CN108291889B - 用于酶传感器的外层 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种用于测量溶液中分析物的浓度的平面酶传感器，所述传感器包括支撑导电材料的电极层的电绝缘材料的基板。所述基板和电极层具有设置在其上的多个层，所述多个层包括酶层和覆盖所述酶层的微孔外层，其中所述外层包含防水性聚合物(例如，聚乙酸乙烯酯或丙烯酸酯共聚物)的连续相、嵌入所述连续相中的蛋白质(例如，酶)，以及可能的聚四氟乙烯颗粒。所述酶和所述聚四氟乙烯颗粒向所述外膜提供受控的孔隙度。

Description

用于酶传感器的外层
技术领域
本发明涉及用于测量溶液中分析物浓度的平面酶传感器。
背景技术
分析物传感器诸如生物传感器包括使用生物元件将基体中的化学分析物转化成可检测信号的装置。有许多类型的生物传感器用于检测各种各样的分析物。在各种类型的生物传感器中，电化学生物传感器通常基于分析物的酶催化氧化。该酶插置并固定化在两个膜之间，其中第一膜或外膜与待测定的样品接触，并允许分析物和氧气从样品通向酶，同时限制蛋白质、红血细胞和其它大分子通过，并且第二膜与传感器电极的面相靠近，并允许过氧化氢通向电极，同时阻碍分子量大于约250g/mol的干扰物质例如抗坏血酸、对乙酰氨基酚和水杨酸通过。在实施过程中，包含分析物和氧气两者的待测定样品与第一膜或外膜的外面接触。样品扩散通过该膜与经固定化的酶接触导致氧气消耗反应，并且所得的过氧化氢扩散通过第二膜或内膜与传感器电极接触导致电流形成，该电流然后可通过常规方法读取。然而，如现有技术中进行的分析物测定在具有高浓度分析物的溶液(如通常例如在未稀释的全血或血清中发现的那样)，或者当可用于传感器的酶本质上具有低转化率或易受到样品中抑制剂的影响，或对于具有低氧气浓度的样品的情况下缺乏准确性。为了获得一致和准确的测量，尤其是当待测定的样品具有高浓度的分析物时，外膜就厚度、孔径和孔分布而言必须具有高度的均匀性。
US 5,696,314公开了包含固定化酶层和微孔层的酶传感器。微孔层被设计成限制分析物到达固定化酶层的速率，同时提供良好的氧气输送，使得氧气在发生于酶层的反应中不用做速率限制试剂。微孔层包括聚合物粉末、矿物粉末、聚合物粘结剂和至少一种表面活性剂。
US 2005/0009130 A1公开了用于酶基传感器的可浇铸扩散膜。该膜包含分散在聚合物材料中的聚合物材料和孔形成颗粒。聚合物材料通常选自非水溶性聚合物，如聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯酯以及例如丁二烯和苯乙烯的共聚物。孔形成颗粒通常是稳定的颗粒，其具有固有和限定的孔隙度，例如无机颗粒和有机颗粒，如硅藻土、硅胶、纤维素、沉淀石膏、高岭土、玻璃、硅藻土等。
DE 10 2004 003 793 A1公开了具有改善的贮存稳定性的电化学生物传感器。其包含具有例如嵌入其中的酶的水性聚合物分散体(诸如聚乙酸乙烯酯、丙烯酸酯共聚物(例如乙酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物))的第一层以及薄防水性可渗透覆盖层的第二(外)层的两层膜。
EP 1 282 417 B1公开了用于制备生物传感器(尤其是肌酸酐传感器)的方法，在该方法中于第一步骤中将第一酶与表面活性物质联合施用到工作电极，并且在随后的步骤中以化学方式在其上固定化第二酶。
现有技术的膜对于分析物的通过通常具有高可渗透性，或者具有不均匀分布的可渗透孔隙度，尤其是在具有高浓度分析物、低浓度氧气的样品或者当可用于传感器的酶本质上具有低转化速率的情况下，与经固定化的酶接触的分析物的量整体或局部超过可用氧气的量。因此，氧气浓度(而非分析物浓度)是反应的速率限制组分，使得分析物测定的准确性被破坏。
具体实施方式
本发明人已出人意料地发现，水性聚合物分散体中作为孔形成剂的酶和其它蛋白质提供了外膜，所述外膜就分析物渗透性、孔隙度均匀性、厚度和使用稳定性而言具有较高的再现性。
本发明的一个方面涉及平面酶传感器，参阅权利要求1。
本发明的另一方面涉及用于制备酶传感器的方法，参阅权利要求11。
附图说明
图1示出参考实施例1中的详细描述的平面酶传感器的构造。
具体实施方式
本发明涉及用于测定溶液诸如生物学来源的样品中各种分析物的平面酶传感器领域。典型的分析物为胆固醇、蔗糖、谷氨酸盐、乙醇、抗坏血酸、果糖、丙酮酸盐、铵、亚硝酸盐、硝酸盐、苯酚、NADH、葡萄糖、乳酸盐、肌酸、肌酸酐、人血清白蛋白、IgG和血红蛋白(例如，糖化血红蛋白，HbA1c)。
术语“平面”应理解为与传统棒状电极相反。本文所述的平面酶传感器通常可用作多用途酶传感器。当在本文中使用时，术语“多用途”旨在表示传感器，其在分析物测量后通过用缓冲液冲洗再生，从而将电流恢复到基线值并使传感器准备好用于测定新的样品阵列。
当在本文中使用时，术语“生物学来源的样品”旨在表示取自生理流体的液体样品。本文的例示性示例为类似血液(例如全血、血浆、血清、血液级分等)、尿液、透析液和胸膜的那些。
酶传感器
如上所述，本发明特别提供用于测量溶液诸如生物学来源的样品中的分析物浓度的平面酶传感器。传感器包括支撑导电材料的电极层的电绝缘材料的基板，其中基板和电极层具有设置在其上的多个层，并且其中多个层至少包括：(a)酶层；和(b)覆盖酶层的微孔外层。外层包含(i)防水性聚合物的连续相和(ii)嵌入所述连续相中的蛋白质。外层还可包含(iii)聚合物颗粒。
