CN101128599A - 用于基于酶的传感器应用的扩散和酶层 - Google Patents
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Abstract
提供了用于基于酶的传感器应用的组合的扩散和酶层，其中该扩散和酶层包含(a)至少一种聚合物材料，和(b)携带酶的颗粒，一般地为亲水颗粒，该亲水颗粒分散在至少一种聚合物材料中。
Description
发明背景
本发明涉及用于基于酶的传感器应用的组合的扩散和酶层，以及包含其的传感器。
基于酶的传感器广泛用于以定性和定量的方式测定血液和其他体液中的目的物质。基于酶的传感器尤其用于测定酶底物。在基于酶的传感器中，发生所称作的化学转换器反应，其中待测定的物质在至少一种酶的参与下转变成另一种物质。许多基于酶的传感器需要共底物的参与。直接或者间接检测共底物的消耗或者其他物质的产生。
基于酶的传感器通常包含几层，其中有酶层和扩散层(盖膜，外层)。该扩散层直接与样品接触并限制传感反应必需的物质、特别是酶底物或共底物的扩散。
基于酶的传感器可以作为电化学传感器或者作为光学传感器(光极)提供。例如在美国专利号6,107,083中描述了葡萄糖光极的构造和功能。
具体地，用于测定葡萄糖、乳酸或者肌酸酐的基于酶的传感器优选用氧化还原酶构造并且检测是基于氧消耗的。在该情况中，传感器必需多孔的盖膜或者至少可渗透的聚合物膜，其控制酶底物和氧的渗透。
使用酶的葡萄糖传感器是用于检测糖类的最熟知的实际措施。该技术包括将样品与传感器接触，使葡萄糖扩散到传感器中，酶层内的酶(葡糖氧化酶)分解葡萄糖，并通过合适的工具如化学发光染料测量消耗的氧的量，或者通过合适的工具如电流分析电极测量产生的过氧化氢的量。
因此，基于酶的传感器可以作为电化学传感器(电极)或者作为光学传感器(光极)提供。葡萄糖光极的构造和功能例如在美国专利号6,107,083(Collins等人)中描述。葡萄糖电极的构造和功能例如在美国专利号6,214,185(Offenbacher等人)中描述。
具体地，用于测定葡萄糖、乳酸或者肌酸酐的基于酶的光极优选用氧化还原酶构造并且检测主要基于氧消耗。基于发光的光极的基本设计概念按顺序包括
a)光可透射的支持体，
b)氧传感层，其在光可透射的、氧可渗透的基质中含有发光染料，
c)酶层，其含有固定在亲水的水和氧可渗透的基质中的氧化还原酶或者酶级联，
d)扩散层，其限制酶底物和/或共底物扩散到酶层中，和任选地
e)光学隔离层，其不透光。
备选地，可以从不透光材料构造酶层或者扩散层以发挥光隔离层的功能。
在样品测量前，将传感器用水或者合适的盐溶液和一定水平的O2(即，150mmHg)平衡。为了测量，将传感器与样品接触。葡萄糖从样品扩散到酶层中。酶层内的葡萄糖和氧消耗导致相邻染料层中氧的耗尽。在发光染料的情况中，染料层内O2-耗尽的速率转化成对应的增强的发光强度(即，表达为ΔI/Δt)。后者的值，即样品接触后某个时间间隔内测定的发光强度的值通过合适的相关函数与葡萄糖浓度关联。在所有O2都在染料层中被消耗的情况中，ΔI/Δt将变为0，因为发光强度将不进一步增加。为了解释染料加载的变动(即，传感器到传感器)或者光源的强度的变动(仪器到仪器)，优选将强度改变表达为ΔI/(IΔt)，其中I是在已知的pO2下的强度(即，样品接触前测量的强度)。我们将后者的量称作斜率，其中在样品测量后给定的时间窗口中测定斜率。实际上，已知许多测定斜率的方法。除了发光强度外，也可以使用发光衰减时间(即，Δτ/Δt)，其通过本领域中已知的脉冲或者相方法测定。
形成酶层的聚合物的选择取决于它的a)在水或者水性样品中的不溶性，b)在不破坏酶的活性的溶剂中的溶解性和c)它对相邻染料层的聚合物的粘附性质。许多非交联的亲水聚合物是潜在的候选材料。某些低水吸收聚醚-聚氨基甲酸酯(湿润状态水含量2.5％)在低级醇(如乙醇)或者醇水混合物中可溶，是对从某些硅氧烷生产的染料层提供良好粘附的优选材料。
使用非常亲水的聚合物(水含量50％或者更高)的一个缺点是高水溶性底物如葡萄糖和乳酸太快地渗透到酶层，从而使得转换反应运行太快，从而导致染料层中O2耗尽太快(几秒或者更短)。除了许多其他缺点外，快速率的测定变得不切实际。扩散层控制酶底物的渗透。
