JPH0260590A - 天然型アブシジン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物の代謝機能を利用した天然型アブシジン
酸の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

天然型アブシジン酸は１９６３年カルフォルニア大学の
アディコットなどにより、綿の幼果の落果促進物質とし
て初めて単離され、それ以降植物に対する重要な生理作
用が見出され、今日では植物ホルモンの一種であること
も確認されている。

天然型アブシジン酸の植物生理作用の特徴は、他の植物
ホルモンであるオーキシン、ジベレリン、サイトカイニ
ンなどと拮抗してそれらの作用を打ち消し、植物の生育
を抑制することにあるが、これらの作用のうち最も注目
すべきものは、植物の気孔の閉塞作用である。将来、天
然型アブシジン酸はこのような生理作用を利用して、干
ばつ、冷害などの気候変化に対応できる物質として農業
生産への応用が期待されている。

さらに、ビール醸造における品質向上やコスト低下（特
開昭５８−１０１６７７号公報）などの醸造への利用、
医薬およびその中間体としての利用などが進められてい
る。

従来、アブシジン酸の製造法としては、有機合成法が検
討されてきたが、この方法では光学活性の天然型アブシ
ジン酸を得ることは極めて困難であり、かつ製造コスト
が極めて高価であって上記農業や醸造には利用が実質的
に不可能であった。

近年では、微生物の代謝機能を利用した発酵培養による
微生物法が有機合成法にかわる有力手法として検討され
るにいたり、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）菌による
製造法（特公昭６ｍ−３５８３８号公報）およびセルコ
スポラ・ロシコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ・ｒｏｓｉｃ
ｏｌａ）による製造法〔Ｅｘｐ−ｅｒｉ１１ｅｎｔａ３
３．１５５６　（１９７７））、特開昭５８−３６３９
３号公報、特開昭５６−１６０９９６号公報などが公知
となっている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、上記微生物法の最大の欠点は発酵生産による天
然型アブシジン酸の蓄積量が極めて少量で、かつ発酵生
産速度も極めて遅く、工業的規模での生産手段としては
、極めて能率の悪い点であった。

〔課題を解決するための手段および作用〕そこで本発明
者らは、天然型アブシジン酸を効率よく生産する方法に
関し、鋭意検討を進めた結果、不完全菌の一種であるボ
トリチス（Ｂｏ−ｔｒｙｔｉｓ）属に属し、天然型アブ
シジン酸生産能を有する菌株を培養するにあたり、培地
成分として柑橘類果皮の熱水抽出液を含んだ培地を用い
て液体培養することにより、培地中に蓄積する天然型ア
ブシジン酸が著しく増加することを見出した。また、接
種方法において種胞子を接種することまたは通気撹拌培
養することにより、培地中に蓄積する天然型アブシジン
酸がさらに増加することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔ　ｉｓ）
属に属し、天然型アブシジン酸生産能を有する菌を、柑
橘類果皮の熱水抽出液を含有する液体培地を用いて培養
して、天然型アブシジン酸を生成蓄積せしめ、培養液よ
り得られた天然型アブシジン酸を単離採取することを特
徴とする天然型アブシジン酸の製造方法であり、さらに
併せて菌の種胞子を接種して培養することあるいは併せ
て通気撹拌培養することを特徴とする天然型アブシジン
酸の製造方法である。

以下、本発明を詳述する。

本発明に使用される菌は、ボトリチス属に属する天然型
アブシジン酸生産菌であれば特に限定されず、通常の変
異菌や変異処理によって生じた菌をも含むのらである。

ボトリチス菌に属する天然型アブシジン酸生産菌の菌株
の具体例としてボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉ
ｓ−ｃｉｎｅｒｅａ）ＦＥＲＭ　　Ｐ−６１５６が挙げ
られる。この天然型アブシジン酸生産能を有するボトリ
チス・シネレアの菌学的性質は、すでに特公昭６１−３
５８３８号公報において検討されている。

次に、本発明において天然型アブシジン酸生産に使用さ
れる培地としては液体培地が用いられる。この液体培地
には、フスマ、小麦、米、カンショ、バレイショ、グル
コース、麦芽糖、麦芽エキス、ショ糖、デキストリン、
廃糖蜜、澱粉などの炭素源、脱脂大豆粉、大豆粉、グル
テン、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイ
ーズリカーなどの窒素源が各々単独で、または二種以上
混合して含有される。