一般来讲，酶传感器的特征在于具有能够将分析物转化成可在电极处检测到的物质的酶层。
本文所述的酶传感器可适于各种各样的分析物，尤其是酶底物和/或共底物。此类酶底物的示例为胆固醇、蔗糖、谷氨酸盐、乙醇、抗坏血酸、果糖、丙酮酸盐、铵、亚硝酸盐、硝酸盐、苯酚、NADH、葡萄糖、乳酸盐、HbA1c、肌酸和肌酸酐。特别要关注的是葡萄糖、乳酸盐、乙醇、肌酸和肌酸酐。因此，酶传感器的示例为肌酸酐传感器(即，由肌酸酐传感器和肌酸传感器组成的双传感器装置)、葡萄糖传感器、乳酸盐传感器等。
基板和电极
基板和电极可根据常规方法提供，例如在US 7,195,697中公开的那样以及如实施例1所述的用于肌酸酐传感器的那样。
典型的基板是氧化铝、玻璃、二氧化硅、印刷电路板、塑料膜和纸材的那些，并且典型的电极由聚合物，玻璃和金属如金、铂、钯、银(氯化物)和碳制得。
干扰物去除层
电极可任选地覆盖有干扰物去除层(即，电极与酶层之间的层)，其功能是防止血液中可能的电化学干扰物在电极处被氧化。该层应允许过氧化氢通过，但不允许较大分子通过。可能的干扰物可为例如抗坏血酸或对乙酰氨基酚。可能的干扰物去除层的示例是乙酸纤维素、乙酸丁酸盐纤维素和聚(邻-苯二胺)。
酶层
酶层包含至少一种酶。酶层可例如包含氧化酶诸如葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、肌氨酸氧化酶或胆固醇氧化酶。酶层还可包含酶混合物，诸如例如酶级联，其使得可以对不能直接被检测到的分析物诸如例如肌酸酐进行检测。肌酸酐不能通过简单的酶进行酶促氧化，而是需要若干酶步骤来生成可通过测量电流的方法检测到的分析物衍生物。用于检测和/或测定肌酸酐的合适的酶级联体系可包括例如肌酸酐氨基水解酶(简称“肌酸酐酶”或“CA”)、肌酸脒基水解酶(简称“肌酸酶”或“CI”)和肌氨酸氧化酶(简称“SO”)。
在一些实施方案中，酶层包含聚合物基体，至少一种酶被嵌入所述基体中。
应当理解，酶层自己的酶必须能够将分析物转化成可检测的物质。因此，即使外层包含能够转化分析物的酶，酶层不应缺少此酶，因为转化成可检测的物质应尽可能接近电极进行，以便提供高灵敏度和线性度。
外层
用于平面酶传感器的外层(扩散膜)与例如常规酶传感器上的径迹蚀刻的扩散限制膜就通过层/膜的孔隙度、形态和扩散机制方面有很大不同。在径迹蚀刻的膜中，孔径比分析物尺寸大得多。此处分析物和相关物质如葡萄糖、乳酸盐、肌酸酐和H2O2的扩散系数大致类似于纯水性介质中的扩散系数。
假定本文所述的平面酶传感器的外层由多个较小且均匀分布的孔组成，在这些孔中进行水和物质(包括分析物)的所有传输。当假定孔被扭曲时，外层具有弯曲度，即有效孔长度大于层的厚度。由于孔径与漫射物质在同一范围内，因此在物质和孔壁之间发生部分摩擦。尤其是介于分析物(例如肌酸酐)和H2O2的尺寸之间的范围内的孔径是有问题的，因为在这种情况下H2O2将具有在外层中和通过外层的快速扩散，而分析物(例如肌酸酐)将受到阻碍。然后分析物(例如肌酸酐)向酶层中的扩散将受到限制，导致检测靶H2O2的形成减少，其在外层之外具有相对较大的扩散常数，并且这严重降低了传感器灵敏度。最佳情况是，分析物(例如肌酸酐)与H2O2的扩散系数比与水性扩散系数比相当。这要求溶胀的多孔相中聚合物链之间的最小距离远远大于例如肌酸酐的分子尺寸
Figure BDA0001668781710000051
为了使分析物的扩散不受阻碍，孔直径必须显著地大于分析物的直径。因此，与H2O2和孔壁之间之间的摩擦相比，分析物分子和孔壁之间的摩擦一定不能太大，因为这有利于H2O2在多孔相中的分析物(例如肌酸酐)上扩散，并且从而降低灵敏度。
因此，酶传感器的外层为传感器提供了受控的渗透性。尤其是结合使用氧气消耗作为分析物测定的方法的传感器时，外层显示出显著优点。由蛋白质(其用作孔形成颗粒)形成的孔允许调节分析物分子例如肌酸酐、葡萄糖等跨外层的扩散，并且防水性聚合物(和任选的聚合物颗粒)的选择影响氧气的渗透性。虽然氧气跨外层渗透在某种程度上也可以通过由聚合物颗粒(如果存在)形成的孔实现，但它基本上受到防水性聚合物的影响，在其具有高透氧性的情况下尤其如此。
因此，本发明的酶传感器的微孔外层提供了令人关注的优点。外层包含(i)防水性聚合物的连续相、(ii)嵌入所述连续相的蛋白质以及任选地(iii)聚合物颗粒，如下文将进一步详细描述的那样。
(i)防水性聚合物
防水性聚合物提供连续相，在该连续相中嵌入了(ii)一种或多种蛋白质(例如酶)以及也可能的(iii)聚合物颗粒。这种连续相同时用作对于底层酶层的粘结剂，并向外层提供结构完整性。聚合物的典型低玻璃化转变温度(Tg)使其能够膨胀/收缩，因为组分在传感器中被水合或洗涤出来。
当在本文中使用时，术语“防水性”旨在表示当暴露于水时它几乎不受影响，因此吸水率如此低以致于大体积聚合物仍不可渗透分析物和检测物质，例如过氧化氢。
通常，防水性聚合物的玻璃化转变温度(Tg)低于100℃，诸如在0℃-60℃例如5℃-60℃的范围内。
用于外层目的的合适的防水性聚合物类型的例示性示例为选自聚乙酸乙烯酯类及其共聚物、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯共聚物、聚氨酯和有机硅的那些，尤其是选自聚乙酸乙烯酯类以及丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物的那些。
