JPH0235095A - 微生物によるラクトシュークロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、Ｇａｌβ１−４（ｉｌｃｃｔｌ−２βＦｒｕ
　（以トラクトシュークロースと省略）よりなる抗う触
性、ビフィズス菌選択糖源の製造法に関し、より詳しく
は、微生物によるラクトースとシュークロースからのラ
クトシュークロースの製造方法に関する。

［従来技術とその問題点］ ラクトシュークロースは、Ｇａｌ　β１−４Ｇ１ｃα１
−２β　Ｆｒｕ　　からなる三糖類で、抗う触性を有し
、またビフィズス菌選択的増殖因子として有効な糖であ
る。

現在、ラクトースとシュクロースの溶液にバチルス（Ｂ
ａａ　ｉ　ｌ　ｔｕｓ）属菌起源のレバンシュークラー
ゼを作用させてラクトシュークロースを合成する方法（
特開昭５９−３９２８７号）や、エアロバクター（Ａｅ
ｒａｂａｃｔａｒ）属菌起源のレバンシュークラーゼを
作用させてラクトシュークロースを合成する方法（特開
昭５５−１１８３６９号）Ａ４が開発され、開示されて
いる。

しかし、これらの方法ではラクトシュークロース以外に
数種類以上のオリゴ糖が生成し、ためにラクトシューク
ロースのみを分離することは極めて難しく、また収率も
他いため、工業上の菫産は事実上不可部で、実用性に乏
しいという問題があった。

［本発明の目的］ 本発明の目的は、微生物の使用により分離、除去の町俺
な原料たるラクトースとシュークロースは残留するが、
分離、除去の困難なオリゴ糖の生成量は極めて少なく、
生成過程においてラクトシュークロースを容易に抽出し
て量産化でき、採算ベースに乗れるラクトシュークロー
スの製造方法を提供できるようにしたことにある。

［問題を解決するための手段］ 上記目的を達成するために１本発明者らは種々、多数の
微生物につき研究したところ。

ローネラ属の微生物がラクトシュークロースを大量に生
成することを突きＷめて、を発明方法を開発するに至っ
た。

しかして本発明に係るラクトシュークロースの製造方法
は、 （＋）ラクトースとシュークロースを主要原料とする培
地で、ローネラ（Ｒａｂｎｅ　ｌ　ｌａ　）属を好気条
件下で培養してラクトシュークロースを生成、Ｊａさせ
、これを採取すること（以下培養法という） （２）ラクトースとシュークロースを含む液に培養によ
って得られたローネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属の菌体お
よび菌体処理物を反応させてラクトシュークロースを生
成せしめ、これを採取すること、 を特徴とする。

本発明において使用されるローネラ属の微生物としては
、たとえばローネラ・アクアティリス（Ｒａｂｎｅｌｌ
ａ　ａｑｕａｔｉｌｉｓ；　Ｊ［Ｊ−１１３８３）か挙
げられる。

なお、ローネラ属のラクトシュークロース生産能につい
ては未だ知られていなかった。

上述した方法において、培養法におけるラクトシューク
ロース生成に用いる培地のラクトースとシュークロース
は、濃度がそれぞれ１〜２０％、成分比が１：１０〜１
０：１の割合の範囲で使用することができるが、好まし
くはラクトース、シュークロースの比が１：１で、それ
ぞれ１０％程度の濃度のものが適当である。

培地には、その細微生物の増殖に必要な窒素化合物、た
とえばペプトン、アミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム等のいずれを加えてもよく、さらに酵母エキ
スや燐酸塩等を加えて使用してもよい。

このように調製した培地に、予め培養しておいたローネ
ラ・アクアティリス属の微生物を接種し、２０〜３７℃
４好ましくは３０℃の温度の好気的条件下において１〜
７日間、好ましくは２〜３日間振どう培養すると、培地
中にラクトシュークロースが蓄積される。