このほか、たとえば、マグネシウム塩、カリウム塩、ナ
トリウム塩、リン酸塩などの無機物質、さらにビタミン
類、油脂類、その他を添加することができる。

本発明においては、培養培地すなわち液体培地に柑橘類
果皮の熱水抽出液を含有せしめることが重要である。

ここで、柑橘類としてはいずれも使用可能であり、たと
えば、温州みかん、レモン、バレンシアオレンジ、グレ
ープフルーツなどが用いられる。好ましくは温州みかん
が用いられる。柑橘類果皮から熱水抽出液を取得する方
法は特に限定されない。たとえば乾燥した柑橘類果皮ま
たは生の柑橘類果皮を５０〜ｔｏｏ”ｃの熱水中に浸漬
したのち、濾過またはデカンテーションすることにより
抽出液が得られる。熱水浸漬の時間は熱水の温度による
が、１０分間以上浸漬するのが通常である。好ましくは
、柑橘類果皮を８０〜１００℃の熱水中で３０分程度煮
沸抽出したのち、濾過する方法が用いられる。

柑橘類果皮の熱水抽出液の添加量としては、乾燥果皮重
量として通常１０〜１５０ｇ、好ましくは４０〜１００
ｇの乾燥果皮から熱水抽出した液を１１の培地に添加す
るのが通常である。

かくして得られる培養培地は常法により滅菌処理を実施
し、実質的な無菌培地としたのち、菌を接種する。

滅菌処理を行った培地にはボトリチス属に属する天然型
アブシジン酸生産菌株の菌そのもの、胞子または菌糸の
いずれを接種してもよいが、好ましくは胞子部分を含む
滅菌水を用い、培地中に均一に胞子を分散させることに
より種胞子を接種する方法が採用される。この場合胞子
以外の菌糸体部分が混入してももちろんさしつかえない
。

本発明において種胞子を接種して培養することが特に好
ましい０種胞子を接種して培養することにより、より均
一な液体培養を行うことができ、天然型アブシジン酸を
高濃度に高速度で蓄積せしめることができる。

培養条件は、培養温度が通常１０〜４０℃、好ましくは
２０〜３０℃、培地のｐＨが通常３〜１２、好ましくは
４〜８、培養期間が通常１〜３０日間、好ましくは５〜
１５日間程度であり、雑菌の混入を排除した培養系を用
い培養する。

さらに本発明においては通気撹拌培養することが特に好
ましい、静置培養においても天然型アブシジン酸は生成
するが、通気撹拌培養によりその生成は顕著に促進され
る。

次に培養終了後、培養液より天然型アブシジン酸を単離
するには通常の方法を採用することができ、たとえば以
下に述べる方法が用いられる。

まず、培養液から遠心分離により菌体を除きその上清液
を活性炭に吸着させ、有機溶媒で溶出させる。この場合
の溶出溶媒としてはたとえば、アセトン、メタノール、
エタノールなどの溶媒が用いられる。溶出液中に移入し
た天然型アブシジン酸は通常の分別抽出、吸着、分配、
薄層クロマトグラフィー、蒸留などの一般的な精製法お
よび通常の有機化合物の精製法を応用することによって
単離、ｍｙが可能である。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を具体的に示す。

実施例１ （培地の調整） 表１に示した各液体培地Ａ、Ｂ、Ａ−およびＢ−各１０
０ｍ１を５００ｍ１容エーレンマイヤーフラスコに入れ
、１２０°Ｃ１１５分蒸気滅菌した。

表　　　１ 培地Ａ　：　”クザベクードツクス″ （Ｃｚｏｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地： 次の組成からなる。