根据本领域中一种已知的方法，由聚合物如聚碳酸酯、聚丙烯和聚酯预先形成的由非水合的微孔结构组成的盖膜用于控制酶底物的渗透。此类膜的孔隙率由物理手段，例如，通过中子或者氩径迹蚀刻提供。葡萄糖主要通过装满液体的这些孔渗透这些膜。在与样品接触前，将共底物O2装满入传感器层。共底物(即O2)渗透过孔和聚合物二者。渗透过聚合物的程度取决于它对O2的渗透性。
一个主要的缺点是预形成的薄膜必须附着到酶层。膜通常机械附着到酶层。机械附着是昂贵和在技术上复杂的。在难以在不产生气泡的情况下将膜应用到下面的层上的情况下，发生了其他问题。当膜例如粘到下面的层上时，也发生类似的问题。
本领域中已知的另一种方法是通过对酶层应用聚合物溶液并通过蒸发溶剂形成扩散层。Offenbacher等人(美国专利号6,214,185)描述了由PVC共聚物制备的盖膜，其由于存在亲水共聚单体组分而允许相当满意地调节渗透性。在暴露于水或者水性样品后，亲水区提供了膨胀的结构，其作为水溶性酶底物的渗透途径。EP 0690134描述了一种电化学传感器，其使用树脂层中的携带酶的镀铂的碳颗粒。重要的是，酶层由单独的扩散膜覆盖，其优选用阴离子稳定化的、基于水的羟基端基封闭的包含胶态二氧化硅的聚二甲基硅氧烷弹性体旋转涂布。
发明概述
与上面的背景相反，本发明提供了相对于现有技术的某些非显而易见的优点和进展。具体地，发明人已经认识到需要对于基于酶的传感器应用改进扩散层或者膜设计。
尽管本发明不限于特定优点或者功能性，但是注意到本发明提供了具有快速的氧恢复时间的传感器，其还用于在短的时帧内进行多次测量。此外，提供了具有短洗涤时间以除去酶促反应产物以及酶层的快速水合(“湿润”)的传感器。
根据本发明的一个实施方案，提供了组合的扩散和酶层，其包含至少一种聚合物材料，和携带酶的颗粒。所述颗粒分散在至少一种聚合物材料中。颗粒可以是亲水的。
本发明基于将扩散层和酶层组合成一个单层的想法。
根据本发明的另一实施方案，扩散和酶层可以还包含用于光学隔离的颗粒，例如，分散在至少一种聚合物材料中的颗粒。
根据本发明的另一实施方案，提供了基于酶的传感器，其包含根据本发明的扩散和酶层，其可以是传感器的覆盖层。
根据本发明的再一个实施方案，提供了包含至少一个染料层的基于酶的传感器。
根据本发明的再一个实施方案，传感器是电化学传感器或者光学传感器。
本发明的另一方面是基于酶的传感器用于检测和/或定性和/或定量测定酶底物、尤其葡萄糖，和/或共底物的用途。本发明的基于酶的传感器可以用于血液中，其中通常进行多次测量。
根据本发明的再一个实施方案，提供了制备用于基于酶的传感器的组合的扩散和酶层的方法，其包括(i)形成包含至少一种聚合物材料和携带酶的颗粒的分散体；(ii)将分散体直接应用于下面的层上以形成携带酶的扩散层；和(iii)干燥分散体。
从下面本发明的详细描述和所附的权利要求书，可以更完整地理解本发明的这些和其他特征和优点。注意到权利要求的范围通过其中的叙述而不是通过本说明书中给出的特征和优点的特定讨论限定。
附图简述
当与下面的附图一起阅读时可以最好地理解下面的本发明的实施方案的详细描述，附图中同样的结构用同样的参考数字指出，其中：
图1是根据本发明的一个实施方案显示的光学测量系统的示意图示；
图2显示了技术现状葡萄糖传感器的氧恢复时间；
图3显示了根据本发明的一个实施方案的葡萄糖传感器的发光强度对比氧恢复时间(秒)；
图4显示了根据图3的传感器的动力学发光强度反应曲线；
图5是从测量的发光强度计算的全血中计算葡萄糖浓度的比较；和
图6是使用全血和分别含有30、70、150、300和400mg/dl葡萄糖的重量分析葡萄糖标准，从根据本发明的一个实施方案(组合的扩散和酶层混合物B、C、D、E)的传感器确定的计算斜率的比较。
技术人员理解图中的元件仅为了简单和清楚而阐明并且不一定按比例绘制。例如，图中的一些元件的尺寸可以相对于其他元件放大以帮助理解本发明的实施方案。
本发明的一般实施方案的详细描述
根据本发明的一个实施方案，提供了组合的扩散和酶层，其包含携带酶的颗粒和任选地分散在至少一种聚合物材料中的颗粒。颗粒可以是亲水的。通过作为水溶性酶底物的可调节的渗透途径的至少一种聚合物的膨胀结构和携带酶的颗粒的膨胀结构可以提供共底物层的渗透性。
用于本发明的层的聚合物材料可以一般是任一种聚合物材料或者聚合物材料的混合物，其具有可调节的膨胀结构，可溶于不破坏酶、无毒性、通常容易挥发和容易应用的溶剂或者溶剂混合物中。通常，聚合物包含亲水的以及疏水的聚合物链序列。尤其适于本应用的聚合物的水吸收能力等于或者小于40％w/w，更一般地等于或者小于20％w/w。
