JPH10506288A

JPH10506288A - 植物の病気の生物学的防除のための真菌Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ

Info

Publication number: JPH10506288A
Application number: JP8511426A
Authority: JP
Inventors: タピオタホネン，リスト; ヘレナアビカイネン，ハンナ; ツーリッキイケスキネン，ミリア; ラーデンペレ，マリア−レーナ; タパーニセイスカリ，ペッカ; ペトリテペリ，エサ; アニタツオミネン，ウーラ
Original assignee: ケミラ、アグロ、オサケ、ユキチュア
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 1998-06-23
Also published as: EP0792348B1; FI101631B; CA2201336A1; FI101631B1; WO1996010626A1; AU3610295A; FI944557A0; ATE283347T1; ES2230550T3; US5968504A; EP0792348A1; NZ293626A; DE69533807T2; DE69533807D1; FI944557A; CA2201336C

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物の病気の生物学的防除に関し、新規な真菌Gliocladium catenulatum、および植物の真菌感染症を防除するためのそれらの使用に関する。本発明は、新規な株のGliocladium catenulatumを含んでなる組成物および上記目的に対するそれらの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】植物の病気の生物学的防除のための真菌Gliocladium catenulatum 発明の分野本発明は、植物の病気の生物学的防除に関し、具体的にはGliocladium属に属する新規な微生物並びに植物の真菌感染症を制御する目的でのそれらの使用に関する。本発明は、新規なGliocladium株を含んでなる組成物および上記目的へのそれらの使用にも関する。発明の背景栽培作物(crops)は、様々な真菌、細菌およびウイルス性疾患並びに多数の昆虫の有害生物によって影響を受ける。多くの栽培技術的、化学的および生物学的防除法がこれらを防除する目的で開発されてきた。このような方法の目的は、植物の病気や他の有害生物によって引き起こされる定性的および定量的収穫量の損失を防止することである。一般に、植物の病気の生物学的防除とは、植物病原体を、別の生物であって植物の病気の生物学的防除生物と呼ばれるもの、および生物学的防除薬または生物学的有害生物駆除剤（biopesticide）から作られた製剤によって駆除することを意味する。植物の病気の生物学的防除の機構は様々であり、その効果は多くの異なった機構の協同作用に基づくものであることが多い。防除効果は、生物によって産生される抑制的化学物質に基づくことがあり、時には防除生物が病原体に寄生し、または成長空間および／または利用可能な栄養物について病原体と競合する。従来の化学的有害生物駆除薬の多くが環境やヒトに有害であることが明らかになったことにより、新規な生物学的防除薬を見出すことの必要性が増してきている。化学的薬剤の欠点は、多くの有害生物が有害生物駆除薬（pesticides）の一つまたは多くに耐性を得てしまったという点でもある。その代わり生物学的有害生物駆除薬に対する耐性は、発生するとは考えられないのであり、それはその効果は異なるタイプの多数の機構に基づいているからである。化学的薬剤は、通常は生物学的有害生物駆除薬より速やかにかつ効果的に作用する。生物学的有害生物駆除薬の作用は成長可能でありかつ繁殖可能な微生物に基づいているので、生物学的有害生物駆除薬としては化学的薬剤よりも長期作用性であることが多い。生物学的有害生物駆除薬の最も重要な群は、昆虫を標的とした細菌生成物である。細菌Bacillus thuringiensisを基剤とした生物学的殺虫薬が、最も普通に用いられることがある。土壌性および種子性の植物の真菌性疾病の多くに有効である放線菌のStreptomycesを基剤とする生物学的殺真菌薬が、フィンランド国で製造されている。Trichoderma属の真菌も、殺真菌作用を有する。 Pseudomonas属、特にPseudomonas fluorescens種の細菌が数多く研究されており、今日では殺真菌作用を有する多数のP．