MX2013001999A - Proceso de produccion y aplicación de bacillus subtillis para el control biologico del carbon de la espiga de maiz. - Google Patents

Abstract

Esta invención hace referencia a la producción y aplicación de B. subtillis en el control de carbón de espiga de maíz, enfermedad ocasionada por el hongo basidiomiceto S. reilianum. El producto obtenido permite la reducción del porcentaje de incidencia de la enfermedad en campo debido a la acción antifúngica que posee, así mismo, incrementa la productividad del cultivo permitiendo un beneficio económico a los productores. La presente invención es única, ya que se propone un proceso de producción para obtención de un producto que funciona como agente controlador de una enfermedad, el cual es amigable con el ambiente, además de tener un efecto estimulador en la producción de maíz, por otro lado, se establece el método de aplicación para su funcionamiento en campo.

Description

Proceso de producción y aplicación de Bacillus subtUis para el Control Biológico del Carbón de la Espiga de Maíz. j CAMPO TECNICO DE LA INVENCION \ La presente invención pertenece al campo técnico de las necesidades corrientes de la vida (A), así como del área Química y metalurgia (C). Particularmente al campo técnico de los Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen sustancias de composición desconocida o indeterminada, p. ej. sustancias i caracterizadas únicamente por su modo de acción (A01 /61/00), Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos, virus, | hongos microscópicos, animales, p. ej. nematodos, o sustancias producidas por, u obtenidas a partir de microorganismos, virus, hongos microscópicos o animales, p.ej. enzimas o productos de fermentación (A01 N63/00), Sustancias producidas por, u obtenidas a partir de microorganismos o animales (A01 N63/02),! y más particularmente al campo técnico de las Bacterias; Sus medios de cultivo (C12N1/20), Microorganismos (C12R1/00) y Bacillus subtilis (C12R1/125).

ESTADO DE LA TECNICA , Se conoce el proceso de utilización del control biológico en cual fue concjebido a principios del siglo XIX siendo un método para combatir plagas y enfermedades de plantas, causadas por hongos, virus, bacterias e insectos mediante el efecto antagónico que poseen diferentes tipos de microorganismos o sus metabolitos (Badii et al, 2000. Historia, fundamentos e importancia del Control Biológico, pp: 3-17; Bautista, 2006. El control biológico en la reducción de enfermedades postcosecha en productos hortofrutícolas: Uso de microorganismos antagónicos. Revista Iberoamericana de Tecnología Post-cosecha. pp: 1-6 ). Los principales mecanismos de acción de los agentes de control biológico que afectan la viabilidad de los patógenos son: la competencia por nutrientes y espacio, la antibiosis debido a la producción de enzimas líticas, antibióticos y siderófóros, así como, la síntesis de substancias promotoras de crecimiento y parasitismo. Las características que debe poseer un microorganismo para su utilización como agente de control biológico son: ser genéticamente estable, efectivo a bajas concentraciones, no exigente en requerimientos nutritivos, hábil para sobrevivir a condiciones adversas del medio ambiente (incluyendo refrigeración y almacenamiento controlado), efectivo para una amplia gama de microorganismos patógenos, fácil de producir en un medio de cultivo de bajo costo, fácil de manipular, compatible con procedimientos de procesos comerciales, no patogénico con el hospedero y que no produzca metabolitos secundarios dañinos a la salud humana (Wilson y Wisniewski (Eds.), 1994. Biological Control of Postharvest Diseases. Theory and Practice. CRC Press, Boca Ratón, FL.; Spadaro Lodovica. 2004. Int. J. Food. Microbiol. 91 : 185-194.).

El uso de bacterias antagonistas aisladas del mismo lugar en donde se encuentra el problema fitosanitario es lo más recomendado, pues éstas se encuentran adaptadas a las condiciones que determinan el hábitat. Los géneros de bacterias más encontrados y utilizados son Bacillus spp. y Pseudomonas spp., los cuales ayudan a regular las poblaciones de especies indeseables, previenen y reducen el impacto negativo en los organismos infectados, además tienen un efecto benéfico en las plantas mediante la colonización de raíces (Guillen et al., 2006. Revista Mexicana de Fitopatología. 24: 1005-1 14). La utilización de estos microorganismos permite restablecer el equilibrio ecológico por el uso de productos químicos que resultan nocivos para la salud y el medio ambiente (Triphathi y Dubey, 2004. Postharvest Biol and Technol. 32: 235-245).

