JPH02501067A - 超純枠半合成代用血液 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 超純粋半合成代用血液 本出願は、１９８６年１１月１０日出願の出願連続番号節９２８．３４５号の一 部継続出願である１９８７年ＩＯ月１３日出願の出願連続番号節１０７，４２１ 号の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は、新規な半合成代用血液の製造法およびその方法から生じる半合成代用 血液に関する。この新規な半合成代用血液は、純粋であり、内毒素の水準が例外 的に低く、非ヘモグロビンタン白質が存在せず、分子的架橋像を特徴とするヘモ グロビン製剤である。この半合成代用血液は代用品として用いるときに毒性作用 を持たず、酸素のような可逆的に結合する気体状配位子の特性を有し、生活組織 および器官に酸素を輸送し且つ供給するのに有用である。更に、この代用血液は 、病気の処理および循環の完全性を保持するための血漿エキスパンダーとして働 （。本発明のもう一つの観点は、前駆体または中間体、すなわち実質的に純粋で リン脂質不含で内毒素不含の未架橋形のヘモグロビン溶液である。

背景材料の説明 複雑な多細胞生物は、栄養摂取および排泄の過程に関する特殊化した組織を備え ている。身体の各種器官と細胞との間を結合することが血液の主要な機能である 。血液、赤血球、血漿および他の成分は、それぞれの組織を循環して、それらの 組織に栄養を連続的に送り、老廃物と組織から組織分泌物に関する各種の組織と を取り除くことによって定常的な細胞環境を保持する。生理学（ＰＨＹＳＩＯＬ ＯＧＹ）、３版、ニドワード・イー・セルカート（Ｅｄｖａｒｄ　Ｅ、　５ｅｌ ｋｕｒｔ）　、２２３頁（１９７１年）。血液は細胞と血漿とからなる粘稠流体 である。細胞の９９％を越える量は赤血球である。赤血球の主要な機能はヘモグ ロビンの輸送であり、このヘモグロビンはまた酸素を肺から組織へ運び、ＣＯ２ を組織から肺へ運ぶ。正常な赤血球は細胞１００　ｍｌ当たり約３４ｇのヘモグ ロビンを含む。ヘモグロビン１ｇは、約１．３３ｍ１の酸素と結合することがで きる。

ガイトン・エイ・シー（Ｇｕｙｔｏｎ、　Ａ、Ｃ，）著、基礎的人間生理学：　 病気の機構における正常な機能（ＢＡ３１ＣＩＩＬ：ＭＡＮ　ＰｌｌＹｓＩＯＬ ＯＧＹ：　ＮＯＲＭＡＬ　ＦＵＮＣＴＩＯＮ　ＩＮ　ＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳ　０ ＦＤＩＳＥＡＳＥ）、８４〜８５頁、（１９７１年）を参照されたい。

酸素を運搬し且つ供給する代用血液としておよび血漿エキスパンダーとして有用 な治療薬が不足し且つ必要とされているため、適当な代用血液を開発するため熱 心な研究が行われてきた。代用血液は、急性出血、外科手術の際に起こる失血、 偶発的な失血の後の回復処置（ｒｅｓｕｓｃｉｉａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒ ｅｓ）等によって失われる血液を補充するのに必要である。更に、血漿エキスパ ンダーとして、代用血液は、体積欠乏ショックを治療する治療薬として、アナフ ィラキシ−およびアレルギーショックの緩和剤として働き、火傷の後におよび激 しい下痢の結果として失われる血漿を補充する働きをする。

溶液状のヘモグロビンは、酸素を輸送する能力を有し、理論的には赤血球の代用 品として用いることができる。

へそグロビン溶液は腫脹活性を有し、これらの溶液は血漿体積も膨張させるので 、血漿エキスパンダーとしての機能も備える。したがって、腫脹活性を有し且つ 酸素を輸送することができることは、ヘモグロビン溶液が血液量減少および組織 低酸素症において迅速な初期治療が必要な活性化流体（ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉ ｏｎ　ｆ’１ｕｊｄ）として望ましいことを示唆している。しかしながら、適当 な活性化流体として機能するためには、ヘモグロビン溶液は所定の期間組織酸素 化を維持できるものでなければならない。

哺乳類の血液中に存在するヘモグロビンは、溶液状で可逆的に酸素化する基本的 特性を有する。その自然な形態では、踊乳類のヘモグロビンは分子量が約ｅｓ、 ｏｏｏであり且つ構造的に２組のサブユニットからなる共役した非架橋タン白質 である。それぞれのサブユニットは、ヘム基とグロビンと呼ばれるポリペプチド 鎖を含んでいる。

哺乳類では、ヘモグロビンは、タン白質、リン脂質およびコレステロールからな る支質と共に赤血球中に存在している。臨床血液学（ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＨＥＭ ＡＴＯＬＯＧＹ）　、ウィントロープ（Ｗｉｎｔｒｏｂｅ）、６版、１３８〜１ ９９頁（１９６７年）を参照されたい。

酸素の可逆的結合には、異なる酸素親和性を有する２種類の異なる第四級構造（ 弛緩および緊張）としてタン白質が存在する能力から生じるヘモグロビン（四量 体性ヘモグロビン）の４本の鎖の間に相互作用を必要とする（ベルブ・エム−エ フ（Ｐｅｒｕｔｚ、　Ｍ、　Ｆ、）　、Ｐｒｏｇ、　ＣｌＩｎ。

Ｂｌｏｔ、　Ｒｅｓ、、　１．３　（１９７５）　）　、　２種類の異なる酸素 親和性によって、酸素緊張が高いとき（約１００ｍ＋＋＋ｔｌｌｌ：　ｐ０２） にはヘモグロビンが酸素を積載することができ、且つ酸素緊張が低いとき（約４ ０Ｉ１ｍ）Ｉｇ　ｐ０２）には酸素を降ろすことができ、酸素−ヘモグロビン曲 線に対して特徴的なＳ字形を生じる。赤血球中のある挿のヘモグロビンの緊張状 態は２．３−ジホスホグリセレート（２，３−ＤＰＧ）のようなを機ホスフェー トの存在によって安定化されるが溶液中のヘモグロビンの緊張状態は２．３−Ｄ ＰＧが存在しないため安定化されないことが知られている。したがって、溶液中 のヘモグロビンは、自然の形態におけるヘモグロビンよりも低いＰ２Ｏを有する （アーノン・エイ（Ａｒｎｏｎｅ、　Ａ、）、Ｎａｔｕｒｅ、　２３７．１４６ 　（１９７２年））。

水性ヘモグロビンは四量体（分子量６８，０００）と二晟体（分子ｆｆ１３４． ０００）の形態の間で平衡になっている（パン泄され、ヘモグロビン溶液は脈管 内から速やかに排出されるのであり、これらの溶液の血漿中半減期は２〜４時間 である。したがって、ヘモグロビンの分子を改良することによって、ヘモグロビ ン溶液の固有な限界を克服すべく努力が傾注されてきた。分子の改良の目的は、 ヘモグロビンを安定化させて、二量体の形成を防止し且つ緊張形状状態を維持す ることである。パン（Ｂｕｎｎ）ら（前記文献）は、ヘモグロビンを架橋するこ とによって腎臓からの排泄が減少し且つ脈管内保持時間が増加することを示した 。パン（Ｂｕｎｎ）らはビス（Ｎ−マレイミドエチル）エーテルを用いたが、生 成するヘモグロビン溶液は高い酸素親和性（すなわち、Ｐ２Ｏ，３ｍｍＨｇ　） ををしていた。

ピリドキサール−５−リン酸も酸素親和性を低下させる上で２．３−ＤＰＧと同 様な硬化を有し、Ｐ２Ｏ，２６〜３０ｍｍ）Ｉｇを生じることが示された（ベネ シュ・アール・イー（Ｂｃｎｅｓｃｈ、　Ｒ，Ｅ、）　、ＢｉｏｃｈｅＩｌ、　 Ｊ、、１１．２５６８　（１９７２年））。

しかしながら、２．３−ＤＰＧとは異なり、ピリドキサールリン酸は架橋剤とし ては作用せず、未改質ヘモグロビンの場合と同様な脈管内保持時間を生じる（グ リーンブルグ・エイ・ジー（Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、　Ａ、Ｇ、）　ら、Ｓｕｒｇ ｅｒｙ、　８６．１３（１９７９年））。したがって、酸素親和性が低く　（Ｐ ２Ｏが２０〜３０ＩＩｌａ＋Ｈｇ程度）且つ適当な脈管内保持時間を有する（半 減期２０時間以上）ようにするにはピリドキサール化と架橋が必要であると考え られた。

１９８５年に、コンブレス・オン・ザ・ユナイテド・ステーブ、オフィス・オン ・テクノロジー・アセスメント（ＯＴＡ）は「血液政策とテクノロジー（Ｂｌｏ ｏｄ　Ｐｏ１ｉｃｙ　ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　Ｊという標題の報告を発 行した。この報告の第６章において、血液生成物の代替源が記載され、代替血液 源および経済性、安全性および利用可能性を考慮した代替品の開発を促進する必 要があることが結論された。この報告によれば、理想的な赤血球は、（１）完全 な赤血球と同様な酸素解離曲線および酸素担持能力、（２）無毒および非抗原性 、（３）良好な流動性を有し、（４）長時間循環しており、（５）保存寿命が長 く、（６）現在の赤血球輸血に比較して価格的に有効であるという６つの特性を 存するといわれる。この報告は、これまでに開発された如何なる代替品も未だこ れら総ての基準を満たしていないとも結論した。

適当な血液代替品を開発するのに、４種類の方法が用いられた。一つの方法では 、ペルフルオロ化合物と呼ばれる合成化合物の一種が開発されている。第二のｈ ゛法では、ヘモグロビンの合成類似体が開発されている。研究者らは、リポゾー ムと呼ばれる脂質ビヒクル中にヘモグロビンをカプセル化することによって赤血 球を集める試みを行っている。最後に、精製されたヘモグロビンを化学的に改質 して、その循環を延長し、その酸素結合−解離特性を増大させた。

前記のＯＴＡ報告によれば、今日までは、これらの方法のいずれも満足のいくも のではなかった。フッ化炭素は異物として循環系から除かれ、肝臓、牌臓および 他の組織に貯蔵される。膜でカプセル化されたヘモグロビンから作られた人口細 胞は、多くの理由から用いられては来なかった。ポリスチレン、エチルセルロー スおよびシリコーンゴムのような合成ポリマーから作られたマイクロカプセルを 用いると、生物学的に不混和性の材料を生活系の中に導入することになる。壁の 透過性を制御することは困難であり、これらのカプセルは堅すぎて且つ大きすぎ るので毛管ベッドを介して通過することができない。

血液および血液分画の使用は、不利なことがある。例えば、全血を用いると、肝 炎発症ウィルスやＡＩＤＳ発症ウィルスに感染し、第一に患者の回復を面倒にし Ｒつ第二に生命に係わる危険を伴う。更に、全血を用いるには、免疫血液学上の 問題と提供者間の不混和性を回避するための血液型と交差試験を必要とする。

血液容積エキスパンダーの要件の多くを満足する生理学的に平衡したコロイド溶 液である血液分画血漿（ＲＦＰ）は、この目的のために安全に用いることは出来 ない。血漿と共に同種の結成肝炎に感染する度合いおよび危険性は極めて高いの で、その使用は最早保証されない。

血液成分のヘモグロビンは浸透性と酸素の輸送および交換する能力を有している が、腎臓の経路および脈管によって循環から速やかに除去され、半減期が極めて 短く、それ故不満足なものとなるという不都合を育している。

特許および特許以外の文献には、重合し、架橋した間質不含ヘモグロビンから満 足な代用血液を製造するための努力が多数記載されている。ボンセン（Ｂｏｎｓ ｅｎ）らの米国特許第４，００１，２００号明細書およびボンセン（Ｂｏｎｓｅ ｎ）らの米国特許第４，００１，４０１号明細書には、重合し、架橋した「間質 不含」ヘモグロビンと、この重合し、架橋した「間質不含」ヘモグロビンからな る製薬組成物（およびこれらを用いる方法）とが開示されている。ボンセン（Ｂ ｏｎｓｅｎ）らの重合し、架橋した「間質不含」ヘモグロビンの製造法は、赤血 球を溶解させ、ケイソウ土で濾過して間質を除去し、透析を行って残留している 低分子量の塩類および代謝物を除去し、重合させて、水溶性の架橋した高分子の 間質不含ヘモグロビンを形成させ、細孔度が約０．２０から０．４５ミクロンの フィルターで濾過することによって最終的な滅菌を行うことから成っている。ボ ンセン（Ｂｏｎｓｅｎ）らによって記載された架橋剤には、グリオキザール、マ ロン酸ジアルデヒド、クエン酸ジアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジブアル デヒド、３−メチルグルタルアルデヒド、プロピルアジブアルデヒド、フタル酸 ジアルデヒド、テレフタルデヒドおよびマロン散ジアルデヒドが挙げられる。

ボンセン（Ｂｏｎｓｅｎ）ら（ＩＩ＋　、米国特許第４．０５３．５９０号明細 書）には、ボンセン（Ｂｏｎｓｅｎ）らの米国特許第４．００１．２００号明細 書およびボンセン（Ｂｏｎｓｅｎ）らの米国特許第４，００１，４０１号明細書 の開示内容を発展させ、代用血液のキャリヤーとしての生理学的に受容可能なポ リマー性代用血漿が記載されている。更に、心臓のバイパスとしての体外循環補 助装置および患者の循環を補助するのに用いられる中空繊維およびシート形の膜 装置のような通常の酸素付加装置において人口酸素交換溶液として用いる用途が 示唆される。更に、ポリヘモグロビンは、好気性バチルスおよびブドウ状球菌に ついての食品の微量生物学的分析法であって、この食品が動物およびヒトの消費 にとって安全であることを確かめる方法でのタン白質および酸素源としておよび 生活可能な分離されて潅流された咄乳類の器官を受容器に最終的に移植するため の保存および貯蔵溶液として示唆されている。

ボンバード（Ｂｏｎｈａｒｄ）らの米国特許第４．１３６，０９３号明細書には 、実質的に発熱物質不含のヘモグロビンとピリドキサールリン酸との縮合生成物 からなる静脈注射に好適なヘモグロビン製剤が開示されている。このヘモグロビ ン製剤は、血液系における保持時間２〜９時間であると記載されている。この生 成物は、赤血球を弱アルカリ性溶液で洗浄し、溶血させ、生成する物質を陽イオ ン交換樹脂で処理することによって製造される。この物質を樹脂から分離し、ヘ モグロビン濃度を約５〜９９６まで希釈し、ｐＨを約７〜９に調整し、ピリドキ サール−５−リン酸で処理し、任意には水素化ホウ素の溶液で処理し、序でジア ルデヒドで処理して、ヘモグロビン分子を架橋する。輸血溶液の非発熱性は、最 少限局アルカリ性溶液で繰返し洗浄することによって得られる。

ボンバード（Ｂｏｎｈａｒｄ）らの米国特許第４，３３６．２４８号明細書では 、へそグロビン分子をカップリングさせて、分子の酸素輸送能力を著しく減少さ せずに脈管内滞留時間を増加させた。ヘモグロビン分子は、３〜８個の炭素原子 を有する脂肪族ジアルデヒドのようなジアルデヒドを用いて、互いにおよび／ま たは血清タン白質およびゼラチン誘導体にカップリングする。任意には、ピリド キサールリン酸を続いて加えてもよい。カップリングしたヘモグロビンを、硫酸 アンモニウム沈澱によって回収する。

シモンズ（ＳＪＩｌｌｍｏｎｄｓ）らの米国特許第４，４０１．６５２号明細書 には、ｒ間質不含」ヘモグロビン溶液の製造法が開示されている。シモンズらの 方法はメトヘモグロビンの形成を減少させｒ間質不含」ヘモグロビンの大規模製 造に特に好適である。この方法は、血球を洗浄して非細胞成分を除去して、典型 的には白血球を優先的に保持する適当な吸着媒によって濾過することによって白 血球を除去し、残っている赤血球を超音波または機械的に溶解し、多価カチオン 、ポリサルフェートおよび多価アニオンと混合することによってヘモグロビンを 沈澱させ、濾過および透析によって最終的に精製することから成る。生成するヘ モグロビン溶液は、「実質的に純粋」であり且つ「間質」や他のりボタン白質細 胞成分を含まず、５９６未満のメトヘモグロビンを含んでいる。

タイ（Ｔｙｅ）の米国特許第４，５２９．７１９号明細書ニハ、ある種のビスー ジサリチル酸エステルで架橋しピリドキシルー５°−ホスフェートで改質した後 、還元してとスージアミドで共有結合的に架橋してピリドキシルー５°−ホスフ ェートで共有結合的に改質した四量体性ヘモグロビンを生成する、「間質不含」 四量体性ヘモグロビンが開示されている。改質され架橋した「間質不含」四量体 性ヘモグロビンは、病気を持たず且つ輸血される組織に酸素を輸送することがで きることが開示されており、脈管内空間に止どまっている。更に、この生成物は 、細胞表面抗原を持たないので、赤血球の代わりに輸液に好適であることが開示 されている。

タイ（Ｔｙｅ）の改質され、架橋された「間質不含」四一体ヘモグロビンは、新 たに抜き取られた、古いまたは凍結してバックした細胞または全血の赤血球から 出発することによって製造される。血液を血栓形成を防止するのに十分な抗凝固 活性を有する容器中に無菌方式で抜き取る。ヒト、ウシ、ヒツジまたはブタのよ うな各種の補乳類の源からのヘモグロビンが有用であることが開示されている。

非ヘムタン白質を、好ましくは亜鉛沈澱によって除去する。赤血球を低張性溶解 した後限外ａ、遇することによって、ヘモグロビンを放出させる。濾過したヘモ グロビンを続いて濾過工程を通過させ、ウィルス粒子、タン白質凝集物および間 質要素を除去する。典型的なフィルターは、名目細孔度が０．０２０ミクロンで あり、１．０００．０００ダルトンの球状タン白質を排除する。亜鉛イオンを加 えて、ヘモグロビンを沈澱させ、沈澱物を；ａ、過によって濃縮する。非ヘムタ ン白質は濾液中に除去される。生成するヘモグロビンを、次にビスージサリチル エステルを用いて架橋して、ピリドキシルー５゛−ホスフェートで処理した後、 可逆性シッフ塩基共付結合を還元する。

コース（Ｋｏｔｈｅ）らの米国特許第４．５２６．７１５号明細書にから製造さ れる血漿タン白質と残留間質脂質を含まない高度に生成されたヘモグロビン溶液 の製造法が開示されている。開示された方法は、赤血球を洗浄溶液と接触させ、 濃縮した赤血球を２〜３倍容の水中に導入することにより溶血させ、限外濾過に よりヘモグロビンから間質を分離し、透過度が１０，０００から５０，０００ダ ルトンの二次限外濾過単位を用いる三回目の濾過工程で濃縮することから成って いる。

しかしながら、「間質を含まない」架橋ヘモグロビンを起源とする代用血液の製 造における近年の発展にも拘らず、内毒素、リン脂質および非へモグロビンタン 白質を実質的に含まず、（１）周囲条件下で適当量の酸素を組織に輸送し、（２ ）全血と同等な腫脹作用を有し、（３）適当な脈管内保持時間を有し、（４）交 差試験または感受性試験なしで総ての受容体に輸液可能であり、（５）細菌およ びウィルス粒子（肝炎、ＡＩＤＳ等）のような病原体を含まず、且つ（６）最低 限度の冷蔵で保存可能な代用血液の必要性は依然として存在している。

発明の要約 酸素を輸送することができ且つ多量の輸液が必要なときには容易に利用すること ができる腫脹活性を有するタン白質溶液から成る代用血液を開発するための当該 技術分野における長年の要求を認識し、本発明者らはヘモグロビン溶液を基剤と した代用血液を開発する努力を行った。更に、かかる代用血液を多量に必要とす ることが、廃棄されるヒト血液として利用することができるかもしれない量より も遥かに多量の出発物質を必要とすることを認識することにより、もう一つの本 発明の目的は、ヒト以外の唾乳類の血液源が出発物質として好適な代用血液を作 り出す方法を得ることであった。

これらの目的を考慮することにより、本発明の架橋形の単量体性唾乳類ヘモグロ ビンからなる半合成代用血液であって、内毒素、リン脂質および酵素のような非 へモグロビンタン白質を実質的に含まないものを得た。本発明のもう一つの観点 は、前記の代用血液を製造する方法から成っている。本質的には、この代用血液 は、＜１）　哺乳類血液分画から赤血球を分離し、（２）赤血球を溶血させるこ とにより単量体性ヘモグロビンとリン脂質を含む間質との複合体を生成させ、（ ３）少なくともリン脂質の一部を含むヘモグロビンを濾過によって分離し、（４ ）単量体性ヘモグロビンを高速液体クロマトグラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）によって 精製して、赤血球の残りの総ての他のタン白質並びにリン脂質、酵素および内毒 素などの夾雑物からヘモグロビンを分離し、（５）単量体性ヘモグロビンを架１ Ｂ＜Ｍ合または凝集）させ、（６）非架橋ヘモグロビンから架橋ヘモグロビンを 部分的に分離することから成る方法によって補乳類の血液分画から製造される。