fluorescens株が知られている。例えば、公表された特許出願であるＷＯ９２／１８６１３号明細書、ＦＩ９２１７２２号明細書およびＷＯ９０／０１３２７号明細書、並びにＥＰ特許第２２８４５７号明細書を参照されたい。 Gliocladium属の真菌は殺真菌作用を有することが知られている。Gliocladium virens株、特にG．virens株G1-3は、特許文献に記載されている。しかしながら、この種の使用に当たっての問題点は、この真菌の処方物であって、この処方物の保存中にこの真菌の成長力が満足な水準で維持されるものを作製することができた者がいないことである。米国特許第４，６６８，５１２号、第４，７２４，１４７号および第４，８１８，５３０号明細書には、他の真菌株に加えてGliocl adium virens株を使用することが生物学的殺真菌薬処方物の製造において記載されている。また、米国特許第５，１６５，９２８号、第５，１９４，２５８号、および第５，２６８，１７３号明細書には、Gliocladium virens株の生物学的殺真菌薬としての使用が記載されている。発明の要約本発明は、多数の有害な真菌に対して極めて活性であることを見出した真菌株Gliocladium catenulatum に関する。本発明は、適当な処方物（formulation）として、活性成分として本発明によるGliocladium catenulatum種に属する真菌株、および所望により当該技術分野で通常の添加物または担体を含んでなる、微生物株により調製される生物学的殺真菌組成物にも関する。このような処方物の例は、種子粉衣(seed dressing)に好適な組成物、植物の成長基剤（growth substrates）上に広げる粉末状または顆粒状組成物、または土壌を処理するための液体処方物である。発明の詳細な説明以下において、本発明の真菌株（fungal strains）、並びにそれらの単離および特性決定について詳細に説明する。また、これらの菌株で処方した生物学的殺真菌組成物の処方物およびその特徴、および単離した真菌株およびそれらから製造した組成物を用いる有効性試験についても説明する。微生物の単離本発明の真菌株を単離した土壌試料を、１９８９年から１９９１年までにフィンランドの各地、主としてＭＴＴ（農業研究センター）の研究施設、ベイト植物（bait plant）として大麦および小麦を用いて様々な土壌の種類および様々な作物の輪作から集収した。試料は、根層（深さ０〜１５ｃｍ）から採取した。幾つかの二次試料をそれぞれの農地(field)から採取して、これを１〜２リットルの試料にプールした。単離は、希釈法（土壌単離）またはベイト植物法（根単離）によって行ったが、これらの方法の手順は、下記の方法の節で詳細に説明する。微生物の特性決定土壌試料から単離した真菌株を、フィンランド特許出願ＦＩ第９４０４６３号明細書に記載のスクリーニング法で試験した。その結果、５種類の菌株が極めて良好な結果を与えることが判った。Gliocladium catenulatum J1446、Gliocla dium catenulatum M67-6、Gliocladium catenulatum J2734、Gliocladium caten ulatum M2423およびGliocladium catenulatum M3081と命名した５つの菌株を、ドイツ国のＤＳＭ（ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルテューレン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクター・ハフトゥング(Deutshce Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) ）で特性決定した。これらの菌株を、ブダペスト条約に従って１９９４年５月１９日に、ＤＳＭ寄託機関にそれぞれ受託番号ＤＳＭ９２１２、ＤＳＭ９２１３、ＤＳＭ９２１４、ＤＳＭ９２１５およびＤＳＭ９２１６によって寄託した。これらの微生物の形態学的特徴は、下記の通りである。形態：一次分生子柄はVerticillium様であり、二次分生子柄はPenicillium様である。それらの長さは、５０〜１２５μｍの間で変化する。それらは直接観察するといぼ状に見えるが、液体検鏡板では滑らかに見える。二次分生子柄では、分生子を互いに結合させたままにして、長鎖を形成する（時には１５０μｍにもなる）ことができる。分生子は緑色であり、大きさは４〜７．５×３〜４．５μ ｍである。末端または節間に、直径が７〜１０μｍの透明な厚壁胞子が存在することができる。コロニー習性：プレート上では、コロニーは比較的広汎に広がっている。