根据本发明，还可能向低水吸收聚合物加入高水吸收聚合物，如聚氨基甲酸酯D4型聚合物(Tyndale Plains-Hunter Ltd.)(湿润状态水含量50％)。此类加入允许调节聚合物混合物的水含量。优点是可调节的斜率(比较图6)。酶可以掺入到此类层中，例如，固定到亲水颗粒，该亲水颗粒分散在形成酶层的聚合物中。
一般的聚合物材料可以选自非交联的非水溶性聚合物，其特征是水吸收＜40％，通常为＜20％(按重量计)的相对小的水吸收。还可能的是聚合物是至少两种可混溶的非交联的和非水溶性聚合物的混合物，该至少两种可混溶的非交联的和非水溶性聚合物的一种具有小于40％w/w(优选小于10％w/w)的水吸收能力，且该至少两种可混溶的非交联的和非水溶性聚合物的一种具有大于20％w/w(优选大于40％w/w)的水吸收能力，从而聚合物层作为整体具有依赖于两种聚合物的混合比率的水吸收能力。
由于关于聚合物材料的各种选择可能性，所以可以容易地提供本发明的层，其可以通过溶液直接应用。该层可以例如涂布在下面的层上，通常在氧光极的氧敏感层上。本发明的层的优点是可以容易地提供组合的扩散和酶层，其不溶于待测量的样品(即，体液，如血清、血浆和血液)中。
根据本发明的组合的扩散和酶层包含分散在形成聚合物材料的层中的亲水的携带酶的颗粒。颗粒和聚合物两者都提供了对共底物的渗透性并从而提供了传感器的快速氧恢复。
酶层对酶底物具有确定的渗透性，其由底物可渗透的颗粒的密度提供，所述密度由根据本发明的颗粒大小和量形成。根据该层的应用，可以改变颗粒的大小和量。
为了用作膜中的颗粒，基本上所有稳定亲水颗粒和此类颗粒的混合物都是有用的，其具有固有的和确定的水吸收和酶加载。根据所希望的应用和/或水吸收和酶加载，可以选择合适的颗粒。
合适的颗粒的实例包括凝胶颗粒。一般的颗粒基于聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和N-丙烯酰琥珀酰亚胺(N-acryloxysuccinimide)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯和琼脂糖珠。设想可以使用基本上所有具有表面结合的酶的稳定的非亲水颗粒和此类颗粒的混合物。此类颗粒的实例包括玻璃、石英、纤维素、聚苯乙烯、尼龙和其他聚酰胺。
根据本发明的酶层还可以包含用于光学隔离和光学传感器的改进的缓和性质的其他成分，如炭黑和二氧化钛。
可以关于所希望的用途灵活地选择本发明酶层的厚度。厚度取决于携带酶的颗粒的大小。合适的的厚度为约1到约100μm，通常约1到约50μm，更通常约1到约20μm。
在根据本发明的酶层的一个实施方案中，颗粒的大小至少对应于层的厚度。在另一实施方案中，以这样的方式选择颗粒的大小，从而使得单个颗粒或者单个颗粒聚簇的大小小于层的厚度。
本发明的基于酶的传感器可以还包含至少一个下面的染料层或者基电极。取决于传感器的类型，其他层可以是例如干扰阻断层、光学隔离层、导电层或者基电极。
因为可以根据需要调节组合的扩散和酶层的渗透性，所以酶层提供了传感器的快速再生。在基于例如氧的消耗的传感器反应的情况中，可以以使传感器再生，例如，氧储库的再生非常快的方式调节氧渗透。从而，本发明的传感器还可以用于多次测量。
基于酶的传感器的组合的扩散和酶层可以例如包含氧化酶，如葡糖氧化酶、胆固醇氧化酶或者乳酸氧化酶。组合的扩散和酶层还可以包含酶混合物，如酶级联，其使得可能检测不能直接检测(通过一次酶反应)的分析物，如肌酸。肌酸不能被简单的酶酶促氧化，而是需要几个酶促步骤来产生分析物衍生物，其可以通过光学或者电流分析手段检测。用于检测和/或测定肌酸酐的合适的酶级联系统包括例如，肌酸酐酰胺水化酶(amidohydrase)、肌酸酐酰胺水解酶和肌氨酸氧化酶。
在根据本发明的一个实施方案的传感器中，酶层通常作为覆盖层沉积。在该情况中，分散体的溶剂蒸发后，形成稳定覆盖层。酶层还通常直接涂布在下面的层上，通常是染料层或者电极。通过直接涂布酶层，通常，酶层通过物理粘附附着到下面的层而不使用机械固定和/或使用胶层。
本发明的基于酶的传感器可以代表任一种类的生物传感器。合适的生物传感器的实例为例如，光学传感器。使用一般的光学传感器，由于酶促反应引起的氧消耗可以用合适的染料检测，所述染料对氧敏感，例如，通过氧可猝灭的发光染料。
