JPH02502907A - 治療剤を腹膜内投与するためのリポソーム小胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 治療剤を腹膜内投与するためのリポソーム小胞発明の背景 哺乳動物の腹膜腔は、２つの経路、すなわち肺臓毛細血管、およびリンパ系によ って循環自系に排出している。毛細血管の排液は、腹膜腔からの比較的低分子量 の物質（約２０．ＯＯＯＭＷ以下）の除去に主として関与しており、他方種々の リンパ節および胸管と他のリンパ管を通して排液を行うリンパ系は、腹膜腔から の比較的高分子量（約７０．ＯＯＯＭＷ）の物質の除去に主として関与している と考えられている。多くの治療剤に関連する実験によって、このような治療剤が 化学的遊離体として投与された場合、腹膜腔は極めて急速にこれら治療剤を排除 していることが証明されている。このような場合、治療剤は主として循環系を通 過し、比較的速やかに体から排出される。リポソーム小胞が、種々の治療剤をカ プセル化するために使用されており、このような小胞を静注すると肝臓および肺 臓での取り込みが増大するため、カプセル化された治療剤はこれらの器官をター ゲットとして用いることができると示唆されている。

リポソーム小胞を腹膜腔に注射する実験は、一般に、カプセル化した薬剤をリン パ系に多く放出させることをねらったものであった。

すなわち、エレンス（Ｅｌ　１ｅｎｓ）ら［Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　Ａｃｔａ、　６７４巻、　１０−１８頁（１９８１）］は、スフィンゴミエ リンおよびコレステロール中にカプセル化した＋ｔｓ１−標識化ポリ（ビニルピ ロリドン）が、静注と比較して腹膜内注射後では２−３倍も低率で肝臓および肺 臓に取り込まれることを確認している。腹膜腔は、腹膜内注射後、数時間、小胞 を貯蔵する機能を有するものとみられるが、′！５■−標識物の腹膜からのクリ アランスにより、１２時間後に腹膜腔に残っている量は総初期注射量の５％より も少なくなった。多くの研究者が、リポソーム小胞を腹膜内注射した後に、増大 したリンパ取り込みを確認している。すなわち、ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）ら［ Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ１ｉｎ、　０ｎｃｏｌ。

、２０巻、　Ｎｏ、　８．１１０５−１１１２頁（１９８４）］は、ジパルミト イルホスファチジルコリン、コレステロールおよびステアリルアミンから製剤化 された多重ラメラ小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｉｓｉｃｌｅ）を使用 して放射線標識した抗腫瘍性物質である１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシ ン（ａｒａ−Ｃ）をカプセル化した小胞を腹膜内注射した場合、静注よりもマウ スの肺癌の治療に対して有効であることを確認している。この結果は、ａｒａ− Ｃの徐放性に起因するものと理論付けられており、おそらくはリンパ系における 薬物濃度の増大に由来するものであろう。同様に、ヒラメ（Ｂｉｒａｎｏ）およ びハント（Ｈｕｎｔ）［Ｊ、Ｐｈａｒ＋ｓ、Ｓｃｉ、、７４巻、　Ｎｏ、　９（ １９ｇ５．９月）］は、卵ホスファチジルコリン、コレステロール、ジパルミト イル・ホスファチジン酸、およびα−トコフェロールから構成された単ラメラ（ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）小胞および多重ラメラ小胞（直径０．０４８−０．７ ２ミクロン）を腹膜内注射した後の生体分布を測定し、腹膜からリンパ系への吸 収は小胞の大きさに左右されないが（５時間後には、注射した放射線標識物の約 ５０％以上が腹膜から吸収された）、リンパ系内における保持は大きさに依存し ている、と結論付けた。この研究の目的は、腹膜腔内に小胞を保持させるのとは 異なり、リンパ取り込みを増大させることにあった。同様の結果がバーカー（Ｐ ａｒｋｅｒ）ら［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、　４１巻、　１３１１−１３１７ 頁（１９８１，８月）］から得られており、ここでは、ジパルミトイル−ホスフ ァチジルコリン−フレステロール−ステアリルアミン小胞中にカプセル化された アドリアマイシン（直径は０．６ミクロンよりも小さい）が腹膜腔を排出してリ ンパ節に蓄積することが示された。

パーカーらによる初期の研究では［Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂ、　Ｄｉｓｐｏｓ、　 、　１０巻、４０−４６頁（１９８２）］、卵ホスファチジルコリン、コレステ ロール、ステアリルアミン、および放射線標識化ジパルミトイル−ホスファチジ ルコリンから構成し、これを使用してａｒａ−Ｃをカプセル化した小胞（大きさ はおおよそ０．６ミクロンよりも小さい）が、遊離のａｒａ−Ｃと比較して腹膜 内注射した後のリンパ取り込みが増大し、さらに注射６時間後に採取した腹膜自 洗液中の放射線標識化物質が４０−６０％保持されたことを示した。パテルら（ Ｐａｔｅｌ　ａｎｄ　Ｒｙ＋ｍａｎ）は、ナイ）　（Ｋ　ｎ　ｉ　ｇ　ｈ　ｔ　 ）ｒＡ、リポソームズ（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）：Ｆｒｏｍ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　 ５ｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐ＋）ｌｉｃａｔｉｏｎ ｓ、　１５章、　４０９−４４０頁の４２５頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ −Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ　１９８１）において、 大き過ぎてリンパ系に入れない多重ラメラ小胞は、内部取り込まれた薬物（ｉｎ ｔｒａｐｐｅｄ　ｄｒｕｇｓ）の腹膜内注射部位における「貯蔵所（ｄｅｐｏｔ ）Ｊとして機能することができると強調している。しかし、ヒラメら（Ｂｉｒａ ｎｏ　ａｎｄＨｕｎｔ）の最近の研究では（止揚）、腹膜腔からのＭＬＶクリア ランスは、彼らの研究した小胞（直径約０．７２ミクロン以下）では大きさに無 関係であるらしいことが示唆されている。さらに、腹膜腔に保持される程度は、 医療上なんの意義もないことが示されている。

米国特許第４，４２７，６４９号［ディンゲル（Ｄｉｎｇｌｅ）ら、　１９８４ 年１月２４日］は、シミリストイル−、ジパルミトイル−またはジステアロイル ホスファチジルコリンから形成されたリポソーム（直径約０゜１−０．５ミクロ ン以上）でカプセル化された抗炎症性ステロイド誘導体を含有する組成物を閉鎖 した体腔内、例えば関節部内の炎症の治療に使用することが提示されている。腹 膜内に使用することは提案されているが、この企ては試験されておらず、腹膜内 投与に関連してリンパ系排液の問題が認識されたことさえも同等示唆されていな い。例えば、ボスク（Ｐｏｓｔａ）ら［ｉｎ　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編ルｉｐ ｏｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　■巻、　２−２６頁の２０頁（ＣＲＣＰ ｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　１９ｇ４）コは、リポソームを腹膜腔に持続的滞留させ る課題は、リポソームが相当の時間残存することが知られている関節におけるよ りも困難な問題であると強調している。

発明の要旨 本発明は、治療剤を腹膜腔に供給（デリバリ−）するための改良リポソーム小胞 に関する。さらに詳細には、本発明の小胞は、他の供給手段と比較して腹膜腔に 治療剤を持続的に供給することができるので、低用量で投与でき、腹膜への改善 ターゲツティングが可能となる。

本発明の供給用小胞は、脂質成分から構成され、さらに長さ１２から２４個の炭 素数の脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリン群から選ばれるリン脂質成分か らなる（最も好ましくは１６から２０炭素の長さである）。この小胞の直径は、 約１ミクロンから約１５ミクロンまたはそれ以上であり、好ましくは約５ミクロ ンから約１５ミクロンである。好ましいホスファチジルコリンはジステアロイル ホスファチジルコリンである。この小胞脂質成分には、非リン脂質の脂質成分、 好ましくはコレステロールを含有させてもよく、最も好ましい比率はリン脂質： コレステロール＝２　：　０．５−１．５である。非ステロイド系抗炎症剤とし て、例えばイブプロフェンもしくはトルメチン（ｔｏｌｍｅｔｉｎ）、または抗 微生物剤、抗腫瘍剤、免疫調節剤または診断剤などの治療剤を上記のリポソーム 小胞に組込み（含有させ）、これを腹膜内投与すれば、持続された時間で腹膜腔 に供給される。