麦芽エキス寒天上では、コロニーは２０℃の温度では１０日間で直径が２．５〜３．５ｃｍの大きさに成長する。コロニーは他の点ではG ．roseumのコロニーに類似しているが、分生子部分は７〜１０日経つと緑色（淡青色〜オリーブ色）に変化する。古い培養物では、分生子部分は暗緑色である。培養物の裏面は、無色または黄色味を帯びている。これらの菌株から、合理的な自己寿命(self-life)を有する処方物、すなわち病気の防除を必要とする農場に容易に広げる（spread）本発明の生物学的殺真菌組成物を製造することができる。処方物は、例えば粉末の形態で製造することができる。微生物の培養は、胞子懸濁物を含み−８０℃に保持されているＰＤＡペレットである接種物から出発することができる。この微生物を、液体培養物としてまたは固形支持体上で培養することができる。栄養培地は、糖、例えばスクロース、および窒素並びに少量の他の栄養物を含んでなる。培養に適する栄養培地は、例えばＧＹＭ（グルコース４ｇ／ｌ、酵母エキス４ｇ／ｌ、麦芽エキス１０ｇ／ｌ）、またはＰＤＢ（ジャガイモ−デキストロース−ブロス）である。培養は、１週間より少し短い期間から１週間を十分に越えた期間まで行う。これにより、真菌（fungus）は胞子を形成する。細胞集団（cell mass）を、濾紙で濾過することによってまたは遠心分離によってブロスから分離することができる。液体培養を用いている場合には、スクロース、乳粉末、カオリン、澱粉、リグニンおよび／またはＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）のような担体を細胞集団に混合する。この集団を室温で乾燥して、粉砕して粉末とする。方法微生物の単離 a) 希釈法（土壌分離）土壌１０ｇを０．５％水寒天(Bactoagar)１００ｍｌと混合した。１０^-1および１０^-2倍希釈物を、混合物から０．５％水寒天中へ、３回複製(replications) として作成した。希釈物を、振盪機で２０〜３０分間（水浴中で）振盪した。希釈物１ｍｌを空のペトリ皿に採取して、Littman Oxgall Agar(LOA)２０ｍｌを注いで加えた。皿を室温で３〜７日間インキュベーションした。成長した真菌コロニーを、純粋なものとしてＰＤＡプレート（ジャガイモ・デキストロース・寒天）に単離した。 b) ベイト植物法（根分離）土壌試料を連続ポットプレート(Vefi-VP 96連続ポットプレート)のウェルに、１５ウェル／土壌試料（ウェル４０×４０×６０ｍｍ）ずつ入れた。小麦、大麦および菜種（turnip rape)を、ウェルに５ウェル／種ずつ播種した。小麦の種子４粒、大麦の種子４粒、および菜種の種子１０〜２０粒をウェル当たりに播種した。種子を砂で覆った。種子および土壌表面に、全体で１０ｍｌ／ポット灌水した。１５℃の温度で培養。２週間培養した後、植物を採取し、流水で洗浄しまたは水を付けずに刷毛できれいにした。根から小さな切片を切り取り、それをプレート上に置いた。使用培地：ＬＯＡ（１０ｇペプトン、１０ｇデキストロース、１５ｇのBacto-Oxgall、０．０１ｇのクリスタルバイオレット、０．０３ｇストレプトマイシン、２０ｇ寒天、水１０００ｍｌ添加）、ＰＣＮＢ（１５ｇペプトン、１ｇＫＨ₂ＰＯ₄、０．５ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２ｇのAvicol、３ｐｐｍストレプトマイシン、２０ｇ寒天、水１０００ｍｌ添加）、およびＰＤＡ−ストレプトマイシン（３９ｇＰＤＡ製剤、３００ｐｐｍストレプトマイシン、水１０００ｍｌ添加）。数日インキュベーションした後、真菌をＰＤＡプレートに移した。菌株は、コルクドリルでペレットをＰＤＡプレートから採取して、これらのペレットを−８０℃でアンプル（Nalgene 5000-0012，PP Sterile 1.2ml）中で凍結することによって保存した。菌株の選択に用いたスクリーニング法に含まれる温室試験は、フィンランド国特許出願第９４０４６３号明細書に記載の通りに行ったが、これらの試験は後で簡単に説明する。砂試験穀物の種子を砂層に播種する。最初に病原体の菌糸体および胞子、次に試験真菌の胞子を、水懸濁液に採取して種子および成長基剤に加えた後、種子を砂で覆う。２．５週間の後、萌芽の疾患症状の強度を検査する（尺度０〜５）。更に実験を行い、病気の強度に影響を与えないまたはそれ自身病原性である真菌を不合格とする。ピート試験（peat test）穀物の種子を、病原体の胞子懸濁液で湿らせ、乾燥する。この後、種子を試験真菌の胞子懸濁液で湿らせ、乾燥して、播種する。水蒸気処理したピートを成長基剤として用いる。２．５週間培養した後、萌芽の健康状態を観察する。