用于本发明的传感器中的合适的染料选自与2，2’-联吡啶、1，10-菲咯啉、4，7-二苯基-1，10-菲咯啉、4，7-二甲基-1，10-菲咯啉、4，7-二磺酸酯化-二苯基-1，10-菲咯啉、5-溴-1，10-菲咯啉、5-氯-1，10-菲咯啉、2，2’-二-2-噻唑啉、2，2’-二噻唑络合的钌(II)、锇(II)、铱(III)、铑(III)和铬(III)离子，与卟啉、氯和酞菁络合的VO2+、Cu2+、Zn2+、Pt2+和Pd2+，和其混合物。在一般实施方案中，发光染料是[Ru(二苯基菲咯啉)3]、八乙基-Pt-卟啉、八乙基-Pt-卟啉酮、或者四苯并-Pt-卟啉。
此外，电化学传感器适于用于本发明中。
本发明的另一方面是如上述基于酶的传感器用于检测或者定量测定物质、通常酶底物的用途。
在医学领域，可能的用途是例如测定生理学参数。可以在任意液体，如各种体液如血液、血清、血浆、尿等等中进行测定和/或检测。传感器的一般的用途是检测和/或测定血液中的分析物。
根据本发明的传感器的可能的用途是例如测定糖尿病患者中的血糖。可以用根据本发明的基于酶的传感器测定的其他代谢产物是例如胆固醇或者尿素。
本发明的基于酶的传感器的另一可能的用途是在环境分析学、生物技术中的过程控制和食品控制领域。
使用根据本发明的基于酶的传感器，可以测定和/或检测许多种物质，例如，酶底物和/或共底物。合适的酶底物是例如胆固醇、蔗糖、谷氨酸、乙醇、抗坏血酸、果糖、丙酮酸、葡萄糖、乳酸或者肌酸酐。通常，进行葡萄糖、乳酸或者肌酸酐的测定和/或检测。待检测和/或测定的更一般的物质是葡萄糖。
因为基于酶的传感器的再生可以受到调节渗透的影响，所以再生足够快以允许多次测量。在传感器的一般的用途中，进行多次测量。此外，基于酶的传感器可以用于本领域中已知的每种传感器应用，如单次使用应用、多次使用应用。
根据本发明的再一个实施方案，提供了制备如上述的用于基于酶的传感器的组合的扩散和酶层的方法。该方法包括：
(i)形成分散体，其包含
(a)至少一种聚合物材料，和
(b)通常为亲水性质的携带酶的颗粒，
(ii)直接在下面的层上应用所述分散体以形成携带酶的扩散层；和
(iii)干燥所述分散体。
由于聚合物材料的多种选择，根据本发明的方法允许层的直接浇铸。此外，可以以不必需分散体的加热的方式选择材料。从而，通过根据本发明的方法，提供了容易的处理。
在根据本发明的方法中，分散体通常通过物理粘附附着到下面的层。同样，干燥分散体可以包括从分散体除去溶剂。
为了更容易地理解本发明，参考下面的实施例，它们意在阐明本发明，但是不限定其范围。
实施例
实施例1：氧染料颗粒的制备
| 材料 | 浓度 |
| 氯化三(1，10-菲咯啉)钌(II)水合物(cat.34，371-4)Aldrich Chemical Co.，Inc.，1001West Saint Paul Ave.，Milwaukee，WI 53233 | 61.5g |
| 100mM磷酸盐缓冲液pH7.5 | 7.5g |
| 硅胶(cat.4115-100)Whatman Inc.，9BridewellPlace，Clifton，NJ07014 | 2.25g |
根据O.S.Wolfbeis，M.J.P.Leiner和H.E.Posch，“A newsensing material for optical oxygen measurement with the indicatorembedded in an aqueous phase”，Microchim.Acta，III(1986)359中公开的方法将染料氯化三(1，10-菲咯啉)钌(II)吸附到硅胶颗粒上。
实施例2：氧层混合物的制备
| 材料 | 浓度 |
| O2钌-二氧化硅染料颗粒 | 0.5g |
| 压敏粘合剂(cat.PSA590)GE Silicones，260HudsonRiver Road，Waterford，NY12188 | 4g |
| 甲苯Aldrich Chemical Co.，Inc.，1001West Saint Paul Ave.，Milwaukee，WI53233 | 2g |
向压敏粘合剂加入甲苯并混合直到均匀。将该溶液加入O2指示剂染料并混合16小时。
实施例3：制备携带酶的亲水颗粒
表1：葡糖氧化酶固定化
| 材料 | 浓度 |