本発明の方法の本質的な観点は、内毒素、リン脂質および酵素のような非へモグ ロビンタン白質を実質的に含まず且つ約９０％より高い分子量分布が１ｌｉ８． ０００ダルトンから５００．０００ダルトンと定義される生成物を生じる条件下 で前記の工程を行うことから成っている。

生成物（以後「本発明のヘモグロビン」と表わす）は、実質的に内毒素を含まず 、脈管持続性が少なくとも２１」間であり、酸素のような気体状配位子を可逆的 に結合する特性を有し、生活組織および器官に酸素を輸送し且つ供給するのに有 用な代用血液である。したがって、本発明の代用血液は、血液エキスパンダーお よび病気の処理においておよび必要な場合すなわち突然且つ多量の血液の喪失に 応じて循環の完全性を保持するための血液エキスパンダーおよび活性化流体とし て有用である。

図面の簡単な説明 第１Ａ〜ＩＨ図は、実施例１の方法を説明するフローシートである。第１Ａ図は 、血液収集相に関する。第１Ｂ図は、血液分離相に関する。第１Ｃ図は、微孔性 濾過相に関する。第１Ｄ図は、カラムクロマトグラフィ相に関する。第１Ｆおよ び１６図は、架橋相に関する。第１Ｈ図は、保存および処理流体調製相に関する 。

第２図は、３群のウサギの間の血小板数の図上比較であり、縦軸にベースライン からの変化率を、横軸に時間を表わしている。Ｔ１はベースラインの血小板の水 準を表わし、Ｔ２は輸液後１５分の時点での血小板の水準を表わし、Ｔ３は輸液 後１時間の時点での血小板の水準を表わし、Ｔ４は輸液後３時間の時点での血小 板の水僧を表わし、Ｔ５は輸液後２４時間の時点での血小板の水準を表わしてい る。黒丸は、計算容積の血液の３分の１を１および２内毒素単位（ＥＵ）／ｍｌ を有するヘモグロビン溶液で置換した６匹のウサギに対する血小板の水準につい ての平均値±標準誤差を表わし、白丸は、血液容積の３分の１を５％血漿タン白 質分画（０，０５〜（１，１５ＥＬｉ／ｍ＋を含むものと実測された市販製品） で置換した４匹のウサギの血小板の水準に就いての平均値上標準誤差を表わし、 四角は、０〜０．３５　ＥＵ／ｍｌを有する本発明による純粋な重さヘモグロビ ンで計算容積の血液の３分の１を置換した６匹のウサギについての平均値上標準 誤差を表わす。

第３図は、３分の１を輸液したウサギについての白血球の水準をベースラインか ら２４時間間で比較して表わしたグラフである。第２図と同様、縦軸は変化率を 表わし、横軸は時間を表わす。Ｔ１はベースラインでの血小板の水準を表わし、 Ｔ２は輸液後１５分の時点での血小板の水準を表わし、Ｔ３は輸液後１時間の時 点での血小板の水準を表わし、Ｔ４は輸液後３時間の時点での血小板の水準を表 わし、Ｔ５は輸液後２４時間の時点での血小板の水準を表わしている。黒丸は、 計算容積の血液の３分の１を１および２　ＥＵ／ｍｌを有するヘモグロビン溶液 で置換した６匹のウサギの平均値上標準誤差を表わし、白丸は、血液容積の３分 の１を５％血漿タン白質分画ｃｏｆｏｓ〜０．１５　ＥＵ／ｍｌを含むものと実 測された市販製品）で置換した４匹のウサギの平均値上標準誤差を表わし、四角 は、０〜０．３５　ＥＬＩ／ｍｌを有する本発明による純粋な重合ヘモグロビン で血液容積の３分の１を置換した６匹のウサギの平均値上標準誤差を表わす。

第四図は、３群のウサギの間における血清フィブリノ−ゲン水準をグラフによっ て比較したものである。縦軸はフィブリノーゲン水準の変化率を表わし、横軸は 時間を表わし、Ｔ１はベースラインにおけるプロトロンビンの水準を表わし、Ｔ ２は輸液後１５分の時点でのプロトロンビンの水準を表わし、Ｔ３は輸液後１時 間の時点でのプロトロンビンの水準を表わし、Ｔ４は輸液後３時間の時点でのプ ロトロンビンの水準を表わし、Ｔ５は輸液後２４時間の時点でのプロトロンビン の水準を表わしている。

黒丸は、計算容積の血液の３分の１を１および２　Ｅｌ／ｍ＋を有するヘモグロ ビン溶液で置換した６匹のウサギの平均値上標準誤差を表わし、白丸は、血液容 積の３分の１を５％血漿タン白質分画（０，０５〜０．１５　Ｅｌ／ｍｌを含む ものと実測された市販製品）で置換した４匹のウサギの平均値上標準誤差を表わ し、四角は、０〜０．３５　ＥＵ／ｍｌを有する純粋な重合ヘモグロビンで血液 容積の３分の１を置換した６匹のウサギの平均値上標準誤差を表わす。

第６図は、３群のウサギの血清クレアチニンを比較してグラフに表わしたもので ある。縦軸は血清クレアチニン水準の変化率を表わし、横軸は時間を表わす。Ｔ １はベースラインにおける血清クレアチニン水準を表わし、Ｔ２は輸液後１５分 の時点での血清クレアチニンの水準を表わし、Ｔ３は輸液後１時間の時点での血 清クレアチニンの水準を表わし、Ｔ４は輸液後３時間の時点での血清クレアチニ ンの水準を表わし、Ｔ５は輸液後２４時間の時点での血清クレアチニンの水準を 表わしている。黒丸は、計算容積の血液の３分の１を１および２　ＥＣ／ｍｌを 有するヘモグロビン溶液で置換した６匹のウサギの平均値上標準誤差を表わしく 発色性ＬＡＬ試験）、白丸は、血液容積の３分の１を５％血漿タン白質分画（０ ，０５〜０．１５　ＥＵ／ｍｌを含むものと実測された市販製品）で置換した４ 匹のウサギの平均値上標準誤差を表わし、四角は、０〜０．３５ＥＵ／ｍｌを有 する純粋な重合ヘモグロビンで血液容積の３分の１を置換した６匹のウサギの平 均値上標準誤差を表わす。

第７図は、サルにおける５０％出血−輸血後のへマドクリット値（Ｈｃｔ）の変 化をグラフにより比較したものである。縦軸はへマドクリット値を表わし、横軸 は日数での時間を表わす。ヘモグロビン輸血を行ったサルのへマドクリットを黒 丸で表わし、血漿タン白質分画のへマドクリットを白丸で表わす。

第８図は、本発明の架橋ヘモグロビン溶液で４０９６交換輸血を行ったイヌ００ 時間から２１日目までの白血球の割合、赤血球の割合、ヘモグロビンの割合およ びヘマトクリットの割合をグラフに表わしたものである。

第９図は、本発明の架橋ヘモグロビン溶液で２５９０交換輸血を行ったイヌの０ 時間から１８日目までの白血球の割合、赤血球の割合、ヘモグロビンの割合およ びヘマトクリットの割合をグラフに表わしたものである。

第１Ｏ図は、本発明の架橋ヘモグロビン溶液で３３９０交換輸血を行ったイヌの ０時間から７８日目までの白血球の割合、赤血球の割合、ヘモグロビンの割合お よびヘマトクリットの割合をグラフに表わしたものである。

第１１図は、５％ヒトアルブミン溶液で３３％輸血を行ったイヌの０時間から４ ７日目までの白血球の割合、赤血球の割合、ヘモグロビンの割合およびヘマトク リットの割合をグラフに表わしたものである。

第１２図は、５０％の血液容積の出血を行った後、交換輸血における第一段階と して５％アルブミン溶液で直接置換したイヌの０時間から２３日目までの白血球 の割合、赤血球の割合、ヘモグロビンの割合およびヘマトクリットの割合をグラ フに表わしたものである。これに続いて、更に５０％の血液容積を取り除いた後 本発明の架橋ヘモグロビン溶液で置換した。

第１３図は、５０％の出血を行った後、等容積の架橋ヘモグロビン溶液で直接に 置換し、第二の５０％出血の後、本発明の架橋ヘモグロビン溶液と５％アルブミ ン溶液を等部で混合したものから成る等容積で置換したイヌの０時間から３０日 目までの白血球の割合、赤血球の割合、ヘモグロビンの割合およびヘマトクリッ トの割合をグラフに表わしたものである。

第１４図は、実施例８の表−５をグラフに表わしたものである。縦軸は、組成上 の亜族分子量のそれぞれに残つている本発明のヘモグロビンの総量の比率を表わ す。横軸は時での時間を表わす。

第１５図は、実施例９の実験作業から集めたデーターをグラフに表わしたもので ある。このグラフは、赤血球が２０％のへマドクリット以下から始めて、本発明 のヘモグロビンに漸進的に交換されると、総血漿ヘモグロビン濃度の増加が期待 される。

第１６図は、実施例９の実験作業から集めたデーターをグラフに表わしたもので ある。７匹の試験動物と６匹のコントロール動物を、初期のへマドクリット水準 から非酸素担持容積代替物（すなわち、リンゲルの乳酸塩およびヒドロキシエチ ル澱粉溶液）で交換して約２０％とした。

両方の群は、初期の値から約２０％まで同様な減少を示したｃ、２０％より低い 値では、コントロール群はへマドクリットの漸進的な減少に関連して動脈酸素含 量か漸進的に減少した。６匹のコントロール動物は生き延びられなかった。反対 に、試験群の動脈酸素含量はかなり高く、ヘマトクリットが漸進的に減少しても 保持された。６匹の試験動物が生き延び、臨床的に正常に見えた。第１６図にお いて、縦軸は動脈酸素含量を表わし、横軸はへマドクリットを表わす。

第１７図は、実施例９から集めた実験データーをグラフに表わしたものである。

縦軸は混合静脈酸素含量を表わし、横軸はへマドクリットを表わす。

第１８図は、実施例９から集めた実験データーをグラフに表わしたものである。

縦軸は酸素含量に対する寄与を表わし、横軸はへマドクリットを表わす。このグ ラフは、各種のへマドクリット水準における動脈酸素含量に対する本発明のヘモ グロビンおよびヒツジ赤血球の寄与を説明している。７匹の試験動物では本発明 のヘモグロビンが増加して、ヘマトクリットが減少すると、動脈酸素含量の比率 の増加は本発明のヘモグロビンによって与えられた。ヘマトクリット水準が３％ の範囲では、動脈酸素含量のほぼ９０％が本発明のヘモグロビンによって与えら れ、残りは残留しているヒツジ赤血球と希釈された血漿によって与えられた。

第１９図は、交換輸血の際の酸素受渡量をグラフに表わしたものである。縦軸は 初期の値の比率を表わし、横軸は時での時間を表わす。リンゲルの乳酸塩溶液で 最初に交換する際には、ヘマトクリットは酸素受渡量と共に減少した。この時点 で（−印）、本発明のヘモグロビン溶液との交換が始まった。ヒツジへマドクリ ットは更に低下するが、酸素受渡量は本発明のヘモグロビン溶液の輸血と連動し てベースラインの水準まで増加回復した。これは、交換の最後には、酸素受は渡 しは主として本発明のヘモグロビンによるものであり、残存へマドクリット（約 ３％）によるものではないことを示している。

第２０図は、実施例ＩＯから集めたデーターをグラフに示したものである。第２ ０　（Ａ）および２０（Ｂ）図において、縦軸は血液容積に対するヘマトクリッ ト比率を表わし、横軸は分で示した時間を表わしている。試験およびコントロー ル群は、両方とも交換輸血の際にヘマトクリットが同様に減少した。

第２１図は、実施例ＩＯの経過中に集めた実験データーのをグラフに表わしたも のである。第２１（Ａ）図は４匹の試験イヌから集めたデーターであり、第２１ （Ｂ）図はヒドロキシエチル澱粉溶液（ＨＥＳ）を輸液した３匹のコントロール イヌから集めたデーターである。試験群は、コントロール群とは異なり、血漿（ 遊離）ヘモグロビンは交換の際に約６％まで漸進的に増加する。縦軸は、血液容 積１００　ｍｌ当たりグラム数を表わす。

第２２図は、実施例１Ｏから集めたデーターをグラフに表わしたものである。４ 匹の試験イヌ（上図）と３匹のコントロールイヌ（下図）を比較すると、本発明 のヘモグロビンを受け取った試験動物は安定な心臓からの排出量を保持したが、 コントロール群ではへマドクリットと動脈酸素含量が低下すると心臓からの排出 量が増加した。

第２２図において、縦軸は、１分力たりの心臓からの排出量（流ｆｆ１）を表わ し、横軸は分で示した時間を表わしている。

第２３図は、実施例１０の実施の際に集めたデーターをグラフに表わしたもので ある。４匹の試験イヌ（上図）と３匹のコントロールイヌ（下図）を比較すると 、試験群では、交換の際に減少はするが適当且つ良好に保持された心臓からの排 出量を示すが、コントロール群ではへマドクリットが減少するのと連動して酸素 含量が低下した。

第２８図では、縦軸は動脈酸素含量を表わし、ＦＪＩｉ情は分で示した時間を表 わす。

第２４図は４匹の試験イヌ（上図）と３匹のコントロールイヌ（下図）をグラフ により比較したものである。第２３図における縦軸は静脈酸素含量を表わし、横 軸は分で示した時間を表わす。試験群では、交換の際に減少はするが適当且つ良 好に保持された静脈酸素含量を示すが、コントロール群ではへマドクリットが減 少するのと連動して酸素含量が漸進的に低下した。

好ましい態様の説明 本発明の生成物は、約９０％より大きな分子量分布が６８．０００から５００． ０００ダルトンの範囲であり、融点降下によって測定した容量オスモル濃度が溶 液１リツトル当たり１８０〜３２０　ミリモルの範囲であり、最終ヘモグロビン 金員が１デシリツトル当たり５〜２５ｇ１好ましくは９〜１３ｇであり、メトヘ モグロビン含量が約２０％未満であり、好ましくは約１０％未満であり、塩化ナ トリウムおよび塩化カリウムは生理学的水準にあり、１ｍｌ当たりのリン脂質は 約１ナノモル未満であり、架橋剤は約１　ｐｐａ未満であり、Ｐ２Ｏは約１８か ら３８、好ましくは約２４〜３２ｍｍ１ｇの範囲であり、脈管内半減期が少なく とも４日間であり、これらの物質の少なくとも一部分は体内に少なくとも６から ８日間残留する架橋ヘモグロビン溶液である哺乳類の代用血液から成っている。

「Ｐ５ｏ」という用語は、当該技術分野において酸素とヘモグロビンとの相互作 用を記載するものと認識されており、ヘモグロビンが５０％飽和された時点での 酸素の分圧（ｐ０２）を表わしている。この相互作用は、縦軸にヘモグロビンの 飽和率をプロットし横軸に水銀ミリリットル数（ｍｄｇ）またはトールでの酸素 分圧をプロットした酸素解離曲線として表わされることがある。

「脈管内半減期」という用語は、生体内環境でのヘモグロビンの処理の量がその 半分にまで低下する時間を怠味する。

代用血液は、５０〜７０％の架橋度のゲル透過クロマトグラフィでの架橋像では 、分子量が１３８，０００未満の物質が検出されないということも特徴としてい る。

代用血液のゲル透過クロマトグラフィについての分布は、低分子量から総排除容 積までを積分すると架橋の量は５０％から７５または８０％までとなることも特 徴とする。

本発明の好ましい態様は、分子量６８　、０００から分子量５００．０００まで の範囲の分子量分布は約９０％より大きく、４００．０００から５００．０００ 以上の分子量の範囲の排除容積は物質の１０から１５％のみである。注意深く濾 過した後、ゲル透過りロマトダラムは、分子量が６８．０００より低い物質はほ とんどないことも示している。ゲル透過クロマトグラフィによって測定した純粋 なヘモグロビンの初期の６８．０００の分子量ピークは、重合した後には広（な り、分子ｆｆ１６８．０００の保持時間が幾分複雑になり、大きくなって最大９ ０．０００までの分子量となる。この最後のピークについて積分を行うと、少な くとも２０％が８８，０００の分子量の範囲にあることが判る。この分画は動物 において有毒な反応を生じず、単に腎臓によって排泄され、試料採取時に尿中に 見出だすことができる。

更に、この代用血液は実質的に内毒素を含まず、発熱因子も含まず、生体内では 下記のような異常でａ害な化学的および生理的機能のいずれも起こさない。すな わち、（１）補体を活性化せず、（２）出血性異常を起こさず、（３）異常な血 小板の機能または凝集を起こさず、（４）異常なプロトロンビン時間（ＰＴ）を 起こさず、（５）異常な部分トロンボプラスチン時間を起こさず、（６）血液型 または交差試験法を妨害せず、（７）　３．５　ｇ／ｋｇ／体重または８　ｆ／ ｌｄｌの循環血液容積では腎臓に対して毒性を持たず、（８）少なくとも７日間 の循環持続性を示し、（９）赤血球形成を促進するための刺激として作用する。

「代用血液」という用語は、生活器官および組織に酸素を輸送し且つ供給し、脈 管内の肚脹圧を保持する能力を有する物質であることを意味する。したがって、 この用語は、当該技術分野において「血漿エキスパンダー」および「活性化流体 」として知られている物質も包含する。

「架橋した」または「重合した」という用語は、分子間および分子内ポリヘモグ ロビンであって、このポリヘモグロビンの少なくとも５０％が四量体形よりも大 きなものである物を包含することを意味する。

本発明のための「実質的に内毒素を含まない」という用語は、溶液１０ｄｌ当た りヘモグロビンＩＯｇの濃度において、溶液１ｍｌ当たり内毒素単位が１．０未 満である代用血液として機能することを説明するものである。この代用血液をウ サギの総血液容積の約３分の１を置換するものとして用いるときには、第２図の 曲線デルタ−デルタと実質的に同様な血小板水準の経時的な変化率、第３図の曲 線デルタ−デルタと実質的に同様な白血球水準の経時的な変化率、第４図の曲線 デルタ−デルタと実質的に同様なフィブリノーゲン水準の経時的な変化率、第５ 図の曲線デルタ−デルタと実質的に同様なプロトロンビン水準の経時的な変化率 または第６図の曲線デルタ−デルタと実質的に同様な血清クレアチニン水準の経 時的な変化率を生じる。

好ましい態様では、本発明の「実質的に内毒素を含まない」代用血液は、リムラ ス・アメボサイティック・リゼー）　（ＬＡＬ）分析法によって測定したところ 、溶液１ｍｌ当たり０．５未満の内毒素単位（Ｅｌｌ／ｍｌ）　、好ましくは０ ．２５未満、最も好ましくは０．０２未満の内毒素単位を含む。こ４Ｇ１〜４６ ４頁（１９８０年）に記載されており、詳細はこれらの文献を参照されたい。

「内毒素」という用語は、細菌の細胞壁の外層の一部として生成した一般的に細 胞に結合したリポ多糖類であって、多くの条件下では有毒であるものを意味する 。動物に注射すると内毒素は、熱、下痢、出血性ショックおよび他の組織の損傷 を起こす。

「内毒素単位Ｊ　（ＥＵ）という用語は、１９８３年の米国薬局方協約、３０１ ４頁に記載された意味であって、ＥＬ’を米国レファレンス・スタンダード・ロ ットＥＣ−２の０．２　ｎｇに含まれる活性として定義されている。ＥＣ−２の １バイアルは、５．０００ＥＵを有する。

本発明は、半合成の実質的に間質を含まない代用血液の製造法も包含する。この 方法は、（１）血液原料を得て、（２）血液原料を分画して、白血球と血小板を 実質的に含まない赤血球分画を生成させ、（３）この赤血球分画を機械的に破砕 して、ヘモグロビン含有溶液を生成させ、（４）ヘモグロビン含有溶液を透明に して、細胞片を実質的に含まないヘモグロビン溶液を生成させ、細胞片を実質的 に含まないヘモグロビン溶液を微孔性濾過を行って部分的に殺菌されたヘモグロ ビン含有溶液を生成させ、（６）部分的に殺菌されたヘモグロビン含有溶液を限 外濾過して、粒度毎に分離されたヘモグロビン含有溶液を生成させ、（７）粒度 毎に分離されたヘモグロビン含有溶液をクロマトグラフィによって分離して、リ ン脂質と非へモグロビンタン白質を実質的に含まないヘモグロビンを生成させて 、このヘモグロビンをクロマトグラフィカラム上に保持し、（８）実質的にリン 脂質を含まないヘモグロビンをカラムから溶出させて、実質的に内毒素を含まな いヘモグロビン溶液を生成させ、（９）前記の実質的に内毒素を含まないヘモグ ロビン溶液を架橋して、架橋した代用血液を生成させ、（ｌＯ）架橋した代用血 液を濾過によって部分的に分離し、総ての段階は実質的に内毒素を含まない環境 で行うことから成っている。

