JPH02306155A - 酵素固定化電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、酵素固定化電極に関し、詳しくは、酵素を
架橋剤等と配合し電極本体上に製膜して固定してなり、
グルコース等の基質検出用の電極等として利用される酵
素固定化電極に関するものである。

〔従来の技術〕

酵素を白金等の電極表面上に固定化する方法として、ゼ
ラチンおよび架橋剤としてのグルグルアルデヒドを含む
希薄な酵素溶液を電極上に塗布して製膜を行うとともに
酵素を共有結合的に固定化する方法がある。ここで、ゼ
ラチンは、酵素固定化膜のマトリックス成分となる。希
薄な酵素溶液と架橋剤としてのグルタルアルデヒドだけ
では、架橋反応によって得られる酵素固定化膜の感度が
弱いため、前記したゼラチンを配合して、膜強度を向上
させているのである。例えば、グルコースオキシターゼ
の固定化膜では、酵素に対して５〜１０倍程度のゼラチ
ンを加えた状態で、前記グルタルアルデヒドによって架
橋させて製膜するようにしている。

このようにして製造される酵素固定化電極を使用する際
には、試料溶液中に含まれる被測定物質以外の多種多様
な成分による妨害から酵素固定化電極を保護しておく必
要がある。そのため、電極本体表面と酵素固定化膜との
間に、妨害物質を除去する妨害除去膜を形成した妨害不
感型酵素電極も考案されている。

妨害除去膜は、ポリアリルアミン等の水溶性高分子、ア
ルブミンおよび架橋剤としてのグルタルアルデヒドを含
む溶液を、前記酵素固定化膜と同様にして、電極本体上
で製膜を行って水溶性高分子を架橋させることによって
形成される。妨害除去膜と電極本体表面との密着性を良
くするためには、妨害除去膜を形成する前に、電極本体
表面に、ゼラチンのグルタルアルデヒド架橋膜からなる
下地膜を形成することも考えられた。

前記のような構造を有する、従来の酵素固定化電極は、
妨害除去膜が乾燥に対して極めて弱いため、湿度の変化
によって膜の収縮が生じ、水溶液中での測定および測定
後の乾燥を繰り返すと、電極本体表面から妨害除去膜お
よびその上の酵素固定化膜が剥離してしまい、検出感度
が低下する等して、使用できなくなるという欠点があっ
た。また、酵素固定化膜は強度が弱く、他の物質と接触
すると、酵素固定化膜表面から活性酵素が脱離したり、
溶液中の不純物が付着したりして感度が劣化するという
欠点もあった。

以上のような欠点を解消し、酵素固定化膜および妨害除
去膜が電極本体表面から剥離するのを防ぎ、酵素固定化
膜に有害物質が付着したり接触するのを防止するため、
酵素固定化膜の表面を保護することが要望されていた。

そこで、本願発明者らは、酵素固定化膜の表面に高分子
樹脂からなる多孔質膜を形成してなる酵素固定化電極を
考え、先に、特願昭５９−１２３９８５号（特開昭６１
−２０５９号公報）として特許出願している。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記先行技術でも、酵素固定化膜の保護はある程度果た
せるのであるが、多孔質膜の膜強度や酵素固定化膜に対
する密着接合性等の点で、さらに改良が要望されていた
。

すなわち、先行技術では、多孔質膜を酵素固定化膜の表
面に形成する手段として、予め製膜された多孔質膜を酵
素固定化膜の表面に被せ、これを乾燥させることによっ
て、多孔質膜を酵素固定化膜に接着固定していたが、こ
の方法では、多孔質膜と酵素固定化膜との密着性が充分
でなく、多孔質膜が剥離する心配がある。

また、多孔質膜を酵素固定化膜の上面のみに接着させて
いたのでは、電掘本体から酵素固定化膜が剥離したり、
前記した妨害除去膜が剥離することを阻止することは出
来ない。そこで、絶縁性基板等の平坦な表面に形成され
た酵素固定化電極全体を多孔質膜で覆って、多孔質膜を
電極本体もしくは絶縁性基板等に直接接着すればよいの
であるが、酵素固定化電極の側面等、立体的な凹凸形状
に沿って、平坦な多孔質膜を完全に密着させるのは困難
であった。

そこで、この発明の課題は、前記したような酵素固定化
電極において、酵素固定化膜を保護する保護膜として、
酵素固定化膜等との密着性をより良好にして、酵素固定
化電掘全体に対する保護性能に優れた保護膜を備え、検
出性能が安定し耐久性に優れた酵素固定化電極を提供す
ることにある〔課題を解決するための手段〕 上記課題を解決する、この発明にかかる酵素固定化電極
は、電極本体に酵素固定化膜が固定されてなる酵素固定
化電極の表面を、高分子樹脂微粉末をスプレーコーティ
ングすることによって形成された保護膜で覆っている。