| CarboLink偶联凝胶(Coupling Gel)(cat.20391ZZ)Pierce，3747North Meridian Road，Rockford，IL 61105 | 5g |
| 葡糖氧化酶(cat.1939998)Roche MolecularBiochemicals，9115Hague Road，Indianapolis，IN 46250 | 0.15g |
| 高碘酸钠Aldrich Chemical Co.，Inc.，1001West Saint Paul Ave.，Milwaukee，WI53233 | 0.015g |
| 100mM磷酸盐缓冲液pH7.5 | 15mL |
| D-盐聚丙烯酰胺塑料脱盐柱(cat.43243ZZ)Pierce，3747North Meridian Road，Rockford，IL61105 | 10ml柱 |
将高碘酸钠加入5ml 100mM磷酸盐缓冲液中并搅拌10分钟。向该溶液中加入葡糖氧化酶，将该溶液在室温下搅拌30分钟。移取该溶液并加入预装的(pre-filled)聚丙烯酰胺脱盐柱。在合适的容器中收集脱盐的葡糖氧化酶。将柱用10ml 100mM磷酸盐缓冲液洗涤以洗除剩余的葡糖氧化酶。然后将葡糖氧化酶加入5g CarboLink偶联凝胶并在温和混合下在室温温育24小时。然后向10ml 100mM磷酸盐缓冲液加入葡糖氧化酶-琼脂糖珠。离心溶液并倒出上层。
实施例4：组合的扩散和酶层混合物A
| 材料 | 浓度 |
| 聚氨基甲酸酯138-03型批号RL151-87聚合物Tyndale Plains-Hunter Ltd.，17K Princess Road，Lawerenceville，NJ 08551 | 3g |
| 炭黑(cat.1810)Degussa Corp./William B.Tabler Co.，Ormsby PlaceIndustrial Park，1331S.15th St.，Louisville，KY 40210 | 0.3g |
| 无水乙醇(200标准强度(Proof))Aldrich Chemical Co.，Inc.，1001West Saint Paul Ave.，Milwaukee，WI 53233 | 6.7g |
| 偶联到CarboLink偶联凝胶的葡糖氧化酶(实施例3) | 5g |
向聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。向该溶液中加入炭黑并混合24小时。向该溶液中加入葡糖氧化酶-琼脂糖珠并混合直到均匀。
实施例5：组合的扩散和酶层混合物B
| 材料 | 浓度 |
| 聚氨基甲酸酯138-03型批号RL151-87聚合物Tyndale Plains-Hunter Ltd.，17K Princess Road，Lawerenceville，NJ 08551 | 2.1g |
| 聚氨基甲酸酯D4型批号140-42聚合物Tyndale Plains-Hunter Ltd.，17K Princess Road，Lawerenceville，NJ 08551 | 0.3g |
| 炭黑(cat.1810)Degussa Corp./William B.Tabler Co.，Ormsby PlaceIndustrial Park，1331S.15th St.，Louisville，KY 40210 | 0.3g |
| 无水乙醇(200标准强度)Aldrich Chemical Co.，Inc.，1001West Saint Paul Ave.，Milwaukee，WI 53233 | 7.3g |
| 偶联到CarboLink偶联凝胶的葡糖氧化酶 | 5g |
向138-03型聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。接着向该溶液中加入聚氨基甲酸酯D4型并混合直到溶解。向该溶液中加入炭黑并混合24小时。向该溶液中加入葡糖氧化酶-琼脂糖珠并混合直到均匀。
实施例6：组合的扩散和酶层混合物C
| 材料 | 浓度 |
| 聚氨基甲酸酯138-03型聚合物Tyndale Plains-Hunter Ltd.，17K Princess Road，Lawerenceville，NJ 08551 | 2.025g |