処理段階のそれぞれを、下記に更に詳細に説明する。

■、　工程 Ａ、　血液の収集 本発明の出発点は、エリスロサイト（赤血球）源である。したがって、出発物質 は、新たに抜き取られたヒト血液、血液銀行から得た時間の経った古い血液、胎 盤またはヒト供与者センターから得たパックした赤血球であってもよい。更に、 動物の血液から得た赤血球も同様に好適である。したがって、ウシ、ヒツジまた はブタのような各種の源からの血液を用いてもよい。屠殺場から得られるウシ血 液は、それが容易に利用することができるため、好ましい赤血球源である。

本発明の新規な方法では、多量に血液を収集し且つ取り扱う特殊な技法を必要と した。血液を無菌状態で抽出する多量収集用の套管針が用いられる。この套管針 は注意して挿入し取り扱う必要があり、長さが約２フイートのチューブに接続さ れている。套管針を挿入するためには、皮を切り離して、剥ぎ取り、次に套管針 を食道を破らないように注意して心臓の近くの動物の主要な血管に挿入する。細 菌の導入を回避し、内毒素不含または内毒素の水準が低い物質を保持することが 大切である。これは、凝固防止剤を予め充填してあり、且つ発熱因子を除去し且 つ内毒素について再チェックしである個別の容器を用いて達成される。典型的な 凝固防止剤はクエン酸ナトリウムである。総ての場合に、容器の内毒素の水準は ＬＡＬによって検出されるｏ、ｏｉ内毒素単位未満でなければならない。

この溶液を、次に無菌状態で集めた血液２〜１０ガロンを入れることができ、血 液を内毒素不含状態に保つことができる小型容器に充填する。その容器に集めた 血液を直ちに栓をして、環境に暴露されないようにした。収集工程が完了したら 、この材料を典型的には４℃に冷却して、細菌の増殖を制限する。この時点では 血液はプールされていないので、この血液は後で内毒素および無菌性についてチ ェックして、（１）いずれのウシも病気でなく、（２）粗悪な収集法によってそ の日の全バッチまたは収集物が汚染されることがないことを確かめる。前記の収 集法が好ましいが、当業者にとって好適であり利用することができる多くの収集 法がある。

Ｂ、　赤血球の分離 血液を処理センターへ運び、その時点でそれぞれの容器から試料を採取して、内 毒素の水準についてＬＡＬ分析によってチェックする。内毒素水準が６〜７　Ｅ Ｕ／　ｍ＋より高ければ、この血液は廃棄する。それぞれの血液容器試験がこの 内毒素水準より低い場合にのみ、この材料が二次処理に適合した。

先行技術の典型的な二次処理は、血液（ＡＣＤで凝固防止した血液）を生理的塩 濃度の食塩溶液に懸濁して、遠心分離し、血漿タン白質と白血球を赤血球から効 果的に分離した。この懸濁法は、総ての遊離タン白質を除去しようとする場合に は、数回の、すなわち２〜４回の「洗浄ｊ段階を経て行う。しかしながら、本発 明の方法では、実際的な製造の規模拡大にはこの方法は維持することができず、 実際に、ヘモグロビン生成物を分離して多くの混入物を含まないようにするため には、この洗浄工程をまったく必要でないことが判った。

好ましい方法では、動物からの全血を内毒素について一度チェックしたならば、 半連続形遠心分離機を通過させ、赤血球、白血球および血漿を所望な規模で効果 的に分離することができる。この方法では、ボウル形半連続遠心分離機であって ボウルが１５．０００〜１８．００Ｏｒｐｍに維持されているもの、すなわちシ ャープレス（Ｓｈａｒｐｌｃｓ）ＡＳ−１５ユニツトを用いる。ボウルと最上部 の形状は、別個の層を分離して、赤血球と白血球と血漿を操作中に除去すること ができるようになっている特定の半径の開口を有するように設計されている。シ ャープレス・ボウル形遠心分離機が好ましいが、典型的で好適な分離装置にはベ ックマン・インスツルメンツ（ＢｅｃｋＩＩｌａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ） 製のようなバスケット遠心分離機が挙げられる。

この操作を準備するためには、遠心分離機を典型的には装置ハウジングコンテナ ー中に配設する少なくとも１時間前に０．５モル水酸化ナトリウムを用いて発熱 因子を除去する。最上部の噴水口または収集装置も同様に処理して、血液が出会 う総ての接触表面から発熱因子を完全に除去する。部品を発熱因子除去工程に付 した後、装置を組み立てる。衛生的に設計されているローブポンプまたは螺動ポ ンプを用いて、全装置および収集口中に流体を流し、典型的には０．５モル水酸 化ナトリウムの溶液を用いるが、当業界に知られている他の発熱因子除去溶液も 同様に好適である。洗浄が完了したら、ヘモグロビン溶液の処理に助けとなる範 囲にまでｐＨを減少させる必要がある。これは水で洗浄することによって行われ 、これによってｐＨは約７〜９の範囲にまで減少する。場合によっては、発熱因 子除去溶液と水との密度の差のために、酸溶液を用いて発熱因子除去段階で用い られる強塩基の中和を助ける必要があった。これらの溶液は総て、洗浄に用いる 前に発熱因子を除去し、チェックしておかなければならない。

ｐＨ水準が９より低くなったならば、遠心分離機の流出液流から試料が得られ、 内毒素試験を行う。内毒素水準が０．０１　ＥＵ／ｍ１以下になったならば、装 置は血液を分離する準備ができている。しかしながら、この分離では、遠心分離 機中への血液の流速を十分に速（して、シャープレス遠心分離機で生じる赤血球 の沈降の量を制限することが重要である。流速が低すぎると、赤血球は遠心分離 機のボウル中に沈澱して、別の容器中に分離または収集されなくなる。４インチ の直径のボウルを有する遠心分離機では、流速は２．５〜３リットル／分を超過 するが６リツトル／分を超過しないことが沈降を制限する上で必要である。更に 大きなボウルや異なるｇ力を用いるときには、異なる流速が必要であるが、特定 のパラメーターは当業界の技術の範囲内である。

総てのパラメーターを設定してしまったならば、各種のバッチまたは各種のウシ からの血液を装置中に導入して、流出液（分離された赤血球）を別の容器に無菌 条件下で集める。しかしながら、この時点で流出液はプールされ、個別の動物毎 には最早処理されない。ｐｌの変動または遠心分離機での細菌の初期汚染の危険 性を少なくするために、ボウルか自転している室に正圧の無菌窒素を加える。装 置を真に殺菌するためには、水蒸気をボウル自転室中に導入し、使用前最大１時 間水蒸気加熱することによる水蒸気殺菌サイクルを用いてもよい。水蒸気加熱が 完了した後、装置をグリコール冷媒管によって、典型的には約４℃まで冷却する 。（動物から血液を収集した後、血液を凍結温度より若干高い温度、典型的には 約４℃にして、保持することが大切である。）赤血球の分離では、収集室、すな わち高速で自転しているボウルの最上部に赤血球が集められる噴出部を、高い衝 撃が赤血球に生じるように形成することが大切である。これらの表面を叩くこと によって赤血球は低張溶液を用いる場合とは反対に機械的分解によって破壊され る。

（低張溶液では、赤血球は膨潤して水圧によって膜が破壊される。）これが、細 胞を膨潤させて水圧によって溶解させる通常の操作から機械的分解への変化であ る。この機械的分解は極めて速やかであり、他の方法によって形成される遊離の 小さな細胞膜成分を余り生じない。赤血球を容器に集めて、第二の遠心分離操作 の”！＝（Ｒをする。

Ｃ３赤血球の透明化（ＣＩａｒ＋　ｒｉｃａｔｉｏｎ）血液を処理して、赤血球 を白血球と血漿から分離してしまったならば、低温すなわち約４℃に保持してお いた純粋な発熱因子を除去した水を用いて機械的に破壊した赤血球を希釈する。

典型的には、破壊された赤血球を少なくとも５０％希釈する。次いで、赤血球を 第二の分離工程に導入するが、典型的には第一の操作と同様な型の遠心分離機を 用いてもよい。好ましい態様では、半連続方式で操作し、１５．０００〜１８． ００Ｏｒｐｍで自転している４”ボウルを備えたシャープレス遠心分離機が用い られる。しがしながら、流速は実質的に減少し、０．５リットル／分以下が好ま しい。第一の処理段階とは異なり、この段階では遠心分離ボウルに異なる型の最 上部形状のものを用いる。この段階では血漿白血球と赤血球組成物のような２層 の分離は行われない。この透明化段階では、放出されたヘモグロビン溶液からの 総ての細胞片が分離される。

発熱因子の除去および無菌性については第一段階において払ったのと同様な中位 を第二段階においても払わなければならない。この材料をこの第二段階で集めた ならば、微孔性濾過の準備ができる。

Ｄ、　微孔性濾過 微孔性濾過は、加圧濾過法とは異なった操作をしなければならない。実際的な意 味では、ヘモグロビン溶液の工業的規模の処理には適さない。微孔性濾過を良好 に用いるためには、プレートおよびフレーム濾過または中空繊維濾過装置を用い てもよいが、膜を横切る圧降下（膜横断圧）は約５ポンド／平方インチ（ｐｓｉ ）以内に注意して保持するように操作しなければならない。圧降ドが耐久水準を １〜２ｐｓｉ超過すると、膜は速やかに目詰りを起こして細胞片が残り、膜を横 切るフラックス速度は半連続的な方法で工業的に精製するには受容不可能な水準 にまで降下する。

この材料の膜を横切る接線速度は２〜５リットル／分の流速におけるものである が、膜のフラックスは０．１がら０．２リットル／分程度である。この操作速度 を維持して、細胞片が膜上に蓄積するのを少なくする。膜に接する溶液の濃度が 初期溶液の１０９６未満に減少すると、残っている溶液は廃棄するかまたは水で 再希釈して追加生成物を抽出することによって、この装置から高収率のヘモグロ ビンを生成させる。濾過装置は衛生的に設計されたローブまたは嬬動ポンプを用 いて、細菌を導入したり発熱因子の混入を起こすことがあるシールおよび軸を減 少させかつ制限してもよい。しかしながら、衛生的に圧送するための当業界に周 知の他のポンプデザインを用いてもよい。かかるポンプには、遠心分離、ギヤお よび管状ダイヤフラムポンプが挙げられる。

膜装置を前処理を行って、発熱因子を除去し且つ適当なｐＨにする。不適切に処 理されると、この時点で発熱因子が加えられ、残りの処理段階でそれらを除去す ることはますます困難になる。発熱因子の除去とｐＨの調整は、標準的な消毒法 と発熱因子除去法を用いて行い、すなわち典型的には水酸化ナトリウムと多量９ 発熱因子不含水で繰返し洗浄して、ｐＨをヘモグロビン溶液の処理を行うのに受 容可能な範囲内（＜ｐＨ（９）にする。このような方法で膜内外の圧の限界を調 整することは周知ではなく、この数年で組織流体の処理に関して選択的に実施さ れてきただけであるが、好適な技法は当業界の技術の範囲内である。

好ましい態様では、濾液側の制限を用いて、フラックス速度がその定常状！Ｉ３ （目詰りを起こさない）条件に限定されるようにする。流体流を接線方向の流れ の膜装置に加えると、流入圧は約２０　ｐｓｉｇであり、流出圧はＯｐｓｉｇで あり、膜の濾液側はＯｐｓｉｇであり、平均膜内外圧（ＡＴＰ）は１０　ｐｓｉ となり、濾過される溶液は多孔性膜表面を満たしこの中に押出され易くなる。こ の溶液が、膜を本質的に目詰りさせ、流体の交差流によって作り出される接線方 向の剪断によっては透明にはならない。流出液（′ａ液）を制限して、ＡＴＰが 僅かに１から２ｐｓｉとなるようにすると、接線方向の流れは表面を一掃して透 明にし、膜を横切るフラックスは一定で、高ＡＴＰを有する初期フラックス速度 と比較して低いままである。

定常状態の条件下での流れは、０．２リットル／分でＡＴＰが１から２ｐｓｉで も、１〜１．２リットル／分でＡＴＰが２０　ｐｓｉであってもよい。しかしな がら、２０　ｐｓｉのＡＴＰは一定のままになり、フラックスを数分以内に０７ ラツクスまで低下させる。

この第一の微孔性濾過段階が完了すると、溶液は少なくとも部分的に殺菌され且 つ０．４５ミクロンより大きい実質的に総ての細胞片が除去されている。場合に よっては、この時点で溶液を殺菌する必要がある。これらの場合には、０．４５ ミクロンの微孔性濾過が完了した後、０．２２ミクロンの濾過を０．４５ミクロ ンの濾過と同様にして用いてもよい。生成する溶液は、引き続いて分子分離を行 う準備ができている。

Ｅ、　限外濾過 次の段階は、分子量が１００．０００より大きいものは全部効果的に保持し、分 子量が１００．０００未満のものは全部通過させる膜を用いて、分子量１００． ０００　（ダルトンで測定）の濾過を注意深く行うことから成っている。典型的 な膜はミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎ）から商業的に入手可能であり、デュラボア（Ｄｕｒａｐｏｒｃ）という商 品名で発売されている。これらの水準より下のものは総て、膜装置を濾過する。

ヘモグロビン（分子量約６７〜６１ｉ、０００）はこの膜装置を通過して、タン クに収集される。

この膜は経時的に目詰りして、濾過フラックスは急速に減少するので、この大型 膜濾過操作には注意深い監視を行う必要がある。それ故、純水溶液で規則的に膜 を洗い流す必要がある。この洗浄により、膜に付着して膜を目詰りさせ、したが ってヘモグロビン溶液のフラックス速度を減少させる細胞片を減少させる。この 膜に関する接線方向の交差流の時間サイクルを最大２時間とすることができ、メ トヘモグロビン水準または目的とするヘモグロビンの生活力に影響をおよぼさな い。微孔性濾過の後の流体容積が限外濾過中の容積の約３０９６まで減少したと きには、無菌の発熱因子不含水を加えて更に多量のヘモグロビン溶液を得ること ができる。希釈率は最大で約５０％である。この物質は廃棄してもよい。３０？ ６の最初の物質を希釈するときには、これを再度的３０９６まで減少させて、こ の時点で廃棄する。濾過された中間体は、引き続いて操作を行うため無菌の発熱 因子不含貯蔵容器に保持する。限外濾過を行うための典型的な装置は、デュラボ ア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）膜を有するミリポア・ペリコン・カセット（Ｍｉｌｌｉ ｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ）であるが、当業界に知られて いる他の装置も同様に用いられる。

次の限外濾過段階には、分子量がｅｓ、ｏｏｏより下の物質の除去が必要である 。これにより、小型分子のヘモグロビンと全血漿上に担持されている他の小型タ ン白質が単離される。総ての場合に、ヘモグロビン溶液は約５から１５［／ｄｉ の濃度に保持される。この段階で行われる濾過によって、ある程度の濃度が提供 される。高濃度では、低いフラックス速度が示される。分子量が１００，０００ と分子量が３０．０００の膜を用いる限外濾過操作では、必要な発熱因子除去段 階とそれに続く発熱因子不含水での洗浄後のチェックとが通常は必要である。

１００．０００の分子量の分離段階では、幾つかの発熱因子の分子量は１００． ０００から１．０００，０００であるので、発熱因子を除去することができる。

３０．０００の分子量を何する膜の発熱因子除去及びこの膜のパケットを調製し て濾過工程を行う場合には、ヘモグロビン溶液をこの接線方向の流系を通過させ て、膜を通して小型分子を輸液することができる。この操作では、リサイクルを 用いてもまたは用いなくともよいが、１００．０００の分子量の濾過段階を必要 とする。保持体（保持される物質）は保存タンクに保持され、内毒素がチェック される。総ての場合に、内毒素は０．５　ＥＵ／ｍｌより低くなければならず、 次の操作で高水準の発熱因子の除去が極めて困難になるからである。

この物質を、無菌の窒素またはアルゴン雰囲気下で保存して、貯蔵タンク装置中 で安定性を保持する。典型的には、メトヘモグロビン水準は、処理におけるこの 時点では１９６より低い。濾過段階は、低温、典型的には約４℃で行わなければ ならない。濾過の後に、この物質を凍結するかまたは直ちに大規模クロマトグラ フィ処理のためのロットサイズに分割する。

Ｆ、クロマトグラフィ クロマトグラフィ分離の前には、物質の濃度状態は２ｇ／ｄｉ以上で且つｌ１ｇ ／ｄｌ以下である。クロマトグラフィ系には、ポンプ、グラディエンド発生機、 カラムおよび検出機がある。

典型的な送液系は、１〜５リットル／分の範囲の送液能力を有するダイアフラム 送液系から成っている。このような系には、バルサフィーダー（Ｐｕｌｓａ（’ ｅｅｄｅｒ）８４８０ステンレス鋼ダイアフラムポンプ等がある。供給系には、 流量が０．１リットル／分から１．５リットル／分の範囲の小型ポンプが用いら れる。このポンプは、典型的には小型容積ポンプであり、管状ダイアフラムのデ ザインのものであることもある。この操作のための典型的なポンプは、バルサフ ィーダー（Ｐｕｌｓａｆｅｃｄｅｒ）７１２０である。クロマトグラフィ装置を 適性に操作するように配置するには、２種類の大型装置を組み立てて、一方を物 質をクロマトグラフィを行う操作系として用い、他方をカラムの洗浄、クリーニ ングおよび再生に用いるようにする。

溶媒組成物発生装置が作られており、応用可能な送液系に経時的に特定のイオン 強度の流体組成物のグラディエンドを発生させる２種類の流体を比例する量で送 る流量制御弁を有している。イオン性相互作用を用いて、カラム系でのイオン交 換クロマトグラフィ分離を行う。二のような装置または同等な装置の作成は、当 業界の技術の範囲内である。

典型的な流量制御弁はバウマン（Ｂａｕｍａｎｎ）流量制御弁であり、標準的な プログラミング用コントローラー、例えばテキサス・インスッルメント（Ｔｅｘ ａｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）５３０プログラミング用コントローラーを用いて 操作するようにプログラミングされている。この系に対する総てのパイプおよび チューブは衛生的なものであり、直径が約１７２インチから１インチの３１６Ｌ チユーブから作られている。グラディエンド発生機およびポンプを通る供給系は 、当業界に知られているように、分離セグメントまたはカラムに対して提供され る。

カラムは、典型的にはステンレスパイプから作られている。ステンレスバイブは 直径が１／２インチのチューブと接続して、一本の長いカラムを構成し°Ｃ分離 を行うようにすることができる。このパイプまたはカラムはテフロンをライニン グして、内部表面がカラム系に対して内部の媒体を充填し易くなっている。

クロマトグラフィ系の流出液を、流れを別けて小さな代表的な量をウォータース ・アソシェーツ（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ）製のＲ４０１型のような 屈折率検出機または紫外部検出機、典型的にはウォータース・アソシェーツ（Ｗ ａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｌａｉｅｓ）製４４１型を通過させることによって監視 することができる。これらの系を用いて、カラムからの流出液を監視して、所望 なタンクが溶出する点を検出することができる。

総てのパラメーターを画定し且つガイドラインを設定してしまったならば、系に は検出が必要なくなり、分画の収集は単純な時間溶出曲線によって行うことがで きる。

これらの材料は、作ってもよくまたは工業的等級のパイプおよびチューブの各種 供給業者から購入してもよい。

カラムを作って、カラムの最上部に提供される試料を均一に分布させると同時に 、カラムの流出液から均一な試料を収集する。長すぎたりまたは短すぎるカラム を作ると、分離効率とイオン交換を行うための平衡化に著しく影響するので、長 さ対直径の比率は重要である。

カラムは、リン脂質を幾分不可逆的に（単純な操作方式で不可逆的に吸着させ且 つ特定のグラディエンド溶出パターンの溶媒を用いて不連続にイオン交換分離を 行うことができる分離媒体から成っている。この分離媒体は、粒度が約５０から １５０ミクロンのシリカゲル粒子から成っており、この物質を横切る流量は約２ ．５リットル／分の範囲である。

シリカゲルの平均細孔度は、ＢＥＴ窒素吸収によって測定すると、３００オング ストロ一ム単位である。このシリカゲルは、様々な製造業者、すなわちダブリュ ・アール・ブレース・デイビソン・ケミカル・カンパニー（Ｖ、Ｒ。