本発明の他の目的は、本発明のリポソーム小胞を調製するための方法であって、 選択した水和媒質（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａ）の量に対して脂質成分お よび治療剤の相対量を調節することによって治療剤を最大の含有量で小胞に組込 むことを特徴とする方法を開示することにある。

したがって、本発明は、治療剤を腹膜内供給するための改良小胞を提供するもの である。他の目的は、腹膜内で起こる生理的症状を処置するのに有用な供給用物 質に特に適した改良された治療用製剤を提供するものである。さらに、このよう な小胞を調製する方法、および治療結果を得るためにこれらを使用する方法をも 提供するも本発明に関して行った研究により、本明細書で開示している腹膜内リ ポソーム供給用小胞を使用すれば、治療剤の腹膜腔への供給に改善が認められる ことが証明された。これらの供給用小胞は、腹膜腔に延長された時間保持され、 それにより治療剤の供給が増大し、治療剤の特定投与量についての治療効果が長 期にわたる。このことは、より少量の投与量および／またはより少ない投与回数 で治療剤を使用しても、依然として治療活性の有益レベルを保持する医療処置を 可能にする。さらに、本発明は、治療剤が他の体の部位（例えば、リンパ系）に 伝播するのを減少させ、および／またはそれを遅らせることによって、腹膜腔を ターゲットとして治療剤を供給する改良手段を提供するものである。したがって 、本発明は、全身性の薬物供給（ドラッグデリバリ−）とは対照的に、腹膜内に 局在化したドラッグデリバリ−を可能にするものであり、これにより、腹膜内部 、すなわち腹膜腔内、または漿液腹膜に隣接する組織で起こる生理的症状に対し て医療処置することができる。さらに、本発明は治療剤の腹膜腔への持続的な供 給を可能にするものであり、体の他の部分へ移行が望まれる程度に、これらの他 の部分に治療剤を持続放出し得る。

さらに詳細に言えば、本発明の供給用小胞は、治療剤がトルメチンまたはイブプ ロフェンなどの非ステロイド抗炎症剤である場合に、腹膜にしばしば伴う通常の 術後合併症、および例えば腸組織の癒着を予防し、治療することにおいて有用で あることが証明された。他の適用例としては、例えば抗微生物剤の腹膜腔への持 続的供給、腹膜透析法を施している間における例えばインスリンまたは他の薬剤 の腹膜腔への持続的な供給、および例えば卵巣癌の治療期に腹膜腔をターゲット として抗腫瘍剤を供給すること、などが挙げられる。

抗微生物剤としては、アミカシン、ゲンタマイシンおよびトブラマイシンなどの アミノグリコシド、ならびにメチシリン（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ）およびアン ホテリシンＢなどの他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。腹膜内放 出が治療上有益であり得る他の薬剤には、γ−インターフェロン、ムラミル−ジ ペプチドおよびインターロイキン類などの免疫調節剤などがある。抗腫瘍剤には 、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびシスプラチン（ｃｉｓｐｌ ａｔｉｎ）などの細胞毒性抗新生物剤を挙げることができるであろう。診断剤ま たは画像（イメージング）剤も治療剤として使用することができる。本明細書に 記載している供給用小胞の他の用途は、医療業の当業者ならば、明白であろう。

本発明を使用して治療剤を腹膜内供給することの成功は多くの因子によって決定 される。第１に、腹膜内リポソーム供給用小胞［ＩＬＤＶ］の大きさは、直径約 １ミクロンから約１５ミクロンまたはそれよりも大きい範囲である。好ましい大 きさの範囲は、直径約５ミクロンから約１５ミクロンである。このようなＩ　Ｌ ＤＶは、大きさの点で、当業界では「多重ラメラ小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌ ａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＭＬＶ））Ｊとして知られているものに相当する（こ の小胞は、リン脂質二重層を多数有する、だいたい球形のリポソーム構造である ）。

これとは対照的に、一般に直径約２０ｎ＋ａから約１０Ｏｎ＋ｅ（０，０２ミク ロンから０．１ミクロン）の範囲の小さい単ラメラ小胞［ＳＵＶ。

ｓｍａｌｌ　ｕｎｉｌａ＋ｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓコは、本発明のＩ　 ＬＤＶにおける長期の腹膜的保持時間を示さない。大きさの点で一般にＳＵＶと ＭＬＶの中間にある大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は通常、直径は１ミクロンを 越えず、したがって本発明に使用するには比較的容易でない。

本発明を実施する上で２番目に重要な事項は、ＩＬＤＶの組成である。適当な大 きさと組成の特性を有するリポソーム供給用小胞は、このような小胞を腹膜内ド ラッグデリバリ−に有用にする、改善された長期の腹膜的保持時間を示すことが 見いだされている。詳細には、自身のリン脂質成分として、長さ１２から２４個 の炭素数の脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリンを含有するＩ　ＬＤＶは、 本発明に使用するには特に適当である。ホスファチジルコリンの脂肪酸側鎖は、 飽和しており、長さ１４から２０個の炭素数であるのが好ましく、最も好ましく は長さ１６から２０個の炭素数である。好ましいホスファチジルコリンを以下に 例示する（以下に記載の「ＰＣ」はホスファチジルコリンを表す）：通称名　　 　　　　　　一般命名法による名称　　側鎖炭素数ジラウロイルＰＣジ−ｎ−ド デカノイルＰＣＩ２シミリストイルＰＣジ−ｎ−テトラデカノイルＰＣ１４ジパ ルミトイルＰＣジ−ｎ−ヘキサデカノイルＰＣ１６ジステアロイルＰＣジ−ｎ− オクタデカノイルＰＣ１８ジアラキドイルＰＣジ−ｎ−エイコサノイルＰＣ２０ シリグツセロイルＰＣジ−ｎ−テトラコサノイルｐｃ　　　２４１つの高度に好 ましいホスファチジルコリンはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ ）である。ＤＳＰＣを使用すれば、生体内環境で特に安定であり、かつ特に長期 の腹膜的保持時間をも示すＩＬＤＶが得られることが見いだされている。

さらに、ＩＬＤＶのリン脂質成分は、適当なリン脂質の実質的な純品から構成さ れているのが好ましい。例えば、種々の長さの炭素側鎖を有する天然由来のホス ファチジルコリン類の混合物である「卵ＰＣＪでは、Ｉ　ＬＤＶにおいて最大の 腹膜的保持時間または小胞安定性が得られない。腹膜的保持時間と小胞安定性と の両者は、リポソーム小胞の組成に大いに依存していると考えられる。このため 、多（の場合は、例えばリン脂質成分を単一の実質的に純粋なホスファチジルコ リンに限定するなど、注意深（その組成をコントロールすることが好ましい。適 当な精製リン脂質は、例えばＡｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒＬ　１ｐｉｄｓから入手 できる。

ＩＬＤＶ組成物には、コレステロール、コレステロールエステルまたは他の非リ ン脂質の脂質成分を含有させることも好ましい。このような成分は、ＩＬＤＶを 生理学的環境下で安定させるのに役立つようであり、したがって含有された治療 剤の過急速の放出を防いでいる。以下で考察するように、治療剤の長期な腹膜的 保持時間は、Ｉ　ＬＤＶに組み込まれることに由来するのであり、「遊離」の治 療剤（すなわち、Ｉ　ＬＤＶに組み込まれていないか、または腹膜に単独で投与 された治療剤）は、腹膜腔から急速に除去される。したがって、生理学的環境下 において、素早やすぎる程には分解されず、かつ治療剤を急速には「漏出コさせ もしない、安定なＩＬ、ＤＶを得ることが重要である。

コレステロール（ＣＨＯＬ）は、本発明のＩＬＤＶの成分として、非常に好まし い非リン脂質成分である。ホスファチジルコリンとコレステロールの混合物にお けるモル比は、ＰＣ：ＣＨＯＬが約２二０．５−１．５が特に適当であることが 見いだされた。ＰＣ：　ＣＨＯＬモル比が２：１が好ましく、ＤＳＰＣ：　ＣＨ ＯＬのモル比が２：１が特に好ましい比率である。