ＫＣＩ　　　　　　　　　　０．５ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ Ｋ２ＨＰＯ４１，０ｇ ＮａＮＯ３２，０ｇ グルコース　　　　　　　８０ｇ 蒸溜水　　　　１１ 培地Ｂ：フスマ熱水抽出培地： 小麦フスマ１２０ｇと１ぶ蒸溜水を ３０分間煮沸後、濾過した上滑液を 蒸留水１１に希釈したもの 培地Ａ−：培地Ａの２倍濃縮液士温州みかん乾燥果皮熱
水抽出液の２倍濃縮液８ 培地Ｂ−：培地Ｂの２倍濃縮液＋温州みかん乾燥果皮熱
水抽出液の２倍濃縮液 ※温州みかん乾燥果皮熱水抽出液の２倍濃縮液　： 温州みかん乾燥果皮８０ｇを水１℃で 煮沸し、濾過後１１にメスアップした ものを２倍に減圧：ａ縮した液 （ボトリチス・シネレア種胞子の調整）前記Ａ培地に寒
天２％を加えて作製した寒天培地２０ｍ１を含むシャー
レ上にボトリチス・シネレア（ＦＥＲＭ　−Ｐ−６１５
６＞の保存用種菌を接種し、２５℃で静置培養した。こ
の場合接種後３日間は暗所におき、これに続く４日間は
３６０ｎｍに極大値を有する波長光に照射させながら培
養し、さらにこれに続く１日間を再び暗所で静置培養し
た。この培養菌体を滅菌水に懸濁させ、濾過を行い実質
的にボトリチス菌の胞子だけを含む水溶液を得た。

（天然型アブシジン酸の生産） 各液体培地にＡ、Ｂ、Ａ−およびＢ−に上記で得られた
ボトリチス・シネレア（ＦＥＲＭＰ−６１５６）の胞子
水溶液を植菌し、２５℃、振幅３■、１７２ｒｐｎで１
１日間通気撹拌しながら往復振盪培養した。

培養終了後、遠心分離により菌体を除く、上滑液を高速
液体クロマトグラフィー（カラム：鳥人ＯＤＳ　　Ｃ＋
ａ　　Ａ−３０２４，６ｘｌ　５０間、展開溶媒：　０
．　Ｉ　Ｍリン酸／メタノール＝４６１５４、検出：２
５７ｍ＋）で分析し天然型アブシジン酸を定量した。

結果を表２に示す。

表　　　２ ※ｔｒａｃｅ：２■／グルコースあるいはフスマ１００
ｇ以下 実施例２ 実施例１で示したＢ−培地１（を含む２β容ミニジャー
ファーメンタ−を用い、胞子植菌後、２５℃、８００ｒ
ｐｌ、通気量１ｖｖｎの条件で通気撹拌しながら１１日
間培養した。培養後、遠心分離して菌体を除き上清液を
得た。この上清液を活性炭に吸着させ、アセトンで溶出
した。

このアセトン溶液を減圧１ａＬ、水溶性残渣をｐ　Ｈ９
，０に調節し、酢酸エチルで抽出洗浄した。

残った水溶液をｐＨ３，０に調節したのち、酢酸エチル
で抽出し、得られた酢酸エチル溶液を無水芒硝で乾燥後
、濃縮し、酢酸エチル可溶性酸性区分を得た。

このものをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、ｎ−
ヘキサン／酢酸エチル−３／１で留出しな。精製された
天然型アブシジン酸区分を分別し、濃縮後純粋な天然型
アブシジン酸結晶５０■を得た。

得られた天然型アブシジン酸の結晶の施光度は〔α〕甘
せ＋４１０°　（Ｃ＝０．２３、エタノール）であった
。

〔発明の効果〕

本発明によれば、微生物を利用した発酵培養により、天
然型アブシジン酸を高い蓄積量から速い発酵生産速度で
得ることができ、工業的規模での生産を可能にすること
ができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）属に属し、天然
   型アブシジン酸生産能を有する菌を、柑橘類果皮の熱水
   抽出液を含有する液体培地を用いて培養して、天然型ア
   ブシジン酸を生成蓄積せしめ、培養液より得られた天然
   型アブシジン酸を単離採取することを特徴とする天然型
   アブシジン酸の製造方法。
2. （２）菌の種胞子を接種して培養する請求項１記載の天
   然型アブシジン酸の製造方法。
3. （３）通気撹拌培養する請求項１記載の天然型アブシジ
   ン酸の製造方法。