Ｇｒａｃｅ　Ｄａｖｉｓｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から入手することが できる。このゲルは、ヘモグロビン溶液を分離するための官能化特性を与える誘 導化した表面を構築するための好ましい基剤である。

分離媒体を製造するには、シリカ表面を最初に特殊なシランで誘導体形成させて シリカ表面にジオール化学型表面を作り出す必要がある。このジオールは、典型 的には、クロマトグラフィの分野において周知の技法を用いて、典型的には水で 部分的に希釈した容器にシリカとシランを懸濁させることによって、表面にグリ シドオキシプロピルトリメトキシシランのコーティングを作ることによって得る ことができる。この反応は水を基剤とする反応であり、このポリマーはシリカの 表面をコーティングする。シリカをコーティングするこの反応では、約７０℃で ２０時間の反応時間を必要とする。シリカにこのコーティングを行った後、この 物質を一連のメタノールおよびアセトン洗浄液で簡単に洗浄して整然として永久 に結合したジオールをコーティングしたシリカを作り出すことができる。次に、 この物質を乾燥して、第二段階または一連の段階に供して、様々なモノマーを表 面にコーティングして、この表面を誘導体化して第四級アミン型表面特性を有し て特定の種類のイオン交換分離をさせるまたは行う。有機定常相は、架橋ポリマ ーの薄い被膜である。この表面上に置かれる架橋ポリマーは、２種類の異なる親 水性ビニルモノマーから成っている。例えば、ｎ−メチル／アクリルアミド（ａ ｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）の４８％水溶液（シラー・ラプス（Ｓｉｌａｒ　Ｌａ ｂｓ））およびメチルアミドプロピルトリメチルアンモニウム−クロリドのよう なモノマーを用いてもよい。

２個のモノマーは各種の可能性を有しており、一方のモノマーはもう一方の官能 性モノマー、すなわち所望なイオン交換または吸収特性を有するものと共重合す る。

このモノマーは他のポリマー鎖と架橋して、この架橋ポリマーをシリカ表面に定 着させる。

この為に選択される特定のモノマーは、ビニル官能価と、反応性基であって、互 いに反応して、表面とアミン官能基からなる定常相のコーティングに対してコー ティングに必要な橋を形成させて、所望な範囲でイオン交換能力を生成させるこ とができるような方式で反応するものとを有する。

これらの２種類のモノマーを、シリカのメタノール溶液と共に水性溶液に懸濁さ せたならば、°懸濁溶液を蒸発させて、シリカゲル上および中にコーティングさ れたモノマーが残る。この段階で、混合物をデュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）製品、バ ゾ（Ｖａｚｏ）　８４のようなラジカル開始系を含む新たな溶液に再懸濁する。

反応を開始するためには、反応混合物を７０〜７５℃まで加熱してこの温度にに 保持しなければならず、これよりも高くても低くてもいけない。

この温度で、反応が進行し、クロマトグラフィ媒体に用いられる表面特性を生じ る官能基を有するポリマーを表面にコーティングして結合させる。反応が完了し たら、アセトンおよびメタノールのような数種類の溶媒で一連の洗浄を行って未 反応モノマーを除去する必要がある。

これらの総ての洗浄が完了した後、この物質を乾燥して、使用準備ができる。

典型的なカラム直径は６インチであり、典型的なカラム長さは２フイートである 。しかしながら、適当な偏光は当業界の技術の範囲内にある。最大操作圧は５０ ０　ｐｓｉである。溶液を、典型的には１リットル／分の流速でカラムに約１分 間送液することによって注入した後、注入を終了する。それ故、荷重因子は、７ ｇ／ｄｌで物質が１リツトルでしかない。ヘモグロビン溶液を積載した後、カラ ムに同じ緩衝液流（例えば、トリス緩衝液、ｐＨ８，９から９．０）を加えて、 グラディエンドまたは可変組成流が始まるまでカラム中を流し続ける。主要な溶 離剤としての緩衝液を、次に経時的に希釈する。典型的にはこの溶離剤は、トリ スの濃度を１．８　、／Ｉ　、ｐＨ約８．６〜９．２としたトリス緩衝剤塩基溶 液から作られている。溶出、の温度範囲は約３〜ｌＯ℃である。この温度範囲は 、温度範囲が変化すると溶出溶液のｐｕも変化するので、重要である。目的の物 質を溶出する第二の溶液は、前記の緩衝液と同様に高度に生成したトリス緩衝剤 溶液を用いて調製することができる。更に、この緩衝液は１モルの濃度までの塩 も含んでいる。この溶液は、最初のｐ１１溶液と同じにｐＨを調整してあり、８ ．６から９．２の範囲である。ヘモグロビンが溶出する前にリン脂質が溶出し、 目的のベモグロビンピークが収集された後に内毒素が溶出する。

クロマトグラフィ選定技法は、紫外部吸収、屈折率、典型的には前記のような装 置を用い、または流出流の可視部観察によって行う。典型的には、溶出するヘモ グロビンの最初の部分を廃棄して、次に、流出液の収集を開始して、ピークまた は応答がその最大振幅の２０９６から１０％まで減少するまで継続する。これに よって、分画を集め、目的とする分画を精製する。収集を適当な保持時間を越え て行うと、他のタン白質および／または内毒素も収集されてしまい、生成物は使 用できなくなることがある。同様に、最大保持時間の前に収集すると、物質は受 容不可能な水準の内毒素を含むことがある。前保持ピークと後保持ピークである リン脂質と外性的なヘモグロビンの副次的成分は両方とも廃棄する。この収集法 では、ｐＨ範囲が８．９から９．０で約４０対１に希釈された中間体生成物も可 能である。

このｐｏ範囲では、物質を速やかに濃縮する必要がある。

この稀薄状態ではメトヘモグロビンの出現と形成は急速に起こる。この濃縮を行 うためには、分子量が１０．０００以下の膜を用いることができる。プレートお よびフレーム流または中空繊維流系のいずれを用いることもできる。

典型的な装置は、ミリポア・ペリコン・カセット（Ｍｉｌｌ！ｐｏｒｅ　Ｐｅ１ ｌｉｃｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ）である。７〜１０ｇ／ｄｌの濃度水準になり、 メトヘモグロビンの水準が１．５９６未満になったとき、これらの分画を集めて 長期保存する。

この時点で、物質を反応装置に輸送して、引き続いて重合反応を行ってもよい。

クロマトグラフィ装置で収集を行った後、クロマトグラフィカラムを一連の洗浄 を行い、第二の未精製物質の積載の準備をする。このカラム調製を行わなければ 、各種の副次的成分や混入物が溶出して、引き続いて行う実験が役に立たなくな る。典型的には、１００％発熱因子不含の０．５〜１．０モルＮａＣＩ洗浄液を 用いて少なくとも５分間または３カラム容積および僅かに１０分間または６カラ ム容積だけ洗浄を行う。緩衝液グラディエンドおよび塩洗浄が完了したならば、 流体相を初期の条件のトリス緩衝剤が０．１８ｇ／Ｉである１００％トリス緩衝 液に戻して、ｐｌを約８．９±０．１に：Ａ整して、ヘモグロビンの溶出工程を 行う。ヘモグロビンのｐＨ範囲については検討しなかったが、８，９から９のｐ Ｈ範囲のクロマトグラフィ系で、純粋なヘモグロビン類似体の分離が最高且つ最 良になる。

これより低いｐＨ範囲（８，６〜８．４）では、ヘモグロビンは純粋な状態で溶 出するが、分離鏡への物質の積載性が著しく低下する。ｐＨ水準が９．５から１ １では、メトヘモグロビン水準を低く維持することができなくなるような速度で メトヘモグロビンが形成される。更に、逆汚染の可能性もある。このような高い ｐ）！範囲では、メトヘモグロビン水準は２時間で５％増加する。カラムから溶 出する物質は、他のタン白質、内毒素およびリン脂質を実質的に含まないヘモグ ロビン溶液である。この物質は、架隅して、実質的に内毒素を含まず、実質的に リン脂質を含まない半合成代用血液の製造における中間生成物としての本来の用 途を有する。

濃縮後に塩化ナトリウムおよびトリス緩衝液を有するヘモグロビン溶液を、短く て１日から長ければ６力月間長期保存した。その結果、生成物を一２０℃に保持 すれば、生成物の分解もメトヘモグロビン水準の増加も見られなかった。しかし ながら、溶液を２〜２４時間を要して融解させると、メトヘモグロビンの増加が 見られる。未凍結状態で放置すると、メトヘモグロビン水準は増加し続ける。物 質を低ｐＨ（ｐＨ７以下）にする他の検討では、メトヘモグロビン水準は著しく 増加し、すなわち３時間以内に１０％増加する。

ヘモグロビン溶液は、典型的には下記の特徴を有する。

ヘモグロビン溶液の規格 ヘモグロビンｇ／ｄｉ　７〜１５ オキシヘモグロビン　９０〜１００％ カルボキシヘモグロビン　０〜２％ メトヘモグロビン　０〜ｌＯ％ ｐＨ６，５〜９．０ 内毒素（ＥＵ／ｍｌ）　（０，０１ 分子量、ダルトン　８８，０００ リン脂質　＜１ｎ　ｍｏｌｅ／ｍ１ ＴＬＣプレート、ヨウ素発色　汚染なしアミノ酸分析　異物タン白質、アミノ酸 なし Ｎ−末端配列　９８％”がウシヘモグロビン配列に一致 ペイジ・ゲル　単一バンド（ウィルスｔ９染なし） 塩濃度　変化することあり 高速クロマトグラフィ　９９．９％“がヘモグロビンタン白質 Ｇ、　重合（架橋）反応 物質を具体的に重合反応に付しまたは凍結状態から融解させたならば、これを、 速やかに混合して高剪断を与えるように排泄された推進翼を有する無菌の発熱因 子を含まない反応装置に導入する。（典型的な装置は、３リツトルアプリコン（ ＾ｐｐｌ　１ｃｏｎ）醗酵装置であり、反応装置の底から１インチのところに平 らな翼形推進機と反応装置の周りに５個の１ノ２インチの邪魔板を取り付けであ る。

これは、架橋剤を加えるときには、大きなポリマーが形成されることを防止する 必要がある。）反応装置に加えられるヘモグロビン溶液を再循環装置に配置し、 ヘモグロビン溶液を反応装置から抜き取り、排除膜、典型的に環境の反応装置に 戻す。（反応装置は、不活性ガス、すなわちアルゴンでガスシールしてもよい。

）この最後の処置は、反応装置を真空にして、この反応装置中の液体をアルゴン ガスシールして行う。この時点で、細菌が導入されるのをなくするように極力注 意する。このふふは発熱因子を含まず、ＬＡＬ分析では内毒素を示さない。

次に、無菌の発熱因子不含緩衝液（ｐＨ８，９〜９．１）を、発熱因子除去膜フ ィルター、典型的には分子量が１０．０００のフィルターを介して反応装置に加 える。同時に、分子量が１０，０００の濃度ループをサイクルさせて導入された 流体と反応装置に存在している流体の容積をバランスさせる。

高ｐＨを中和するのに用いられる反応緩衝液は、ナトリウム、クロリドおよびカ リウムの生理的組成物であり、典型的にはナトリウムは１２０ミリ当量であり、 クロリドは１２０　ミリ当量であり、カリウムは４ミリ当二である。

溶液のｐｌを、ＨＣＩとトリス塩基を用いてｐｌが約４．７から５．２に調整す る。ｐＨ減少工程中のｐＨが低過ぎると、中和用酸溶液を導入した時点で多量の メトヘモグロビンが形成される。濾過工程を維持して、ｐＨを反応装置中で約７ ．４から８．０の範囲まで降下させる。この時点で、導入を終了し、架橋溶液を 導入する。

適当な架橋剤は、ボンセン（Ｂｏｎｓｅｎ）らの米国特許第４．００１，２００ 号明細書に開示されており、詳細はこの特許明細書を参照されたい。好ましい種 類の架橋剤は、アルデヒド官能基を有するものであり、最も好ましくはジアルデ ヒドであり、グルタルアルデヒドが特に好ましい架橋剤である。

グルタルアルデヒドを用いるときには、グルタルアルデヒドを典型的には約１０ ０＋ｎｌ　／時の割合で加える。グルタルアルデヒド溶液は、典型的には高純度 規格のグルタルアルデヒド（−２０℃〜４℃で保存）を短時間、典型的には２〜 ５分間で融解させることによって調製する。好ましくはグルタルアルデヒドの濃 度が約２５９０であるこの溶液を、次に発熱因子不含水に加え、好ましくは２５ ９６溶液約５ｍｌを発熱因子不含水１００ｍ１の割合で希釈して溶液を作成する 。この溶液を前記した速度で反応装置および反応混合物に加える。

架橋溶液とその架橋（重合）の実施は、ゲル透過クロマトグラフィによって観察 する。ゲル透過クロマトグラフィでは、細孔度が３００オングストロームの親水 性充填剤カラムであって分離能が２４．０００段／ｍを越えるものを用いる必要 がある。典型的なカラムは、ウォータス・アソシエーツ（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ ｏｃ１ａｔｅｓ）から入手でき、典型的な充填剤はウォータース・プロティン・ パック（ＷａｔｅｒｓＰｒｏｔｅｉｎ　Ｐａｋ）　３００ＳＷである。記録され る溶出クロマトグラムをピークの溶出時間に対して積分して、出発物質に対して 定量する。架橋剤皮が５０％から７０９６になるのが好ましい。この数値は、分 子量がｅｏｏ、ｏｏｏ　＜ダルトン）未満で且つ分子量が６８．０００　（ダル トン）より大きいカラムから溶出する物質の割合によって決定される。

Ｈｏ　膜濃縮 ゲル透過クロマトグラフィによって計算された架橋度が５０〜５５％になったな らば、溶液を分子量１０Ｑ、０００の膜濃縮を行う。この膜濾過では、反応混合 物の接線方向の流れを、膜を通過させ、８ｇ、ＯＤＤ以下の物質を膜装置を通し て透過させる。これは、流体が２５％減少するまで行う。

架橋が完了したと思われる時点で、冷却溶液、すなわち発熱因子不含リジン、ｐ Ｈ７を加える。リジン溶液の濃度は１ｇ／ｌである。このリジン溶液を加えて、 グルグルアルデヒド戸ヘモグロビンの重合反応を冷却して過剰のグルタルアルデ ヒドと錯体形成させる。この物質は、ヘモグロビン分子に結合した未重合グルタ ルアルデヒドを固定するものとも考えられる。この添加が終了したら、分子量分 布を決定し、ゲル透過クロマトグラフィによって測定すると安定化していること が判る。次いで、濾過を開始して、過剰のリジンと過剰のグルタルアルデヒドと 任意の他の分子量が１００．０００より小さい分子量柱を除去する。

初期の未架橋ヘモグロビン溶液のゲル透過クロマトグラムは、分子の大きさがｉ ｅ、ｏｏｏから６８，０００ダルトンであり、６８．０００ダルトンで最大量で あることを示している。

濾過の後、幾らかの、多くても５０％のｅｓ、ｏｏｏダルトンのヘモグロビンが あるが、ｅｓ、ｏｏｏダルトンの分子量より小さい物質は検出されない。架橋の 後、この物質を濾過すると、電解質と溶液のｐＨをバランスさせることができる ので、バランスの取れた注射用の生理溶液を得ることもできる。

この濾過工程が完了したならば、物質を装置から取り出し、包装して凍結する。

総ての工程が完了して、包装の際に、物質の試料を採取して試験を行う。

＋＋、生成物 典型的には、生成物は下記のような特徴を有する。この物質の分子量分布は、物 質の９０％より多くが６８．０００ダルトンから５００．０００ダルトンの範囲 にある。氷点降下によって測定した容量オスモル濃度は、典型的には溶液１リツ トル当たり２２０から３２０ミリモルである。ゲル電気泳動で示される電気泳動 パターンでは、ｅｓ、ｏｏｏから５００．０００の分子量範囲のバンドを示して いる。最終的なヘモグロビン含量は５〜２５、好ましくは９〜１３ｇ／ｄＢ：調 整することができ、メトヘモグロビン水準は２０９６より少なく、好ましくは１ ０％より少ない。塩化ナトリウムとカリウムのイオン濃度は、動物または試験さ れる種にとって無毒である。リン脂質を検出するために展開した薄層クロマトグ ラフィでは、ヨウ素発色によって展開したところスポットは見られない。リン酸 によって測定されるリン脂質は検出不能であり、検出限界としての１　ｎ　ｍｏ ｌｅ／ｍ１未満である。ガスクロマトグラフィを遊離のグルタルアルデヒドを定 量尺度として用いる。検出限界が１　ｐｐＨのガスクロマトグラフィでは、グル タルアルデヒドは検出されない。ゲルクロマトグラフィおよび等電果中法によっ て測定したところ、ヘモグロビン以外のタン白質は存在しない。

溶液を、感度スケールが０．０１から０．１のＬＡＬ　（リムラス・アメボサイ ティック・リゼート）法によって測定すると、通常は０．Ｏ１内毒素単位／園１ 未満であり、総ての試験でも発熱因子は含まれていない。この物質についてウサ ギを用いて検討すると、発熱因子不含物質によって示されるのと同じ特徴が示さ れ、ウサギは発熱しない。

この物質は、異常内毒素反応および他の因子は、１／３容量の純粋な血漿分画を 供給したコントロール群のウサギについての出血条件に関して行ったのと同様に 試験したウサギでは生じない。総ての場合に、酵素の水準が幾分高くなり且つ組 織に変化を示すある種の組織病理学があったことに注目すべきである。しかしな がら、これらの変化の大半は、可逆性のものと思われ、前記のように出血条件お よび純粋な血漿タン白質分画による置換によって見られるものと同様であった。

これは、高等動物では内毒素反応および他の因子を欠落しているものと考えるこ とができる。純度は、分離用のイオン交換能を用いる高速液体クロマトグラフィ によって観察したところ、４個の別個なピークを示し、これらのピークは定量時 にゲル透過クロマトグラフィによって特徴付けられた分子量分布とは無関係にバ ッチ間で一致している。精製した物質は、Ｐ２Ｏの値が２０〜２８ｍｍＨｇであ ることによって示されるように、酸素輸送における生命維持能力を示す。更に、 重要なことは、本発明のヘモグロビン溶液は、他の先行技術による架橋ヘモグロ ビン溶液によって示される脈管収縮特性よりも小さな臨床的に重要な脈管収縮特 性を示すことである。この物質は、更に各種の哺乳類の赤血球の増加した細胞外 観の特性を示し、生体内では下記のような異常で有害な化学的および生理学的機 能のいずれをも起こさない。すなわち、（１）補体を活性化せず、（２）出血性 異常を起こさず、（３）異常な血小板の機能または凝集を起こさず、（４）異常 なプロトロンビン時間（ＰＴ）を起こさず、（５）異常な部分トロンボプラスチ ン時間を起こさず、（６）血液型または交差試験法を妨害せず、（７）　３．５ 　ｇ／ｋｇ／体重または８　ｇ／ｉａ＋の循環血液容積では腎臓に対して毒性を 持たず、（８）少なくとも７日間の循環持続性を示し、（９）赤血球形成を促進 するための刺激として作用する。この物質は、典型的にはド記の表に示されるよ うな特徴を有する。

典型的な本発明の代用血液の特徴化 無菌性　標準的培養法により殺菌 検出不可能な 内毒素水準　ＬＡＬによって試験し、感度が０．０１　ＥＬＩ／ａ＋ｌから０． １２５　ＥＵ／ａｔの範囲の標準曲線と比較するときの （０，０１Ｅｌｆ／＋１の試料 バッグ内容　Ｎａ　１２０±２０ミリ当量、ＣＩ　１１５±２０ミリ当量、　Ｋ 　４，０±１　ミリ当量、ヘモグロビン　ｌ１ｇ土２／ｄ１、リジン　＜Ｉｇ／ ｌ、グルタルアルデヒド 検出されず、トリス　＜１．５ｇ／ｌ。

発熱因子不含Ｈ２０容積：４５０〜５００１１％メトヘモグロビン＜１０％、 リン脂質＜ｌ　ｎｍｏＩｅ／１、 ヘモグロビン分子量分布く％）二 ＜ｅｓ、ｏｏｏ　：少なくとも５０％、＞５００．０００　：　８％±２％、 氷点降下による容量オスモル濃度： 溶液１リツトル当たり２２０〜３２０ミリオスモル 容器　フェンウオール・バッグ・コード（Ｆｅｎｖａｌ　Ｂａｇ　Ｃｏｄｅ）　 ４Ｒ２０２３、６００ｍ１無菌、非発熱因子性流路、フェンウ オール・ラボラトリーズ（ＦｅｎｗａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製 安定性　−２０℃では、８か月より長期間変化なし ４℃では、５日間メトヘモグロビン 水準が１０％より低い。