このようにして得られたラクトシュークロースを含有す
る培養液は、第１図に４＜すように、原料であるラクト
ース、シュークロースと、生成物であるラクトシューク
ロースと副生成物であるグルコースとフラクトースが歩
積蓄積されたものであり、その他のオリゴ糖の生成が極
めて少ない。

したがって１通常の分離、精製、固形化手段により単一
物質としてのラクトシュークロースを効率よく得ること
ができる。

また、培養によって得られたローネラ・アクアティリス
の菌体および菌体処理物によるラクトシュークロースの
生成は、ラクトースとシュークロースの濃度がそれぞれ
１〜４０％で、成分比が１＝１０〜１０：１の割合のか
なり広い範囲で使用することができるが、好ましくはラ
クトース、シュークロースの成分比がｌ：１で、それぞ
れ濃度が２０％程度のものが適当である。

反応に使用する菌体はグルコースやシュークロース又は
他の単糖類、二糖類を炭素源とし、それに微生物の増殖
に必要な窒素化合物（たとえばペプトン、アミノ酸、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）やミネラルを含
む培地で増殖させた菌体を使用することができる。

反応に使用する菌体処理物としては、上記方法で培養し
菌体の抽出物、およびたＬ記方法で得られた菌体および
菌体抽出物をアルギン酸カルシウムやカラギナンなどの
通常の方法で固定化したものなどを使用することができ
る。

培養液または菌体反応液を遠心分離やケイ藻上濾過など
の手段によって除去し、得られた一ヒ澄み液または濾液
を通常の手段を適宜利用してラクトシュクロースを精製
することができる。

たとえば、前述した上澄み液を減圧濃縮しそのＩＨ縮液
をカーボン・セライトカラム（成分比１：１　）に通し
て吸着させ、水で十分に洗浄することによりグルコース
等の単糖を除去する。

次ぎに、エタノールを５％含む溶出液でシュークロース
とラクトースを溶出させ、引き続きエタノールｌＯ％を
含む溶出液でラクトシュークロースを溶出させる。

かくして得られたラクトシュークロース溶出液を減圧濃
縮した後、真空乾燥法、凍結乾燥法等により固形化せし
める。

この固形物は、薄層クロマトグラフィーや高速液体クロ
マトグラフィーなどにより分析したところ単一物質であ
った。

またこの固形物は還元性を示さないこと。

インベルターゼ〔シグマ製、グレードＸ、３００〜５０
０　ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　５ｏｌｉｄ、　キャンディダ・
ニーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）由来〕
によりラクトースとフラクトースに加水分解され、また
β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム製、
３００　ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　　蛋白、大１揚菌由来）に
よりガラクトースとシュークロースに加水分解されるが
、α−グルコシダーゼ〔フナコシ酸、８００　ｕｎｉｔ
ｓ／ｍｇ　５ｏｌｉｄ、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ）属〕では加水分解されないこと、さら
に第２図に示される赤外吸収スペクトル分析結果などか
らしてガラクトースグルコースとフラクトースからなる
三糖であること、またその結合様式はガラクトースとグ
ルコースβＩ−４結合、グルコースとフラクトースはα
１２結合とわかり、ラクトシュークロースと断定できた
。

［実施例］ 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施
例に限定されるものではない。

実」Ｌ且」エ ラクトース　　　　・・・・５．０％ シュークロース　　・・・・５．０％ 硫酸アンモニウム　・・・・０．２％ 酵母エキス　　　　・・・・０．０２％ＫＨ２ＰＯ１１
・・−０、２％ Ｎａ２ＨＰＯａＡ２Ｈ２０−・・−０、８％Ｍｇ５Ｏａ
ｉＨ２０−０、０５％ ｐＨ・・・・７．０ 上記組成の培ｊｌｊ４１００ｍ文を５００ｍ文容三角フ
ラスコにとり、別に前培養しておいたローネラ壷アクア
ティリスの培養液１膳立を接種し、３０℃で３日間ロー
タリーシェーカーで振とぅ培！（１８ｏｒｐｍ）を行っ
た。