リン脂質またはリン脂質−コレスチロール混合物は、多くの当業界既知の方法に よって調製することができる。最終産物Ｉ　ＬＤＶを生体内投与しようとする場 合、滅菌すなわち無菌法が一般に要求される。１つの許容された方法は、クロロ ホルムなどの適当な溶媒中に、適当な量のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）および 非リン脂質の成分（コレステロール）を撹拌下に溶解することに関連する。次い で、得られた溶液を、回転減圧蒸留器で穏やかに熱して蒸発乾固させる。蒸留器 の空気取り入れ口に０．２２ミクロン・ミレックス・フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ 　ｆｉｌｔｅｒ）を使用し、蒸留後にフラスコの口へ滅菌用セプタム（ｓｅｐｔ ｕｍ）を付けることによって、滅菌を維持することができる。フラスコの側面を 覆う薄い脂質フィルムを入手する。次いで、セプタムを介して濾過滅菌注射器に よってフラスコに導入した窒素実施例Ｉ Ｌ−α−ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）１．２１ｇおよびコ レステロール０．２９ｇ　（ＤＳＰＣとコレステロールのモル比２：１）をクロ ロホルム４５ＭＱに溶解する。得られた溶液を９つの部分標本５酎に分け、各標 本を１００３１１２容量フラスコに入れる。回転減圧蒸留器を使用し、このフラ スコから溶媒を留去する。フラスコを取り除く前に、蒸留器の空気取り入れ口に ０．２２２ミフロンミレツクスフイルター取り付け、滅菌を維持する。溶媒を留 去した後、滅菌用セプタムをフラスコに取り付ける。各セプタムの表面を７０％ アルコールで拭き、０．２２ミクロンフィルターを固定した１９ゲージ滅菌注射 器を各セプタムに通す。次いで、すべてのフラスコを大容量乾燥器に入れ、−晩 そこで乾燥させる。

フラスコそれぞれに約１６７友ｇの液体が入っている。

別法として、噴霧乾燥（スプレー乾燥）法によってもリン脂質成分を調製するこ とができる。リン脂質、またはリン脂質およびコレステロールを、加熱および撹 拌下に、クロロホルムなどの適当な溶媒に溶解して最小濃度約３０％（ｗ／ｖ） とする。次いで、得られた液体を、空気−窒素混合気体を使用するスプレー乾燥 器で微細な粉末になるまでスプレー乾燥する。これを行う条件を例示すれば、空 気温度７１℃、空気入ｊ１３．５−４．５ｘ”／分、ノズル設定１．５−２．０ ｋｇ／ｃｍ’および注射速度５−８１１２／分である。

治療剤は、適当な溶媒中、適当な脂質成分を用いた水和によって、本発明のリポ ソーム供給小胞に組込むことができる。水和も滅菌すなわち無菌法で行うべきで あろう。これは、一般に撹拌下で行い、例えば旋回撹拌法（ｖｏｒｔｅｘ　ｓｔ ｉｒｒｉｎｇ）［小フラスコの大きさの試料］、および組織／溶液ホモジナイザ ー［大量の試料］で行う。これら撹拌法のいずれによっても、非常に類似した薬 物のカプセル化効率と生体内有効性を有するＩＬＤＶが得られることが見いださ れた。水和混合物の温度は、液体成分の相転移温度に近付くまで加熱すべきでア リ、２　：　ＩのＤＳＰＣ：　ＣＨＯＬ液体混合物テハ、６５℃が適当な温度で ある。研究室規模の試料では、水和は約１時間で完了するであろうが、他方、大 規模な混合物では２４時間までのより長時間を要するであろう。スプレー乾燥法 において、スプレー乾燥と水和のプロトコールを大規模にし、大量のＩＬＤＶを 得ることができることが証明された。この方法により、１−３０リツトル容量の バッチを入手したので、これと同じ方法を利用すれば、より大量のものを入手す ることが可能である。

実施例２ 脂質フィルムからのＩ　ＬＤＶの調製 イブプロフェンナトリウム（Ｎａ−ＩＢＦ）０．２０２ｇを滅菌したパイロジエ ン（発熱物質）不含の水４０！ｉ２に溶解する。次いで、この溶液を０．２２２ ミフロンミレツクスフィルターに通す。

Ｎａ−ＩＢＦ溶液３．９１１２を、脂質フィルムを含むフラスコ中に注射する。

このフラスコを窒素雰囲気下、６５℃の水浴中で４０−６０分旋回撹拌する。（ 穿索浄化はまず０．２２ミクロンフィルターに通して行う。）各フラスコの内容 物に滅菌、パイロジエン不含リン酸緩衝化食塩水を加え、そのフラスコを１５． 　ＯＯＯｒｐｍで６から１０分間遠心する。この洗浄を総数５回繰り返し、カプ セル化されていないＮａ−ＩＢＦを除去する。次いで、フラスコ内容物まとめ、 ＰＢＳ　（０，１５Ｎ　ＮａＣｌ２中、５＋ｏＭ　ＰＯ，”→を総１１３２１１ ２加える。このようにして調製したリポソーム懸濁液は、ＰＢＳ中に懸濁した大 きさ約１ミクロンまたはそれよりも大きいＩＬＤＶを含有している。これは数カ 月間貯蔵安定であるが、長期保存したなら、使用直前に、脱水し、滅菌したパイ ロジエン不含水と再混合するのが好ましい。

薬物不含の対照物を調製するため、水／Ｎａ−ＴＢＦ溶液の代わりに純水を使用 して上記の操作を行う。

この操作を、（ａ）遊離酸形態のＩＢＦ、および（ｂ）トルメチンのナトリウム 塩を使用して繰、り返す。同様の成績が得られ、ＩＢＦまたはトルメチンナトリ ウムを含有するＩ　ＬＤＶを調製する。

脂肪酸部分は他の脂肪酸、例えばＣ１！からＣ９４脂肪酸から誘導したものであ るホスファチジルコリンから小胞を調製するには、類似の操作法を使用できるで あろう。Ｃ０からＣ２゜の飽和脂肪酸が好ましい。

定性を示すＩ　ＬＤＶの製剤には、多くの事項に対する妥当な配慮が必要である 。これには、例えば適当な水和溶媒の選択、脂質および治療剤の適当な相対量の 使用、ならびに適当な水和溶液量の使用などがある。

適当な水和溶媒の選択に当たっては、適量の治療剤を溶解または懸濁できる溶媒 の能力、および適切な特性および治療剤含量を示すＩ　ＬＤＶが形成されるよう な溶媒の能力が絡む。治療剤をＩ　ＬＤＶに組込むに当たってそれを適切な可溶 性に、またはより安定にするために、例えば治療剤を塩形態に変換するなどして 化学的に修飾することが望ましい場合がある。非ステロイド抗炎症薬であるイブ プロフェンおよびトルメチンの場合、それぞれの薬物を遊離酸形態からナトリウ ム塩形態に変換すると、Ｉ　ＬＤＶへの薬物の組込みが顕著に増強されることが 見いだされた。この結果は、高い濃度では適切な小胞の形成を妨げるように働く 遊離酸形態の洗浄剤に似た挙動に由来するものと考えられる。他の場合では、Ｉ 　ＬＤＶに十分に組込まれる程に高い溶解濃度を達成させるために、化学的に修 飾することが必要であるかもしれない。それにもかかわらず、例えばイブプロフ ェンの遊離酸形態から本発明の方法によって調製したＩＬＤＶでも、治療的に有 益であることが証明された。

水和工程では、種々の溶媒または溶媒系を使用することができる。

治療剤であるイブプロフェンナトリウムおよびトルメチンナトリウムを使用した 場合、滅菌水が、ホスファチジルコリン−コレステロール脂質混合物には好まし い溶媒であることが見いだされた。混じり合わない極性および非極性溶媒を使用 する２相の溶媒系を使用しても、Ｉ　ＬＤＶ成分の相対的な極性および非極性溶 解性に応じて有用であり得る。