Ｉｌ＋、有用性 本発明の代用血液は、先行技術による代用血液および血液エキスパンダーと同様 な方法で利用することができる。例えば、この代用血液は急性の出血によって失 われた血液を代用するために、外科手術中に失われる血液を代用するために、偶 発的な失血後の蘇生法で酸素を供給するため、および一般的には関連した条件に おける血液容積を維持するために用いることができる。血漿エキスパンダーとし ては、この代用血液は、体積欠損ショックにおいて、アナフィラキシ−およびア レルギーショックの緩和剤として、火傷の後や激しい下痢の結果として失われる 血漿を代用するのに用いられる。

本発明の代用血液は、したがって総ての補乳類に利用することができるが、特に ヒトの治療に有用である。本発明の代用血液は受容体である血液およびその成分 と混和性であり、実質的に無毒で、非抗原性で、非発熱因子性であり、特に実質 的に内毒素および他のの細胞に結合したおよび細胞とは遊離したタン白質を含ま ない。そのコロイド腫脹特性により、この生成物は病気の状態の管理においても 血液および血漿の水準を維持するのに特に有用である。更に、この物質は、病気 を移す危険性を伴うことなく用いられる点において極めて重要である。更に、本 発明の代用血液は、全血の投与に関連する免疫学的問題を持たず、生体内では下 記のような異常で有害な化学的および生理学的機能のいずれをも起こさないと考 えられている。すなわち、（１）補体を活性化せず、（２）出血性異常を起こさ ず、（３）異常な血小板の機能または凝集を起こさず、（４〉異常なプロトロン ビン時間（ＰＴ）を起こさず、（５）異常な部分トロンボプラスチン時間を起こ さず、（６）血液型または交差試験法を妨害せず、（７）　３．５　ｇ／ｋｇ／ 体重または８　ｇ／ｉｄ＋の循環血液容積では腎臓に対して毒性を持たず、（８ ）少なくとも７日間の循環持続性を示し、（９）赤血球形成を促進するための刺 激として作用する。本発明の代用血液は、フスチス（Ｈｕｓｔｉｓ）著の「輸血 （Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）　Ｊに開示されているような当業界に おいて通常の投与法を用いて投与してもよい。

血液エキスパンダーとしては、本発明の代用血液をポリエチレンオキシド、ポリ アクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、およびエチレ ンオキシド−プロピレングリコール縮合体のような水溶性で生理学的に受容可能 なポリマー性の代用血漿と混合してもよい。この物質は、線状多糖類、例えば、 分子量が４０．０００から７０，０００のデキストラン、アラビアゴムペクチン 、バランスした流動ゼラチンおよびヒドロキシエチル澱粉のようなコロイド状の 血漿様代替物および血漿エキスパンダーと混合してもよい。

更に、本発明の代用血液は通常の酸素化装置において、人口酸素交換溶液として 用いてもよい。患者の循環を助けるのに用いられるときには、酸素化装置が広く 用いられ、循環を維持し且つ単離された血管床における血液と酸素化膜を透過す る酸素との間でガス交換することによる酸素の移入を行うため１個異常のポンプ を用いて体外から静脈内の血液を機械的に酸素化する。

下記の実施例において、括弧内に示される装置は更に下記の参考リストに示され ている。第１Ａ〜ＩＨ図はこの実施例の方法のためのフローシートであり、実施 例の装置参照番号は図の参照番号に対応する。

Ａ、　血液の収集 出発点は、屠殺したウシからのエリスロサイト（赤血球）源をそれぞれ収集した ちの約５ガロンであった。層殺状から得られるウシ血液は、容易に利用できるこ とにより、好ましい赤血球源である。

収集用套管針を用いて、無菌状態で血液を抽出した。

動物の皮を切断し、はぎ取った後、套管針を動物の心臓の近くの主要血管に挿入 するのである。細菌の導入を避けて、凝固防止剤として発熱因子を除去したクエ ン酸ナトリウム（０，５リツトル）を予め充填した２５リツトルの個々の容器を 用いて発熱因子不含または発熱因子水準の低い物質の保持を行った。収集した血 液を直ちに栓をして環境に暴露されないようにした。収集工程が完了したら、物 質を約４℃に冷却して、細菌の増殖を押さえた。この時点では異なるウシからの 血液はプールされなかった。

血液を発熱因子および無菌性についてチェックして、（１）いずれのウシも病気 を持たず、または臭集中に汚染が起こらなかったことを確かめた。血液は、層殺 状がら処理プラントまで冷凍条件で輸送した。

Ｂ、　赤血球の分離 血液を、供給ポンプ（Ｐ−３０１）を用いて、収集容器がら２．５から６リツト ル／分の速度で、１５．０００がら１ｇ、０００ｒｐｍで作動する分離用遠心分 離機（ＣＴ−３０１）へ圧送した。

遠心分離機からの流出液（分離された赤血球）を、無菌条件下で１１４リツトル の希釈タンク（Ｔ−３０１）に集めた。

この時点で流出液はプールされ、最早側々の動物毎には処理されなかった。無菌 窒素を正圧で遠心分離機に送り、細菌を除いた。

Ｃ１赤血球の透明化 赤血球を、４℃に保持しておいた注射用水（ＷＦＩ）を用いて、希釈タンク（Ｔ −３０１）において希釈した。赤血球を、透明化供給ポンプ（Ｐ−３０２）によ って、希釈タンク（Ｔ−３０１）から１５．０００から１８．０００　ｒｐ１！ で作動する透明化遠心分離機（ＣＴ−３０２）へ圧送した。この透明化段階によ って、無菌保持タンク（Ｔ−３０２）へ横力によって流れた放出されたヘモグロ ビン溶液から総ての細胞片を分離した。

Ｄ、　微孔性濾過 ヘモグロビンを、段階Ｉのミクロフィルター供給ポンプ（Ｐ−４０１）によって ５リットル／分で段階ｌのミクロフィルター（Ｐ−４０１）　（０，４５ミクロ ン）を通して、圧送した。

フィルターからの保持液は、無菌保持タンク（Ｔ−３０２）にリサイクルした。

濾液を、段階ｌのミクロフィルトレート・ポンプ（Ｐ−４０２）によって０．５ リットル／分で、段階Ｉのミクロフィルトレートタンク（Ｔ−４０２）に送った 。この微孔性濾過段階において用いたタンクＴ−４０２は容量が１００リツトル のガラス容器であり、注射用水（ＷＦＩ）およびアルカリ性洗浄接続であって無 菌ベントフィルターを有するものを備えている。微孔性フィルターはプレートと フレームから構成され（例えば、ミリポア・ベリコン・カセット型）、平均膜内 外圧（ＡＴＰ）を１〜２ポンド／平方インチに注意深く保持するように操作した 。

膜を横切る膜の接線方向流は２〜５リットル／分であったが、膜中のフラックス は０．１〜０．２リットル／分の程度であった。この操作速度を保持して、細胞 片が股上に蓄積されないようにした。膜に対して接線方向の溶液の濃度が初期溶 液の１０％未満にまで減少したとき、残りの溶液を廃棄した。（または、これを 注射用水で再希釈して、系からのヘモグロビンを高収率で得た。）溶液を、次の 分子の分離に付した。

Ｅ、　限外濾過 ヘモグロビンを、段階Ｉのウルトラフィルター供給ポンプ（Ｐ−５０１）を用い て、分子量が１００．０００の段階ｌのウルトラフィルター（Ｆ−５０１Ａ　＆ 　Ｂ）を通して段階Ｉのミクロフィルトレートタンク（Ｔ−４０２）へ送った。

フィルターからの保持液をミクロフィルトレートタンク（Ｔ−４０２）にリサイ クルし１、濾液を段階ｌのウルトラフィルトレートタンク（Ｔ−５０１）へ送っ た。保持液側の流速は５リットル／分であった。濾液の流速は０．２リットル／ 分であった。

ヘモグロビンを、次に、段階１１のウルトラフィルター供給ポンプ（Ｐ−５０２ ）を用いて、段階Ｉのウルトラフィルトレートタンク（Ｔ：も０１）から段階１ １　（３０，０００Ｄ）のウルトラフィルターＣＦ−５０２Ａ　＆　Ｂ）を通し て送った。保持液は、段階■のウルトラフィルトレートタンク（Ｔ−５０１）に リサイクルするかまたは段階１１のウルトラフィルトレートタンク（Ｔ−５０２ ）へ送った。濾液は廃棄した。これらのタンクは１００リツトルの容量のガラス 容器であり、無菌ベントフィルターを有しており、ＷＦＩおよびアルカリ液で洗 浄するための接続を備えている。接続は、段階１１のウルトラフィルトレートタ ンク（Ｔ−５０２）の下に配設され、下流系をＷＦＴおよびアルカリ液で洗浄す るようにした。

Ｆ、クロマトグラフィ クロマトグラフィ段階は、Ｔｌ−５３０ソフトウエアパツケージによって自動化 した。キー変数はロックによって保護して、工程操作を反復し得るようにした。

ヘモグロビンを段階１１のウルトラフィルトレートタンク（Ｔ−５０２）から送 り、ＧＤＴ供給ポンプ（Ｐ−４０１）を用いて約１リツトル／分で１分間ＧＤＴ カラム（Ｃ−８０１Ａ−Ｄ）へ注入した。ヘモグロビンの注入の後、グラディエ ンドまたは可変組成流を開始し、グラディエンドポンプ（Ｐ−６０２）を用いて カラムへ注入した。グラディエンド流の組成を、コンピューターによって制御さ れたブロポーショニング弁を用いて画定した。ヘモグロビンの溶出の前にリン脂 質が放出され、目的のヘモグロビンピークを集めてしまった後向毒素が溶出した 。典型的には、溶出するヘモグロビンの最初の部分を廃棄した。次に、流出液の 収集を開始して、ピークまたは応答がそのピーク振幅の２０〜１０００にまで減 少してしまうまで継続した。これによって、収集される分画が構成され、目的の 分画を精製した。ヘモグロビンの収集の後にもグラディエンドを継続して、洗浄 サイクルを開始する前にカラムから汚染物を除去した。洗浄ポンプ（Ｐ−８０３ ）による洗浄サイクルは、最初にトリス／ＮａＣｌを用い、次にＷＦＩ、次にト リスを用いる洗浄からなり、これにより注入／溶出サイクルの前にＧＤＴカラム を再平衡させた。ヘモグロビンを、ＷＦＩおよびアルカリ洗浄接続と無菌ベント フィルターを備えた１００のガラス容器であるＧＤＴタンク（Ｔ−６０１）に集 めた。この溶液は、四量体性であり、生ゲル電気泳動法および高速液体クロマト グラフィによって測定するとｅｇ、ｏｏｏダルトン範囲が９９．９％を越えた。

この物質は発熱因子を含まず、メトヘモグロビン水準は２％より低かった。濃度 は、濃縮前は０．２　ｇ／ｄｌであり、２０ｇ／ｄｌまで濃縮することができる 。

Ｇ、　重合（架橋）反応 物質を、ＧＤＴタンク（Ｔ−６０１）から分子量が１０，０００の段階Ｉの架橋 フィルターを通して段階工の架橋ポンプ（Ｐ−８０３）によって送った。保持液 をＤＧＴタンク（Ｔ−６０１）ヘリサイクルさせた。濾液を廃棄した。濃度が７ 〜ｌＯｇ／ｄｌになり且つメトヘモグロビンの水準が１．５％未満となるまで、 この段階を継続した。この物質を袋詰めにして凍結するか、または段階１１の醗 酵槽供給ポンプ（Ｐ−９０４）によって直ちに段階１１の架橋醗酵槽（ＰＲ−９ ０２）に送った。

凍結した物質を融解して、直ちに醗酵槽（ＰＲ−９０２）へ重力によって供給し てもよい。

処理した物質を、段階１１の架橋ポンプ（Ｐ−８０５）によって、分子量が１０ ．０００の段階１１の架橋フィルター（Ｆ−９０４）を通して送った。保持液を 、段階１１の架橋醗酵槽（ＰＲ−９０２）にリサイクルした。濾液を廃棄した。

醗酵槽の内部は、真空にし且つアルゴンでガスシールすることによって低酸素環 境に保持した。反応装置の容積は、同時に無菌の発熱因子不含緩衝液（ｐＨ８， ９〜９．１）を発熱因子除去膜フィルターを介して反応装置に加えることによっ て一定に保持した。この緩衝液は、ナトリウム、クロリドおよびカリウムから成 っていた。１）ＩＩをｌｌＣｌ　とトリエ塩基で：Ｊ８整する。次いで、架橋剤 （グルタルアルデヒド）を反応装置に加えた。

Ｈ９膜濃縮 ゲル透過クロマトグラフィによって計算した架橋度が５０〜５５％より大きくな ったならば、物質を段階１１の架橋ポンプ（Ｐ−９０４）によって分子量がｉｏ ｏ、ｏｏｏの段階１１の架橋フィルター（Ｆ−９０５）を通して送った。保持液 を、流体の容積が約２５９６減少するまで、段階１１の架橋醗酵槽（ＰＲ−９０ ２）にリサイクルした。この濾過段階において電解質とｐＨを調整して、バラン スのとれた注射用生理溶液を得た。

次いで、物質を重力によって袋重点装置へと流した。

生成物を袋詰めにして、冷凍保存した。任意段階Ｅを省いたこと以外は前記の工 程によって製造された物質の３種類の異なるバッチを分析したところ、実施例４ の「結果」の節に記載された特性を有する架橋ヘモグロビン溶液を生じた。

参照番号 Ｐ−３０１アルビン（ＡＬＢＩＮ）ＳＬＰ　１０７　Ｐ５１　Ｂｌ衛生的ローブ −ロータリーポンプ。

Ｐ−３０２Ｐ−３０１と同じ。

Ｐ−４０２Ｐ−３０１と同じ。

Ｐ−４０３コール・パーマ−・マスターフレックス（Ｃｏ　ｌ　ｅＰａｒｍｅｒ 　Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ）７０１９型嬬動ポンプ。

Ｐ−５０Ｉ　Ｐ−３０１と同じ。

Ｐ−５０２Ｐ−３０１と同じ。

Ｐ−６０Ｌ　Ｐ−３０１と同じ。

Ｐ−６０２Ｐ−３０１と同じ。

Ｐ−６０３Ｐ−３０１と同じ。

Ｐ−９０５アルビン（ＡＬＢＩＮ）Ｓｌ−Ｐ　１１０　Ｐ５１　Ｂｌ衛生的ロー ブ−ロータリーポンプ。

Ｔ−３０１２５ガロンの３】６Ｌステンレス・スチール、エレクトローポリッシ ュト・インテリア・ファブ（Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ　５ｔｅｅ１．Ｅｌｅｃｔｒｏ −ＰｏｉｉｓｈｅｄＩｎｔｅｒｉｏｒ　Ｆａｂ、）　、サーモ・エレクトロン・ ライスコンシン、インコーボレーテド（Ｔｈｅｒｍ。

Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ＷｉＳＣＯｎＳｉｎ、　Ｉｎｃ、）製。

Ｔｍ２Ｏ３７−３０２と同じ。

Ｔ−４０１０−１／シヨツト（Ｓｃｈｏｔｔ）　１００Ｌシリンダー状ガラス容 器（ＧＥＲ１００）。

Ｔ−５０１Ｔ−４０１と同じ。

Ｔ−５０２Ｔ−４０１と同じ。

Ｔ−６０１Ｔ−４０１と同じ。

ＣＴ−３０１シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）モデルＡ−１８、Ｍ−３５００ −５２０型。

ＣＴ−３０２ＣＴ−３０１と同じ。

Ｆ−４０１衛生バイブ接続を有し、ミリポア５平方フイートの濾過カセットを備 えたステンレススチールハウジング。

Ｆ−４０２Ｆ−４０１と同じ。

Ｐ−５０１Ａ１５０１８　Ｆ−４０１と同じ。

Ｆ−５０２Ａ１５０２Ｂ　Ｆ−４０１と同じ。

Ｆ−９０４Ｆ−４０１と同じ。

Ｆ−９０５Ｆ−４０１と同じ。

Ｃ−６０１Ａ−Ｄ　レジストフレックス（Ｒｅｓｉｓｔｏｆ　Ｉｅｘ）６”ステ ンレススチールでＴＦＥライニングしたパイプおよびフランジ。

ＰＲ−９０２３リツトルのアプリコン（Ａｐｐｌｉｃｏｎ）醗酵槽。

撹拌：　２〜６枚の翼櫂型装置（１，５ｃｍ　Ｘ　ｌ　ｃｍ櫂）であってタンク の底から３　ｃｍおよび＋４ｃ＋＋＋の部分に設置されたもの、および４個の邪 魔板。

袋充填装置　モデルＰ−４００−Ｘテーブル・トップ充填装置、フジ・マシーン ・カンパニ ー　（Ｃｏｚｚｉ　Ｍｃｈｉｎｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ）。

実施例２ 最終生成物の分子量分布を決定するために、この検討を行った。分子量が１，０ ００，０００より大きなヘモグロビン粒子は、ヒトおよび動物に幾つかの臨床上 の問題を起こすことがある。最終生成物１μｌ　（タン白質８０μｌ）を５０倍 に希釈して、この５０μｍをヒユーレット−バラカード（）Ｉｅｖｌｅｔｔ−Ｐ ａｃｋａｒｄ）高速液体クロマトグラフィ装置に注入した。ウォーター・データ ー・７４０　・モジュール・ステーション（Ｗａｔｅｒ　Ｄａｔａ　７４０　Ｍ ｏｄｕｌｅ　５ｔａｔｉｏｎ）を用いて、結果を積分した。

１９８０年以来、タン白質の特徴化および精製用の軟質および半硬質ａ機ゲルを 用いる古典的ゲル濾過法は、高性能サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰＳＥＣ） と次第に拮抗するようになってきた。ＩＩＰｓＥｃの方法は、高い背圧で操作す る高効率の緩衝液混和性カラムが開発されたことに関連している。二〇カラムに は、所定の細孔度分布と誘導体形成したタン白質親和性表面を有する硬質の親水 性の多孔性シリカゲル粒子が充填される。タン白質は、分子量および大きさが減 少する順序で溶出する。

下記の）Ｉｂ濃度を有する物質の４種類の発熱因子不含バッチを、試験に用いた 。

バッチ番号　Ｈｂ　ＭＥＴ　Ｈｂ ２２Ｂ１　１０．３　３．４ ２２７１　１０．４　３．８ ２３１１　１１．３　７．２ ２３４１　９．０　３．５ 下記のタン白質スタンダードを用いた。

（１）ブルー・デキストラン、分子量２，０００．０００（２）アルドラーゼ、 分子量１５８，０００（３）ウシアルブミン、分子量６７．０００（４）オバル ブミン、分子量４５．０００（５）フェリチン、分子量５４０．０００試験装置 カラム：ワン・プロティン−パック（Ｏｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ）３００ 　ｓｖ、ウォータース・アソシエーツ（警ａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ）。

緩衝液　０．１Ｍ　ｋ　ｐＨ７，８゜ 流速　１ｍｌ／分。

ＨＰＬＣ装置　ヒュレット・バラカード（ＨｃｖｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ）　、 １０９０液体クロマトグラフ、２８０ｒｌＬ１１検出器、７４０・ウォータｍ− チーター・モジニール拳ステー ション（７４０Ｗａｔｅｒ　Ｄａｔａ　Ｍｏｄｕｌｅ　５ｔａｔｉｏｎ）。

統計分析 ７４０　・ウォーター・データー・モジュール・ステーション（７４０Ｗａｔｅ ｒ　Ｄａｔａ　Ｍｏｄｕ！ｅ　５ｔａｔ４ｏｎ）を用いて、データーを積分した 。グルタルアルデヒドを加える前に、Ｈｂ温溶液５０μｌ）を注入して、分子量 が６８．０００のＨｂに対しては保持時間を９．６９９と仮定した。

ブルー・デキストランに対する保持時間は、約４．８時間であった。Ｈｂ温溶液 対する保持時間４．９５９は分子量が１．０００．０００より大きいものに対応 する。

結　果 分子量分布： 波長：２４４ 流速：　１ｍｌ／分。

保持時間２２１３１　２２７１　２３１１　２３４１４．９５９　９．４％　７ ．８％　８．９％　８．５％５．１６５　８．６％　１１．０７％　５．２％　 ３．７％７．３６２　２９．３％　４１．９％　３３．３％　３３．５％８．２ ５９　１７．８％　１５．４３％　１８．２７％　１７．５％９．８９９３４． ９％　２３．８％　３４．３３％　３６．８％結　論 物質の総ての４バツチは、バッチ毎の分子量分布は極めて一貫していた。最良の バッチは２２７１であり、２３．８％が非架橋物質であり、７．８％が高分子量 の粒子であった。