其中聚乙酸乙烯酯类可以是例如所提及的聚乙酸乙烯酯。此类聚合物可以商品名Kollicoat(例如Kollicoat SR)商购获得，其中聚乙酸乙烯酯用聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)稳定。稳定剂聚乙烯基吡咯烷酮还起到成孔成分的作用，但是比(ii)一种或多种蛋白质的效率低。
其中丙烯酸酯共聚物可以是例如所提及的丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，诸如具有20％-99％(w/w)的甲基丙烯酸甲酯单体的那些。此类聚合物可以商品名Eudragit，例如Eudragit NM(诸如Eudragit NM30D)、Eudragit RS和Eudragit E100商购获得。
可商购获得的防水性聚合物的当前优选示例为Eudragit NM30D和KollicoatSR30D。
丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物如以商品名Eudragit商购获得的那些以水基胶乳的形式提供，因此溶剂对酶层的敏感酶要尽可能温和。
由于低玻璃化转变温度，多种令人关注的水性聚合物分散体中的一者为由赢创工业集团(Evonik Industries)提供的Eudragit NM30D，其作为pH为5.5-8.6的低粘度乳白色水性分散体。它包含大约30％(大约28.5％-31.5％)w/w的共聚物聚(丙烯酸乙酯-共-甲基丙烯酸甲酯)颗粒和大约0.7％w/w的聚乙二醇硬脂基醚作为乳化剂。Eudragit NM具有低膜成形温度(5℃)、低渗透性、pH独立溶胀性，高度柔性并且具有600,000g/mol的重均摩尔质量。因此，其在室温和37℃下是柔软且略微粘的。它起到膜体系中的连续粘结相的作用，并改善了膜的完整性和内聚力。浓缩和稀释的Eudragit NM30D颗粒的流体动力学尺寸经测量为大约0.175μm。为了制备具有増强的分析物渗透性的膜，使Eudragit NM30D与水中溶解度比所述聚(丙烯酸乙酯-共-甲基丙烯酸甲酯)高的组分(即蛋白质如肌酸酶)混合。
优选地，基于外层的总体积计，防水性聚合物占15％-80％，诸如20％-60％，具体地讲是20％-30％。
(ii)一种或多种蛋白质
外层的特殊特征是(ii)一种或多种蛋白质的用途，这些蛋白质被认为是半硬颗粒，如孔形成剂。令人惊讶的是已经发现，如在酶层中使用酶一样，使用相同的酶是随时间的变化稳定灵敏度的有效方法。据信，使用如存在于传感器的酶层中的相同酶作为外层中的孔形成剂的益处是，其减少了传感器使用寿命期间的酶活性的缺乏。令人惊讶的是，据发现，肌酸酶为肌酸酐传感器的良好的孔形成剂添加剂，这也使得外层更加可重现、孔隙度方面更均匀以及随时间推移更恒定的灵敏度。
蛋白质(诸如酶)作为孔形成剂的作用不完全清楚，但一个作用是提高传感器中的肌酸酶过剩从而增加其使用寿命的积极效果，另一个作用是提供对分析物和共分析物如H2O2的具有最佳扩散特性的外层。这主要通过酶三维结构及其水吸收能力实现，因为在传感器的整个寿命期间，外层中的酶活性似乎不是传感器功能所必需的。浸出研究表明，最初存在于外层中的肌酸酶的较大部分在使用的前24小时内浸出，并且超过80％已在第一小时内浸出。这个结果令人惊讶，因为大多数其它亲水性孔形成剂的浸出导致灵敏度随时间推移而降低，这通常被解释为孔形成剂的损失导致外层的孔隙度降低所指。然而，当最初存在于外层中的水溶性酶肌酸酶浸出时，多孔结构得以保持并且变成为充满水和盐，所述水和盐使孔保持打开并稳定对外层的渗透性。
据信，嵌入的蛋白质在整个外层中提供连续的、充满水的孔隙度。例如，当肌酸酶包括在外层中时，孔隙度和传感器灵敏度与外层的酶浓度成比例。便利地，肌酸酶是由于活性和稳定性较差而在酶层中缺乏最多的一种酶。遍及整个区域的均匀孔隙度和外层的厚度为酶层中的所有酶分子提供了分析物的均匀扩散，因此传感器似乎具有更多的酶过剩和更长的使用稳定性。
合适的蛋白质是在水性溶液中具有球状结构的那些。通常，蛋白质的分子量在30,000g/mol-400,000g/mol诸如100,000g/mol-200,000g/mol的范围内。在一些实施方案中，蛋白质是交联的，以便至少使(平均)分子量加倍。
在一个有趣的实施方案中，嵌入连续相中的蛋白质为酶。合适的蛋白质或酶的示例是选自白蛋白、肌酸酶和其它水解酶，尤其是肌酸酶的那些。
在当前优选的实施方案中，孔形成酶为肌酸酶。酶肌酸酶(CI)为水溶性的，作为二聚体存在于溶液中，分子量为47,000g/mol，并且在水溶液中形成大致球状的三维结构，并具有亲水部分和疏水部分两者以及离子基团。它们的异电点为约5.4，因此在pH 7.4处它们将具有净负电荷。酶的半硬颗粒意指在室温下，酶的螺旋状和β片状构形不被破坏，并且溶液中的酶晶体形态得以保留。浓缩和稀释的未交联的肌酸酶的流体动力学尺寸经测量为3nm-5nm，其具有较小的杂质并为1nm-3nm，其可能分别具有一些聚集的酶。用作孔形成剂的肌酸酶被交联成大约双倍分子尺寸，直径大约为6nm-10nm。
优选地，基于外层的总体积计，一种或多种蛋白质诸如一种或多种酶占1％-30％，诸如4％-25％，具体地讲是7％-15％。
(iii)聚合物颗粒