ＩＬＤＶに組込む治療剤の量は最大であることが一般に好ましいが、すべての場 合に水和混合物中における治療剤の溶解濃度を最大にすることが望ましいわけで はない。むしろ、薬物の組込みと小胞特性に関して最善の結果には、溶媒のイオ ン強度、治療剤の濃度、および脂質濃度の平衡（バランス）が要求される。既述 のように、治療剤がイブプロフェンナトリウムおよびトルメチンナトリウムの場 合のＤＳＰＣ−ＣＨＯＬにおける最善の溶媒は、滅菌水である。

イオン強度の異なる別の溶液によっては、これらの薬剤および脂質成分を溶解す ることができるが、薬物のカプセル化が低下してしまう。

実施例３ Ｉ　ＬＤＶ形成に対する水和溶媒の作用第１表は、イブプロフェンナトリウムＩ ＬＤＶの形成に対する種々の水和溶媒の作用を示すものである。実施例２に記載 の方法によって、ＩＬＤＶを調製したが、これは既述のホモジナイザー撹拌法に よっても調製することができる。第１表における薬物の組込みをＨＰＬＣによっ て確認した。

第１表 種々の水和媒質におけるイブプロフェンナトリウムの包嚢（脂質＝ＤＳＰＣ：Ｃ ＨＯＬ、２：　１）脂質　　　　水和媒質　　　　イブプロフェン　カプセル化 （ｉｇ）　　　　　　（ｖｏｌ）　　　　　　ナトリウム（ｉｇ）　　　（％） ４０　　７０ｍＭ　Ｐｏ４”−（２ｍ１２）　　　　２．０　　　　　１．０５ ４０　　７０＋＋＋ＭＰＯ，’−（２ｉ＋１２）　　　　８．０　　　　　２． ７０４０　　　　　　水　　　（ｌｉＱ）　　　　１０．０　　　　　　５．０ ７４０　　　　　　水　　　（１ｘＣ）　　　　　５．０　　　　２５．０８４ ０　２．５ｍＭ　ＰＯ，ト（１ｘＱ）　　　　５．０　　　　　８．８６４０　 　　　　ＰＢＳ　　　（２ｉ（２）　　　　８．０　　　　１３．０５第１表か ら分かるように、イブプロフェンナトリウムの最善のカプセル化は、約５．０ｉ ｇ／ｘ（ｌイブプロフェンナトリウムを含有する水和水溶液中で、４０夏ｇ／ｘ Ｑ　ＤＳＰＣ：　ＣＨＯＬ脂質（２：１）を使用した場合に得られる。約３．０ ｉｇ／ｘＱから約８．０ｘｇ／ｘρの範囲のイブプロフェンナトリウムが好まし い。同様の脂質濃度、すなわち４０ｘｇ／ｘＱは、トルメチンナトリウムＩＬＤ Ｖの形成に適当であることが見いだされた。

実施例４ ＩＬＤＶ形成に対する脂質および薬物濃度の作用第２表は、種々の脂質組成およ び薬物濃度についての水和水溶液中におけるイブプロフェンナトリウムの水性包 嚢の結果を示すものである。ＤＳＰＣ−コレステロール脂質混合物はカプセル化 物質として優れているが、第２表により、高濃度の治療剤が小胞形成を妨げてい る作用は明らかである。本発明の方法を使用すれば、溶液１村当たり小胞脂質３ ５ｍｇについて約１ｍｇまたはそれよりも多いイブプロフェンナトリウムの正味 の組込みをきまって達成することができる。

第２表 イブプロフェンナトリウムの水性包嚢 （種々の濃度と脂質混合物） 脂質（４０ｍｇ）　　イブプロフェン　溶液容量　カプセル化（組成）　　ナト リウム（ｉｇ）　　　（ｉＱ）　　　　　（％）ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ　　　　３ ５．９　　　　２．０　　　０．１５（２：１） ＤＳＰＣ：Ｃ）ＩＯＬ　　　　ｉｓ、ｏ　　　　　１．０　　　０．２４（２： １） ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ　　　　　９．０　　　　１．０　　　７．８４（２：１） ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ　　　　　４．５　　　　１．０　　２０．３４（２：１） ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ　　　　　４．５　　　　１．０　　１６．９３”（２：１ ） ＤＰＰＣ：ＤＳＰＣ：Ｃ）ＩＯＬ　　　１８．０　　　　１．０　　　０．３１ （６：２：１） 実施例５ トルメチンナトリウムＩ　ＬＤＶの形成第３表は、ＤＳＰＣ：　ＣＨＯＬ　（２ ：　１）小］］２１ニｊ−；ケルトルｊ　ｆンナトリウムの水性包嚢を示すもの である。水中、６５°Ｃで１時間旋回撹拌下に水和を行った後、ＰＢＳ中、Ｉ　 ＬＤＶで６回洗浄した。

カプセル化をＨＰＬＣまたは１′Ｃ−トルメチン測定によって測定した。

第３表 トルメチンナトリウムの水性包嚢 （脂質＝ＤＳＰＣ：　ＣＨＯＬ、２　：　１）脂質　トルメチレン　溶液容量　 カプセル化（ｒｇ）　　ナトリウム（ｒｇ）　　　Ｃｍρ）　　　　（％）４０ 　　　１５　　　　　１．０　　　３５．６４０　　　１５．７　　　　１．０ 　　　１９．７４０　　　１５　　　　　１．０　　　２１．５”４０　　　１ ０　　　　　１．０　　　２７．５４０　　　１０　　　　　１．０　　　３３ ．３寡＊　：　”ｃ　−）ルメチン分析を使用した。

第３表から分かるように、４０ｒｇ／ｘＱ　ＤＳ　ＰＣ：　ＣＨＯＬ　（２：１ ）脂質を加えた水中における濃度１０−１５ｘｇ／１ｒ＝（ｌのトルメチンナト リウムは、適当な水和混合物である。トルメチンナトリウムのより高い濃度、す なわち３０ａ＋ｇ／ｘ（でも、大規模にした調製に有用であることが確認された 。本発明の方法を使用すれば、溶液１１１Ｑ当たり小胞脂質３５１１ｇについて 約２２−３ｘまたはそれ以上のトルメチンナトリウムの正味の組込みをきまって 達成することができる。既述のイブプロフェンナトリウム小胞の場合のように、 例えば５Ｏ−１００ｘｆｆバツチサイズのような大規模にした調製法を使用すれ ば、これら組込みの治療的に有用なレベルが維持される。

異なる治療剤と異なる脂質成分についてＩ　ＬＤＶを調製するための各種成分の 適当な濃度は、本明細書に記載した操作法による通常の実験によって確認するこ とができる。

既述の水和操作法により、Ｉ　ＬＤＶが調製される。水和した後に、得られた小 胞溶液を高速混合ホモジナイザーで数分混合すると、均質にするには有用であろ う。精製は、得られた小胞を滅菌水またはＰＢＳで洗浄し、得られた混合物を約 ３０．０００Ｇで６−１０分遠心し、次いで上清をデカントすることによって行 うことができる。

この工程は、５−７回繰り返す。大規模な精製は、緩衝液または他の溶媒中の小 胞を、加圧下に超濾過膜を通してポンプ注射し、組込まれていない治療剤などの 低分子量の成分を除去するような超濾過透析によって行うことができる。

得られたＩ　ＬＤＶは一般に、直径１−１５ミクロンの範囲内にある大きさであ り、ＭＬＶ構造を有している。小胞はさらに、ＰＢＳに再懸濁し、種々のサイズ の幾つかのマイクロフィルターに通すことによって、大きさに関して精製するこ ともできる。適当な保存溶液には、緩衝液中に、組込まれた薬剤量１１−５ｘ／ ｚ（ｌまたはそれ以上と共に、約３５ｘｇ／ｘＱの小胞を含有させる。既述のよ うにＤＳＰＣ：　ＣＨＯＬ（２：　１）を使用して調製したイブプロフェンナト リウムおよびトルメチンナトリウム小胞の場合、小胞の大きさは通常、直径が約 １０ミクロンであった。これは、小さい（１ｔ、（１’）および大きい（例えば ５０−１５０−１Ｏ０の調製バッチの両者で当てはまる値であった。

