で行なわれる。
【００１７】既にリシンを生産しかつ従ってリシン過剰
生産に等価で高められたアスパラギン酸の量を合成する
突然変異体がＡＭＥによって抑制されるという事実は、
それ自体驚くべきことである。
【００１８】上記の場合に、ＡＭＥに抗して選択される
突然変異体が付加的に出発菌株と比較して高められたリ
シン生産を示すことは、ますます驚くべきことである。
特に好適なのは、親菌株と比較して減少されたクエン酸
シンターゼ含量を有する、本発明により得られるＡＭＥ
耐性突然変異体である。この菌株の性質は、文献の記載
によればアスパルテート−アミノ酸、例えばＬ−リシン
の分泌の改善に有利である（A. YOTOKTA、J. SHIIO、Ag
ric. Biol. Chem. ５２、４５５〜４６３（１９８
８））。クエン酸シンターゼ活性度の測定は、P.A. SRE
RE他、Acta Chem. Scan. １７、１２９（１９６３）に
従って行なわれる。
【００１９】
【実施例】下記の例は、ＭＮＮＧでの処理によって得ら
れた、コリネバクテリウム グルタミクム（ＡＴＴＣ１
３０３２）の突然変異体に関するものである。
【００２０】例 １
【００２１】
【外１】
【００２２】を夜通しスタンダードＩブイヨン(Standar
d I Bouillon)（Merck Art. ７８８２）中で培養し、生
理的食塩水（ＮａＣｌ ０．９％）で洗浄し、突然変異
させ、かつＡＭＥを含有する平板に塗抹する。この平板
は、ＢＭＣＧ培地（Liebl他、Appl. Microbiol. Biotec
hnol（１９８９）３２：２０５〜２１０）を含有してお
り、この培地はＤ，Ｌ−ホモセリン２００μｇ／ｍｌ及
びＡＭＥ２〜２４ｇ／ｌ、特に４〜８ｇ／ｌで補充され
ている。３０℃で５日間の恒温保持後に耐性コロニーを
接種する。
【００２３】リシン生産の試験のためにＣＡＳＯ−ブイ
ヨン（Merck. Art. ５４５９）中の耐性コロニーを１６
時間恒温保持（３００ｒｐｍ、３０℃）する。この懸濁
液をそらせ板を備えた１００ｍｌのエルレンマイヤーフ
ラスコ中で糖蜜２４０ｇ／ｌ、大豆ミール水解物１００
ｍｌ／ｌ、硫酸アンモニウム１２ｇ／ｌ、炭酸カルシウ
ム（ｐＨ＝７）１０ｇ／ｌを含有する培地９ｍｌ中で
１：１０で希釈し、かつ４８時間恒温保持する（３０
℃、３００ｒｐｍ）。４８時間後に発酵液(Fermentatio
nbruehe)を遠心分離し、かつ上澄みのリシン濃度をアミ
ノ酸分析によって測定する。
【００２４】クエン酸シンターゼ比活性度を確認するた
めに、菌株をスタンダードＩブイヨン（Merk Art. ７８
８１）及びグルコース４ｇ／ｌ中で培養する。細胞の収
穫及び酵素調剤の製造は記載された方法によって実施さ
れる（G. THIERBACH他、Apple. Microbiol. Biotechno
l. ３２、４４３〜４４８（１９９０））。
【００２５】
【表１】
【００２６】例 ２
【００２７】
【外２】
【００２８】を夜通しスタンダードＩブイヨン（Merck
Art. ７８８２）中で培養し、生理的食塩水（ＮａＣｌ
０．９％）で洗浄し、突然変異させ、かつＡＭＥを含
有する平板に塗抹する。この平板は、ＢＭＣＧ培地を含
有しており、この培地はＬ−ロイシン１００μｇ／ｍｌ
及び例１と同様のＡＭＥで補充されている。
【００２９】３０℃で５日間の恒温保持後に耐性コロニ
ーを接種する。
【００３０】リシン生産の試験のために例１の場合と同
様にして糖蜜３０ｇ／ｌ、ショ糖８５ｇ／ｌ、大豆ミー
ル水解物１５８ｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン１００ｍｇ／ｌ、
硫酸アンモニウム２５ｇ／ｌ、リン酸水素カリウム０．
５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．４ｇ／ｌ、塩化カルシ