微孔外层还可包含嵌入所述连续相中的(iii)聚合物颗粒。聚合物颗粒通常为具有低吸水率的防水性聚合物颗粒，并且如此丰富使得它们最终构成类似于外层内的菱形结晶状网状物的结构。这些特征改善了传感器灵敏度、酶过剩和线性度。此外，聚合物颗粒(例如PTFE颗粒)的高氧溶解度降低了氧气依赖性并进一步増加了线性度。
用作菱形结晶状网状物的聚合物颗粒通常是稳定的合成聚合物颗粒，其不聚集也不在水性介质中显著地相互排斥。应当理解，相对于也存在于外层中(ii)蛋白质，聚合物颗粒不是蛋白质来源。
构成菱形结晶状网状物的颗粒的尺寸通常介于约2nm和500nm之间，更典型地为约50nm至200nm。
已发现，将相对较大体积分数的聚合物颗粒(如硬PTFE颗粒)添加到水性分散体中对外层的均匀性和可重现性具有积极影响。因此，外层的分析物渗透性对外层厚度的变化不太敏感。据信，这是因为高度填充的复合体系中的扩散发生在硬填料颗粒和聚合物粘结剂相之间的较大界面中，因此存在高度的互连性，这基本上在外层膜层中具有相同的几何形状。
相比于互连是由更小含量或更粗糙的颗粒建立的情况，期望大量的聚合物颗粒以使外层的形态对厚度的较小变化更不敏感，并且这相对于膜渗透性应当提供更加可重现的外层。
如果存在，基于外层的总体积计，外层通常包含从0.5％至80％，更典型地从30％至70％，更典型地从40％至60％的量的硬聚合物颗粒。
与防水性聚合物相比，聚合物颗粒是非常疏水的，并且不具有吸水率或至多1％的吸水率。聚合物颗粒没有作为粘结剂的功能，并且因此可具有比防水性聚合物高的玻璃化转变温度(Tg)，该玻璃化转变温度在干燥层时起到粘结相的作用。
为了用作在外层中形成聚合物颗粒的菱形结晶状网状物，基本上所有稳定的颗粒以及此类颗粒的混合物原则上是可用的，所述颗粒具有固有的和限定的孔隙度。根据所需的应用，据信形成聚合物颗粒的合适的菱形结晶状网状物包括天然或合成聚合物，其在水性溶液中具有三维结构。与通过在吸水后(以及可能的洗涤出蛋白质后)留下多孔体积来增加外层的孔隙度的“软”孔形成蛋白质相比，据信形成聚合物颗粒的“硬”菱形结晶状网状物通过其表面积来增加体系的孔隙度，其中扩散和孔形成蛋白质沿着硬颗粒和防水性聚合物(分散体颗粒)的粘结剂之间的界面进行。
添加硬聚合物颗粒以便获得甚至更均匀且良好分散的多孔相，例如，如可针对Eudragit/PTFE疏水性聚合物基体情况的那样。在这种情况下，外层由于PTFE而具有低吸水率，这改善了传感器灵敏度和线性度，并且PTFE的高氧气溶解度降低了氧气依赖性。
在一个有趣的实施方案中，聚合物颗粒选自碳氟聚合物，包括来自聚四氟乙烯(PTFE)、聚三氟乙烯、聚氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚三氟氯乙烯、聚氟乙烯丙烯、聚全氟烷氧基乙烯以及它们的共聚物的颗粒。出于描述的简洁性，本说明书将涉及优选的碳氟聚合物，聚四氟乙烯(PTFE)。
聚四氟乙烯(PTFE)是最初由杜邦公司(DuPont)制成的合成含氟聚合物。PTFE一般具有高密度(约2.2g/cm3)和高熔点(大约327℃)。高密度与高熔点一起使得这些颗粒坚硬。在大气压力下，结晶或部分结晶的聚四氟乙烯(通常结晶度为90％至95％)经历了从低于环境温度至高达熔点的若干相变化。在19℃以下，通过在主碳链周围聚集含氟原子获得了一个井然有序的六边形晶体结构，从而迫使晶格中形成聚合物主链的螺旋构象。PTFE在190℃下经历相变，并且体积将増加1.2％。具有碱性pH10-11的商业名称为“
Figure BDA0001668781710000101
PTFE 60％(w/w)水性分散体”的聚四氟乙烯聚合物(PTFE)由西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)供应。PTFE分散体包含大约6％(w/w)非离子表面活性剂乙氧基化三甲基壬基醚(TergitolTMN-10类型，Mw 230g/mol)。浓缩和稀释的PTFE颗粒的流体动力学尺寸经测量分别为0.9μm和0.3μm。
实施方案
在一个实施方案中，平面酶传感器(具体地为肌酸或肌酸酐传感器)的外层包含基于外层的总体积计20％-30％的量的选自丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(例如Eudragit NM30D)的防水性聚合物、10％-20％的量的酶(具体地是肌酸酶)以及50％-60％的量的聚合物颗粒。
在另一个实施方案中，平面酶传感器(具体地为肌酸或肌酸酐传感器)的外层包含基于外层的总体积计70％-80％的量的选自丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(例如Eudragit NM30D)的防水性聚合物以及20％-30％的量的酶(具体地是肌酸酶)。
在另一个实施方案中，平面酶传感器(具体地为肌酸或肌酸酐传感器)的外层包含基于外层的总体积计20％-30％的量的选自聚乙酸乙烯酯(例如Kollicoat SR30D)的防水性聚合物、10％-20％的量的酶(具体地是肌酸酶)以及50％-60％的量的聚合物颗粒。
在又一个实施方案中，平面酶传感器(具体地为肌酸或肌酸酐传感器)的外层包含基于外层的总体积计70％-80％的量的选自聚乙酸乙烯酯(例如Kollicoat SR30D)的防水性聚合物以及20％-30％的量的酶(具体地是肌酸酶)。
在其中外层不包含硬聚合物颗粒的情况下，防水性聚合物和蛋白质之间的相对体积比优选地为90:10至60:40，诸如85:15至60:40，或80:20至75:25。