明らかに病気を防止する真菌株について、野外土壌試験を行う。野外土壌試験粉砕して湿らせた畑土を１．５リットルのポットに入れ、３６粒の穀類の種子をそれぞれのポットに播種する。播種の前の種子の処理は、ピート試験と同様に行う。例えば、３個の複製ポット（replicate pots）を試験に用いる。４週間培養した後、萌芽の症状を検査する。これらの試験で良好であった菌株について野外試験を行い、選択した微生物分離物の生物学的有害生物駆除効果を最終的に確認する。真菌株の病原性植物の病気の防除における真菌株Ｊ１４４６の有効性を、総数で８種類の植物種についての多くの試験で試験した。試験の幾つか、特に植物の種子は時に極めて高投与量で処理したけれども、試験のいずれもが植物の発育に対してＪ１４４６の有害な効果を示さなかった。これに基づいて、Ｊ１４４６は植物の発育を妨げないのは明らかである。更にこれを立証するため、新たに一連の試験を行い、３２種類の異なる植物種についてＪ１４４６の有効性を示したが、同じ結果が得られる。本発明の他のGliocladium catenulatum株は、Ｊ１４４６程広汎に試験はしなかった。上記菌株（Ｊ２７３４、Ｍ６７−６、Ｍ２４２３およびＭ３０８１）を用いた有効性試験では、これらが病原性であることは見られなかった。実験例下記の実験では、本発明の利用について例示する。項目(A)では、本発明のGli ocladium catenulatum から作成した処方物の作成を、項目(B)では、カリフラワー、キュウリ、ヒメウイキョウおよび小麦のRhizoctonia-、Pythium-、Alternar ia -またはFusarium感染症に対するＪ１４４６真菌株の、胞子懸濁物としてのまたは別の処方物としての防除効果の結果を、項目(C)では、トマト、カリフラワー、テンサイ、キュウリおよびレタスでの立ち枯れ病真菌(Rhizoctonia、Pythiu m 、Fusarium、PhomopsisおよびAlternaria)に対する真菌株の有効性を、項目(D) では、大麦および小麦での病原体FusariumおよびGaueumarmomyces graminisに対する本発明の真菌株、特に菌株Ｊ１４４６の効果および市販の処方物の効果を、また項目(E)では、これらの菌株による作用様式を説明する。 (A) 真菌株からの処方物の調製Ｊ１４４６真菌株からの粉末処方物は、下記のようにして作成した。 (a) 振盪培養培養は、スクロース４ｇ／ｌ、酵母エキス４ｇ／ｌ、麦芽エキス１０ｇ／ｌ、およびＣＭＣ１０ｇ／ｌを含む栄養培地０．５リットルが入っている１リットル三角フラスコで行った。ｐＨは、オートクレーブで滅菌する前には、調整しなかった。接種物としては、胞子を含む寒天ペレット（ジャガイモ・デキストロース・寒天培地）であって−８０℃に保存したものを用いた。振盪装置の速度は１５０ｒｐｍであり、成長温度は室温（２２〜２６℃）であり、培養時間は３〜７日間であった。細胞を遠心分離（９０００ｒｐｍ、２０分）によって分離した。細胞集団に、下記の材料の１つまたは２つ以上を混合した：スクロース、乳粉末、カオリン、澱粉、リグニンおよびＣＭＣ。処方物１細胞４０％（乾燥物）スクロース２０％カオリン３５％ＣＭＣ（７％水溶液）５％混合物を、換気装置中で開放ペトリ皿で、室温にて４〜７日間乾燥した。層の厚みは１〜２ｃｍであった。乾燥したプレートを粉砕して、粉末とした。処方物の生存力は１０⁷ｃｆｕ／ｇ粉末（ｃｆｕ＝コロニー形成単位）であった。ｃｆｕ（コロニー形成単位）は、微生物の生存力決定に用いられる単位である。希釈した微生物懸濁液を寒天プレート上に塗布して、数日後にコロニー数を計数するのである。希釈倍率が知られていれば、コロニーの量、すなわち元の試料中の微生物細胞の量を計測することができる。処方物２細胞４０％（乾燥物）乳粉末４０％スクロース２０％上記と同様に、乾燥して粉砕する。処方物の生存力は、１０⁷ｃｆｕ／ｇ粉末であった。処方物３細胞４０％（乾燥物）澱粉３５％スクロース２０％ＣＭＣ（７％水溶液）５％上記と同様に、乾燥して粉砕する。処方物の生存力は、１０⁷ｃｆｕ／ｇ粉末であった。処方物４細胞４０％（乾燥物）リグニン３５％スクロース２０％ＣＭＣ（７％水溶液）５％上記と同様に、乾燥して粉砕する。処方物の生存力は、１０⁹ｃｆｕ／ｇ粉末であった。 (b) 発酵槽での培養処方物５培養は、Braun Biostat １０および３０リットルの曝気型発酵槽であって、液体容積がそれぞれ１０リットルおよび２５リットルであるもので行った。栄養培地および条件は、振盪フラスコ培養と同様であった。培養時間は４日間であり、分離および処方、並びに乾燥は、上記のようにして行った。粉砕後の処方物の生存力は、１０⁷〜１０⁸ｃｆｕ／ｇ粉末であった。 (c) 固体培地での培養処方物６菌株Ｊ１４４６は、シリカ担体を含む固体培地で培養した。成長培地は、ジャガイモ−デキストロースブロス（Difco、２４ｇＰＤ培地／１リットル蒸留水）５０ｍｌ、シリカ（Sipernat 22S，Degussa）２０ｇ、およびＣａＣＯ₃(Merck 製)０．２ｇを含んでいた。基剤（substrates）をビーカー中で混合し、１２０ ℃で２０分間オートクレーブ処理を行った。冷却した培地に、ＰＤＡプレートから胞子を滅菌水にこすりとることによって得たＪ１４４６胞子懸濁液４ｍｌを接種した。この培地を無菌的にペトリ皿に移し、真菌が胞子を形成するまで１６℃で１０日間インキュベーションした。この後、培地を、開放ペトリ皿で室温にて２日間乾燥した。乾燥した製剤の生存力は７×１０⁷ｃｆｕ／ｇであった。本発明の他の菌株から、処方物を同様の方法で作成することができる。 (B) 真菌株Ｊ１４４６の防除効果の成績、胞子懸濁液としてのおよび別の処方物としての使用第１〜１２表に、菌株Ｊ１４４６を用いて下記のようにして行った防除効果実験の結果を示す。カリフラワーでの真菌Rhizoctonia solaniの防除：第１表には、２つの異なる温度での真菌株Ｊ１４４６の防除効果を示し、第２表には、Ｊ１４４６製剤（様々な大きさの発酵槽で作成した数バッチ）とプレート培養との効果の差を示し、第３表には、液体発酵製剤の様々な量および使用方式での効果を示す。真菌Pythiumの防除：第４表には、含浸処理(drench treatment)を用いるキュウリに対する様々な製剤の効果を示し、第５表には、液体発酵製剤を用いるときの乾燥および液体粉衣（dressing）のヒメウイキョウに対する防除効果を示し、第６表には、含浸処理を用いるときの防除作用に対する様々な濃度の影響を示す。試験植物はキュウリである。カリフラワーに対する真菌Alternaria brassicicolaの防除：第７および８表には、４種類の異なるｐＨ値での液体粉衣（２種類の異なる濃度）としての真菌株Ｊ１４４６の効果を示し、第９表には、液体ドレッシング（粉衣）を用いるときの様々な製剤の効果を記載している。第１０表にも同様に、液体ドレッシングを用いることによって第９表の試験よりも感染が強い場合の様々な製剤の効果を示す。２種類の異なる成長基剤での小麦に対する真菌Fusarium culmorumの防除：第１１表には、プレート上で培養した真菌株および液体ドレッシングを用いるときの固体相製剤の防除効果。温度１５℃。成長基剤としてピート。第１２表に記載の試験は、使用した成長基剤が砂であるため、F ．culmorumによる人工的な感染の他に畑土由来の天然感染症も見られたこと以外は同様である。 (C) 立ち枯れ病真菌に対する本発明の真菌株の効果疾病および試験植物：Alternaria : 種子由来；カリフラワーRhizoctonia :土壌由来；カリフラワーPythium :土壌由来；テンサイ、レタス、キュウリFusarium : 土壌由来；トマト。希釈率：１プレート／リットルのピート、これにより胞子の量は約１０⁶／ｍｌピートとなる。混合および保存：真菌の菌糸体および胞子を、プレート（３週齢以上）からスライドでかきとり、Ultra Turraxで蒸留水、１００ｍｌ／リットルのピート（１プレート／１００ｍｌ水／１リットルのピート）と混合し、懸濁液をピートと混合して、ピートを室温で試験によって１日、１週間、２週間、または１か月間保存した。ピート：総ての試験において、ピートにドロマイト石灰８００ｇおよび１５０ｇのピートY-lannos／１００リットルのピート(Y-lannos＝フィンランド普遍的肥料の商標)を用いて施肥し、水蒸気処理した。接種ピートは、１ＰＤＡプレートの病原性真菌を水を含む寒天とUltra Turraxを用いて混合し、この懸濁物を水蒸気処理したピート（１ＰＤＡプレートの真菌／１００ｍｌ水／１リットルのピート）と混合することによって製造した。ピートは室温で保存した。汚染ピートを水蒸気処理したピートと１：１９の割合で試験用に混合した後、拮抗薬懸濁物を混合した。実施：カリフラワーおよびテンサイ試験：（Rhizoctonia，Altemaria，Pythium）種子を、０．５リットルのプラスチックポットに２５種子／ポットずつ播種した。５個の複製物を用いた。培養は、約６０００〜８０００ルックスの連続光で１８〜２０℃の温度で行った。分析：実生の出現を、播種から９日後に計数した。試験の終了まで、死亡したものを計数して２日間隔で棄却した。試験は、播種から約３週間後（１８〜２２日）に停止した。ついで、実生の損傷を０〜３の尺度で解析した。０＝健康１＝子葉での立ち枯れ病２＝根および実生の基部が若干罹患３＝実生の基部が著しく罹患、死亡実生。