ウム１０ｍｇ／ｌ、硫酸鉄１２ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン
１１ｍｇ／ｌ、クエン酸０．６ｇ／ｌ、ビオチン０．３
ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、炭酸カルシウム２
５ｇ／ｌを含有する培地中で行なう。
【００３１】クエン酸シンターゼ比活性度の確認を例１
に記載されている場合と同様にして行なう。
【００３２】
【表２】
【００３３】例 ３
【００３４】
【外３】
【００３５】を夜通しスタンダードＩブイヨン（Merck
Art. ７８８２）中で培養し、生理的食塩水（ＮａＣｌ
０．９％）で洗浄し、突然変異させ、かつＡＭＥを含
有する平板に塗抹する。この平板は、ＢＭＣＧ培地を含
有しており、この培地はＬ−ロイシン１００μｇ／ｍ
ｌ、ＤＬ−ホモセリン１６０μｇ／ｍｌ及び例１と同様
のＡＭＥで補充されている。３０℃で５日間の恒温保持
後に耐性コロニーを接種する。
【００３６】リシン生産の試験及びクエン酸シンターゼ
比活性度の測定を例２の場合と同様にして行なう：
【００３７】
【表３】
【００３８】例 ４ ＡＭＥに依存したコリネバクテリウム グルタミクム（ＡＴＴＣ１３０３２）の 抑制帯域 濃度 0 10 20 40 60 80 100 120[g/l] (AME) Ｌ−アスパラギン酸−β−メチルエステル 抑制暈 0 0 0 0.5 1.4 1.6 1.9 2.4[cm] （ 澄明 ） 細胞懸濁液を軟質寒天（ＢＭＣＧ）に注入した。凝固後
にＭＯＰＳ−緩衝液（０．１モル、ｐＨ＝７）中のＡＭ
Ｅ溶液０．１５ｍｌを寒天上の鋼シリンダ（ｄ＝０．５
ｃｍ）に滴下する。３日間の恒温保持（３０℃）後に抑
制暈を測定しかつ評価する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:15）

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｌ−リシンを分泌する微生物のコリネ形
    菌株の効率を向上させるための方法において、該菌株に
    Ｌ−アスパラギン酸−β−メチルエステルに対する耐性
    を誘発させることを特徴とする、Ｌ−リシンを分泌する
    微生物のコリネ形菌株の効率向上のための方法。
  2. 【請求項２】 請求項１記載の菌株から生じる突然変異
    体が付加的に、親菌株より僅かなクエン酸シンターゼ活
    性度を有する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 コリネバクテリウム属又はブレビバクテ
    リウム属の菌株を使用する、請求項１又は２記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 Ｌ−アスパラギン酸−β−メチルエステ
    ルに対する耐性を有する、請求項１により得られる、コ
    リネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属のＬ−リ
    シン分泌菌株。
  5. 【請求項５】 付加的に、親菌株より僅かなクエン酸シ
    ンターゼ活性度を有する、請求項２により得られるＬ−
    リシン分泌菌株。
  6. 【請求項６】 Ｌ−リシンを発酵により製造する方法に
    おいて、請求項４又は５記載のＬ−リシン分泌菌株を使
    用することを特徴とする、発酵によるＬ−リシンの製
    法。
JP5004777A 1992-01-17 1993-01-14 Ｌ−リシンを分泌する微生物のコリネ形菌株の効率向上のための方法及び発酵によるｌ−リシンの製法 Pending JPH06197779A (ja)

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