在其中外层包含聚合物颗粒的情况下，防水性聚合物、蛋白质和聚合物颗粒之间的相对体积比优选介于40:20:40至50:10:40至20:10:70之间。
外层还可包含基于外层的总体积计至多10％诸如至多2％的量的附加组分，如缓冲液、盐、表面活性剂、润湿剂、颜料如二氧化钛(用于改善外层的缓解特性)等。
当混合在一起时，上述不同材料之间存在多个相互作用。在胶态颗粒范德华力的相互作用下，静电相互作用和空间排斥力可发挥重要作用。相互作用的胶态颗粒可导致稳定性问题诸如聚集、絮凝或相分离。颗粒分散体的稳定性取决于随着颗粒彼此接近，它们之间存在的排斥力和吸引力的平衡。
在诸如本发明的外层的复合膜中，扩散通常沿着惰性填料颗粒的表面进行。这意味着它们在聚合物基体中的分布在很大程度上限定了穿过外层的扩散通路。由于EudragitNM颗粒的连续相对分析物不可渗透，因此分析物的扩散将在由形成孔的酶颗粒限定的填充有水的连续相中进行。在干燥外层时，乳化剂和酶分子将趋于集中在聚合物颗粒之间的开放空间中，并且它们在干燥外层中的存在将导致足以使分析物扩散的量的吸水率。
具体实施方案
在一个实施方案中，酶传感器为肌酸传感器。在该实施方案中，酶层包含肌氨酸氧化酶和肌酸酶。在本文的一些有趣的变型中，外层中的蛋白质为酶，具体地为肌酸酶。
在肌酸传感器的一个变型中，外层包含基于外层的总体积计20％-30％(具体地24％-28％)的量的选自丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(例如Eudragit NM30D)的防水性聚合物、7％-12％(具体地8％-10％)的量的酶(具体地是肌酸酶)以及50-65％(具体地55％-60％)的量的PTFE聚合物颗粒。
孔形成酶的量应足够大，以提供从外层的一侧至另一侧的连接孔隙度。由于渗滤阈值为约15％，使用大约9％的酶就实现了这一点，这对于在吸收水后达到几乎15％的孔隙度具有重要意义。如果量太高，由于过氧化氢的后扩散相对太大，灵敏度降低，并且由于来自酶层的酶的渗漏，使用稳定性也将降低。硬聚合物颗粒的量必须高于渗滤阈值，以尝试在整个层中确保颗粒之间的物理接触。我们发现，灵敏度和使用稳定性随PTFE颗粒的量而増加至最多达大约60％，并且最佳性能为50％-60％v/v。PTFE控制孔隙度，因为扩散沿着粒子表面发生。因此它是疏水的，并且减少了使用的膜的水吸收，这使渗透性随时间推移而稳定。分散体中的聚合物颗粒具有相对低的膜成形温度(5℃)，这使得能够在室温下固化层，并且这对无法承受高干燥温度的酶是有利的。
在另一个实施方案中，酶传感器为肌酸酐传感器。在该实施方案中，酶层包含肌氨酸氧化酶、肌酸酶和肌酸酐酶。在本文的一些有趣的变型中，外层中的蛋白质为酶，具体地为肌酸酶。
在肌酸酐传感器的一个变型中，外层包含基于外层的总体积计20％-30％(具体地24％-28％)的量的选自丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(例如Eudragit NM30D)的防水性聚合物、7％-12％(具体地8％-10％)的量的酶(具体地是肌酸酶)以及50％-65％(具体地55％-60％)的量的PTFE聚合物颗粒。
如上针对肌酸传感器的相同的注意事项也适用于肌酸酐传感器。
在另一个实施方案中，酶传感器为葡萄糖传感器。在该实施方案中，酶层包含葡萄糖氧化酶。在本文的一些有趣的变型中，外层中的蛋白质为酶，具体地为相同的肌酸酶。需注意，在葡萄糖传感器中，肌酸酶仅用作孔形成剂。
具体地对于葡萄糖传感器而言，外层包含基于外层的总体积计20％-35％的量的选自丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(例如Eudragit NM30D)的防水性聚合物、0.5％-3.0％的量的酶(具体地是肌酸酶)以及65％-80％的量的PTFE聚合物颗粒。
在又一个实施方案中，酶传感器为乳酸盐传感器。在该实施方案中，酶层包含乳酸盐氧化酶。在本文的一些有趣的变型中，外层中的蛋白质为酶，具体地为肌酸酶。
具体地对于乳酸盐传感器，外层包含基于外层的总体积计20％-35％的量的选自丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(例如Eudragit NM30D)的防水性聚合物、0.5％-3.0％的量的酶(具体地是肌酸酶)以及65％-80％的量的PTFE聚合物颗粒。
在又一个实施方案中，酶传感器为醇传感器。在该实施方案中，酶层包含醇氧化酶。在本文的一些有趣的变型中，外层中的蛋白质为酶，具体地为肌酸酶。
具体地对于醇传感器，外层包含基于外层的总体积计20％-35％的量的选自丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(例如Eudragit NM30D)的防水性聚合物、0.5％-3.0％的量的酶(具体地是肌酸酶)以及65％-80％的量的PTFE聚合物颗粒。
在又一个实施方案中，酶传感器为脲传感器。在该实施方案中，酶层包含脲酶。在本文的一些有趣的变型中，外层中的蛋白质为酶，具体地为肌酸酶。
具体地对于脲传感器，外层需要相对开放，因此外层包含基于外层的总体积计20％-35％的量的选自丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(例如Eudragit NM30D)的防水性聚合物、5％-15％的量的酶(具体地是肌酸酶)以及50％-75％的量的PTFE聚合物颗粒。
