JPH02279613A - 殺虫剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）　発明の目的 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：以下ＢＴＩ！Ｉ
とイ５）の産生する結晶毒素を有効成分とする鱗翅目昆
虫等に対して有効な殺虫剤（以下ＢＴ農薬という）を製
造する方法に関するもので、農薬業界及び実業の分野で
広く利用されるものである。

〔従来の技術〕

Ｂ　Ｔ園の産生ずる結晶毒素は、鱗翅目、双翅目、鞘翅
目等の昆虫に対して強力な殺虫作用を示し、しかも、人
畜魚介類に対して、無害であることから、バイオ良薬と
して実用化されている。

一般に、ＢＴ農薬は結晶毒素の他に、自己再生のための
生命体である胞子（芽胞とも苫５）を含んでおり、自然
界において、そのままの状態で散布されると、胞子が発
芽し、ＢＴ醒の増殖が生じ、蚕に薬害を与える恐れがあ
り１国内の養蚕業保護の立場から、胞子の二次増殖のな
いＢＴ農薬が求められている。

このｆｉ題を解決するため罠、結晶毒素を含有するＢＴ
菌の培養液内の細菌細胞・芽胞に対して、該結晶毒素の
殺虫能を喪失せしめることなく、細菌細胞・芽胞を殺滅
し得る緩徐な化学的殺菌処理と同じく緩徐な物理的殺菌
処理とを組合せ、それらを同時に行なうことを特徴とす
る殺虫剤の製造法が提案されている（特公昭５１−５０
４７号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の方法は、細菌細胞・芽胞の殺滅方法としては優れ
ているものであシ、実用化されている方法であるが、該
方法で得られた結晶毒素はその実用的な濃度（ＢＴ農薬
は一般にコナガに対して１．　ＯＯＯ乃至２，０００倍
の製剤水懸濁液として用いられる）における残存殺虫活
性が製造毎に異なり、場合によってはかなりの高濃度で
使用しなければ充分な殺虫活性を示さないものが得られ
ることがあり、一定の薬効を示す製品を定常的に得るこ
とが困難な方法であった。

本発明者等は、上記の問題点を追求し、それを解消し１
品質の一定した製品が得られる製造方法を確立すべく鋭
意検討を行なった。

（ロ）発明の構成 〔課題を解決するための手段〕 本発、明者等は、前記問題点を解消するための検討Ｓ程
において、殺菌処理を施す培養液の培養期間に応じて、
殺菌処理後の残存殺虫活性が変化することを見出し、殺
菌処理する培養液の培養期間を特定の範囲内、すなわち
該微生物の培養過程において、芽胞の９０係が細胞外に
放出されてから２４時間以内の培養期間内に制御するこ
とによって、実用に供し得る殺虫剤を製造するに足る残
存殺虫活性を有する結晶毒素が一定して得られるのみな
らず、残存殺虫活性の飛躍的に向上した結晶毒素が得ら
れることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ＢＴ菌の培養液の殺菌を、芽胞の
９０９６が放出された後であって、かつ該放出後２４時
間以内に実施することを特徴とする殺虫剤の製造方法に
関するものである。

ＯＢＴ菌の培養液 本発明に用いられる培養液としては、結晶毒素を産生ず
るＢＴ菌株を１通常公知の培養方法及び条件で培養して
得られる一般的な培養液があげられる。

例えば、肉エキス、ペプトンなどよりなる培地を用い、
ＢＴＭを通常の方法及び条件で培養し、芽胞及び結晶毒
素が形成され、所定の培養期間内にある培養終了液、或
いは該培養液を部分精製または精製して得られた結晶毒
素と芽胞を含有する水懸濁液等が使用される。