| 聚氨基甲酸酯D4型批号140-42聚合物Tyndale Plains-Hunter Ltd.，17K Princess Road，Lawerenceville，NJ 08551 | 0.325g |
| 炭黑(cat.1810)Degussa Corp./William B.Tabler Co.，Ormsby PlaceIndustrial Park，1331S.15th St.，Louisville，KY 40210 | 0.3g |
| 无水乙醇(200标准强度)Aldrich Chemical Co.，Inc.，1001West Saint Paul Ave.，Milwaukee，WI 53233 | 7.35g |
| 偶联到CarboLink偶联凝胶的葡糖氧化酶 | 5g |
向138-03型聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。接着向该溶液中加入聚氨基甲酸酯D4型并混合直到溶解。向该溶液中加入炭黑并混合24小时。向该溶液中加入葡糖氧化酶-琼脂糖珠并混合直到均匀。
实施例7：组合的扩散和酶层混合物D
| 材料 | 浓度 |
| 聚氨基甲酸酯138-03型聚合物Tyndale Plains-Hunter Ltd.，17K Princess Road，Lawerenceville，NJ 08551 | 1.95g |
| 聚氨基甲酸酯D4型批号聚合物Tyndale Plains-Hunter Ltd.，17K Princess Road，Lawerenceville，NJ 08551 | 0.35g |
| 炭黑(cat.1810)Degussa Corp./William B.Tabler Co.，Ormsby PlaceIndustrial Park，1331S.15th St.，Louisville，KY 40210 | 0.3g |
| 无水乙醇(200标准强度)Aldrich Chemical Co.，Inc.，1001West Saint Paul Ave.，Milwaukee，WI 53233 | 7.4g |
| 偶联到CarboLink偶联凝胶的葡糖氧化酶 | 5g |
向138-03型聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。接着向该溶液中加入聚氨基甲酸酯D4型并混合直到溶解。向该溶液中加入炭黑并混合24小时。向该溶液中加入葡糖氧化酶-琼脂糖珠并混合直到均匀。
实施例8：组合的扩散和酶层混合物E
表2
| 材料 | 浓度 |
| 聚氨基甲酸酯138-03型聚合物Tyndale Plains-Hunter Ltd.，17K Princess Road，Lawerenceville，NJ 08551 | 1.875g |
| 聚氨基甲酸酯D4型聚合物Tyndale Plains-Hunter Ltd.，17K Princess Road，Lawerenceville，NJ 08551 | 0.375g |
| 炭黑(cat.1810)Degussa Corp./William B.Tabler Co.，Ormsby PlaceIndustrial Park，1331S.15th St.，Louisville，KY 40210 | 0.3g |
| 无水乙醇(200标准强度)Aldrich Chemical Co.，Inc.，1001West Saint Paul Ave.，Milwaukee，WI 53233 | 7.45g |
| 偶联到CarboLink偶联凝胶的葡糖氧化酶 | 5g |
向138-03型聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。接着向该溶液中加入聚氨基甲酸酯D4型并混合直到溶解。向该溶液中加入炭黑并混合24小时。向该溶液中加入葡糖氧化酶-琼脂糖珠并混合直到均匀。
实施例9：氧敏感层的构建
将含有氧敏感的荧光染料(实施例2)的硅氧烷粘合剂刮涂(刀高设置120um)在126um Melinex 505聚酯基质顶上。将氧敏感层干燥到33um的厚度。
实施例10：组合的扩散和酶层的构建
为了构建组合的扩散和酶层，将混合物A、B、C、D和E分别刮涂(刀高设置120μm)在干燥的氧敏感层(实施例9)上面。1小时后，组合的扩散和酶层具有38μm的厚度。
实施例11