用于制备平面酶传感器的方法
本发明还提供了用于制备上文所述的平面酶传感器的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供支撑导电材料的电极层的电绝缘材料的基板，所述基板和电极层具有设置在其上的多个层，最外层为包含至少一种酶的酶层，优选的酶层包含聚合物基体和嵌入所述聚合物基体中的至少一种酶；
b.提供(i)防水性聚合物和(ii)蛋白质的水性分散体或胶体溶液；以及
c.将所述分散体或胶体溶液分配到所述酶层上，并允许所述分散体/胶体溶液干燥，从而形成外层。
外层通常作为覆盖层沉积到酶层上。在这种情况下，在分散体的溶剂蒸发后，形成了稳定的覆盖层；通常直接形成于酶层上。通过将外层直接涂覆到酶层上，外层通过物理粘附被附接到下面的酶层，而无需机械固定或使用胶水或粘合剂层。
当外层用作最外覆盖层(其为优选的)时，它直接与测试样品接触，并且单独调节感测反应所需的分析物的扩散。
在一些重要的实施方案中，蛋白质为酶，尤其是选自肌酸酶和其它水解酶，最优选地选自肌酸酶。
该方法将提供如上文所述的酶传感器并且具有标题为“酶传感器”中指定的特征。
步骤a
提供支撑导电材料的电极层的电绝缘材料的基板的第一步骤可通过常规方法实现，其中基板和电极层具有设置在其上的多个层，并且其中最外层为包含至少一种酶的酶层，优选的酶层包含聚合物基体和嵌入所述聚合物基体中的至少一种酶。本文的一个示例描述于实施例1中。
步骤b
在步骤b中，提供了(i)防水性聚合物和(ii)蛋白质的水性分散体或胶体溶液。在一些实施方案中，水性分散体或胶体溶液还可包含(iii)聚合物颗粒。
防水性聚合物、蛋白质和聚合物颗粒的性质在以上标题为“外层”中进行了进一步描述。另外，考虑到任何溶剂均不包含在以上针对干燥外层指示的量中，因此在相同的标题中描述了这些组分的相对量。
水性分散体或胶体溶液通常通过将(i)防水性聚合物(商业上通常作为水性分散体提供)与(iii)聚合物颗粒(商业上也通常作为水性分散体提供)和(ii)酶(商业上通常以水性缓冲溶液提供)混合来制备。此外，出于分配分散体的目的，加入水(例如去离子水)以提供合适的分散体粘度。通常，水性分散体/胶体溶液具有15％-25％(w/w)的固体含量。
为了防止水性聚合物分散体/胶体溶液聚集并确保分配过程进展得令人满意，一般期望包括一种或多种低分子量添加剂。这通常是低分子量的非离子表面活性剂，例如乙氧基化烃，如Triton X-100、Tergitol TMN3、TMN6或TMN10。
步骤c
在步骤c中，分散体或胶体溶液分散在酶层上，并且允许分散体/胶体溶液干燥，从而形成外层。
从由水性聚合物分散体浇铸的外层中获得的膜形成物和形态与从浇铸的基于溶剂的溶液中获得的膜形态迥然不同。在基于溶剂的聚合物溶液中，不同类型的大分子紧密共混并且无规地分布于整个溶剂中。在溶剂蒸发时，聚合物链彼此接近，并最后形成具有高度聚合物-聚合物-相互渗透的膜。相比之下，当使用水性聚合物分散体时，在膜形成过程开始时存在一定尺寸的分离的纯防水性聚合物(如例如Eudragit)和蛋白质(如肌酸酶)结构域。由于大分子在胶态颗粒内的移动性受限，因此聚合物链不能完全相互扩散。仅在靠近颗粒表面的区域中，可预期更多或更少的聚合物-聚合物紧密共混。因此，在水蒸发时，形成了具有纯防水性聚合物和纯蛋白质(例如酶)结构域的聚合物膜，并且所得的孔隙度由蛋白质(例如酶)颗粒在聚合物分散体中的分布限定。聚合物-聚合物相互渗透仅发生在防水性聚合物的颗粒具有紧密接触的地方，并且其比由有机溶液制备的膜的情况低得多。为了使蛋白质相(例如酶相)与外层的一侧到另一侧相互连接，以用于固定外层的渗透性，蛋白质含量最优选地应高于渗滤阈值，其理论上大约为外层的15％v/v。在水吸收和浸出后，用水填充尺寸为5nm-15nm的蛋白孔，并且分析物和H2O2扩散通过这些孔。
外层由步骤b中制备的水性分散体/胶体溶液制得。
在一些有趣的实施方案中，水性分散体/胶体溶液还包含聚合物颗粒。由于防水性聚合物和孔形成聚合物颗粒在物理上不相容，因此在干燥分散体/胶体溶液时形成了共连续的两相膜形态。孔形成聚合物颗粒均匀地分布在整个聚合物相中，从而在整个聚合物粘结相中提供连接。
除了由蛋白质提供的孔隙度之外，外层的孔隙度和因此的渗透性可通过形成孔的硬聚合物颗粒提供。因此，从渗透性角度看，在选择聚合物颗粒时没有限制。用于硬聚合物颗粒的聚合物材料通常可为任何聚合物分散体材料或聚合物材料的混合物。然而，优选地使用无毒或易于应用的材料。
外层由水性胶体溶液或分散体制备，所述水性胶体溶液或分散体比基于溶剂的外层更具酶友好性，该外层通常用于平面代谢物传感器，因此在外层分配期间，肌酸酐传感器在酶失活问题方面极具优势。
外层的厚度可相对于所需的用途和/或渗透速率灵活地选择。合适的厚度在0.5μm至1000μm的范围内，通常在3μm至500μm的范围内，并且更典型地在5μm至50μm的范围内。
因此，可通过改变(孔形成剂)蛋白质的涂层厚度和/或浓度来容易地调节外层的渗透。
由于可根据需要调节外层的渗透性，因此外层提供传感器的快速再生。在基于例如氧气消耗的感测反应的情况下，可以这种方式调节氧气渗透和含量，使得传感器再生(例如，氧气贮存器的再生)非常快。因此，传感器对于多用途酶传感器尤其有用。