培養について、さらに具体的に説明すると。

窒素源、炭素源、ミネラルおよびビタミンに富む天然培
地で培養する。結晶毒素ならびに菌体の産生け１通気攪
拌条件に大きく左右され、充分な好気的条件で培養した
場合に１両者の産生量が増す。培養温度は、約２５〜３
０℃がよい。炭素源としては、例えば、コーンスチープ
リカー、鷺酸アンモニウム、塩化アンモニウム、綿実粉
、酵母エキス、大豆粉、カゼイン氷解物などが挙げられ
る。また、ミネラルおよびビタミンは、楯密、コーンス
チープリカー、Ｓ母エキスで代用することができ、必要
に応じては、無機塩類、ビタミン類をさらに添加しても
よい。％に、大量生産を行う場合、深部通気攪拌培養が
望ましい。

０　培養期間の設定 芽胞が細胞外に放出され始めてから、芽胞の９０慢が細
胞外に放出されるまでの経過は。

無菌的に経時採取した培養液を位相差光学顕微鏡を用い
て鏡検することにより、容易に追跡できる。芽胞の放出
は、細胞内に形成された結晶毒素と芽胞が、培養の進行
に拌ってＢＴ＠細胞壁が自己消化した結果、細胞外にそ
れらが放出され、培養液中にて浮遊した状態りう。

芽胞は短軸１〜５μ×長軸５〜１０μの楕円状物体で、
光屈折性を有するため、位相差光学顕微鏡の視野内では
、青白い光を放つことから、他の顆粒と識別できる。ま
た、公知の染色法によっても、結晶毒素と芽胞は区別で
きる（　Ｆａｄｅ１人、５ｈａｒｉｆ　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｊ、　　ＩｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３．２２７〜
２２９　（１９８Ｂ　）　）。

さらに、芽胞の９０％が細胞外に放出されたことは、蹟
微鏡視野内の全菌数（結晶毒素・芽胞を内在する細胞と
遊離芽胞の総数）に対する遊離芽胞の割合が当該範囲に
あることで確認できる。なお、培養条件によって、ある
程度の差はあるものの、芽胞が細胞外に放出され始めて
から、上記の状態に達するまで８〜２４時間を必要とす
る。本発明においては、この様圧して芽胞の９０優が細
胞外に放出された培養液に対して２４時間以内に殺菌処
理を施こすのである。

上記範囲外で殺菌処理を行なうと、結晶毒素の殺虫活性
が損なわれ、実用的濃度で有効な殺虫剤を定常的に製造
することが不可能となり、また残存殺虫活性が飛躍的に
は向上しない。

０殺菌 本発明における殺菌は、細菌細胞・芽胞を殺滅するため
に行われるものであって、下記のような化学的殺菌処理
及び物理的殺菌処理方法があり、前掲の特公昭５１−５
０４７号公報に開示されているように、単に一種類の殺
菌処理のみでは、結晶毒素の殺虫能力を保持させながら
、細菌細胞・芽胞を完全に死滅させることは困難である
から、本発明においても緩徐な化学的殺菌処理と物理的
殺菌処理とを組合わせて、それらを同時に行うことが好
ましく、その方法により、容易に細菌細胞・芽胞を完全
に死滅させることができ、殺虫能の優れた産業上極めて
有用な殺虫剤を得ることができる。

Ｏ化学的殺菌処理 化学的殺菌処理方法は、ホルマリン、パラトルエンスル
ホンクロルアミドナトリウム、パラトルエンスルホン酸
ジクロアミド、アゾビスクロロホルムアミジン、アクリ
フラビン、メチレンブルー、塩化ベンザルコニウム、塩
化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムなどの薬剤
を上述の培養液等に適量加え殺菌する方法である。

０　物理的殺菌処理 物理的殺菌処理方法は、加熱、超音波、放射線などによ
り、上述の培養液等を殺菌する方法である。

０　殺虫活性の測定法 結晶毒素の殺虫活性を定量的に把損する方法としては、
コナガを用いた殺虫試験により半数致死濃度を求め、残
存殺虫活性を定量的に測定するという方法を採用した。

すなわち、適当に希釈した試料液夫々に対する検定供試
昆虫の死亡率を測定し、試料液の濃度と死亡率との関係
から半数致死濃度を求め殺虫活性の高低を比較する方法
である。