酵素固定化電極の構造を、実施例を示す第１図および第
２図を参照しながら説明する。基本的には通常の酵素固
定化電極と同様であり、第２図に示すように、絶縁性基
板１等の上に、電極本体２、下地膜３、妨害除去膜４、
酵素固定化膜５が形成されたものが使用される。なお、
このうち、下地膜３および妨害除去Ｈ臭４については、
必要がなければ設けない場合もある。すなわち、この発
明は、前記した妨害不感型酵素電極、および、そうでな
い通常の酵素電極の何れにも適用できるものである。

各構造部分について説明する。絶縁性基板１は、通常の
各種電子素子の基板と同様の、セラミック、合成樹脂等
からなるものが使用される。電極本体２は、白金電極等
、通常の酵素固定化電極用の電極材料からなるものであ
る。

下地膜３は、例えば、ゼラチン等の生体高分子水溶液に
架橋剤を添加して、電極本体２の表面に塗布し、架橋反
応を行わせて膜を形成させる。

妨害除去膜４は、アルブミン等のタンパク質を含む水溶
性高分子、例えば、ポリアリルアミン水溶液に架橋剤を
添加して、下地膜３の表面に塗布し、架橋反応を行わせ
て膜を形成させる。

酵素固定化膜５は、例えば、グルコースオキシターゼ等
の酵素と、ゼラチンおよび架橋剤を含む酵素溶液を、妨
害除去膜４の表面に塗布し、架橋反応を行わせて膜を形
成させるとともに、形成された膜にグルコースオキシタ
ーゼ等の酵素を固定化することによって得られる。

上記説明において、ゼラチンおよびアルブミンは各形成
膜のマトリックス成分となるものである。また、架橋剤
としては、各形成膜とも、グルタルアルデヒド等のジア
ルデヒドその他、通常の製膜に利用されている各種架橋
剤が使用できる。

第２図のように形成された酵素固定化電極に対し、第１
図に示すように、酵素固定化膜５の表面を、高分子樹脂
微粉末をスプレーコーテングすることによって形成され
た保護膜６で覆っている。

高分子微粉末としては、ポリテトラフルオロエチレン等
のフッ化エチレン、シリコーンオイル、ポリカーボネー
ト、ポリアミド、アクリル樹脂等、水に不溶な高分子で
あって微粉末に加工でき、酵素固定化膜５の保護を果た
せるものが使用される。これらの高分子微粉末は、アル
コール等の揮発性の有機溶媒に懸濁させたものを、通常
の溶液噴射用のスプレーガン等を用いて、酵素固定化膜
５の上から吹きつけられる。具体的には、スプレー容器
入りで市販されている、通常の離型剤もしくは潤滑剤を
利用することができる。酵素固定化膜５の上に吹きつけ
られた高分子微粉末は、有機溶媒が揮発すれば、高分子
微粉末が酵素固定化膜５の表面に接合されて、多孔性の
保護膜６が形成される。多孔性保護膜６の孔径は、高分
子微粉末の吹き付は量すなわち吹き付は時間によって制
御でき、通常、１０〜１００人程度の孔径で実施される
。

保護膜６は、酵素固定化膜５の上面のみに形成されてい
ても、ある程度の酵素固定化膜５の保護は果たせるが、
第１図に示すように、保護膜６が、酵素固定化膜５の上
面から、各形成膜３〜５および電極本体２の側面を経て
、絶縁性基板１の表面までの全体を覆うように形成され
ていれば、酵素固定化電極全体を保護膜６で良好に保護
できるとともに、保護１！ｉ！６を絶縁基板１に接合さ
せることができ、保護膜６と絶縁性基板１との強固な接
合によって、酵素固定化電極全体を確実に固定して保護
することができる。なお、電極本体２と絶縁性基板１と
が剥離することは少ないので、保護膜６は、少なくとも
、酵素固定化膜５の上面と各形成膜３〜５の側面および
電極本体２までの、酵素固定化電極の表面を覆っていれ
ば、酵素固定化電極全体の剥離防止および保護を果たせ
る。

〔作　　用〕

高分子樹脂微粉末をスプレーコーティングすることによ
って形成された保護膜は、酵素固定化膜５に対する密着
性が高く、酵素固定化膜５を良好に保護しておくことが
できる。すなわち、予め製膜された多孔質膜を酵素固定
化膜５の上に接着するのではなく、微粉末の高分子樹脂
を酵素固定化膜５にスプレーコーティングして、個々の
微粉末を酵素固定化膜５に接合一体化させて、多孔性の
保護１１＊６を形成している。したがって、形成された
保護膜６と酵素固定化膜５との接合強度もしくは密着性
は、従来の予め製膜された高分子膜を接着するものに比
べて、はるかに高いものとなる。

また、スプレーコーティングによれば、酵素固定化膜５
の上面だけでなく、酵素固定化膜を含む各形成膜３〜５
および電極本体２の側面から、酵素固定化電極を形成す
る絶縁性基板等の表面までを、一体的に保護膜６で覆う
ことができる。また、酵素固定化膜５等の表面に凹凸が
あっても、何ら問題なく、保護膜６が確実に密着一体化
されることになる。