该方法允许施加外层而不损害更低层(例如，酶层)。
外层可例如直接施加到酶层上而不影响或以其它方式破坏酶层的酶。
分散体/胶体溶液通常在分配到酶层上之后被干燥。实质上，可使用本技术领域中已知的每种干燥方法，尤其是在大约室温下操作的那些。
酶传感器的用途
可根据本文所述的方法制备的本文所述的酶传感器可替换常规设备(例如，血气分析仪)中的任何常规酶传感器。因此，本文所定义的酶传感器的主要特征在于外微孔层的特征，并且可易于在现有的传感器阵列和料筒中实现。
因此，根据本发明的酶传感器的用途可容易地由技术人员参考常规方法而实现。
因此，设想外层的特征还将向任何类型的酶传感器提供优点，包括尚未建立常规标准的那些酶传感器概念。
总论
虽然本说明书和权利要求间或地涉及聚合物、传感器、酶等，但应当理解，本文所定义的产品和方法可包括一种、两种或更多种类型的单独组分或元素。在其中存在两种或更多种不同组分的实施方案中，相应组分的总量应与本文针对单独组分所定义的量相对应。
表达中的“(s)”：聚合物(polymer(s))、传感器(sensor(s))、酶(enzyme(s))等指示可以存在一种、两种或更多种类型的单独组分或元素。另一方面，当使用表达“一个”时，仅存在相应组分或元素中的一(1)种。
在整个说明书中，词语“包含”(comprise)或变型形式诸如“包括”(comprising)或“含有”(comprises)将被理解为意指包含规定的元素、整体或步骤，或者元素、整体或步骤的组，但不排除任何其它元素、整体或步骤，或者元素、整体或步骤的组。
实施例
材料
肌酸酶(大约30％w/w)的磷酸盐缓冲液，BBI
去离子水
Eudragit NM30D：聚(丙烯酸乙酯-共-甲基丙烯酸甲酯)的30％w/w水性分散体2:1
PTFE：60％w/w聚四氟乙烯分散体水溶液，Aldrich 66580
Kollicoat SR30D：30％w/w水性分散体(约27％聚乙酸乙烯酯、2.7％聚维酮和0.3％月桂基硫酸钠)，巴斯夫(BASF)
实施例1-肌酸酐双传感器系统的构造
在一个实施方案中，平面酶传感器为适用于测量生理流体样品中肌酸酐的厚膜传感器。厚膜传感器由双传感器系统构成，双传感器系统包括肌酸传感器和肌酸酐传感器，其各自如图1所示组合而成。
参考图1，在一个表面处提供了200μm厚度的电绝缘氧化铝基板110，其具有直径为1000μm且厚度为10μm的圆形铂工作电极120、以30°-330°角度范围覆盖工作电极的外周边的外径为3000μm、内径为2000μm且厚度为10μm的环形铂反电极130，以及以0°定位在工作电极的外周边处的直径为50μm的圆形银/氯化银参比电极140。三个电极结构中的每一个经由穿过横跨基板的孔(未示出)的铂连接到整个氧化铝基板110上的传感器电子器件(未示出)。在操作时，工作电极120相比于参比电极140被极化成+675mV。
此外，氧化铝基板110是玻璃和聚合物密封剂的两层状结构。这些两层状结构包括包围工作电极120的外径为1800μm、内径为1200μm且厚度为50μm的环形结构160,161以及围绕整个电极系统的厚度为50μm的结构150,151。这些两层状结构两者由内层150,160和外层151,161组成，所述内层面向来自ESL欧洲联合国(Europe of the United Kingdom)的厚度为20μm的ESL玻璃4904的氧化铝基板110，所述外层为如授予美国加利福尼亚州的SenDx医疗公司(SenDx Medical Inc.of California,USA)的国际专利申请WO 97/43634所公开的来自美国加利福尼亚州的SenDx医疗公司(SenDx Medical Inc.of California,USA)的聚合物密封剂，其包含28.1重量％的聚甲基丙烯酸乙酯(Elvacite，部件号2041，得自杜邦公司(DuPont))、36.4重量％的乙酸卡比醇酯、34.3重量％的硅烷化高岭石(部件号HF900，得自恩格尔哈德(Engelhard))、0.2重量％的热解法二氧化硅和1.0重量％的三甲氧基硅烷。
直径为1200μm且厚度为10μm的乙酸纤维素和乙酸丁酸纤维素的圆形内层170覆盖工作电极120。
对于肌酸酐传感器，肌酸酐酶、经戊二醛处理的肌酸酶和肌氨酸氧化酶的直径为1200μm并且厚度为12μm的圆形酶层180覆盖内层170。
对于肌酸传感器，经戊二醛处理的肌酸酶和肌氨酸氧化酶的直径为1200μm并且厚度为12μm的圆形酶层180覆盖内层170。
本发明的外层190(参考实施例2)覆盖包括酶层180、反电极130和参比电极140的结构。
实施例2-外层材料的测试
出于针对合适的外层检查各种候选物的目的，通过混合以下组分制备三种不同的外层材料(A、B和C)：
A：400μL的肌酸酶分散体的磷酸盐缓冲液，2150μL去离子水，1020μL EudragitNM30D，1200μL PTFE分散体
B：2000μL去离子水，1000μL Kollicoat SR30D，2000μL PTFE分散体
C：2350μL去离子水，1110μL Eudragit NM，1310μL PTFE分散体
如以上实施例中所述，将不同的外层材料施加到构造上(如图1中的190)。
使用包含已知浓度的肌酸和肌酸酐的校准溶液，在重新配置的辐射计ABL90柔性分析仪中测试传感器。收集和分析数据。