これらの結果から、健康な実生の量を播種した種子の百分率として計数した（従って、未発生種子も考慮にいれた）。実生の乾燥重量も秤量した（１０５℃１７時間）。ドレッシング試験：カリフラワーの種子を３種類の拮抗薬濃度でドレッシングした：１プレートの真菌／２５ｍｌの水（１０⁰、但しｃｆｕ１０⁷）、およびこの１０^-1（ｃｆｕ１０⁶）および１０^-2（ｃｆｕ１０⁵）の希釈。テンサイについては、１０⁰および１０^-2の希釈率を用いた。懸濁液５ｍｌを種子に加え、１分間作用させる。種子を濾紙上で翌日まで乾燥した後、播種する。試験の手順および解析は、他のキャベツおよびテンサイ試験と同様に行った。トマト：試験では、１０個の複製を用い、それぞれの複製は１個の実生を有していた。種子を水蒸気処理していないピートに播種した。試験１：１リットルプラスチックポットの底に、濾紙を敷き、その上で汚染されたピート１０ｇを測定し、ポットを拮抗薬ピートで満たした。１２日経過したとき、実生をポットに植えた。培養時間は２か月であった。解析：１０ｃｍの細片を茎の基部および約１ｍの高さから切断した。切断表面を目視検査した。維管束の褐変が明確に認められない場合に、茎の０．５ｃｍ厚みの細片をトウモロコシ−ストレプトマイシン培地に置いた（４片／プレート）。２週間後に培地を検査した。試験における等級付け尺度は０〜５であった。０＝健康な基部。１＝目視では疾病は見られないが、寒天培養では基部細片上に疾病有り。２＝基部が明らかに褐色（目視）。３＝基部が明らかに病変あり、寒天培養すると、１ｍの高さでも病変あり。４＝１ｍの高さでも目視で病変あり。５＝植物は死亡。試験２：初期培養は試験１と同様であった。実生は１５日後に汚染ピート（１：１９）と拮抗薬懸濁物とを混合したピートの１リットルポットに植えた。４７日間培養。解析：茎の細片を基部および５０ｃｍの高さから切断した。これらの両方の細片を、トウモロコシ−ストレプトマイシン培地に置いた。培養物を２週間後に検査した。解析では、尺度０〜４を用いた。０＝健康。１＝基部細片について寒天上で成長。２＝基部について目視により検出可能な病変。３＝５０ｃｍで病変、成長減少。４＝植物は死亡。キュウリ：Pythium ：１０個の複製、１植物／複製。実生を純粋なピートで１１日間発芽させ、汚染して処理したピートに植えた。処理後の培養時間は２４日であり、これにより実生の基部および根の疾病等級を尺度０〜５によって解析した。０＝健康。１＝若干罹患した根、基部は健康。２＝根および基部が若干損傷。３＝根および基部が明らかに病変。４＝根がほとんど死亡し、基部は病変。５＝植物は死亡。更に、実生の長さを測定して、乾燥重量を秤量した。Phomopsis ：３個の複製、それぞれにおいて３本の植物。予備発芽させた種子を、底に汚染ピート１０ｇを入れた０．５リットルポットに播種し、ポットを拮抗薬ピートで満たした。１９日後、実生を、３リットルポットの水蒸気処理したピートに移した。実生を約２０℃で人工光で培養した。追加施肥を、週に２回行った。播種から３か月後に試験を停止した。解析：キュウリの苗条（shoots）の疾病等級を尺度０〜５で検査した。０＝健康な植物。１＝根にはわずかな病変症状が見られるが、基部は健康。２＝根は若干病変し、基部は若干損傷。３＝根および基部は明らかに損傷。４＝植物は萎れ、根は貧弱であり、基部は褐色。５＝植物は死亡。レタス：種子（３５）を連続ポットプレート（Vefi-VP 96）のPythiumで汚染され拮抗薬で処理したピートに播種した。実生を６週間培養した後、実生根の健康および厚みを尺度０〜３で解析した。０＝根は健康。１＝若干細くなる。２＝明らかに細くなり、褐変した根。３＝実生はほとんど死亡。実生の新鮮重量を秤量した。Ｊ１４４６粉末試験適用試験の量：試験植物：カリフラワーおよびテンサイ適用量：１ｇのＪ１４４６粉末／リットルのピート０．５ｇ／リットルのピート０．１ｇ／リットルのピート０．０５ｇ／リットルのピート０．０１ｇ／リットルのピート０．００１ｇ／リットルのピート。粉末をUltra Turraxを用いて水（１００ｍｌ／リットルのピート）と混合し、これを１時間放置して、ピートと混合した。播種、試験の管理および解析は、他のカリフラワーおよびテンサイ試験と同様にして行った。結果 (D) 温室および野外試験でのＪ１４４６単離物および市販製剤の比較 (a) 真菌Fusarium culmorumに対するＪ１４４６を用いる選択試験砂試験：Ｊ１４４６は等級０、０、０、０、０および１を得て、次の試験段階に用いた。ピート試験：野外土壌試験： (b) Ｊ１４４６による温室および野外土壌試験 (E) 菌株の作用の機構本発明の真菌株Gliocladium catenulatumが他の真菌に作用する仕方の検出は、始まったばかりである。