精製後は、ＩＬＤＶはＰＢＳの懸濁物として保存してもよく、または乾燥して安 定な粉末としてもよい。保存する前には、組込んだ活性成分および個々の小胞製 剤の安定性に応じて蒸気滅菌またはオートクレーブなどの１つまたはそれ以上の 滅菌工程に供すことができる。

本発明のＩ　ＬＤＶを使用して行った試験によって、本発明の小胞が長期の腹膜 内保持および薬物供給時間を示し、さらに観測可能な治療的有用性を有している ことが判明した。既述のように、当業界の従来からの研究では、種々の大きさお よび組成のリポソーム小胞が、各種のリンパ系因子による実質的な取り込みによ って、腹膜腔から容易に排除されることが示されている。しかし、本発明のＩＬ ＤＶは、当業界で従来知られていた期間を越えた期間で、治療剤を腹膜腔に供給 することができる。

実施例６ 腹膜的投与後の遊離放射線標識物の生体分布エチレンジアミン四酢酸にキレート させたγ−線放出放射性同位元素インジウムーｍ　（”’Ｉ　ｎ−ＥＤＴＡ）を 使用し、ラットにおいてインビボ生体分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔ　１ｏｎ ）試験を行い、腹膜内投与した遊離”’Ｉｎ−ＥＤＴＡが急速に排出されるのが 確認された。

本発明に関する試験として、０時点で、ラットに”’Ｉｎ−ＥＤＴＡを腹膜内注 射し、種々の時間にラットを殺した後、各種組織と検体における放射性同位元素 の取り込みを測定した。第４表は、これらの検体の取り込み値を示すものである 。第４表に指摘した時間に、動物を麻酔し、全血を採取し、腹膜腔をリン酸緩衝 化食塩水２０ｉＱで３回洗浄した。洗浄液をまとめ、低速で遠心した。「腹膜液 （ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｆｌｕｉｄ）Ｊとは、洗浄して腹膜腔から採取した液 を意味し、小さい大きさの小胞を含有している。「腹膜ベレット」とは、洗浄し た腹膜液のペレット化された部分を意味し、細胞物質（主として腹膜マクロファ ージ）を含有している。残った組織を採取し、洗浄し、プロット（吸取り）し、 重さを計り、γ−線のカウント用試験管に分配した。すべてのデータは、指摘し た時間にラットを殺し、次いで各試料物質から回収された全注射”’Ｉｎ−ＥＤ ＴＡに対するパーセントを３匹のラットについて平均した値である。

第４表 ”’Ｉｎ−ＥＤＴＡ生体分布、フリー注射（１０ｕＣｉ／１．５１） １時間（％）　　２時間（％）　　６時間（％）　　２４時間（％）注射投与量 　　注射投与量　　注射投与量　　注射投与量血液　　　　２．４　　　　　０ ．２０９　　　０．１４８　　　０．１肝　　　　　０．４４　　　　０．１４ ０　　　　０．’１２２　　　　０．１牌　　　　　０．０２　　　　０．００ ８　　　　０．００８　　　　０．００６腎　　　　　　１．６７　　　　０． ７８０　　　　０．５５　　　　　０．４胃　　　　　　０．１１９　　　　０ ．０３８　　　　０．０３３　　　　０．００８５ｍ、ｌｎｔ　　　　１．４２ ４　　　０．４８　　　　０．６２６　　　０．　ＩＬｇ、Ｉｎｔ　　　　Ｏ， １４１０，７８０１，８４９２，３腹膜液　　　２．７５７　　　０．３０６　 　　０．００７　　　０．０１５腹膜ペレツト　　０．０１１　　　０．００５ 　　　０．００７　　　０．００４尿　　　　１９　　　　　　７３　　　　　 　　６０．２　　　　　１４．０５糞便　　　　４．６　　　　０，０２　　　 　７．６　　　　１６．８３合計　　　３２．５８　　　７６．７３　　　７１ ．２７　　　３３．９１第４表に示されているように、”’Ｉｎ−ＥＤＴＡの腹 膜内注射により、腹膜腔および体全体からの急速なりリアランス（消失）が認め られる。肝、腎および糞便の”’　Ｉ　ｎ−Ｅ　Ｄ’ＴＡレベルの調査は、吸収 およびリンパ系移行が排泄のための機構であり得ることを示している。

実施例７ 腹膜内投与後の放射線標識化Ｉ　ＬＤＶの生体分布第５表および第６表は、ＤＳ ＰＣ：　ＣＨＯＬ（２：　１）から構成されるＩＬＤＶに組込んだ”’Ｉ　ｎ− ＥＤＴＡを注射したう・ノドについて比較した、実施例６のデータとの比較デー タを示すものである。

これらの表から分かるように、６時間後に、注射”’Ｉ　ｎ−ＥＤＴＡの約６０ ％が腹膜腔から回収され、１２０時間後でさえも、約１０％が依然として回収可 能であった。さらに、肝および腎の値は、この同じ材料の静脈内注射後に得られ た値よりも約３−５倍低い値である。

第５表 １目Ｉｎ−ＥＤＴＡ生体分布、ＤＳＰＣ：　ＣＨＯＬ小胞（３，８３ｕＣｉ、２ ０．５７ｘｇ脂質／う・ソト）１時間（％）　　３時間（％）　　６時間（％） 　　８時間（％）注射投与量　　注射投与量　　注射投与量　　注射投与量血液 　　　　０．５２３　　０．４４８　　　０．１１　　　　０．１４５肝　　　 　　０．５７６　　　２．２７．　　　　３．４１５　　　６．３３牌　　　　 　０．０３６　　　０．７５３　　　０．４３３　　　　１．８４腎　　　　　 ０．２８４　　　０．１４７　　　　０．１１８　　　　０．１４５胃　　　　 　　０．２０３　　　０．０２３　　　　０．２５９　　　　０．３４３５ｍ、 Ｉｎｔ　　　　Ｏ，２６１１，１１６０，１８２０，５１４Ｌｇ、ｌｎｔ　　　 　Ｏ，０５３０，１３９１，０２１，２７腹膜液　　１２．２９　　　１１．０ ５　　　１１．１８　　　　１．４３腹膜ベレツト　４０．６６　　５６．２９ 　　　５１．６７　　　４４．５８尿　　　　　２．３１７　　　７．０１　　 　　　９．１５　　　　　６．３２８糞便　　　　２．４９　　　　２．７２２ 　　　３．９２　　　　０．１４合計　　　５６．６９　　　８２．２８　　　 ８１．４５　　　６２．９３第６表 ”’Ｉｎ−ＥＤＴＡ生体分布、ＤＳＰＣ：　ＣＨＯＬ小胞（３，６２２ｕＣｉ、 ２０ｍｇ脂質／ラット）３時間（％）２４時間（９４８時間（％）７２時間（％ ）１２０時間（％）訓　　樹　訓　訓　訓 投与量　　　　投与量　　　投与量　　　投与量　　投与量血液、　　　　０． ２７８　　　０．０５６　　　０．０３　　　　０゜５５　　　０．０３肝　　 　　　１．６５９　　　６．６９　　　　　７，９４　　　　９．２　　　　５ ．３６牌　　　　　０．１９７　　　１．４４　　　　　０．７７５　　　２． ３３　　　１．２１腎　　　　　０．２２３　　　０．１４７　　　　０．１２ ６　　　０．１４２　　０．１４９胃　　　　　０．０６９　　　　４．２５　 　　　　　’０．８３８　　　　１．２６　　　　０．８０１ＳＬｌｎｔ　　　 　Ｏ，３２０，１９１０，２２９０，９２５１，１４６ＬＬｌｎｔ　　　　Ｏ， ０５３０，７９２０，２５９０，２０９０，５０８腹膜液　　１４．２　　　　 　３．４　　　　　１．１４３　　　０．２６８　　２．４１腹膜ベレフト　４ ２．３７　　　３４．６　　　　２２．７３　　　１２．５３　　　７．４８尿 　　　　　５．７２ １６．６　　　　２２．４３　　　３０．８４−二ｊ［（９：　　　　２．２４ −一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一一一−合計　　　６７−３ ９　　　６４．３４　　　　５６．５０　　　５７．７６第６表に示す試験では 、”’Ｉｎ−ＥＤＴＡについて腹膜ペレットをカウントし、全細胞内容物につい て部分量をカウントし、次いで得られた全細胞懸濁物を培養物中にプレートした 。培養の３時間後、得られた細胞を洗浄し、接着した細胞（マクロファージ）を カウントし、次いでその接着細胞を採取して”’Ｉ　ｎ−ＥＤＴＡについてカウ ントした。全細胞集団の約９０−９５％が接着細胞であった。しかし、接着細胞 から回収された注射投与量の％は、注射投与量の０．０３％から０．５％しかな かった。したがって、指摘した時間に回収された”’Ｉ　ｎ−ＥＤＴＡは、残っ た無傷の腹膜内ＩＬＤＶを表していた。