Bacillus subtilis es un habitante natural del suelo ampliamente reconocida como una poderosa herramienta con potencial en el control biológico de un amplia gama de patógenos de plantas (Compant et al., 2005. Appl Environ Microbiol. 71 :4951-4959; Nagórska et al, 2007. Acta Biochimica Polonica. 54, 495-508); sin embargo no se conoce su uso en campo para el control del carbón de la espiga del maíz, una enfermedad de distribución mundial que causa numerosas pérdidas económicas, cuyo agente etiológico es el hongo basidiomiceto ¡ Sporisorium reilianum. j Este patógeno del suelo infecta a la planta durante la germinación de la isemilla, ocasionando una infección sistémica; sin embargo, los síntomas son discretos y se manifiestan hasta el final de la floración, en donde el hongo reemplaza las inflorescencias y las mazorcas por masas carbonosas constituidas de esporas, las cuales son diseminadas por el viento y depositadas en el suelo, permaneciendo viables hasta por 20 años (Matyac y Kommedahl, 1985. Phytopathology. 75, 577- 581 ; Ghareeb et al, 201 1. Plant Physiol. 156, 2037-2052). El desarrollo de la ? enfermedad es determinado por la humedad ( 5-25%), temperatura del suelo (20-30°C), la cantidad de esporas en el suelo, la susceptibilidad del maíz, la fertilidad y alcalinidad del suelo y la densidad de la población del cultivo (Mack et al, 1984; HortScience 19, 77-78; Matyac y Kommedahl, 1985. HortScience 19, 77-78).

Las limitantes que tienen los métodos de control de esta enfermedad son importantes ya que ninguna ha logrado tener éxito. Diferentes híbridos comerciales con tolerancia a la enfermedad han sido muy utilizados, sin embargo, i los genotipos que fueron evaluados en año como tolerantes al siguiente son I susceptibles. Las prácticas culturales como la rotación de cultivo, lavado y desinfección de maquinaria y herramientas agrícolas y el mantenimiento de los niveles de humedad durante etapas tempranas del cultivo pueden contribuir en la disminución de la incidencia de la enfermedad. Con respecto al control químico se recomienda el tratamiento a la semilla con el fungicida triadimenol en una dosis de 500 ce por cada 100 Kg de semilla, en este caso se alcanza un control hasta el 30% (Pérez y Bobadilla, 2004. Metodología para la definición del nivel de tolerancia a la incidencia del carbón de la espiga de maíz. Tríptico Informativo. SAGARPA e INIFAP). | El uso de agentes químicos ha sido una práctica común; sin embargo, ésta se ha restringido debido a sus efectos carcinogénicos, periodo largo de degradación, contaminación ambiental y otros efectos negativos en alimentos y humanos, en este caso el uso del control biológico es una opción atractiva aunado a un esquema de manejo integral de la enfermedad (Spadaro y Gullino, 2004. Int. J. Food. Microbiol. 91 , 185-194).