〔作用〕

殺菌処理を施すＢＴの培養液を、その培養期間が芽胞の
９０％が細胞から放出されてから、２４時間以内のもの
とすることが、なぜ結晶毒素の殺虫活性を維持すること
に有効であるのか、その具体的な機構は不明であるが、
本発明によれば殺菌処理後の殺虫活性を飛躍的に高める
ことができるのである。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例中に於ける芽胞の放出率測定、生残細胞・芽胞数
測定及び残存殺虫活性測定は以下の方法に準じて行なわ
れた。

芽胞の放出率測定： 培養の種々の過栓で培養液を適宜、無菌採取し、位相差
光学顕微鏡（倍率１５００倍、油浸法）下で培誉状況を
観察する。培養液−試料あたり、任意に視野を５箇所選
び、芽胞の放出率を伽々に求め５その平均値をもって、
各培養過程における芽胞の放出率とした。

なお、芽胞の放出率は、視野に存在する全芽胞数（結晶
毒素ならびに芽胞を自己体内に含む細胞と培養液中に遊
離する芽胞の総数）に対する遊離芽胞数の割合（％）で
表示することとする。

生残細胞・芽胞数測定： 試料液１−を採り、無菌水にて適宜希釈し、肉エキス・
ペプトン寒天平板上に流し、３０℃にて４８時間培養し
、発生する集落を数えて、これより試料中の生残細胞・
芽胞数（ケ／、ｗｊ）を計算する。

残存殺虫活性測定： 試料液を適当に水で希釈した一連の５乃至６濃度段階の
被検定液を作製し、この一連の被検定液５０酎に２００
−のキャベツ生葉を１分間浸漬する。キャベツ生葉風乾
後、これを大型シャーレに敷き各区３０頭のコナガ６令
幼虫を放飼し、７２時間後に死虫数を数え、死亡率（＠
を算出する。この結果をフィニー（Ｆｉｎｎｅｙ　）の
図解法（Ｆｉｎｎｅｙ、Ｄ、Ｊ　、ｕ９４７）ｐｒｏｂ
ｉｔ　Ａｊｌａｌｙｓｉｓ　、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　
［Ｊｎｉｖ、Ｐｒｅｓｓ。

（：：ａｍｂｒｉｄｇｅ、ｐｐ３１　Ｂ　）　Ｋより解
析し、半数致死濃度（被検定液中の試料液の濃度；　ｐ
ｐｍ）を求める。

培養例 肉エキス１チ、ペプトン１１％、ＮａｃｔＯ，５％。

ｐ）１７．０の培養原料液１００−を５００１容坂ロフ
ラスコに入れ、１１０℃にて１０分間加熱殺菌し、これ
にバチルス・チューリンゲンシス・バラエティ・クルス
タキ）ＩＤ−１菌株’Ｅ−肉エキス・ペプトン寒天斜面
に３０℃。

２４時間靜置場養した種菌を接種し、５０℃にて振盪培
養を行った。

表１に培養時間と芽胞の放出率の関係を示す。

視野によりて芽胞の放出率に若干のばらつきが認められ
るものの、培養４８時間目には、芽胞の放出率は９０％
以上となった。なお、培養に用いる培地の種類ならびに
培養条件（フラスコ培養：培地仕込量と振盪速度、ジャ
ー培養：培地仕込量９通気量と攪拌速度）によって培養
の進行状態に差異は生ずるが。