現在のところ、下記の真菌の一つの単離物を真菌株Ｊ１４４６と共に培養する二重培養(double cultivations)における菌糸体の相互作用を顕微鏡観察しただけである：Rhizoctonia solani，Fusarium culmorumおよびPythium sp．。これらの植物病原性真菌の総ての菌糸体は、真菌株Ｊ１４４６の菌糸体がそれらの近くで成長すると、退行し始める。最初に、大きな液胞が細胞に形成された後、細胞が空になり、最後に細胞壁が退行する。この種の反応は、明らかにＪ１４４６がその環境に分泌する抗生物質または酵素様物質によるものである。明らかに、R ．solaniは、Ｊ１４４６が産生する物質に対して上記の真菌の内で最も感受性が高い。栄養培地が薄いと、この真菌のコロニーの成長はＪ１４４６のコロニー付近で完全に停止し、この結果、狭い抑制帯が裸眼で観察することができる。検討を行った３種類の真菌の総ての菌糸体の一部は、菌糸体が接触する前は退行しないままである。また、これらは、真菌株Ｊ１４４６の菌糸体がその回りに折り重なっているときには、後になって退行すると思われる。折りたたみの強度は、用いられる成長培地によって変化すると思われる。真菌株Ｊ１４４６の菌糸体は、他の真菌の菌糸体中に浸透するということはわからない。結果の解釈本発明の目的である真菌株Gliocladium catenulatumは、植物の病気の生物学的防除の使用に有望であることが証明された。菌株Ｊ１４４６の使用の可能性は、ほとんどの場合に見出だされている。これは、３種類の極く一般的な立ち枯れ病の土壌由来の起因菌である真菌Rhizoctonia solani、PythiumおよびFusarium に対して良好に作用する。また、真菌AlternariaおよびFusariumによる種子由来の病因の防除に、同じ物で良好な結果が得られた。本発明の真菌株および処方物を用いると、実際の培養において明らかに現実的である使用量によって良好な結果が得られた。成長培地と混合すると、試験において土壌由来の疾病を長期間防除することができるということでも非常に有望である。これまでの観察によれば、本発明の真菌株は、植物の発生および成長を促進し、その品質を改良すると思われる。成長培地をこれらの菌株で処理することによって、それ自体では無害なカビの成長を減少させ、小さな種子を有し遅く発芽する植物の発生を促進することもわかった。微生物の寄託下記の真菌株を、ＤＳＭ寄託機関（ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルテューレン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクター・ハフトゥング(Deutshce Sammlung von Mikroorganismen und Zel lkulturen GmbH)）、マシェルオーデル・ヴェーク１ｂ、ブラウンシュバイク，Ｄ−３８１２４ドイツ国、に寄託した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年１１月２１日【補正内容】請求の範囲１．真菌株Gliocladium catenulatum J1446(DSM 9212)の生物学的に純粋な培養物。２．真菌株Gliocladium catenulatum M67-6(DSM 9213)の生物学的に純粋な培養物。３．真菌株Gliocladium catenulatum J2734(DSM 9214)の生物学的に純粋な培養物。４．真菌株Gliocladium catenulatum M2423(DSM 9215)の生物学的に純粋な培養物。５．真菌株Gliocladium catenulatum M3081(DSM 9216)の生物学的に純粋な培養物。６．受託番号がそれぞれＤＳＭ９２１２、ＤＳＭ９２１３、ＤＳＭ９２１４、ＤＳＭ９２１５およびＤＳＭ９２１６であるGliocladium catenulatum J1446 、M67-6、J2734、M2423およびM3081から選択される真菌株Gliocladium catenula tum を含んでなる、生物学的殺真菌性物質。７．温室および野外培養において、種子由来および土壌由来の疾病に対して有効な広いスペクトルを有する安定な生物学的殺真菌組成物であって、真菌株Gl iocladium catenulatum と当分野で通常の担体および／または添加剤を含んでなる組成物。８．真菌株が、それぞれ受託番号ＤＳＭ９２１２、ＤＳＭ９２１３、ＤＳＭ９２１４、ＤＳＭ９２１５およびＤＳＭ９２１６を有するGliocladium catenula tum J1446、M67-6、J2734、M2423およびM3081である、請求の範囲第７項に記載の組成物。