他の３バツチについての架橋物質の割合は次の通りである。

バッチ番号　非架橋物質（％）　高分子量をＨする粒子（％） ２２６１　３４．９　９．４ ２３１１　３４．３　８．９ ２３４１　３６．８　８．５ 同時に、高分子量を有する粒子の割合は、９．４％、８．９％および８．５％で あった。

架橋血液試料内の内毒素濃度の検出を、リムラス・アメボサイティック・リゼー ）　（ＬＡＬ）分析試験を用いて試験した。ＬＡＬは、馬蹄カニのアメーバ様細 胞の抽出物から得られたものである。試料を陽性であるか陰性であるかを試験し て、レファレンス内毒素の一連の希釈によって作成した末端点反応に対して定量 した。標準曲名会期曲線は、前記の希釈物からの比色法による値から作成し、内 毒素含量を曲線を補作して決定した。

１９８０年１月１８日に（３８ＦＲ１４０４）、ＦＤＡは、馬蹄カニのアメーバ 様細胞から誘導されるリムラス・アメボサイティック・リゼートは生物学的生成 物であり、ウサギの代わりに用いることができることを発表した。ＬＡＬは、生 成物内部の細菌性の内毒素股は発熱因子の敏感な指示薬であることが判っている 。内毒素を検出する感度が高いため、発熱因子では熱、ショックを起こし且つ極 めて高い量が見出だされる場合には死亡することもある生成物をヒトに投与する ことを防止することができる。

試験およびコントロール製品 ４種類の重合した血液試料を、ＬＡＬ分析試験を用いて試験したところ、０．Ｏ １内毒素単位／　ｍ１未満であることが２２８１　＜０．０１ ２２７１　＜０．０１ １３１１　＜０．０１ ２３４１　（０，０１ 材料： （１）　ｌｓｏ℃のオーブンで４時間以上、好ましくは２４時間加熱することに よって発熱因子を除去したガラス試験管。

（２）　リムラス・アメボサイティック・リゼート、ロット番号３７２、スペク トロチーム・サブストレート（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｃ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ） 、（ケープ・コード壷アソシエーツ（Ｃａｐｅ　Ｃｏｄｅ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅ ｓ））。

血液の希釈試料。

本発明の代用血液（ｉＩｂ刊、Ｈｂ−Ｉ＋および１ｂ−１１１、以下、ヘモグロ ビンと呼ぶ）の３バツチおよび対照用のヒト血漿タン白質分画（ＰＰＰ）を用い て、それぞれ６匹のウサギからなる４群におけるａ′！ｌ−の血液容積の３分の １を置換した。

この検討では、本発明の代用血液をウサギに静脈内投与した場合の急性毒性を評 価した。この検討は、（１）死亡率、（２）罹病率、（３）生活器官に影響する 病理生理学的変化、（４）病理学的変化（巨視的）　、（５）病理学的変化（微 視的）によるものである。この検討は、３バツチの代用血液（）Ｉｂ−１、Ｈｂ −Ｉ＋およびＨｂ−ＩＩ＋）の効果をヒト血漿タン白質分画（ｐｐｐ）の効果と 比較した後、４群のウサギにおいてＩ！！Ｅ算の血液容積の１／３を置換するよ うに設計されている。

実験モデル ÷ニーシーラント雄ウサギ、体重４．０ｋｇをクロロプロマシン、５＋ｎｇ／ｋ ｇ体重、筋肉中、で鎮静させ、拘束した。

次のような器具を用いた。

（ａ）尿カテーテル、 （ｂ）動脈線（一方の耳動脈）、 （ｃ）静脈線（一方の耳周辺静脈）、 （ｄ）ＥＣＧ用の針−電極、 （ｅ）体温消息子（皮下）。

実験プロトコール 鎮静 １　器具使用 ＠ Ｔ１　（ベースライン）＠および＊ 出血 ２　代用血液の輸液 ＠ Ｔ２（輸液から１５分後）＠および＊ ＠ ３　＠ Ｔ　３　（輸液から１時間後）＠および＊＠ ＠ ４　＠ ＠ ＠ ５　＠ ＠ Ｔ４（輸液から３時間後）＠および＊、カニユーレと電極を取り外し、動物をケ ージへ戻す。

２４　Ｔ５（輸液から２４時間後）＠および＊剖検。

＠−血流力学的バラメーターの測定、 ＊−血液および尿試料。

麻酔　動物をクロロプロマシン０．５ｍｇ／）ｃｇ体重、筋肉内注射、によって 鎮静させ、金属製のウサギ固定装置に拘束して、室内空気を自発呼吸させた。動 物を電気加熱パッド上に置いて、体温を保持した。

器具使用 プラスチック製カニユーレ（２２ゲージ）を両耳の中央動脈（一方は圧トランス デユーサへ接続して動脈血圧を観察し、他方は動脈血の除去および採取に用いた ）および耳静脈に挿入してヘモグロビン溶液の輸液を行った。

針電極を四肢に設置して、心電図を観察した。カテーテルを相続に挿入して、尿 排出量を計ＡＰｊして尿試料を収集した。温度消息子を皮下に挿入して、体温を 観察した。

動脈血を２０ｍ１／ｋｇ体重の量（ｖｌ算血液量の約１／３）を除去し、この量 を直ちに同量のヘモグロビン溶液で置き換えた。実験室試験のために続いて除去 した血液全量をヘモグロビンで置換した（１　：　１　（ｖ：ｖ）　）。動物を ３時間（発熱性試験を完了するのに要する時間）、綿密に観察した。この期間中 に、クロロプロマシンの追加量を必要に応じて投与して、動物を鎮静させ続け、 Ｉ７４規定食塩水に５％デキストロースを溶解したものを静脈内輸液によって投 与しく　１５ｍｌ　／　ｋｇ体重／時）、水分損失を補充した。

心電図、血圧および体温を連続的に観察して、１５分毎に記録した。尿排泄量を 、３０分毎に記録した。血液試料を、ヘモグロビンの輸液完了時、１５分後、１ 時間後、および３時間後に採取した。総ての観察ラインを取り外して、動物をケ ージに戻し、水を「随意に」摂取させた。

追加の血液試料を６．１２、および２４時間目に採取した。

２４時間後に、動物をベンドパルビタールを過剰投与によって殺し、完全な剖検 を行った。前眼房を含む体腔に置けるヘモグロビン色素の存在の可能性について は特に留意した。切片を総ての器官から採取して、組織学的検討を行った。

下記の試験を、それぞれの血液試料について行った。

（１）血小板数を含む完全なＣＢＣ（コールタ−・カウンター）、 （２）ＰＴＴ（ＭＬＡ　７００）　、フィブリノーゲン、フィブリン開裂生成物 、 （３）電解質（ナトリウム、カリウム、クロリドおよび重炭酸塩）（ＡＳＴＲＡ 装置）、 （４）アルカリホスファターゼ、ＬＤ）ｌ　５ＳＧＯＴおよび５ＧＰＴ（ＡＳＴ ＲＡ装置）、 （５）ＢＬＩＮおよびクレアチニン（ＡＳＴＲＡ装置）、（６）容量オスモル濃 度（蒸気圧）、 （７）血漿ヘモグロビン濃度（ベンジジン）、（８）動脈血気体（ＩＬ　ｐＨ／ 血液ガス分析機）、（９）総Ｊｉｂ、　０ｘｙ−Ｈｂ、　Ｃｏ−Ｈｂ　ＳＭｅｔ −１１ｂおよび酸素含量（ｌＬ２８２　コーオキシメーター（Ｃｏ−ｏｘｉｍｃ ｔｃｒ）　）、（１０）Ｐ２Ｏ（アミツク・ヘムーＯ−スキャン（Ａｍ　ｉ　ｎ ｅ。

Ｈｅａ＋−０−Ｓｃａｎ）　）　。

尿は次の項目について試験した。

（１）ヘモグロビン濃度（ベンジジン）、（２）クレアチニン（ＡＳＴＲＡ装置 ）、（３）ナトリウムおよびカリウム（ＡＳＴＲＡ装置）。

尿を経時的に集めて、血漿および血中クレアチニンを定量することによって、ヘ モグロビン輸液後３時間毎の間隔でクレアチニンクリアランス試験を行った。

データーを、下記の表に示されるように表にまとめた。

各群６匹の動物から得られたデーターを、平均値上標準誤差として表にまとめた 。経時変化の統計的有意性を分散分析によって評価した（表−３）。動物の各種 の群を、対にしたデーターについてスチューデントのＴ−検定法を用いて比較し た（表−４）。表−３および４を編集するための生データーを、表−１および２ に示す。

下記の症状の発現について留意した。

（１）−アナフィラキシ−性ショック、（２）−神経学的欠損の発作または発現 、（３）−気管支痙章または肺水腫（直接効果）、（４）−発熱、 （５）−血色素尿、 （６）−貧血、 （７）−正常な活動の欠除、 （Ｉｌｌ）−２４時間目における正常な機能の抑制（食餌およびこれらの変化を 下記の配置にしたがって検討した。

１、　臨床的観察： ａ、　体重、 ｂ、　体温、 Ｃ８不整脈、 ｄ、　血圧（収縮期）、 ｅ、　血圧（弛緩期）、 ｇ、　尿排出量。

２、　呼吸機能を反映する実験室データーａ、　動脈血ｐｌ＋。

ａ、　ヘマトクリット、 ｄ、　血小板、 ｂ、　フィブリン開裂生成物、 ａ、　総ビリルビン、 ｂ、　５ＧＯＴ。

ａ　、　Ｂ　Ｕ　Ｎｓ ｂ、血清クレアチニン、 Ｃ９血清電解質、 ｄ、　血清容量オスモル濃度。

（Ｄ）　総体的病理学 剖検では、前眼房、心膜、胸膜および腹膜中へのヘモグロビンの管外遊出に留意 した。

心臓、肺、肝臓、肺臓および腎臓を、水腫、充血、出血および梗塞形成の総体的 徴候について検査した。

（Ｅ）　組織病理学 心臓、肺、肝臓、肺臓および腎臓の切片は、光学顕微鏡用に処理して、検査した 。

組織病理学変化を等級付ける方法を開発して、データーを統計的に分析した。

心臓において見られた主要な変化は、心筋拘縮の病巣部によって表わされた。左 心室の横断面に見られるそれぞれの病巣部を、１＋の等級とした。

肺臓において、病理学も斑性であった。主要な変化は間質性水腫および細胞浸潤 （「間質性肺炎」）で表わされた。組織の異常の総体的な描写およびそれぞれの 異常部位において観察される変化の激しさから、等級付けを行って１から４まで の尺度を展開した。

肝臓では、主要な変化は、ｇ血および中心小葉の空胞化によって表わされる。こ れらの変化を異常小葉の数と中心小葉細静脈から始まる空胞化の程度の両方によ って１から４までの尺度で等吸付けを行った。

肺臓においては、馨血が主に見られた。

腎臓では、糸状体の変化および色素円柱による細尿管の壊死または閉塞は見られ なかった。主要な変化は、被膜下部分から始まり、副腎髄質との接続部へと拡が る管状上皮の空胞化によって表わされた。二の拡がりの程度を、１から４までの 尺度によって等吸付けた。

統計分析 データーの分析は、下記の２８類の試験を用いて行った。

（ａ）各種の時間間隔で動物の各群において起こる変化を検討するための分散分 析、および （ｂ）動物の各種の群において、それぞれの時間に起こる変化を検討するための 対にしたデーグーに対するスチューデントのｔ−検定。

行った統計分析の結果を、表−３および４に示す。

表　１ １、体重　［９ｍ〕 ６、尿排出量　［ｍｌ／３０　＋ｅｉｎＪ　表１　（続きン７、動脈血　ｐＨ［ ユニット（ｔｌｌｌｌＴｓ）コａ、　Ｐａｄ２Ｃｙｎ　Ｈ９］ １１、コロイド滲透圧（ＣＯＰ）　［ｒｍ例９］　表１　（！ＩＩき）１５、ヘ モグロビン［９／ｄｌｌ １６、ヘマトリットＥＷ］　表１（続き）１８．フィブリノゲン［ｓｇ／ｄｌ１ ２０、プロトロンビン時間［５ｅｃ１ ２１、Ｈヒ’）ルヒン［ａ１ｇ／ｄｌｌ　表１　（ａり２２、５ＧＯＴ　（ＡＳ Ｔ）　［ＩＬＩ／Ｌ］２３、　Ｌ　Ｄ　Ｈ［Ｉｕ／Ｌ］ ２５、　Ｂ　Ｕ　Ｎ　［Ｍ／ｄＤ ｉ６．血清クレアチニン［■／ｄｉ　］　表１（続き）２８、血清カリウム　［ ＋＝εｑ／１］３１、血清オスモル龜度　（ｍｏｓ＋ｔｒｋｉｌ　表ｆ（続き） 表■ １０組織病理学［２４時間後］ Ｍ　：算術平均 土ＳＤ：標準偏差 １・体重　［−〕　表■（続き） 表−■　分析した４群の得点の差に基づく分散分析処理時間 パラメーター　ＴＩ　Ｔ２　Ｔ３　Ｔ４　Ｔ５ベースライン　１５分間　１　＠ 　３　時間　２４壇１隙候 体重　−一　〜−−−ＮＳ　ＮＳ 体温　−−ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ 隨 心拍度数　−−ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ収ａａ血圧−−０，０１７ＮＳ　ＮＳ　 ０．０３５（Ｐ−０，０７４） 弛緩期血圧　−−ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ不整脈　−−ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　− ｕＫｉＡ　−−＜０．００１　０．００Ｂ　０．０３５　ＮＳ（ｍｌ／３０分） １：２　ＮＳ　ｏ、（１１ｇ　ＮＳ　Ｎ５（Ｐ−０，（１９）３：２　ＮＳ　Ｎ Ｓ　ＮＳ　ＮＳ ４：２　（０，００１（０，００１０，００８Ｎ５（Ｐ−０，０９）＠履 動脈血ｐＨ−−ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　Ｎ５（０，０９）ＰａＯ２ＮＳ　Ｏ，０３５ ０，００６Ｎ５（０，０７４＞１：２　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ ３：２　ＮＳ　０．００Ｂ　０．０１４　ＮＳ　（０，０５５）４：２　ＮＳ　 ＮＳ　０．００２　Ｎ９表−■（続き） パラメーター　ＴＩ　Ｔ２　Ｔ３　Ｔ４　Ｔ５ベースライン　１５分間　１　＠ 　３　時間　２４時間ＰａＣＯ２０，００４０，０１１Ｎｓ　ｋＳｌ：２　ＮＳ 　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ ３：２　ＮＳ　ＮＳ　λＳ　ＮＳ ４：２　０．００Ｂ　Ｏ，００６ＮＳ　Ｎ５ＷＢＣＯ，００２０，００２ＮＳ　 ＮＳ１：２　０．０４５　ＮＳ　ＮＳ　八′Ｓ３：２　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ ４：２　（０，００１＜０．００１　ＮＳ　Ｎ５ＲＢＣＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ Ｓヘモグミビン　−　（０，００１＜ｏ、ｏｏｘ　０．００３　ＮＳ１：２　（ ０，００１＜０．００１　０．００１　０．０２１３：２　（０，００１０，０ ０１０，ｆ）０４　ＮＳ４：２　（０，００１＜０．００１　０．００２　ＮＳ ヘマトクリ？）　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ血［０，０３００，０３７０，０１０ ＮＳ１：２　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　λＳ ３：２　０．０３８　０．０３３　０．０５９　ＮＳ４：２　０．００８　０． ００Ｂ　０．００１　Ｎ９表−■（続き） パラメづ−ＴＩ　Ｔ２　Ｔ３　Ｔ４　Ｔ５ベースライン　１５分間　ｌ　＠　３ 　時間　２４時閃雇■ フィブリノーゲン　−　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　λＳブ（ｌ）Ｃｌンど濃　ＮＳ　！ １！Ｓ　ＮＳ　ＮＳ隋 ５ＧＯＴ　−（０，００１ＮＳ　ＮＳ　Ｏ，０４３１：２　（０，００１Ｎ５（ ０，０５２）　ＮＳ　ＮＳ３：２　（０，００１ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ４：２　＜ｏ 、ｏｏｉ　ＮＳ　ＮＳ　Ｏ，０１６Ｌｌ））Ｉ　−ＮＳ　ＮＳ　Ｎ５（０，０８ ７）　ｌ＜Ｓ（０，０８０）ＳＧＰＴ　−ＮＳ　＜０．００１　ＮＳ　ＮＳ１： ２　ＮＳ　＜０．００１　ＮＳ　ＮＳ３：２　ＮＳ　（０，００１ＮＳ　ＮＳ４ ：２　ＮＳ　（０，００１ＮＳ　ＮＳ腎履 ＢＩＪＮ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ Ｍ８Ｍクレアチニン　ＮＳ　Ｎ５（０，０９５）　Ｎ５（０，０６９）　ＮＳＥ 、ｉｔト’））Ａ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　Ｎ５ｔｉカリ５Ａ　−ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ 　Ｎ５ｒｉｉ化ｉ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　Ｎ５ ｒａｉＩ　ＮＳ　Ｏ，０３３０，０４４ＮＳ１：２　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ 表−■（続き） パラメーターＴＩＴ２Ｔ３Ｔ４Ｔ５ ベースライン　１５分間　１　時局　３　時局　２Ｉ３：２　ＮＳ　ＮＳ　０． ００９　ＮＳ４：２　０．０４３　０．００４　０．０３０　ＮＳ血清容！オス モルｆ度　−ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ　ＮＳ特表平２−５０１０［；７　（２７） １８ケースと６コントロールとの比較 対になったデーターのスチューデントｔ’−検定血液学データ 対になったデーターのスチューデントを−検定対になったデーターのスチューデ ントを一検定血清クロライド 血清重炭酸イオン 肺臓 データー分析 結果 検討したヘモグロビンの３種類のバッチは次の通りであった。

）１ｂ−１−群１ ）１ｂ−１１一群２ Ｈｂ−ＩＩ＋一群３゜ これらのバッチは、下記のように特徴化された。

１１ｂ−Ｉ　Ｈｂ−ＩＩ　）ｌｂ−１１１１、ヘモグロビン、ｇ／ｄｉ　１４． ０　１３．０　１０．０２、オ専ンヘモグロピン　９０．３　９１．２　９８． ６３、カルボキシヘモグロビン　１．６　０．９　１．７４、メトヘモグロビン 　８．８　１０４　２．７５．１素容Ｉ％　１７．５　１Ｂ、２　１３．６６、 ｐＨ７，５８，５５７，０ ７、ナトリウム　、ｍＥｑ／ｌ　１１ｇ、５　１０２．３　１１９．２８、カリ ウム、ｍＥｑ／ｌ　３．８８　４．１６　２．４４９、クロリド、ｍＥｑ／Ｉ　 １１８．０　１１７．３　１２０．９１０、容！オスモル濃度。

ｍｏｓＩｌ／ｋｇ　２４４　２３Ｂ　２４２Ｉｔ、内毒素　、ＥＵ／ＩＩ　（０ ，０１＜０．０１　＜０．０１１２、　分子！、６８．０００− ５００．０００　８５％　８０％　９０％１３、　９ン脂質 ＴＬＣシリカゲルブ レートによって分析、ヨウ素蓋 気で晃色 透明　透明　透明 これらのバッチをヒト血漿タン白質分画（プラズマ−ブレックス（Ｐｌａｓｍａ 　Ｐｌｅｘ）　、、アモーア・ファーマスニーティカル・カンパニー（Ａｒｍｏ ｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）製）と比較した。（群 ２−コントロール群）（Ａ）死亡率 ４群（それぞれの群において６匹のウサギ）の動物は、いずれも２４時間の観察 期間が終了しても、死亡しなかった。

（Ｂ）臨床的徴候 ヘモグロビンを投与した後、最初の３時間は、唯一の臨床的な徴候はヘモグロビ ン尿であった。２４時間では、総ての動物は正常であった。すなわち正常な活動 性を有し、正常に食餌し、飲んだ。この時点までに、ヘモグロビン尿は正常の水 準に戻った。

体重および体温には変化がなかった。

（Ｃ）巨視的病理学 剖検時に、動物はいずれもヘモグロビンの管外遊出を起こしていなかった。総て の器官は、肝臓で動物の半数に口面が見られたことを除いて、巨視的には正常と 思われた。

（Ｄ）組織病理学 ＰＰＰ群には、ヘモグロビン群と同様に、心筋「拘縮」の病巣部が見られた。変 化の激しさをＰＰＰ群ではｌ＋として等級付け、群１．３および４出はそれぞれ １．５＋、１．７＋および１．２５＋と等級付けした。差は、統計的には有意で はなかった。