〔実　施　例〕

次に、この発明の実施例について説明する。

下記第１表に示すように、各形成膜３〜５を構成する配
合成分を、それぞれｐ　Ｈ５，５の０．０１Ｍ酢酸緩衝
液に溶解し、これを水に対して１：１で混合した水溶液
を、絶縁性基板１上に形成された、大きさｌ　Ｘ　ｌ　
＊ｘの電極本体２の上に、順次、０゜５μｌづづ塗布し
て、製膜を行った（第２図参照）。

一実施例１− 酵素固定化電極の酵素固定化膜５の上から、ポリテトラ
フルオロエチレンの微粉末をスプレーコーティングして
保護膜６を形成した。保護膜６は、酵素固定化膜５の上
面だけでなく、側面から絶縁性基板１の表面までを覆う
ように形成した（第１図参照）。ここで使用したポリテ
トラフルオロエチレンは、離型剤、潤滑剤等として市販
されているスプレー容器入りのもの（株式会社井内盛栄
堂）を使用した。

このようにして製造された、この発明にかかる酵素固定
化電極を用いて、下記の試験を行った。

３７℃、ｐ　Ｈ６，７の０．０７５Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液を収容したセルに、酵素固定化電極を浸漬し、濃
度０〜１０００ｍｇ／ｄｉのＤ−グルコース標準液２０
μｌを攪拌しながら、マイクロピペットを用いてセル中
に注入し、酵素固定化電極に接続されたポーラログラフ
により、酵素反応によって生成された過酸化水素による
酸化電流と経過時間とを測定し、その結果を第３図およ
び第４図にグラフで示した。このときの印加電圧は、銀
対極に対して０．６　Ｖであった。

第３図は、検出電流の応答曲線を示し、電流が１５秒以
内に一定値に達していることから、良好な応答特性を示
すことが判る。第４図は、検出電流とＤ−グルコース標
準液の濃度の関係を示し、測定点が直線上に並んでいる
ことから、検出電流と濃度が直線的な相関関係にあるこ
とが判り、この結果をもとにして、未知濃度のＤ−グル
コース液を迅速かつ正確に分析することが可能であるこ
とが実証された。また、得られた酵素固定化電極は、試
験を繰り返し行っても測定結果が変わらないことから、
測定液中の不純物の影響を全く受けず、乾燥・膨潤を繰
り返しても剥離しないことが確認され、保護膜６による
保護効果が優れていることが実証できた。

一実施例２− 保護膜６を形成する材料として、シリコーンオイルを用
いた以外は、実施例１と同様にして酵素固定化電極を製
造した。シリコーンオイルとしては、スプレー管入りの
市販品（信越化学型、ＫＦ９６ＳＰ）を用いた。

こうして得られた酵素固定化電極を用いて、実施例１と
同様に、Ｄ−グルコース標準液の濃度と検出電流値の関
係を測定した。その結果を第５図に示しており、前記実
施例１の場合と同じく、良好な直線性を示していること
が判る。

〔発明の効果〕

以上に述べた、この発明にかかる酵素固定化電極は、酵
素固定化膜の表面に高分子微粉末をスプレーコーティン
グして形成された保護膜を設けているので、酵素固定化
膜が、測定対象物質以外の物質と接触したり汚れたりす
るのを確実に防止することができるとともに、この酵素
固定化膜に対する保護膜の接合性が良好で強固になり、
酵素固定化電極の耐久性や性能維持を図ることができる
特に、保護膜がスプレーコーティングによって形成され
ているので、酵素固定化膜の上面だけでなく、酵素固定
化電極全体の側面から、酵素固定化電極を支持する絶縁
性基板までを、立体的な凹凸に関係なく、保護膜で一体
的に覆うことができ、酵素固定化電極全体を保護膜で良
好に保護できるとともに、酵素固定化電極の各形成膜同
士が剥離したり、各形成膜と電極本体とが剥離したりす
るのを、確実に防止することが可能になる。したかって
、従来、妨害除去膜が剥離し易いという欠点のあった妨
害不感型酵素電極等に適用すれば、剥離防止の点で極め
て高い効果を発揮できることになる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明にかかる実施例の断面図、第２図は保
護膜を形成する前の断面図、第３図は酵素固定化電極の
応答特性を示すグラフ図、第４図および第５図は測定液
濃度と検出電流の関係を示すグラフ図である。 １・・・絶縁性基板　２・・・電極本体　３・・・下地
膜４・・・妨害除去膜　５・・・酵素固定化膜　６・・
・保護膜代理人　弁理士　　松　本　武　彦 第１図 第３図 付Ａ時間（ｐル）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　電極本体に酵素固定化膜が固定されてなる酵素固定
   化電極の表面を、高分子樹脂微粉末をスプレーコーティ
   ングすることによって形成された保護膜で覆っている酵
   素固定化電極。