ESPECIFICACION DE LA INVENCION El desarrollo de la presente invención está basado en que actualmente en la agricultura se prefiere el uso de prácticas más ecológicas como el control biológico, el cual se define como es el uso de organismos o sus productos para limitar la iniciación y propagación poblaciones indeseables. Diferentes microorganismos han sido utilizados como agentes de control un ejemplo es la bacteria B. subtilis, la cual posee diferentes mecanismos que! inhiben el desarrollo de los fitopatógenos, como son; la producción de enzimas extracelulares, la estimulación del sistema de defensa de la planta y la producción de una gran variedad de antibióticos (Nagórska et al, 2007. Acta Biochimica Polonica. 54, 495-508). ¡ Con base en estos antecedentes, se realizó el aislamiento de B. subtilis a partir de suelos de cultivo de maíz, de la zona maicera de Mixquiahula Hgo. Para cada uno de los aislados se realizaron pruebas de actividad antifúngica contra S. réilíanum, utilizando la siguiente metodología: Se inocularon cajas de petrie con medio YEPD (Extracto de levadura 1%, Peptona 2%, Dextrosa 2% y Agar 2%) con 3ml_ del mismo medio diluido (Extracto de levadura 0.5%, Peptona 1%, Dextrosa 1% y Agar 0.6%), el cual fue previamente fundido y mantenido a 39°C, al cual se le adicionaron 0.1 ml_ de un cultivo de 18 h de S. reilianum, incubado a 28°¡C a 180 rpm con una absorbancia de 0.8. Posteriormente se inocularon las bacterias en el centro de la placa con un palillo estéril. Las cajas fueron incubadas a 28°C por 72 h y fueron observadas cada 12 h. Las cepas bacterianas con actividad inhibitoria fueron aquellas con capacidad de inhibir el desarrollo del hongo. ¡ Se aisló una cepa con actividad antifúngica, a partir de la cual se obtuvieron muestras de cultivo en medio PDB (Caldo Papa y Dextosa) en las fases logarítmica, estacionaria temprana y estacionaria tardía de crecimiento (12, 24, y 60 h, respectivamente), incubado a 28°C, a 180 rpm, la cualesi fueron centrifugadas 8,000 rpm, y los sobrenadantes fueron esterilizados en autoclave. Los sobrenadantes esterilizados fueron utilizados para realizar pruebas de actividad antifúngica de la siguiente manera: En cajas de petrie con medio YEPD se inocularon con 3 mL del mismo medio diluido (Extracto de levadura 0.5%, Peptona 1 %, Dextrosa 1 % y Agar 0.6%), el cual fue previamente fundido y mantenido a 39°C, en el cual se adicionaron 0.1 mL de un cultivo de 18 !h de S. j reilianum, incubado a 28°C a 180 rpm con una absorbancia de 0.8. Una vez i solidificado el inoculo del hongo, sobre el mismo se colocaron cuatro penicilindros estériles, en donde de adicionaron 100 pL de los sobrendantes esterilizados. Las i placas fueron incubadas a 28°C por 72 h y observadas cada 12 h. Los sobrenadantes con actividad antifúngica fueron aquellos que presentaron fíalos de inhibición en el crecimiento del hongo.

Los sobrenadantes con mayor actividad antifúngica fueron aquellos obtenidos a las 60 h de cultivo. ! Tabla 1. Actividad antifúngica sobre S. reilianum de sobrenanantes esterilizados obtenidos de cultivos de B. subtilis en diferentes fases de crecimiento : Inhibición (cm) ' Fase logarítmica Fase estacionaria Fase estacionaria i (12 h) temprana (24h) tardía (60h) 0.0 ± 0.00 1.1 ± 0.04 1.9 ± 0.08 I Con base a lo anterior se realizaron pruebas en campo para medir el efecto de la aplicación de B. subtilis en el control del carbón de la espiga del maíz, para lo cual el experimento fue realizado en Mayo de 2010 en campos de cultivo del municipio de Mixquiahuala Hgo, en donde la enfermedad se encuentra presente, utilizando el híbrido de maíz comercial AS1601 sensible al hongo. j Las semillas fueron tratadas con un cultivo de 60 h de B. subtilis en un m'edio de producción (la composición se muestra en el apartado de mejor método para llevar a cabo la invención) incubado a 28°C y 200 rpm, ajustado a una concentración de 1 X 108 células/mL. La dosis fue la siguiente; para 1 Kg de semilla se adicionaron 40 mL del cultivo y 10 g de grenetina a granel y se agitó enérgicamente. En costales se extendieron las semillas tratadas y se dejaron secar durante 12 h a temperatura ambiente antes de uso. I Las semillas utilizadas para el experimento control no fueron tratadas con la bacteria.