肺臓 ＰＰＰ群を含む総ての群に間質水腫、ｇ血および細胞浸潤が見られた。変化の激 しさを、ＰＰＦ群では１．４＋とし、群１．３および４では、それぞれ２＋、１ ．８＋および１．８＋と等級付けた。また、差は、統計的には有意ではなかった 。

肝臓 肝臓にみられた変化は、たの器官に見られた変化よりも均一なものであった。中 心小葉の空胞化を、ＰＰＰ群では１．４＋と等級付けし、群１．３および４では それぞれ１．５＋、１．８＋および２＋と等級付けした。有意差はなかった。

腎臓 腎臓では、糸状体の変化および色素円柱による急性の細尿管の壊死または閉塞は 見られなかった。管状上皮の空胞化は被膜下部分に均一に見られた。ここから副 腎髄質との接続部への拡がりはＰＰＰ群では１．６＋として等級付け、群１．３ および４ではそれぞれ１．８＋、２．１５＋および２．７＋と等級付けした。Ｐ ＰＰ群とヘモグロビン群との差は、群３についてのみ有意であった。

討論および結り この研究において観察された化学的および組織病理学的変化は、共に緩やかない しは中位のものであり、理論的には可逆的であった。かかる可逆性は、観察器官 を２４時間から１週間へ延長して検討を行うことによって、決定される。

実施例４に詳細に設定した実験プロトコールを用いて、３群のウサギに出血−輸 血を行った。６匹のウサギの１群（群Ａ）は、概算血液量の１／３を、１〜２内 毒素単位／ｍｌを含むヘモグロビン溶液で置換した。４匹のウサギからなる１群 （群Ｂ）は概算血液量の１／３を５％　ＰＰＰで置換したものであった。更にも う一つの６匹のウサギから成る群（群Ｃ）は、概算血液量の１７３を本発明のヘ モグロビン溶液で置換したものであった。この溶液は、下記のように特徴化した 。

実験１　実験２　実験３　平均 １、ヘモグロビン、ｇ／ｄｉ　１１．［ｉ　１１．６　１！、４　１１．５２、 オキシヘモグＣビア　９０．３　９［１，’、　９０．１　９０．２３、カルボ 牛シヘモグロビン　０．１　０．３　０．５　０．３４、メトヘモグロビン　９ Ｊ　９．５　９．７　９．Ｇｓ、１ｆｆｉ？！、（％）　１４．７　ｔｉｅ　１ ４．４　１４Ｊ６、　ｐＨ，単位　７．１４０　７．１６１　７．１６８　７． １５６７、　ＰＣＯ）ル　−４．１　１０．４　１０．２　１１．６８、　ＰＯ ２）４　１４７．５　１４７．２　１４７．０　１４７．２９、　Ｐ　トル　２ ８．０　２８．０ １０、　コロイド浸透圧、トル　２０．７　２１．０　２０．９　２０．９１１ 、ナトリウム、■Ｅｑ／Ｉ　１１４．６　１１３．９　１！５．１　１１４．５ １２、　カリウム、ＥｑノＩ　３．７２　３Ｊ３　３．７０　３．ｆｙ８１３、 クロツＦ、ａ＋Ｅｑ／Ｉ　１１１．０　２０ｇ、４　１０７．２　１０８．９１ ４、リン、ｎｇ　％　０．０９７　０．０９７　０．０９７　０−０９７１５、 内毒素、ＥＵ／ｉｆ　Ｏ，２９０，ｆ９　０．２３　０．２３１Ｂ、　リンｌ賃 （ＴＬＣ）　存在せず１７、　ｉ合（り０７）グラフィ）　８５％　を越える七 ！ｌ１体１／３を輸液したウサギの各群について、輸液の後２４時間中に血小板 数、白血球数、血清フィブリノーゲン水準、プロトロンビン水準、および血清ク レアチニン水準を比較した。集めたデーターを、それぞれ第２図〜第６図に示す 。第２〜６図のそれぞれにおいて、三角形は群Ａのウサギの平均値（士標準誤差 ）を示し、四角形は群Ｂのウサギに就いての平均値（士標準誤差）を表わし、丸 形は群Ｃのウサギについての平均値（±標準誤差）を表わしている。

第２図〜第６図によって表わされるデーターを比較すると、本発明の架橋ヘモグ ロビン溶液では死亡例はなく、臨床的に重大な徴候もなかった。分散分析を用い ると、輸液から２４時間後には、収縮期圧が若干増加し５ＧＯＴが上昇したこと を除いて、群の間に有意差はなかった。収縮期血圧の上昇は臨床的に受容可能な 範囲内で（＋２０＋ａｍ＋１ｇ）で起こったので、臨床的に重大であるとは思わ れなかった。５ＧＯＴの上昇は、血漿ヘモグロビンによる非晶分析上の干渉のた め、真の値であるとは思われなかった。試験群は一時的なヘモグロビン尿を示し たがＢＬＩＮまたは血清クレアチニンにおける有意な上昇は見られなかった。同 様な組織病理学的変化は、ＰＰＰおよび本発明の架橋ヘモグロビン溶液の群にも 見られた。これらの変化は特異的なものとは考えられず、可逆的な性状のものと 思われた。

ピーグル大および雑種の猟犬について、イヌの交換輸血の予備検討を行０、総血 液容積交換量を２５％から７５％とした。イヌ１．２および３は、体重がそれぞ れ約１０ｋｇのピーグル大であり、イヌ番号４．５および６は体重がそれぞれ約 ２０ｋｇの雑種猟犬である。

イヌ番号１（第８図）はビーグルであり、初期へマドクリット値が２４％であっ たことから、輸液を行う前から貧血であったと思われた。貧血は未確定形のもの である。

初期の応答は、ヘマトクリット値が急激に上昇することによって特徴付けられ、 交換輸液から１．５時間後にはへマドクリット値は２８％と成った。次いで、ヘ マトクリット値は輸液から２日目には約３６％より高い値に上昇し、４０％の範 囲に止どまった（輸液から１０２日間）。ヘモグロビンも持続的に上昇し、これ は最初のうちは試験輸液の結果としての細胞内ヘモグロビンと遊離の血漿ヘモグ ロビンの両方を表わしていた。

連続的な方式で得られたケム（Ｃｈｅｗ）２０の曲線は、輸液から最初の９日間 は肝臓の酵素水準の増加が示されたが、総体的には有意な異常性は見られなかっ た。標準化され自動化された肝臓酵素の測定装置を用いると、溶液中の遊離ヘモ グロビンによって干渉が生じるので、これらの結果の解釈は困難であった。

ポストン大番号２（第９図）は、ビーグルであり２５％の交換輸液を行ったが、 好ましくない臨床的効果はなかった。初期のへマドクリットは、交換輸液の後か なり低下したが、速やかに上昇して、８時間後には休息水準の３７％を越えた。

上昇したヘマトクリット水準は、輸液から９２日０まで持続し、ＲＢＣも適度に 平行して増加することから、赤血球の生産が増加していることが示唆された。

同様な肝臓酵素の変化はクレアチニンにも見られ、休息水準より若干高くなった 。残りのケム（Ｃｈｅｗ）　２０の値は、有窓には変化しなかった。

ボストン大番号３（第１０図）はビーグルであり、３３９６の交換輸液を行った ものである。−に稚児には安静時へマドクリット水準を越える同様な上昇が見ら れ、この水準は輸液から７８日後まで維持された。

この動物では肝臓酵素は、若干異なる状態を示した。

ＬＤＨは最初の２日間は一時的に上昇したがＬＤＩ＋水準はその後正常に戻った 。これとは逆に、５ＧＯＴと５ＧＰＴの値は、最初の輸液から数週間安静水準を 越えて緩やかに状しした。臨床的には、この動物には悪影響は見られなかった。

しかしながら、血清クレアチニン水準は輸液の後若干上昇した。

イヌ番号４（第１１図）は体重が約１７ｋｇの雑種犬であり、コントロール動物 として用いた。３３％出血を続発させ、抜き取った血液容積を等量の５％ヒトア ルブミンで置き換えた。この後、ヘマトクリット水準は正常に復し、引き続＜８ １日間は安静時の値を若干超過した。

イヌ番号５（第１２図）は体重が約２０ｋｇの雑種猟犬であり、７５％の交換輸 液を行ったところ、ヘマトクリット値は著しく低下し、次いでヘマトクリットは 増加して輸液の日から７白目には安静時の水準を超過した。こと動物は、輸液か ら引き続いて４３日間安静時の水準を越えるヘマトクリット値を持続した。

肝臓酵素は、ＬＤＨと５ＧＯＴにおいて一時的に上昇したが、次第に正常範囲に 復した。５ＧＰＴの上昇は１度観察されたが、これは異常データーであるかもし れなかった。

イヌ番号６（第１３図）は、体重が約２０ｋｇの雑種猟犬であり、イヌ番号５に おいて見られたのと同様に、７５９６交換輸液を行った。

試験したイヌの総ては臨床的に良好であり、麻酔の急性作用が治まると直ぐに正 常な行動活動性へ速やかに復帰した。いずれの試験動物にも長期間に亙る悪影響 は見られなかった。

まとめ 本発明の架橋ヘモグロビン溶液の急性毒性と効力の予備検討において、５匹のイ ヌは計算血液容積の２５から７５％を置換する単一の交換輸液を受け、１匹のコ ントロールイヌでは５％アルブミンで３３％置換を行った。

いずれのイヌでも、急激にまたは最大１２週間までの長期観察期間中に死亡した り臨床的に発病したりするものはなかった。総ての試験イヌは置換の直後に正常 な動作を示し、２週間以内にＲＢＣパラメーターは正常範囲へ速やかに復した。

試験動物の化学のプロフィールは肝臓の酵素が一時的に上昇したことを除けば、 しかもこの観察はコントロールイヌ（大番号４）でも見られたこと考慮すれば、 正常範囲内に止どまっていた。交換輸液中およびその直後に採取された試料につ いての動脈血のガスの結果は、７５％の交換を行った２匹のイヌをも含めて総て のイヌにおいて正常なＰＯ２値が維持されたことを示していた。

大番号５および６は、両方とも（体重によって計算した）血液容積の約７５％の 交換輸液を受けたものである。

番号５のイヌは、５０％の血液容積を出血させた後直ちに交換輸液における第一 段階として５％アルブミン溶液で置換した。この後に、更に５０％の血液容積を 速やかに除去したところ、番号５のイヌは呼吸困難に陥り、呼吸数は１４回／分 から３８回／分に突然増加して、瀕死の呼吸パターンを伴った。この時点で、番 号５のイヌが明らかな臨床的な困難を示したので、本発明の溶液である架橋ヘモ グロビン溶液の等量を素早く輸液して血液容積を正常に戻した。本発明の架橋ヘ モグロビン溶液の輸液中に、呼吸数は１４に戻り、瀕死の呼吸パターンは止んだ 。最初の出血の前と、最初の置換の後と、二回目の置換の後に、血中ガスを定量 したところ、ＰＯ７は正常範囲内に止どまっていた。

番号６のイヌも、番号５のイヌと同様に７５％の交換輸液を行ったが、この場合 には最初の５０％の出血に対して等容積の本発明の架橋ヘモグロビン溶液で置換 し、二回目の５０％出血では等容積の本発明の架橋ヘモグロビン溶液と５％アル ブミンとを等量で混合して成るもので置換した。最初の出血と置換の後、呼吸困 難の徴候はなく、二回目の出血と置換の際または後にも呼吸困難の徴候はなかっ た。

交換輸液中および後の動脈血中ガスの定量したところ、交換中にＰＯ２は正常に 維持されていた。

これらのデーターは、本発明の架橋ヘモグロビン溶液が容積拡大と酸素輸送機能 とを有していることを示唆している。本発明の架橋ヘモグロビン溶液を１回だけ の輸液に対する応答では、試験動物とコントロールの両方に肝臓酵素の一時的な 上昇が見られたが、異常な臨床行動または血液学的パラメーターの異常な化学は 見られなかった。

実施例１のプロトコールによって製造され、前記において特徴化された特性を有 するヘモグロビン溶液（本発明のヘモグロビン溶液）の免疫原性を霊長類で試験 し、３回の計算血液容積の１／３の出血−輸液に付した。

６匹のセブス（Ｃｏｅｂｕｓ）サル、体重４ｋｇ、をケタミン１５ｍｇ／ｋｇ体 重を筋肉内に注射して鎮静させ、拘束した。無菌カニユーレを経皮的に大腿動脈 および静脈に挿入した。

血液を、動脈からキログラム出の体重の２％に相当する量（約１／３の血液容積 ）を採取した。本発明のヘモグロビン溶液を静脈を通して３０分間を様して輸液 した。血液試料（２，５＋ｓｌ）を、（１）血液を除去する前、（２）本発明の ヘモグロビンを輸液してから１時間後、（３）１週間毎日、（４）１力月間は１ 週間毎に、（■）３力月間は１力月毎に採取した。血清について、オウクテロニ ー試験を用いて抗体の存在を試験した。同じ実験を３および６か列後にも行った 。したがって、それぞれの動物は、３ヶ月た。

総ての動物は、３回の出血−輸液のサイクルを生き延びた。毒性の徴候は見られ ず（総ての動物は正常に見えた）。オウクテロニー試験、総ての動物において総 ての血清について一貫して陰性であった。

この検討は、本発明のヘモグロビン生成物の特異な脈管持続性を示すために行っ た。ホモジナイズの研究の初期以来、ヘモグロビンは循環において極めて短時間 保持されるといわれてきた。新規な技法と新規な生成物は、効果的に作用するだ けでなく、循環においても保持される。

生成物の分子量を画定するため、本発明者らは、新規なヘモグロビンを基剤とし た本発明の一時的な代用血液を特徴化するデーターを展開した。本発明者らはイ ヌ血清におけるこの物質の経時的減少を測定して、試験プロトコールによって下 記の特徴を有するものとしてこの代用血液を特徴化することができた。下記の実 施例では、試験動物に用いられるヘモグロビンは、実施例１にしたがって製造さ れるヘモグロビン生成物であり、本発明のヘモグロビンと表わすことにする。

１、　イヌ血清中のヘモグロビンの分子量分布の決定本発明のヘモグロビンを用 いて５％のへマドクリット間で等容交換する場合の効率試験中に得られたピーグ ル人血清を、ゲル透過クロマトグラフィ（ＨＰ　１０９ＯＡ）によってヘモグロ ビンの分子量分布をチェックした。本発明のヘモグロビンを適用した後の、経時 的な分子量分布の変化は次のようになった。

■、１　分析条件 ＨＰＬＣ装置　ＨＰ　１０９０　Ａ　。

積分計　ＨＰ　３３９２ 検出器　ダイオード・アレイ（Ｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ）−ＵＶ−Ｖ／Ｓ／　、 ヒユーレット・パラカード（Ｈｅｖｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）　％ＧＰＣカラ ム　ＴＳＫ　Ｇ　３．０００　ＳＷ　３００＋＋＋ｍ　ｘ　７．５＋ａｌｌ。

溶離液　０．ｌｎ　Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７，０）、検出波長　２Ｇ０ｎｍ　（マ ーカータン白質）／４０５ｎｍ　（イヌ血清中のヘモグロビン）結果 これらの結果を下記の表−５にまとめた後、第１４図にグラフ状に示す。他の溶 液中で示される始めに報告された２４時間よりも遥かに長時間脈管内持続性が保 持されることが容易に判る。

％ｌｌｂ ピーク番号　＊ｌ　＊２　＊３　＊４ 大血清、Ｏ値　３．１４　Ｂ、６２　５．４３時間２０分　５．８　１２９．１ １　１Ｂ４．４５　２３９．７８　７１９．３５２４時間　５　１７０．１１　 １８８．３４　２３０．８７　４６１．７４４８時間　４．５　５１１．９８　 ２３１＋、２９　２４９．４２　２４９．４２９６時間　３．８　９１０．３８ 　１６５．００　１７２．５０　１２７．５０１２０時間　２．８　１．０５８ ．８１　８０．００　Ｂｏ、００　４０．００１４４時間　１．５　１，８３７ ．００　Ｂｏ、００　Ｂｏ、００　１５．００１６８時間　０．７　１，４５５ ．１７　４２．５０　４５．００　５．００２１［ｉ時間　０．０８　１１．１ ８　１７．７４　１８．４７　−２４０時間　０．０９　’ｉ“、２５　１９． ３４　２２．９７　−２９４時間　０．１　６．５２　５５．０５　２５．３５ 　−＊：　それぞれの欄における数値は、センナメーターの値にフルスケール（ ＋ｎＶ）を掛けたピーク高さを表わしている。

ヘモグロビンが除去されるために、濃度は連続的に減少する（表−５を参照）。

それ故、積分装置の振幅を増大させて（「フルスケールＪ　（ｍＶ））操作する 必要があった。異なる試料のクロマトグラフィピークを比較することができるよ うにするには、ピーク面積またはピーク重量を記録しなければならなかった。こ れは、次のようにして行った。

ピーク高さに振幅「フルスケール」を掛けた。生成する値は、ヘモグロビン濃度 に関して線状であると見ることができた。これは、イヌ血清に本発明のヘモグロ ビンを１％から７％のヘモグロビン濃度で加えることによって証明された。１０ ｇ「ピーク高さＸフルスケールｊ対血清の採取時間（最大２９４時間、表−５） の値をプロットすることによって、第１４図に示された速度論を得ることができ る。最大分子量を有するヘモグロビン分子量分布の部を表わすピーク番号１は、 理論から予想されるように最大保持時間の値を示す。この曲線は理想的な指数関 数を表してはいないので、この曲線から半減期を計算することはできない。

ピーク２．３および４によりて表わされるヘモグロビンー成分に就いては、下記 のような脈管内半減期が得られた。

ピーク２：　約８４時間、 ピーク３：　約６８時間、 ピーク４：　約２４時間。

分子量が減少すると、半減期が減少するのであり、すなわち脈管内保持時間が短 くなり、これは理論的予想を確認している。

本発明のヘモグロビンの輸液から２４時間後の、血清中および尿中の分子量分布 を調べた。この比較では、ｅｓ、ｏｏｏのヘモグロビン成分を代表するピーク番 号４が、例外的に、この時間で尿中に現れることを示している。

総体的な本発明のヘモグロビン分子量分布の６分率でのＨｂ酸成分ピーク番号４ ）の量は、ピーク面積を積分することによって計算することができる（下表−６ １照）。

表−６ 試料　ピーク番号４の面積 （総分布に対する百分率） 本発明のヘモグロビン　４８．０ 血清３時間２０分　４４．０ ２４時間　３８．９ ４８時間　１４．６ 血清からの減少は、第１４図における半減期評価曲線によって説明される。この 図は、表−５のデーターをグラフに示したものであり、このデーターはそれぞれ の部分群の分子量百分率に残っている本発明の総ヘモグロビンの百分率を表わし ている。

この検討の目的は、牌摘したヒツジにおいて繰返し交換輸液を行い、赤血球を除 去することによって本発明のヘモグロビン溶液の効力を決定し、ヘマトクリット 値を約５％まで低下させることであった。この試験設計によって、本発明のヘモ グロビン溶液の有力な効力を生命を維持するのに十分な赤血球の不在での延命力 によって示すことができる。この検討では、それぞれの動物について、治療効果 の性状、程度および期間も評価した。

試験物質 前記と同様で実施例１で製造されたのと同じ本発明のヘモグロビン溶液。

試験装置 この研究には、純水飼育したまたは混合飼育した体重が２０．０から２５．０ｋ ｇのヒツジを用いた。動物は、商業的な飼育場であってそこの動物が研究の前は 総体的な健康について証明されており且つＱ熱に対して血清学的に陰性であるこ とが知られているところから入手した。ヒツジは、通常のウィルスおよび細菌の 病原に対して予防接種を受けており、内部および外部寄生虫に対して試験され且 つ治療されており、そうでない場合には変数を作り出す可能性のある病気の影響 を最小限にするように処理した。動物は４．１匹ずつかんな屑を敷いた檻の中に 収容して、ヒツジに一定の食餌を保証して与え、飲料水には自由に近付けるよう にした。環境パラメーターは、７０丁±３丁、４５％相対湿度（±）および１２ 時間／１２時間の光線サイクルを維持した。動物室は通常の動物室と同様に操作 したが、技術者が処理を行うときには手袋、実装着およびガウンを着用した。

器具操作 研究の少なくとも２週間前に、ヒツジを２４時間絶食させ、０．２［アトロビン サルフェートを筋肉内注射して予備麻酔を行い、マスクによって４％ハロサンを 用いて麻酔を行い、挿管して、約２％のハロサンを保持した。次いで、腹部沖心 線法により無菌的技法を用いて牌摘を行った。この処理の間に膵臓に１：１００ ０エピネフリンを注射して貯蔵されているＲＢＣを移動させた。牌摘に続いて、 骨髄と肝臓の生検も行った。次いで、動物を１４日間回復させ、良好な健康状態 を継続するように監視した。血液学的数値を、牌摘の前後で比較して、予備検討 としての外科処置による悪影響を決定した。