９．担体および添加剤として、シリカ、カオリン、乳粉末、カルボキシメチルセルロース、スクロース、リグニン、および澱粉の１または２以上を用いる、請求の範囲第７項または第８項に記載の組成物。１０． (a) 真菌株Gliocladium catenulatumを適当な成長培地で培養し、細胞集団を分離し、それに担体および／または添加剤を加え、得られた集団を乾燥して、これを粉砕して粉末とするか、または (b) 真菌株Gliocladium catenulatumをシリカを含む適当な成長培地で培養し、所望ならばこれに担体および／または添加剤を加え、得られた集団を乾燥して、これを粉砕して粉末とすることによって製造する、請求の範囲第７〜９項のいずれか１項に記載の組成物。１１．植物において真菌感染症を抑制する方法であって、植物またはその種子に請求の範囲第６項に記載の物質、または請求の範囲第７〜９項のいずれか１項に記載の組成物を適用し、またはこれを、種子を播種する前または後に成長基質に添加することを特徴とする、方法。１２．植物の病気を防除するための、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載のGliocladium catenulatum株の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラーデンペレ，マリア−レーナフィンランド国ヘルシンキ、パヤラーデンティ、10 ビーシー 24 (72)発明者セイスカリ，ペッカタパーニフィンランド国キルコヌミ、フォルス（番地なし) (72)発明者テペリ，エサペトリフィンランド国ヘメーンリナ、ディモンクヤ、５ビー 10 (72)発明者ツオミネン，ウーラアニタフィンランド国エスポー、コンティオンティ、７シー 17

Claims

【特許請求の範囲】１．真菌株Gliocladium catenulatum J1446(DSM 9212)の生物学的に純粋な培養物。２．真菌株Gliocladium catenulatum M67-6(DSM 9213)の生物学的に純粋な培養物。３．真菌株Gliocladium catenulatum J2734(DSM 9214)の生物学的に純粋な培養物。４．真菌株Gliocladium catenulatum M2423(DSM 9215)の生物学的に純粋な培養物。５．真菌株Gliocladium catenulatum M3081(DSM 9216)の生物学的に純粋な培養物。６．真菌株Gliocladium catenulatumを含んでなる生物学的殺真菌性物質。７．真菌株が、それぞれ受託番号ＤＳＭ９２１２、ＤＳＭ９２１３、ＤＳＭ９２１４、ＤＳＭ９２１５およびＤＳＭ９２１６であるGliocladium catenulatu m J1446、M67-6、J2734、M2423またはM3081である、請求の範囲第６項に記載の生物学的殺真菌性物質。８．真菌株Gliocladium catenulatumおよび当分野で通常の担体および／または添加剤を含んでなる、生物学的殺真菌組成物。９．真菌株が、それぞれ受託番号ＤＳＭ９２１２、ＤＳＭ９２１３、ＤＳＭ９２１４、ＤＳＭ９２１５およびＤＳＭ９２１６であるGliocladium catenulatu m J1446、M67-6、J2734、M2423およびM3081である、請求の範囲第８項に記載の組成物。１０．担体および添加剤として、シリカ、カオリン、乳粉末、カルボキシメチルセルロース、スクロース、リグニン、および澱粉の１つまたは２つ以上を用いる、請求の範囲第８項または第９項に記載の組成物。１１． (a) 真菌株Gliocladium catenulatumを適当な成長培地で培養し、細胞集団を分離し、それに担体および／または添加剤を加え、得られた集団を乾燥して、これを粉砕して粉末とするか、または (b) 真菌株Gliocladium catenulatumをシリカを含む適当な成長培地で培養し、所望ならばこれに担体および／または添加剤を加え、得られた集団を乾燥して、これを粉砕して粉末とすることによって製造する、請求の範囲第８〜１０項のいずれか１項に記載の組成物。１２．植物において真菌感染症を抑制する方法であって、植物またはその種子に請求の範囲第６項または第７項に記載の物質、または請求の範囲第８〜１０項のいずれか１項に記載の組成物を適用し、またはこれを種子を播種する前または後に成長基質に添加することを特徴とする、方法。１３．植物の病気を防除するための、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載のGliocladium catenulatum株の使用。