高速液体クロマトグラフィーにより生Ｉｔｓしたラクト
シュークロースを測定したところ、３．９ｇのラクトシ
ュークロースが生成されていた。

なお、ラクトシュークロースの定量は、高速液体クロマ
トグラフィー〔ポンプは日立製作所製８５５型、検出器
は昭和電工製５Ｅ−５１，カラムはＬｉｃｈｒｏｓｏｒ
ｂ−ＭＨ２（５ｇ　ｍ）　Ｃ１ｃａ　Ｍｅｒｋ製、溶媒
はアセトニトリル：水＝　７０：３０を用い（流速は１
．０１文／鵬ｉｎ）　）を実施し、ピーク面積値より求
めた。

得られた培養液１００ｍ文を遠心分子ｉ（回転数１５０
０Ｏｒｐｍ）により菌体を除去し、上澄み液を減圧′ａ
縮した。この濃縮液をカーボン・セライトカラム（成分
比　ｌ：１）へ通液し、水４文を７５０ｍ１　／ｈｒの
流速で流し、また５％エタノール６文（流速７５０ｍ！
／ｈｒ）でシュークロースとラクトースの単糖に溶出さ
せた後、１０％エタノール６文（流速　７５０ｍ１／ｈ
ｒ）を流し、活性炭に吸着されているラクトシュークロ
ースを溶出させた。

このラクトシュークロースを含む溶出液をさらに減圧ａ
縮した後、凍結乾燥を行うことにより白色粉末のラクト
シュークロース３６１ｇを得た。

実施例２ 実施例１で用いた培地１００ｍＪｌを５００ｍ　ｌｌｌ
容三角フラスコにとり、別に前培養しておいたローネラ
ｅアクアティリスの培養液１ｍｌを接種し、３０℃で１
日間ロータリーシェーカーで振とう培’？ｊ（１ＢＯｒ
ｐｍ）を行った。

培養終了後、遠心分離機にて遠心分離 （１５０００ｒｐｍ）　Ｌ、、菌体を回収した。

回収した菌体を蒸留水５０■見で２回洗浄した後、蒸留
水５０　ｍ文に懸濁した。

この菌体懸濁液（０口ｂｂｏ　＝　２０　）にラクトー
ス、シュークロース各々１０ｇ含む１／１５Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ７，０）５０■見を加え、３０℃で２４時間反
応を実施した。

反応終了液中のラクトシュークロースの量は、高速液体
クロマトグラフィーで測定した結果６．７ｇであった。

［効　果］ 本発明方法によれば、ラクトシュークロースを含有する
培養液は、前述したごとく原料であるラクトース、シュ
ークロースと生成物であるラクトシュークロースが蓄積
されたものであり、その他のオリゴ糖の生成が極めて少
ないため、通常の分離、精製、固形化１段等により単一
物質としてのラクトシュークロースを効率よく採取でき
る。

したがって、抗う蝕にして低カロリーのラクトシューク
ロース甘味料の製造を、量産により採算ベースに乗れる
工業化できるに至った。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた培養液の糖組成を示す高速
液体クロマトグラフ、第２図は実施例１で得られた白色
粉末ラクトシュークロースの赤外吸収スペクトルを示す
グラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ラクトースとシュークロースを主要原料とする培
   地で、ローネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属を好気条件下で
   培養してラクトシュークロースを生成、蓄積させ、これ
   を採取することを特徴とする微生物によるラクトシュー
   クロースの製造方法。
2. （２）ラクトースとシュークロースを含む液に、培養に
   よって得られたローネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属の菌体
   および菌体処理物を反応させてラクトシュークロースを
   生成せしめ、これを採取することを特徴とする微生物に
   よるラクトシュークロースの製造方法。