放射線標識化イブプロフェンおよびトルメチンを使用して行った実験では、本発 明のＩ　ＬＤＶが長期の残留時間で活性成分を腹膜腔に供給するのに有効である ことを示している。さらに、イブプロフェン、イブプロフェンナトリウム、およ びトルメチンナトリウムを含有する腹膜内投与ＩＬＤＶで投与ウサギを処置する ことによって、外科的に誘発させた組織外傷後の外科的な癒着の進行を妨げ、ま たは減少させる本発明のＩ　ＬＤＶの治療上の有用性が証明された。

実施例８ 腹膜内ＩＬＤＶ投与後の放射線標識化イブプロフェンの生体分布第７表は、”’ Ｉｎ−ＥＤＴＡ小胞の生体分布に関して既述したように、ラットに腹膜内投与し た後の３Ｈ−イブプロフェンＩＬＤｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから入手した 。小胞を水溶液水和媒質中で調製した後、均質にし、遠心／再懸濁したく６回） 。シンチレーションカウンター法によって放射活性を測定した。２つの洗浄液、 すなわち最初に水（３回）、次いで１０％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ を使用し、残った小胞または有り得る薬物の組織への接着を除去した。採取した 洗浄液を遠心し、細胞および残余小胞を含有するベレット、ならびに遊離薬物を 含有する上清をシンチレーションカウンターによって計数した。肝、牌、および 腎も採取し、細分し、プロトゾール（Ｐｒｏｔｏｓｏｌ）で消化し、次いで放射 活性を計数した。。

第７表 ３Ｈ−イブプロフェン生体分布、ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ小胞（５５７，６６０ｄｐ ｍ、　　３７ｉｇ脂質／ラット）３時間（％）　　５時間（％）　　２４時間（ ％）注射投与量　　注射投与量　　注射投与量血液　　　　２．５４　　　　１ ．２７　　　　０．３７肝　　　　　６．８３　　　　８．６７　　　　１１． ７牌　　　　　０．４０　　　　２．４８　　　　　１．９６腎　　　　　　０ ．６０　　　　　０．４４　　　　　　０．３７洗浄液　　１１．１　　　　６ ．２５　　　　１．１５腹膜ベレツト　２７．０　　　　１９．６５　　　　５ ．０４腹膜総量　　３９．５５　　　２７．２２　　　　７．３６尿　　　　１ ０．４５　　　１３．８９　　　　３８．０２糞便　　　　２．９２　　　７． ７９　　　２１．４５合計　　　６３．２９　　　６１．７６　　　８１．２７ 註）小胞は比率２：１のＤＳＰＣ：　ＣＨＯＬから調製し、各時点では２匹のラ ットを使用した。１つの２４時間注射では、注射投与量の１２，７％が皮下にあ ることが分かった。「％注射投与量」の計算に当たっては、この１２．７％を最 初の投与量から除いた。

第７表における３Ｈ−イブプロフェンの腹膜試料への生体分布は、第５表および 第６表の”’Ｉｎ−ＥＤＴＡのそれよりも低いが、それにもかかわらず、測定し た値は、例えば遊離”１■ｎ−ＥＤＴＡの注射（第４表）と比較して腹膜供給の 顕著な増加および保持時間を示している。注射投与量に基づく％では、肝、牌お よび腎に見いだされる見掛けの薬物量は、静注した小胞製剤で主として観察され る注射投与量よりも４０−５０％低い。

本発明のＩ　ＬＤＶにおける治療剤を持続的に腹膜腔に供給する能力は、注射量 に対する初期注射後の特定の時間に腹膜内部に残存する治療剤の％とじて測定す ることができる。第７表から分かるように、持続的な供給は、２４時間後の腹膜 内部に残存する治療剤が初期注射投与量の少なくとも５％存在することから明ら かである。

さらに、腹膜内投与したイブプロフェンおよびトルメチンＩＬＤＶの治療上の有 用性は、他の供給用小胞のそれよりも優れていることが証明された。この点に関 し、同時継続中の出願番号第９００゜１２２号［ジゼレガら（Ｇ、Ｓ、ｄｉＺｅ ｒｅｇａ、　Ｄ、Ｂ、Ｊｏｈｎｓ、　Ｓ、Ｗ、５ｈａｌａｄｙ、　ＬＤ、　５ｈ ｅｆｆｉｅｌｄ、およびｌ、　１．Ｒｉｃｈｅｒ）の１９８６年８月２５日出願 の「非ステロイド系抗炎症剤の局所投与による術後癒着形成を阻害する方法」コ を引用して本明細書の開示とする。

癒着形成は、実際上解決法のない主要な術後合併症である。幾つかの情報源によ れば、手術後の癒着形成の傾向は１００％に達しており、手術の種類に応じて臨 床上重要な合併症の発生率は約５−１０％である。このような合併症の中には、 腸閉塞、不妊症、および疼痛などがある。癒着は、時には、癒着を除去する別の 手術を要することがあるが、これはさらに問題を悪化される場合がある。

動物実験および限られたヒトの臨床試験の結果に基づき、イブプロフェン（これ はしばしば抗生物質などの他の薬剤と併用される）などの非ステロイド系抗炎症 剤の全身投与は、術後癒着を減少させることが現在知られている最も有効な薬理 学的手段であるようである。この手段の難点は、比較的大量の薬物を数日にわた って投与しなければならないために、患者が悪丸１副作用にさらされるという重 大な危険を伴うことである。さらに、この手段では、限られた数のタイプの手術 、例えば婦人科領域の手術にしか有効でないことが示されている。癒着に対処す るためにイブプロフェンを全身投与することは、一般に、数日間の治療期（術前 処置を含む場合がある）で２０ｍｇイブプロフェン／ｋｇ／日の過剰量を要する とみなされている。２．５ｘｇ／ｋｔｔ／日程に少ない投与量が推奨されている ［シンガー　（Ｓｉｎｇｅｔ）、米国特許第４．３４６，１０８号］。

イブプロフェン、およびその薬学的に許容され得る塩またはエステルに加え、他 の非ステロイド系抗炎症薬剤、例えばトルメチン、インドメタシン、スリンダッ ク（ｓｕｌｉｎｄａｃ）、スブロフエン、オキシフェンブタシン、およびそれら の薬学的に許容され得る塩またはエステルなどを癒着、または他の炎症関連疾患 の治療に使用することができる。既述のように、イブプロフェン、イブプロフェ ンナトリウムおよびトルメチンナトリウムは、本発明のＩ　ＬＤＶで腹膜内投与 したとき、癒着を予防するのに特に有用であることが確認されている。例えば、 本発明のＩ　ＬＤＶ中における総投与量約０．１５ｍｇ／ｋｇのイブプロフェン は、腹膜側壁および大腸の隣接部位に擦傷（約１５ＣＩ’）を負わせたウサギの 癒着形成を、実質的に完全に予防して有効であったことが見いだされた。同様に 、総投与量約７．３ｍｇ／ｋｇのトルメチンにより、子宮角（ｕｔｅｒａｌ　ｈ ｏｒｎ）損傷の重篤な分娩外傷を受けたウサギで僅かな癒着しか形成されなかっ た。これらの結果は、例えばポリ（ラクチドーコーグリコリド［６５：３５］） マイクロカプセルに含有されたイブプロフェン、小型ポンプ投与したイブプロフ ェン、スプロフェン、スプロフェンナトリウムまたはＰＢＳ中トルメチンナトリ ウム、水性トルメチンナトリウム、および各種濃度のエトキシル化ソルビタン・ モノ−オレエート（Ｔｖｅｅｎ８０）と併用したトルメチンの腹膜内投与によっ て得られる結果と、同等であるか、または優れている。