制备、切割和测量传感器盘的一般方法由Trettnak等人在Analyst，113(1988)1519-1523(“Optical sensors”)；Moreno-Bondi等人在Anal.Chem.，62(1990)2377-2380(“Oxygen optode for use ina fiber-optic glucose biosensor”)；M.J.P.Leiner和P.Hartmann在Sensors and Actuators B，11(1993)281-289(“Theory and practice inoptical pH sensing”)中描述。
从各薄片(实施例10)冲压出本发明的传感器盘并用于加热到37℃的气密的流通室，其包含透明壁、通道和用于导入气体和溶液的进口和出口(未图解)。
用附图1-6可以看出实验结果。
图1显示了根据本发明的一般实施方案的光学测量系统的图解。R表示作为光源的蓝色LED，S是作为检测器的光电二极管，A和B是滤光器，分别用于检测激发和发射波长，镜片排列用于将激发光传导到染料层L和将发射光传导到光测器S以及用于电信号加工的装置(未图解)。在激发端，使用干涉滤光器A(480nm的峰值传导)，并在发射端使用520nm截止滤光器B。E表示酶层，其包含携带酶的颗粒P和D(炭黑)。L表示染料层，O是氧敏感染料，且T是光可透射的支持体。
图2显示了技术现状葡萄糖传感器的氧恢复时间。将含水样品导入含有技术现状光学葡萄糖传感器的测量室中，该测量室使用附着到酶层顶部上的RoTrac-毛细管孔膜控制葡萄糖和氧向传感器的扩散。酶层由含有亲水葡萄糖珠的亲水聚合物与固定化的酶(葡糖氧化酶)组成。测量前，酶层用水活化(水合)并用含有100mmHg O2分压的气体平衡(未显示)。将含有200mg/dl葡萄糖的样品导入小室中并测量荧光60秒。酶层中的葡糖氧化酶将样品的葡萄糖转化为葡糖酸内酯，从而消耗作为共底物的氧。O2的消耗导致耗尽相邻染料层中的氧。染料层中存在的O2敏感发光染料以增强的发光强度响应。然后用pH7.4的缓冲液洗涤葡萄糖传感器2分钟以除去未消耗的葡萄糖。然后将含有90mmHg氧的气体泵过小室并且发光强度恢复到最初强度水平(对应于100mmHg O2)。图2显示了相对于时间(秒)的测量的发光强度。氧恢复时间大于4分钟。
图3显示了根据本发明的葡萄糖传感器的发光强度对比氧恢复时间(秒)。根据实施例9和10，使用组合的扩散和酶层混合物A制备传感器。基线1表示根据最初O2含量的发光。
然后将含有200mg/dL葡萄糖的样品导入本发明的葡萄糖传感器中。测量发光强度60秒并根据线2增加；传感器中的酶(葡糖氧化酶)将样品中所含的葡萄糖转变为葡糖酸内酯，消耗氧，并从而耗尽传感器中的氧储库，从而导致发光强度增加。
然后，将葡萄糖传感器用pH7.4的缓冲液洗涤2分钟以除去未消耗的葡萄糖。向传感器泵过100托氧并进行监控直到氧荧光强度恢复到与最初相同的荧光强度(线1’)。重复该程序两次以观察氧恢复一致性(线2’；1”和2”)。本发明葡萄糖传感器显示出小于120秒的洗涤时间的氧恢复时间。
图4显示了使用根据本发明的葡萄糖传感器，对于30到400mg/dL葡萄糖的含水样品，根据图3的传感器的动力学发光强度反应曲线。
图5是从用与图3和4中相同类型的传感器得到的测量的发光强度计算的全血中计算葡萄糖浓度与使用Yellow Springs电化学葡萄糖仪器通过电化学参比方法得到的葡萄糖浓度的比较。该图显示了参比仪器和根据本发明的葡萄糖传感器之间的良好一致(R2＝0.9949)。
图6是使用分别含有30、70、150、300和400mg/dl葡萄糖的全血重量分析葡萄糖标准，从根据本发明的传感器(组合的扩散和酶层混合物B(干燥状态中3.9％w/wD4)、C(干燥状态中4.2％w/wD4)、D(干燥状态中4.6％w/wD4)、E(干燥状态中5.0％w/wD4))确定的计算斜率的比较。表1显示了聚合物混合物A到E的水含量和水吸收值。最后一行显示了高亲水聚氨基甲酸酯D4型(＞50水吸收)的各自的值。
表10
| 聚合物混合物 | 聚合物PU 138-03[gramm] | 聚合物D4[gramm] | 水含量PU[gramm] | 水含量D4[gramm] | 水含量[重量％] | 水吸收[％重量] |