当該方法に基づいて、培養時間と芽胞の放出率の関係が
容易に得られる。

実施例１（ホルマリン及び加熱による殺菌処理）培養例
に示した各培養時間毎に、培養液を採取する。つぎに、
それらの固形分を測定（培養液の遠心ｉ　４，００　Ｏ
ｒｐｍ、　４℃、１０分）残渣を１００℃で恒量となる
まで乾燥し、その重量百分率で算出し、適当な濃度のＨ
２ＳＯ４或はＮａＯＨ溶液及び無菌水を用いて、それら
の培養液固形分を単位重量中に同量含み、かつｐＨが５
．５となるように調製する。上記の培養液を５ｙｘｌず
つ試験管に分注し、これに２優のホルマリン水溶液５−
を夫々加えて、混合液中のホルマリン濃度を１俤となる
ようにし、これを７０℃に１０分間加熱した後、室温に
冷却し、１４．００　Ｏｒｐｍにおいて１０分間遠心分
離操作に付し、上清液を捨てて沈降物に５ｘＪの無菌水
を加えて懸濁する操作を２回繰り返し、ホルマリン及び
菌体外可溶性毒素物質を除去した。

このようにして得られた夫々の試料液の生残細胞・芽胞
数（ケ／−）と残存殺虫活性を測定した結果を表２に示
す。この結果より、殺菌処理を施す培養液を、その培養
時間が芽胞の９０慢が放出された後、２４時間以内のも
のに設定することで高い残存殺虫活性が得られることが
わかる。

実施例２（パラトルエンスルホンクロルアミドナトリウ
ム及び加熱による殺菌処理） 実施例１の方法に準じてｖｊ４製された培養液を、５ｘ
Ｊずつ試験管に分注し、混合液中のパラトルエンスルホ
ンクロルアミドナトリウムの濃度が０．１係となるよう
に、夫々の化合物を添加混合し、６０℃に１０分間加熱
した後、直ちに冷却した。この試料液から実施例１の方
法により、パラトルエンスルホンクロルアミドナトリウ
ム及び菌体外可溶性毒素物質を除去した。

このようにして得られた夫々の試料液の生残細胞・芽胞
数（ケ／−）と残存殺虫活性を測定１゜た結果を表２に
示す。この結果より、殺菌処理を施す培養液を、その培
養時間が芽胞の９０％が放出された後、２４時間以内の
ものに設定することで高い残存殺虫活性が得られること
がわかる。

実施例３（実施例２の培養条件を変えたもの）バチルス
・チューリンゲンシス・バラエティ・クルスタキＨＤ−
１を、坂ロフラスコ中のＣ培地（グルコース１チ、コー
ンメチ−プリカー１チ、Ｍｎ　１　ｐｌ）ｍ　：　ｐＨ
７，０）　５０ｍに接種し、５０℃、１０時間振盪培養
する。同培養液１２０ｄを種菌とし、予め１２ｔの２Ｘ
Ｃ培地（Ｃ培地の２倍濃度＝１２０℃、１ａｔｍ、　１
５分滅菌）を仕込んでおいたジャーファーメンタ−（全
容量２０ｔ）Ｋ接種し、ｐＨを７．０に調整、維持しつ
つ、３０℃で通気攪拌培養（回転数ｓｏｏｒｐｍ、通気
量Ｑ、　５　ｖｖｍ）を行う。培養過程において、培養
液を経時採取し、ｐＨ調整、殺菌処理及びパ９）ルエン
スルホンクロルアミドナトリウムと菌体外可溶性毒素物
質の除去を行った。

このようにして得られた夫々の試料液の芽胞の放出率（
憾）、生残細胞・芽胞数（ケ／ｄ）と残存殺虫活性を測
定した結果を表６に示す。この結果より、殺菌処理を施
す培養液を、その培養時間が芽胞の９０係が放出された
後、２４時間以内のものに設定することで高い残存殺虫
活性が得られることがわかる。

（ハ）発明の効果 本発明方法は、ＢＴ菌の結晶毒素を含む培養液の細菌細
胞及び芽胞を高い殺虫活性を維持したまま完全に殺滅す
ることができ、安全でより高い薬効のＢＴ農薬を、安定
に製造することが可能となるという潰れた効果を奏する
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の培養液の殺菌を芽胞の
   ９０％が放出された後であって、かつ該放出後２４時間
   以内に実施することを特徴とする殺虫剤の製造方法。