実施例９ Ｉ　ＬＤＶ腹膜内投与による癒着の予防第８表および第１０表は、本発明のＩ　 ＬＤＶを使用してウサギで行った癒着予防実験の結果を示すものである。これら の表では、ニューシーラント雌性臼ウサギ（１，８−２，０ｋｇ）をアセレプロ マジン（ａｃｅｌｅｐｒｏｍａｚｉｎｅ）およびケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ） 麻酔して中線腹壁切開した。右横腹膜の側壁上に、その表面腹膜を外科用メスで ３ｘ５ｃｍ領域全体が斑点状に出血するまで掻き、３ｘ５Ｃ１１四方の擦傷を負 わせた。これと同じ方法によって、左横腹膜の側壁に沿った面の最初の部位より も下方に、１．５−２．０ｃｍ四方の同じ総面積（１５Ｃ１つの別の擦傷を負わ せた。この２番目の部位は非処置の対照として使用した。この腹膜損傷部位に隣 接する大腸の漿膜表面にも同様に擦傷を負わせた。

擦傷をつけた日から７日後に、ウサギをベンドパルビクールの過剰投与によって 殺した。癒着の程度を以下のように評価した：１、癒着なし ２、薄皮性癒着（分離可能） ３、軽度癒着（分離できない一試験領域の約３５％までを占める）４、中度癒着 （分離できない一試験領域の約３５から６０％を占める） ５、重度癒着（分離できない一試験領域の約６０％以上を占める）本実施例で使 用したＩ　ＬＤＶは、既述の方法と同様の方法によって調製したＤＳＰＣ：　Ｃ ＨＯＬ（２：　１）で構成させた。処置混合物は、５ＩＩＩＭ　リン酸緩衝化食 塩水中に懸濁させた、ＩＬＤＶ１２００ｘｇおよび遊離酸形態のイブプロフェン ３５ｍｇを含有する３１ＭＱ懸濁液であった。対照ビヒクルは、イブプロフェン を入れないことを除いては上記と同様の組成であった。ウサギ１匹当たり各々イ ブプロフェン３．５ｍｇとなる量で懸濁液１０１１２を投与した。処置および対 照ビヒクル懸濁液を損傷部位に直接滴下した。６匹のウサギは、右側壁部位にリ ポソーム／イブプロフェン処置を行い、他の部位は処置せず、また６匹のウサギ は、右側壁を対照ビヒクル処置（すなわちイブプロフェン不含のリポソーム）し 、他の部位は処置しなかった。処置後７日目にウサギを殺し、既述のように評価 した。得られた結果を以下の第８表に示す。

第８表 イブプロフェン癒着保護結果 第８表で示した実験では、イブプロフェン／リポソーム組合わせの処置を行った ウサギは実際、薬剤を直接投与しない部位さえも癒着は起こらなかった。このこ とは、薬物が腹膜液の循環の結果、腹膜内で移動することができることを示して いると考えられる。さらに、肉眼観察によると、処置部位では組織反応または肉 芽腫が認められなかった。

第１０表は、イブプロフェンナトリウムを含有するＩＬＤＶ（ＤＳＰＣ：　ＣＨ ＯＬ、２　：　１）を、薬物を含有しない対照ＭＬＶを種々の比率で併用して投 与した、既述の方法と同様の癒着予防実験の結果を示すものである。対照ＭＬＶ 　（ＭＬＶ−１およびＭＬＶ−２）およびイブプロフェンナトリウムＩＬＤＶを 以下の第９表に示す成分比率で調製した。

第９表 水和容量　　脂質　　総脂質　　薬物　　薬物／脂質（ｉｇ）　　　（ｉｇ／肩 の　　（ｉｇ）　　　（πｇ／１Ｉ２）　　（重量比）ＭＬＶ−１５０３３１６ ７５００ ＭＬＶ−２５０３４１７１００Ｏ ａ− イブブ［＋７！：／　　　　　　　　５０　　　　　　　３３　　　　　１６７ ５　　　　０．９８　　　　　０．０２９１ＬＤＶ　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　（４９ｇ）第１０表では、薬物−含有および対照小胞を一緒に混合 し、投与して既述のようにウサギを試験したそれらの比率を、手術後７日目にお けるウサギの評価結果と共に示しているものである。

第１０表 イブプロフェンナトリウム癒着保護結果Ｎａ−対照　　　　　　評　　　価 ウサギＮｏ、　　イブプロフェン　　ＭＬＶ　　　処置部位　　非処置部位ＩＬ ＤＶ（ｘ（１）　　　　（ｉの ２　　　　　　１０　　　　　　０　　　　　３、　　　　　３１２　　　　　 　０．３　　　　９．７　　　　１　　　　　　３１３　　　　　　０．３　　 　　９．７　　　　１　　　　　　３上述の癒着実験では、Ｉ　ＬＤＶの最小有 効量は明らかにならなかったようにみえる。しかし、第１０表のウサギ１２およ び１３から、ＩＬＤＶ担体中のイブプロフェンナトリウムが総投与量約０．３ｍ ｇで有効であることは注意すべきである。これは約０．１５ｘｇ／ｋｇと同等で あり、または損傷組織領域０．０２ｘｇ／ｃｍ”と同等である。

これらデータの妥当な外挿法により、癒着予防のために適用する単回投与におけ る非ステロイド系抗炎症薬物製剤の最小の有効濃度は、適用するＩ　ＬＤＶ溶液 １１１１２当たり活性薬剤約０．０２５ｍｇから５虞ｇであろうことが判明して いる。これらまたは他の適用例における適当なＩＬＤＶの投与量は、当業界の常 法である通常の実験によって確認できるであろう。

実施例１０ 子宮角モデルの癒着予防 他の種類の癒着予防実験として、癒着発現のモデルとしてニューシーラント雌性 臼ウサギを使用した。このタイプの外科的手法で惹起させた外傷は、手術に通常 伴うあらゆる外傷よりも重篤な癒着を招来し易いと考えられるので、この試験は 術後癒着の形成阻害について薬物の効能を評価する試験としては非常に厳しい試 験である。

ウサギをアセレプロマジン（ａｅｅｌｅｐｒｏｍａｚｉｎｅ）およびケタミン（ ｋｅｔａ＋５ｉｎｅ）で麻酔した後、下方の中腹壁を切開した。次いで、両子宮 角の漿膜表面をガーゼ外科用スポンジで握り、斑点状に出血するまでむしって擦 傷を負わせた。

このように子宮角に外傷を負わせた直後に、トルメチンナトリウムを含有する種 ｋＯ）１１０）ＤＳＰＣ：　ＣＨＯＬ（２：　１）Ｉ　ＬＤＶ　（既述の方法と 類似の方法によって調製し、ＰＢＳに懸濁して懸濁液１１１１２当たりＩＬＤｖ ４０１１ｇおよびトルメチンナトリウム１．４６ｘｇとする）を外傷部位に滴下 し、次いで縫い合わせた。手術の７日後、ウサギを殺し、粘着の発現度を評価し た。

この評価の結果を、外科的外傷部位に滴下したＩ　ＬＤＶ懸濁液の量を示す容量 値と共に以下に示す： １０ＲＱ−僅かな癒着 ３ＲＱ−僅かな癒着、しかし１０ＭＱ投与量よりも幾分重い癒着であった。癒着 は薄皮性であった。