以下测试被设计成解决酶层的可用性，从而解决外层的均匀性。该测试比较含有肌酸酶抑制剂的溶液中的传感器响应与不含肌酸酶抑制剂的溶液中的传感器响应。两种溶液的读出越相似，酶的可用性越高，并且外层更加合适。碳酸氢盐用作抑制剂，因为它是血液中的相关和内源性组分。
结果汇总于下表1中，其中B和C为参考层。
表1
Figure BDA0001668781710000181
具有外层材料B的传感器显示出比具有外层材料A的传感器更低的灵敏度，并且灵敏度之间的比率也更低。这表明该酶的较小部分是活性的和/或可用的，并且传感器B更容易受到血液样本中的碳酸氢盐变化的影响。
具有外层材料C的传感器具有非常低的灵敏度，该非常低的灵敏度与不存在形成孔的肌酸酶相关。
在另一个测试循环中，比较了具有以下组分的两种外层材料(D和E)：
D：400μL的肌酸酶分散体的磷酸盐缓冲液，3350μL去离子水，1020μL EudragitNM30D
E：400μL的肌酸酶分散体的磷酸盐缓冲液，2150μL去离子水，1020μL EudragitNM30D，1200μL PTFE分散体
结果汇总于下表2中。
表2
Figure BDA0001668781710000191
尽管与不具有PTFE的外层D相比，在外层E中具有PTFE的传感器的灵敏度更高，但在抑制剂的存在下外层E的持续测量的能力更好。因此，除了对具有低O2浓度的样品给予更高的稳定性之外，PTFE颗粒也可能有助于制备更均匀的外层。
不同外层材料(干燥基)中组分的相对量：
v/v％ 酶 PTFE Eudragit Kollicoat
A 11％ 55％ 35％ -
B - 57％ - 43％
C - 61％ 39％ -
D 23％ - 77％ -
E 11％ 55％ 35％ -

Claims (15)

1.一种用于测量溶液中分析物的浓度的平面酶传感器，所述传感器包括支撑导电材料电极层的电绝缘材料基板，所述基板和电极层具有设置在其上的多个层，所述多个层至少包括：
a.包含至少一种酶的酶层；
b.覆盖所述酶层的微孔外层，所述外层包含(i)防水性聚合物的连续相和(ii)嵌入所述连续相中的蛋白质；
其中形成所述外层的所述连续相的所述防水性聚合物选自聚乙酸乙烯酯类以及丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
2.根据权利要求1所述的传感器，其中嵌入所述连续相中的所述蛋白质是酶。
3.根据权利要求2所述的传感器，其中所述酶选自水解酶。
4.根据权利要求1所述的传感器，其中形成所述外层的所述连续相的所述防水性聚合物具有低于100℃的玻璃化转变温度(Tg)。
5.根据权利要求4所述的传感器，其中形成所述外层的所述连续相的所述防水性聚合物具有0℃-60℃或5℃-60℃的范围内的玻璃化转变温度(Tg)。
6.根据权利要求1所述的传感器，其中基于所述外层的总体积计，所述防水性聚合物占15％-80％。
7.根据权利要求6所述的传感器，其中基于所述外层的总体积计，所述防水性聚合物占20％-60％或20％-30％。
8.根据前述权利要求1-7中任一项所述的传感器，其中所述微孔外层还包含嵌入所述连续相中的聚合物颗粒。
9.根据权利要求8所述的传感器，其中所述聚合物颗粒选自碳氟聚合物，包括来自聚四氟乙烯(PTFE)、聚三氟乙烯、聚氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚三氟氯乙烯、聚氟乙烯丙烯、聚全氟烷氧基乙烯以及它们的共聚物的颗粒。
10.根据前述权利要求1-7中任一项所述的传感器，其中所述酶层包含肌氨酸氧化酶和肌酸酶，并且其中所述外层中的所述蛋白质为肌酸酶。
11.根据前述权利要求1-7中任一项所述的传感器，其中所述酶层包含聚合物基体，所述至少一种酶被嵌入所述聚合物基体中。
12.根据前述权利要求1-7中任一项所述的传感器，其中所述外层包含基于所述外层的总体积计20％-30％的量的选自丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物的防水性聚合物、10％-20％的量的酶以及50％-60％的量的聚合物颗粒。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的传感器，其中所述外层包含基于所述外层的总体积计20％-30％的量的选自聚乙酸乙烯酯类的防水性聚合物、10％-20％的量的酶以及50％-60％的量的聚合物颗粒。
14.一种用于制备根据前述权利要求1-13中任一项所述的酶传感器的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供支撑导电材料电极层的电绝缘材料基板，所述基板和电极层具有设置在其上的多个层，所述最外层为酶层；
b.提供(i)防水性聚合物和(ii)蛋白质的水性分散体或胶体溶液，其中所述防水性聚合物选自聚乙酸乙烯酯类以及丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物；以及
c.将所述分散体或胶体溶液分配到所述酶层上，并允许所述分散体/胶体溶液干燥，从而形成外层。
15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)中的所述分散体或胶体溶液还包含(iii)聚合物颗粒。
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