El experimento se realizó en parcelas demostrativas con 6 repeticiones, cada una de las cuales contenían 4 surcos de 5 m, con una separación entre ellos de 80 cm. Se sembraron dos semillas cada 17.5 cm, las cuales fueron cubiertas con 1 g de teliosporas del hongo preparadas en suelo (30.5 g de teliosporas/kg de suelo). i Se aplicaron seis riegos uno cada mes. Se utilizaron dos herbicidas después del primer riego, Sansón® y arvel®. i Después de 30 días de la siembra se eliminaron plantas para tener solo 28 en cada surco, lo cual permite una densidad de población de ¡ 72,500 plantas/hectárea.

Al momento de la cosecha se utilizó la metodología propuesta por Pérez y Bobadilla en el 2004 (Pérez y Bobadilla, 2004. Metodología para la definición del nivel de tolerancia a la incidencia del carbón de la espiga de maíz. Tríptico Informativo. SAGARPA e INIFAP), para lo cual se cuantificaron el número'total de i plantas y el número total de enfermas, lo valores obtenidos fueron utilizados para determinar el Porcentaje de Incidencia del Carbón (PIC) y el porcentaje de eficiencia del tratamiento (PET) de acuerdo a la siguiente fórmulas: PIC = {Número de plantas enfermas ¡Número total de plantas)l(l00%) ¡ PET = 100 - [(PIC Tratamiento/ PIC Control)(l00%)] j Para determinar el rendimiento real y potencial, se contaron el número total de mazorcas y en número total de mazorcas enfermas de los dos surcos centrales, de los cuales se tomaron al azar 22 mazorcas y se pesaron. Posteriormente se tomó una submuestras de 5 las cuales fueron pesadas y desgranadas. Se determinó el porcentaje de humedad del grano obtenido (PHG) un medidor de humedad de granos marca John Deere, así como su para determinar el factor de desgrane (FD) usando la siguiente fórmula: FD = (Peso del grano de las 5 mazorcas /Peso total de las 5 mozorcas) Con estos datos se calculo el rendimiento potencial (RP) y el rendimiento real (RR) utilizando las siguientes fórmulas: RP = (WXr)[(lOO - PHG)/86]( Xl00O/G) RR = (W)(T- Cj(lOO - PHG)/S6l¡FD)(íOQO/G) Donde W=promedio del peso de las 22 mazorcas (kg), T=Número ¡total de mazorcas, C=Número total de mazorcas enfermas, PHG=Porcentaje de Humedad del grano, 86=Factor estandarizado de rendimiento a un 14% humedad, FD= Factor de desgane y G=separación de los surcos (0.8 m). j Con los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza (ANOVÁ), para determinar sí el tratamiento tiene un efecto positivo en el control del carbón de espiga del maíz, estadísticamente validado. Un valor de P= 0.05 fue considerado estadísticamente significativo. ¡ El tratamiento B. subtilis permitió una disminución del Porcentaje de Incidencia del Carbón (PIC) con se muestra en la Tabla 2, obteniendo una eficiencia del 52.9 %. Los resultados obtenidos muestran que el tratamiento con B. subtilis permitieron un incremento en el rendimiento comparado con el control (Tabla 3).