１ｊ１１２−軽度癒着 対照（薬物なし）−重度癒着：実際、子宮と腸、および子宮と前腹膜壁とで形成 された癒着を引き裂くことなく、ウサギを開くことはできなかった。

上記の試験をトルメチンＩＬＤＶを使用して数回繰り返したが、本質的に同じ結 果が得られた。

上記の実験におけるＩＬＤＶの適用法は、擦りむいた腹膜内外傷部位に直接滴下 する方法であったが、特に腹膜内投与などの他の適用法を使用することもできる ことは明らかである。腹膜腔内部のＩＬＤＶが例えば腸の輪動収縮などに起因し て自然に移動することが上記の実験で観察され、直接適用部位以外の腹膜内部位 に治療の有益性が認められたことを注意しておく。さらに、種々の症状を治療す るために、当業界の通常の実験および常法により認められる適当な投与量および 投与方法によって、既述の非ステロイド系抗炎症剤の代わりに他の活性治療剤を 使用することができる。

国ａＳ査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．炭素数１２から２４個の長さの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリン群 から選ばれるリン脂質からなる脂質成分、および直径約１ミクロンから約１５ミ クロンの大きさのリポソーム小胞に組込まれた治療剤 からなることを特徴とする治療剤を腹膜腔へ持続的に供給するのに適したりポソ ーム小胞。 ２．該リン脂質成分が、炭素数１６から２０個の長さの飽和脂肪酸側鎖を有する ホスファチジルコリン群から選ばれる請求項１に記載のリポソーム小胞。 ３．該脂質成分がさらに非リン脂質の脂質成分を含有する請求項１に記載のリポ ソーム小胞。 ４．該リン脂質成分と該非リン脂質の脂質成分とのモル比が２：０．５−１．５ である請求項３に記載のリポソーム小胞。 ５．該リン脂質成分がジステアロイルホスファチジルコリンであり、該非リン脂 質の脂質成分がコレステロールである請求項４に記載のリポソーム小胞。 ６．ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとのモル比が約２： １である請求項５に記載のリポソーム小胞。 ７．該リン脂質成分として、単一の実質的に純粋なホスファチジルコリン化合物 が選ばれる請求項１に記載のリポソーム小胞。 ８．該治療剤が、非ステロイド系抗炎症薬剤、抗腫瘍剤、抗微生物剤、免疫調節 剤、または診断剤からなる請求項１に記載のリポソーム小胞。 ９．該非ステロイド系抗炎症薬剤が、イブプロフェン、イブプロフェンの塩類、 トルメチン、およびトルメチンの塩類から選ばれる請求項８に記載のリポソーム 小胞。 １０．該小胞が多重ラメラ小胞である請求項１に記載のリポソーム小胞。 １１．直径が約５ミクロンから約１５ミクロンの大きさである請求項１０に記載 のリポソーム小胞。 １２．ジステアロイルホスファチジルコリンからなるリン脂質成分、 コレステロール成分、および 直径約１ミクロンから約１５ミクロンの大きさのリポソーム小胞に組込まれた治 療剤 からなることを特徴とする治療剤を腹膜腔へ持続的に供給するのに適したりポソ ーム小胞。 １３．ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとのモル比が２： ０．５−１．５である請求項１２に記載のリポソーム小胞。 １４．ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとのモル比が約２ ：１である請求項１３に記載のリポソーム小胞。 １５．該リン脂質成分として、実質的に純粋なジステアロイルホスファチジルコ リンが選ばれる請求項１２に記載のリポソーム小胞。 １６．該治療剤が、非ステロイド系抗炎症薬剤、抗腫瘍剤、抗微生物剤、免疫調 節剤、または診断剤からなる請求項１２に記載のリポソーム小胞。 １７．該非ステロイド系抗炎症薬剤が、イブプロフェン、イブプロフェンの塩類 、トルメチン、およびトルメチンの塩類から選ばれる請求項１６に記載のリポソ ーム小胞。 １８．該小胞が多重ラメラ小胞である請求項１２に記載のリポソーム小胞。 １９．直径が約５ミクロンから約１５ミクロンの大きさである請求項１８に記載 のリポソーム小胞。 ２０．腹膜内部で起こる生理的症状を処置するために選ばれる治療剤が組込まれ ている、炭素数１２から２４個の長さの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリ ン群から選ばれるリン脂質成分からなる直径約１ミクロンから約１５ミクロンの 大きさのリポソーム小胞からなることを特徴とする治療剤を腹膜腔へ持続的に供 給するのに適した治療用製剤。 ２１．腹膜腔に供給される治療剤の量が、初期投与後２４時間経過時において、 少なくとも治療剤の全初期投与量の約５％のレベルで維持されているものである 請求項２０に記載の治療用製剤。 ２２．該リン脂質成分が、炭素数１６から２０個の長さの飽和脂肪酸側鎖を有す るホスファチジルコリン群から選ばれる請求項２０に記載の治療用製剤。 ２３．該リポソーム小胞がさらに非−リン脂質の脂質成分を含有し、リン脂質成 分と非−リン脂質の脂質成分とのモル比が２：０．５−１．５である請求項２０ に記載の治療用製剤。 ２４．該リン脂質成分がジステアロイルホスファチジルコリンであり、該非リン 脂質の脂質成分がコレステロールであり、そしてリポソーム小胞内におけるジス テアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとのモル比が約２：１である 請求項２３に記載の治療用製剤。 ２５．該治療剤が、非ステロイド系抗炎症薬剤、抗腫瘍剤、抗微生物剤、免疫調 節剤、または診断剤からなる請求項２０に記載の治療用製剤。 ２６．該非ステロイド系抗炎症薬剤が、イブプロフェン、イブプロフェンの塩類 、トルメチン、およびトルメチンの塩類から選ばれる請求項２５に記載の治療用 製剤。 ２７．請求項２０に記載の治療用製剤の治療学的有効量を投与することを特徴と する腹膜内部で起こる生理的症状の処置方法。 ２８．腹膜内注射によって投与する請求項２７に記載の方法。 ２９．（１）炭素数１６から２０個の長さの飽和脂肪酸側鎖を有するホスファチ ジルコリンからなる脂質成分を調製し、（２）適当な水和媒質中で、適量の該脂 質成分を適量の治療剤と一緒にし、 （３）該治療剤が組込まれた、直径約１ミクロンから約１５ミクロンの大きさで あるリポソーム小胞を調製する方法において、工程（３）を行うに際してリポソ ーム小胞への治療剤の組込みが最大になるように、工程（２）における脂質成分 と治療剤との量を選択することを特徴とする治療剤を腹膜腔へ持続的に供給する のに適したりポソーム小胞の調製法。 ３０．該脂質成分がジステアロイルホスファチジルコリンおよび非リン脂質の脂 質成分からなり、該治療剤がイブプロフェンまたはイブプロフェンの塩であり、 工程（２）における脂質成分の量が水和媒質に対して約４０ｍｇ／ｍｌであり、 工程（２）における治療剤の量が水和媒質に対して約３．０ｍｇ／ｍｌから約８ ．０ｍｇ／ｍｌである請求項２９に記載の方法。 ３１．該脂質成分がジステアロイルホスファチジルコリンおよび非リン脂質の脂 質成分からなり、該治療剤がトルメチンまたはトルメチンの塩であり、工程（２ ）における脂質成分の量が水和媒質に対して約４０ｍｇ／ｍｌであり、工程（２ ）における治療剤の量が水和媒質に対して約１０ｍｇ／ｍｌから約１５ｍｇ／ｍ ｌである請求項２９に記載の方法。 ３２．該水和媒質が水であり、工程（２）における脂質成分の量が水和媒質に対 して約４０ｍｇ／ｍｌである請求項２９に記載の方法。 ３３．該非ステロイド系抗炎症薬剤がイブプロフェンナトリウムであり、脂質成 分３５ｍｇ当たり少なくとも約１ｍｇのイブプロフェンナトリウムがリポソーム 小胞に組込まれている請求項９に記載のリポソーム小胞。 ３４．該非ステロイド系抗炎症薬剤がトルメチンナトリウムであり、脂質成分３ ５ｍｇ当たり少なくとも約２ｍｇのトルメチンナトリウムがリポソーム小胞に組 込まれている請求項９に記載のリポソーム小胞。 ３５．請求項１に記載のリポソーム小胞の治療学的有効量を投与する工程を包含 する、生理的症状を処置するための方法。 ３６．請求項２０に記載の治療用製剤の治療学的有効量を投与する工程を包含す る、腹膜内部に起こる生理的症状を処置するための方法。