| 混合物A混合物B混合物C混合物D混合物E | 32.12.0251.951.875 | 00.30.3250.350.375 | 0.0820.0570.0550.0530.051 | 0.0000.3100.3360.3620.388 | 2.6513.2814.2715.2916.32 | 2.7215.3116.6518.0519.50 |
| 纯聚合物D4 | 0 | 1 | 0.000 | 1.034 | 50.84 | 103.42 |
考虑到表1，如从图6可以看出的，聚合物混合物中高水吸收聚合物(D4)的比例越高(即，形成聚合物的组合的扩散和酶层的水吸收能力越高，且从而该层的水含量越高)，在其他方面基本相同的条件(聚合物和颗粒的总量)下斜率越高。水吸收能力的进一步增加将产生甚至更高的斜率。关于给定的选择的时间窗口(样品接触后7-13秒)，对于允许的最大斜率存在限制。
为了确定斜率，在传感器与样品接触前，测量用90mmHg平衡的传感器的发光强度Ical。然后，导入样品并记录在样品接触后在t1＝7、t2＝9、t3＝11、t4＝13秒时的四种强度I1、I2、I3、I4。为了解释染料加载(传感器与传感器之间)的变化，将4种强度每种除以Ical以得到强度I1c、I2c、I3c、I4c。使用数据对(t1I1；t2I2；t3I3；t4I4)，根据等式y＝a+bx进行线性回归，其中b表示斜率。
注意到术语像“优选地”、“通常”和“一般地”不在本文中用于限制所要求保护的本发明的范围或者暗示某些特征对于所要求保护的本发明的结构或功能是关键的、必须的、或甚至重要的。相反，这些术语仅仅意在强调可以用于或不用于本发明的具体实施方案的备选或者额外的特征。
对于描述和定义本发明的目的，注意到术语“基本上”在本文中用于代表内在的不确定性程度，其可以归因于任何定量比较、值、测量或者其他代表。术语“基本上”也在本文中用于代表定量代表可以从所述的参比改变的程度，而不导致所讨论的主题的基本功能的改变。
已经详细地并参考本发明的具体实施方案描述了本发明，将明白可以在不背离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下做出修饰或者改变。更具体地，尽管本发明的的一些方面在本文中鉴定为优选的或者尤其有利的，但是预期本发明不一定受到本发明的这些优选方面的限制。
Claims (20)
1.组合的扩散和酶层，其包含：
至少一种聚合物材料，和
携带酶的颗粒，其中所述颗粒分散在所述至少一种聚合物材料中。
2.权利要求1的扩散和酶层，其中所述颗粒是亲水的。
3.权利要求1的扩散和酶层，其还包含用于光学隔离的颗粒，其中所述用于光学隔离的颗粒分散在所述至少一种聚合物材料中。
4.权利要求1的扩散和酶层，其中所述扩散和酶层具有约1到约100μm的厚度。
5.权利要求1的扩散和酶层，其中所述扩散和酶层具有约1到约50μm的厚度。
6.权利要求1的扩散和酶层，其中所述扩散和酶层具有约1到约20μm的厚度。
7.权利要求1的扩散和酶层，其中所述聚合物包含亲水的以及疏水的聚合物链序列。
8.权利要求1的扩散和酶层，其中所述聚合物是非交联的和非水溶性聚合物。
9.权利要求1的扩散和酶层，其中所述聚合物是低水吸收聚合物，优选低水吸收聚醚-聚氨基甲酸酯共聚物。
10.权利要求9的扩散和酶层，其还包含高水吸收聚合物，优选高水吸收聚醚-聚氨基甲酸酯共聚物。
11.基于酶的传感器，其包含根据权利要求1的扩散和酶层。
12.权利要求11的基于酶的传感器，其包含至少一个染料层。
13.权利要求11的基于酶的传感器，其中所述根据权利要求1的扩散和酶层是覆盖层。
14.权利要求11的基于酶的传感器，其中所述传感器是电化学传感器或者光学传感器。
15.根据权利要求11的基于酶的传感器用于检测和/或定性和/或定量测定酶底物和/或共底物的用途。
16.根据权利要求15的用途，其中所述酶底物是葡萄糖。
17.根据权利要求15的用途，其中所述测定在血液中进行。
18.根据权利要求15的用途，其中进行多次测量。
19.制备用于基于酶的传感器的组合的扩散和酶层的方法，其包括：
(i)形成包含至少一种聚合物材料和携带酶的颗粒的分散体；
(ii)直接在下面的层上应用所述分散体以形成携带酶的扩散层；和
(iii)干燥所述分散体。
20.权利要求19的方法，其中所述干燥包括从分散体除去溶剂。
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