試験生成物である本発明のヘモグロビンを維持するために、リンゲルの乳酸塩溶 液を用いて最初の交換を行い、ヘマトクリット値が約２０９６になるようにした 。次に、本発明のヘモグロビンを用いて更に交換を行い、残留へマドクリット値 が５％未満とした。この研究のため、７匹のヒツジであって全体的な健康状態が 良好であり且つ予め病気の治療を行ったものを選択した。動物は、この研究のた めに特別に鑑定された。更に、６匹のコントロールヒツジを同様にヘスパン（） ｌｅｓｐａｎ）＠　（ヒドロキシエチル澱粉溶液）のみを用いて試験した。この 研究中に１匹のヒツジを無作為に選択して、８試験日のそれぞれについて試験し た。ヒツジは研究の２４時間前に絶食させ、水は約１６時開存えなかった。ヒツ ジの体重を測定し、０．２ｍｇのアトロビンサルフェートを筋肉内に事前投与し 、４％ハロサンをマスクによって投与して麻酔した。適当に麻酔したとき、ヒツ ジに挿管して約２％ノ１０サンに維持した。麻酔を段階Ｉ１１　、平面２〜３ま で滴定して、維持した。大腿動脈を無菌技法を用いて切開し、１５ゲージのカテ ーテルを血管に入れた。同様な技法を用いて、頚静脈に大型の穴スワンーガンズ （ｂｏｒｅ　Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚ）カテーテルを挿入した。次に、動物を代謝ケ ージに入れて、２時間回復させた。動脈カテーテルトランスジューサー出測定し たベースライン血圧と血液試料は、移植したカテーテルを用いて得た。２０ｃｃ の血液を毎回採取して、血液学、化学および血中ガス分析を行った。等８的方法 を用いて、血液容積をそれぞれの動物において下記のようにして置換した。

方法 １、約４００から６０ｈ＋Ｉ　（１）理論循環容積（ＣＶ）　を大腿動脈カテー テルから抜き取った。血圧を再度記録して、ショックを生じた（　Ｂ　Ｐ　６０ ／４０　）後、食塩水をリンゲルの乳酸塩と共に５〜１０ｍ１／分で輸液して全 血を置換した（等容積）。この輸液の後、再度血圧を記録して、試料を作成し、 動物を安定化した。

２、この安定仕初の後、血圧を記録し、次いで再変更に４００〜８００　ｍｌの 血液を抜き取った。この血液の抜き取りの後、血圧値、試料およびショックの臨 床的評価を約１０分間行った。

３．１０分間の評価期の後、本発明のヘモグロビン溶液を１０ｍ１Ｚ分の輸液速 度で投与した。血圧、試料および臨床的徴候を１０分間観察して、治療効果を表 わす条件を確認した。

４、段階２および３を繰返し、ヘマトクリット値を５％より低い値まで下げた。

動物を連続的に観察して、臨床的徴候を記録した。

５、それぞれの動物を観察して、出血と治療に関連した徴候を２時間チェックし た。最終的な血液試料２０ｃｃを採取して、血液学、化学および血中ガス分析を 行った後、カテーテルを取り外して、カテーテル化部位を軽いハロサン麻酔の下 で無菌状態で閉じた。

６、尿排出量の変化を代謝ケージ中で観察し、出血治療および回復期の間記録し た。血中ガスの値を、動脈カテーテルを設置したままそれぞれの相の量測定した 。

７、動物が麻酔から回復したとき、ケージに戻して、臨床的状態によって必要な 補佐的治療を行った。包括的な臨床観察および補佐的治療を２１日間継続した。

研究の始めに、ベースライン血液試料を頚静脈から抜き取り、２４時間尿試料を 集めて尿分析を行つた。毎日および研究の終わりに、比較用血液試料を抜き取り 、尿を集めて眼科的検査を繰返した。１４日０にヒツジを前記と同様に麻酔して 、再度肝臓および骨髄生検を行った。死亡した動物は、巨視的病理学および組織 病理学的計画を行った。行った一連の試験は次の通りである。

血ｔＪ虫数　アルカリフォスファターゼ　０２飽和ヘモグロビン　ＢＵＮ　Ｏっ 含量 ヘマトクリット　クレアチニン ＲＥＢＣ形態　ビリルビン（ｌおよびｐ）クロリド カルシウム リン 総タン白質 コレステロール 容量オスモノ軒即友 二酸化炭素 トリグリセリド 鉄 鉄蓄積物 容量 尿分析 比重 Ｈ ヘモグロビンポリマー クレアチニン／沈澱物検査 水性体液 ＲＢＣ血清およびヘモグロビン ウシヘモグロビン抗体 ＣＳＦ　重合ヘモグロビン ヘモグロビン　フェリチン ＲＢＣへブチグロビン ＰＴ肺　心臓 ＰＴＴ　（生検を含む）　腎臓（左および右）フィブリノーゲン　脳 眼 副腎（左および右） 甲状腺Ｓ 骨髄（生検を含む） 血行力学 心臓排出量 （熱的希釈） 動脈圧 中央静脈圧 肺動脈楔人圧 観察および試験からの総てのデーターは、特殊な履歴、観察および試験記録形式 について記録した。

統計分析 効力プロトコールを用いて、７匹のヒツジを試験した。

それぞれのヒツジは、ベースライン血液試料と２４時間尿試料を採取した。これ らのデーターは、経過観察期間中毎日帯た。経過観察期間のそれぞれの日につい て、統計的比較を対試験法を用いて行い、それぞれの経過期間測定を対応するベ ースライン測定と比較した。特に興味深いことは、血液および全交換輸液が完了 した直後の測定値を対応するベースライン血液試料との比較である。

・シーニュー・ニス・コンブレス、オフィス・テクノロジ・アセスメント（Ｕ、 Ｓ、　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、　０ｆｆｉｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）　、０ＴＡ−Ｈ−２６０，１月、１３３〜１５０頁、１ ９８５テド（Ｍｅｒｃｋ　Ｃｏａ＋ｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、）　、シーウエイ、二 ニー・シャーシー、４２〜４９頁、１９７９年。

３、コラタ・アール・ジェイ（ＫｏｌａＬａ、　Ｒ，Ｊ、）、ビュロース・シー ・エフ（Ｂｕｒｒｏν３＋　ｃ、ｐ、）およびツマ・エル・アール（Ｓｏｍａ、 　Ｌ、Ｒ，）　ｒショック：病態生理学および管理」＝　−（Ｗ、Ｂ、　５ａｕ ｎｄｅｒｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　、フィラデルフィア、３２〜４８頁、１９８０ 年。

ヒツジでの効力プロトコールの予備的結果は、この実施例に含まれる。血行パラ メーターに関する生データーをまとめて、表−７（試験動物）および表−８（コ ントロール動物）に示す。第１５〜１９図の血中ガスおよび血行力学データーを グラフに表わしたものでは、試験動物は動脈および静脈酸素含量が、交換輸液中 に酸素運搬容積置換を受けなかったコントロールで達成された水準よりもかなり 高い水準に維持されたことを示している。総ての試験動物は、交換の後も生き延 びた。

これとは対照的に、コントロール動物の場合には６匹総てが、急激な交換輸液を 生き延びられなかった。コントロール動物の６匹は、動脈および混合静脈酸素含 量およびヘマトクリット値が１０％よりも低くなると、心臓排出量は悪化した。

第１８図では、ヒツジのへマドクリット値と比較してみた本発明のヘモグロビン の寄与をヘマトクリット水準が低下する時点で比較している。第１８図は、交換 の終了時には、残留へマドクリットが５％未満であり、動脈酸素含量の約８０か ら９０％はが本発明のヘモグロビンによって与えられ、試験動物の血液の液相と 残留赤血球とによって与えられるのは約ｌＯ〜２０％であることを示している。

実験中は、試験動物もコントロールヒツジも室内空気を呼吸した。試験群もコン トロール群も、最初交換の際には動脈酸素含量に同様な傾向がみられ、ベースラ インへマドクリット値は約２０％のへマドクリット水準に低下した。この点から 以後は、試験群は元のヒツジ赤血球に代えて本発明のヘモグロビンを受け取った 。この時点では、除去した血液に代えてウシヘモグロビンを用いる動物では酸素 含量が良好に維持されていることが図に示されている。コントロールの場合には 、ヘスパン（！Ｉｅｓｐａｎ）■は溶解したガスとしての場合を除き有意な量の 酸素を運搬しないので、静脈酸素含量が減少し、それと共にヘマトクリット値も 減少する。

結論 この研究は、酸素輸送溶液としての本発明のヘモグロビンの効力を明瞭に示して いる。血中ガスデーターと血行力学データーは試験動物の延命性と一致している が、コントロール動物は急激な交換輸液を生き延びたものはなかった。試験動物 の総てにおける残留へマドクリットは５％未満、場合によっては１〜２％である ので、この研究は、本発明のヘモグロビンが試験動物における適当な酸素輸送に 有意に貢献したことを明確に説明している。

更に、試験動物は総て、集中看護または吸入酸素量を増加させなくとも長期間生 き延びた。

実施例１０ 本発明のヘモグロビンを、ピーグル大に対する効力、許容度および副作用につい て試験した。検討する製剤は内因性血液が著しく失われる場合の酸素輸送機能お よび容積置換を有することができるかどうか、および供給されたヘモグロビンど れくらいの時間で体外に排出されるのかという疑問に答えるように実験配置を行 った。許容度と予想外の副作用の発生についても、二次的に検討した。

がある。このことから、実験動物の貧血を重くして、少なくとも検出可能な損傷 が０２欠損から生じ、同時にヘモグロビン溶液の投与がこれらの損傷を防止する ことを示すことができなければならない。

試験物質 本発明のヘモグロビン溶液は、前記した通りのものであり、実施例１の方法によ って製造したものである。

実験モデル ７匹の純粋飼育したピーグル大を用い、これらのイヌは、実験の開始の約３週間 前に牌摘しておいた。

予備投薬と麻酔を開始した後、嬬勤ポンプを用いて制御された方法で４匹の動物 について本発明のヘモグロビン溶液で等容血液希釈を行い、残留へマドクリット を最大５％までとし、３匹の動物については、ヒドロキシエチル澱粉溶液（ＨＥ Ｓ）であってイオン組成とコロニー浸透圧を本発明のヘモグロビン溶液と等しい もので行った。パラメーターの数は、交換輸液とおよび１０日間の経過期間中に 決定した。

イヌでの試験結果 この研究では、４匹のイヌは、３時間の全身麻酔の下で本発明のヘモグロビンで 交換輸液を行い、約１０分毎に測定を行った。総ての試験イヌは、残留ヘマトク １ハツト５％未満で急激な好感輸血を生き延びた。血行力学および血中ガス分析 の結果は、試験イヌは総て処理の終了時には良好に酸素付加されていたが、３匹 のコントロールイヌはヒドロキシエチル澱粉溶液での交換輸液を生き延びなかっ た。これら３匹のイヌは、ヘマトクリット水準の減少に関連して不適当な酸素付 加を示していた。第２０〜２４図に、測定した選択したパラメーターについての 試験およびコントロール群の差異を示す。

糀！ この効力研究の予備的な結果は、本発明のヘモグロビン溶液が赤血球量の著しく 枯渇した試験イヌの正常な酸素付加に寄与することを示している。極めて低い残 留ヘマトクリット水準では生き延びられなかったコントロールイヌとは対照的に 、これらの試験動物は総て、急激な交換輸液を生き延びた。この研究では、本発 明のヘモグロビン溶液が著しく赤血球を損失した極限条件下で酸素を輸送するこ とは明らかである、と結論される。

本発明の詳細な説明してきたが、本発明の精神率たは範囲から離反することなく 、多くの変化および改質が行い得ることは当業者には容易に明らかになるであろ う。

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ％変化 ％変化 ％変化 ％変化 浄書（内容に変更なし） ％変化 Ｏ己Ｅｘ　Ｏ（Ｊｔ　ＯＩＪＩ　Ｏ ■ミＦホゾ４１ゝ 浄書（内容に変更なし） ｃｔ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 血漿ヘモグロビン（ＭＧ／ＤＬ） 浄書（内容に変更なし） 動脈血酸素含量（容積％） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 初期値の％ 浄書（内容に変更なし） 分 ０３０６　＋３０４　０３０５　ｔｓ　３１８０３０３　＋３０２　０３０８ ＦＩＧ、２０ 浄書（内容に変更なし） 分 ０３０６　＋　３０４　Ｑ　３０５　ａ　３１８分 ｏ　３０３　＋　３０２　０３０８ Ｆ／Ｇ、２ｆ 浄書（内容に変更なし） ＣＯ 分 口３０６　＋　３０４　◇３０５　６３１８Ｏ 分 ｏ３０３　＋３０２　◇３０８ 浄書（内容に変更りし） 分 口３０３　＋　３０２　ム３０８ 浄書（内容に変更なし） 分 Ｑ　３０６　＋　３０４　◇３０５　ム　３１８ＦＩＧ、　２４（Ａ） 分 ｏ　３０３　＋３０２　０３０８ 手続補正書防式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０２９６７ ２、発明の名称 超純粋半合成代用血液 平成１年１２月１１日 （発送日　平成１年１２月１９日） ６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の出願人の欄委任状、図面翻訳文 （Ｆｉｇ、ＩＡ　−Ｆｉｇ、７．Ｆｉｇ、１４〜Ｆｉｇ、２４（Ｂ））７、補正 の内容 （１）別紙の通り （２）図面翻訳文（Ｆｉｇ、ＩＡ−Ｐｌｇ、７．Ｐｉｇ、１４〜Ｆ１ｇ、２４（ Ｂ））の浄書（内容に変更なし） 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．内毒素を実質的に含まない架橋ヘモグロビン溶液を含んでなる代用血液。 ２．リムラス・アメボサイト・ライゼート（ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）分析法によって測定した単位／ｍｌ溶液での内毒素濃度が０．５ 未満である、請求の範囲１に記載の代用血液。 ３．前記の内毒素濃度が０．２５未満である、請求の範囲２に記載の代用血液。 ４．前記の内毒素濃度が０．０２未満である、請求の範囲３に記載の代用血液。 ５．下記の特徴を有する請求の範囲１に記載の代用血液。 （ａ）ＬＡＬ試験によって測定した内毒素濃度が０．５ＥＵ／ｍｌ未満であり、 （ｂ）リン脂質濃度が約１ｎｇ／ｍｌ未満であり、（ｃ）約９０％より高い分子 量分布が６８，０００から５００，０００ダルトンの範囲である。 ６．下記の特徴を有する請求の範囲５に記載の代用血液。 （ａ）約９０％より高い分子量分布が６８，０００から５００．０００ダルトン の範囲であり、（ｂ）氷点降下法によって測定した容量オスモル濃度が１８０か ら３２０ミリオスモル／リットルの範囲にあり、 （ｃ）ヘモグロビン含量が５〜２５ｇ／ｄｌであり、（ｄ）メトヘモグロビン含 量が２０％未満であり、（ｅ）Ｐ５０が１８から３６ｍｍｈｇの範囲であり、（ ｆ）脈管内半減期が少なくとも４日間であり、（ｇ）ゲル透過クロマトグラフィ での架橋度（ｐｒｏｆｉｌｅ）が５０から７０％であり、 （ｈ）リン脂質含量が約１ｎｍｏｌｅ／ｍｌ未満であり、ＬＡＬ分析法によって 測定した内毒素濃度がお．５ＥＵ／ｍｌ未満であり、 （ｊ）非ヘモグロビンクン白質が存在しない。 ７．下記の工程を含む内毒素を実質的に含まないヘモグロビンの溶液の製造法。 （１）間質不含の無菌ヘモグロビン溶液から内毒素をクロマトグラフィによって 分離し、 （２）工程（１）からの生成物を架橋する。 ８．下記の工程からから成る、哺乳類用の半合成の間質不含代用血液の製造法。 （１）全哺乳類血液を分画して赤血球分画を生成させ、（２）前記の赤血球分画 を破壊してヘモグロビン含有分画を生成させ、 （３）前記のヘモグロビン含有分画を濾過して、無菌の間質不含ヘモグロビン溶 液を生成させ、（４）前記の間質不含ヘモグロビン溶液をクロマトグラフィによ って分離して、実質的に内毒素不含ヘモグロビン溶液を生成させ、 （５）前記の実質的に内毒素不含ヘモグロビン溶液を架橋させる。 ９．下記の工程を含む、哺乳類用の半合成の間質不含代用血液の製造法。 （１）哺乳類血液を分画して白血球と血小板を実質的に含まない赤血球分画を生 成させ、 （２）前記の赤血球分画を機械的に破壊してヘモグロビン含有溶液を生成させ、 （３）前記のヘモグロビン含有溶液を透明にして、実質的に間質不含のヘモグロ ビン含有溶液を生成させ、（４）前記の実質的に間質不含のヘモグロビン含有溶 液を微孔性濾過して、部分的に殺菌された間質不含のヘモグロビン含有溶液を生 成させ、 （５）前記の部分的に殺菌された間質不含のヘモグロビン含有溶液を限外濾過し て、サイズ毎に分離され部分的に殺菌された間質不含のヘモグロビン含有溶液を 生成させ、 （６）前記のサイズ毎に分離され、部分的に殺菌された間質不含のヘモグロビン 含有溶液をクロマトグラフィで処理し、実質的にリン脂質不含のヘモグロビンを 生成させ、 （７）前記の実質的にリン脂質不含のヘモグロビンを溶出させて、実質的にリン 脂質不含で実質的に内毒素不含のヘモグロビン溶液を生成させ、（８）前記の実 質的にリン脂質不含で実質的に内毒素不含のヘモグロビン溶液を架橋して、前記 の半合成代用血液を生成させ、 （９）前記の半合成代用血液を分離する。 １０．請求の範囲７、８または９のいずれか１項に記載の方法によって製造され る生成物を有して成る代用血液。 １１．間質不含の無菌ヘモグロビン溶液から内毒素をクロマトグラフィによって 分離することから成る、実質的内毒素不含溶液の製造法。 １２．下記の工程を含む実質的に内毒素不含のヘモグロビン溶液の製造法。 （１）哺乳類全血を分画化して赤血球分画を生成させ、（２）前記の赤血球分画 を破壊して、ヘモグロビン含有分画を生成させ、 （３）前記のヘモグロビン含有分画を濾過して、無菌の間質不含ヘモグロビン溶 液を生成させ、（４）前記の間質不含ヘモグロビン溶液をクロマトグラフィによ って分離して、実質的に内毒素不含のヘモグロビン溶液を生成させる。 １３．下記の工程を含む、実質的に内毒素不含のヘモグロビンの製造法。 （１）哺乳類血液を分画化して、白血球と血小板を実質的に含まない赤血球分画 を生成させ、（２）前記の赤血球分画を機械的に破壊してヘモグロビン含有溶液 を生成させ、 （３）前記のヘモグロビン含有溶液を透明にして、実質的に間質不含のヘモグロ ビン含有溶液を生成させ、（４）前記の実質的に間質不含のヘモグロビン含有溶 液を微孔性濾過して、部分的に殺菌された間質不含のヘモグロビン含有溶液を生 成させ、 （５）前記の部分的に殺菌された間質不含のヘモグロビン含有溶液を限外濾過し て、サイズ毎に分離され部分的に殺菌された間質不含のヘモグロビン含有溶液を 生成させ、 （６）前記のサイズ毎に分離され、部分的に殺菌された間質不含のヘモグロビン 含有溶液をクロマトグラフィで処理し、実質的にリン脂質不含のヘモグロビンを 生成させ、 （７）前記の実質的にリン脂質不含のヘモグロビンを溶出させて、実質的にリン 脂質不含で実質的に内毒素不含のヘモグロビン溶液を生成させる。 １４．請求の範囲１１、１２または１３のいずれか１項に記載の方法によって製 造される生成物を有する、実質的に内毒素不含のヘモグロビン溶液。 １５．ＬＡＬ試験法によって測定したところ、１ｍｌ当たりの内毒素単位が０． ５未満である、ヘモグロビン溶液。 １６．１ｍｌ当たりの内毒素単位が０．２５未満である、請求の範囲１５に記載 のヘモグロビン溶液。 １７．１ｍｌ当たりの内毒素単位が０．０２未満である、請求の範囲１６に記載 のヘモグロビン溶液。 １８．リン脂質含量が１ｎｍｏｌｅ／ｍｌ未満である、請求の範囲１５、１６ま たは１７のいずれか１項に記載のヘモグロビン溶液。 １９．請求の範囲１５、１６、１７または１８のいずれか１項に記載され、非ヘ モグロビンタン白質を含まない、ヘモグロビン溶液。