Tabla 2. Efecto del tratamiento con B. subtilis sobre el Porcentaje de Incidencia del Carbón (PIC) Tratamiento Numero total de Numero de Porcentaje de Porcentaje de plantas plantas Incidencia del eficiencia del enfermas Carbón (PIC) tratamiento % B. subtilis 124.0 ± 20.4 14.7 ± 10.0 1 1.2 ± 8.9 Tabla 3. Efecto del tratamiento con B. subtilis en el rendimiento de la producción de maíz Tratamiento Número Número Peso de Promedio Factor de Porcentaje Rendimiento Rendimiento Total de de las 22 del peso desgrane de Potencial I real (RR) mazorcas mazorcas mazorcas de las 22 (FD) humedad Ton/ha (RP) respectivamente. El valor de probabilidad fue < 0.05 (P=0.0157), lo que indica una diferencia significativa del tratamiento con B. subtilis con respecto all control (Tabla 4), con esto se acepta la hipótesis alternativa indicando que el uso de 6. subtilis en campo disminuye el PIC. ¡ i Tabla 4. Resultados obtenidos del análisis ANOVA Grados de Suma de Media de valor de F Probabilidad (P) libertad cuadrados cuadrados I 1 322.66 322.6 16.2 0.0157¡ 6 79.56 19.9 La solución que presenta la presente invención es la utilización de B. subtilis como agente de control biológico del carbón de la espiga del maíz partiendo del hecho de que en México, la enfermedad se encuentra presente en los estados de Jalisco, Aguascalientes, Guanajuato, Querétaro, Hidalgo, Puebla, México y Veracruz, atacando principalmente a maíz de ciclo tardío en siembras de humedad residual y de temporal (Pérez et al., 2009. Revista Innovando Juntos, Fundación Hidalgo Produce. 24, 4-12), además esta enfermedad tiene un gran impacto en la economía de los productores disminuyendo sus ganancias considerablemente. En relación a estos problemas fitosanitarios, se tienen reportes que datan desde finales de la década de 1960, con afección de maíces criollos Chalqueños en el Valle del Mezquital, Hgo. A mediados de los 70's surgió como respuesta él híbrido H-133, que se mantuvo sin problemas hasta 1985, año en que la afectación incrementó paulatinamente llegando a presentar pérdidas de hasta el 50% de la superficie sembrada con maíz en 1988, motivos por el cual fue remplazado por el H-135. Fue hasta cuando resurgió este problema fitosanitario en tres híbridos de maíz en los municipios de Tula y Francisco I. Madero. En 1998 productores reportaron daños en 10 parcelas y seis híbridos, principalmente en el municipio de Francisco I. Madero, San Salvador, Mixquiahuala y Tlaxcoapan. El problema se fue acrecentando y en el año 2000 se atendieron reportes de 99 parcelas, 19 genotipos y 14 municipios, observándose un incremento considerable en ese año. De acuerdo con los resultados de la evaluación del ciclo agrícola P.V. 200;1 , de los 22 municipios del Distrito de Desarrollo Rural se muestrearon 20, de los cuales 17 de ellos resultaron con algún grado de afección, sobresaliendo: Tlaxcoapan, Tlahuelilpan, Mixquiahuala, Atitalaquia, Tula de Allende, San Salvador y Feo. I. Madero, y para el P.V. 2003 se registró una incidencia en 456 parcelas en una superficie 1 ,275.42 ha en 17 municipios , afectando hasta a 35 híbridos (Pérez et al., 2009. Revista Innovando Juntos, Fundación Hidalgo Produce. 24, 4-12).

Los procesos de producción y la utilización de B. subtilis para el control del carbón de la espiga del maíz, hasta la fecha no habían sido reportados. El tratamiento biológico con esta bacteria producida de acuerdo a la metodología desarrollada disminuye significativamente el Porcentaje de Incidencia del Carbón en campo e incrementa la productividad del cultivo.

Las ventajas técnicas que presenta la invención descrita son, que el proceso de producción de B subtilis descrito en este documento, permite que la j bacteria sintetice metabolitos secundarios con actividad antifúngica, adernás de incrementar la biomasa de este microorganismo, de tal forma, que se tiene un formulado que al ser aplicado en campo inhibe el desarrollo del patógeno durante la germinación de la semilla, momento en el que ocurre la infección y por otro lado incrementa la población de esta bacteria benéfica en el suelo. El método de aplicación ayuda a la disminución del porcentaje de incidencia del carbón con una eficiencia del 47.6 % de control, así mismo, incrementa la producción en un 27.5%. En términos económicos aunque la enfermedad se encuentra presente, el tratamiento disminuye el riesgo de pérdidas económicas al incrementar la productividad del cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es el proceso de esterilización del fermentador con el medio de producción. 1.- Fermentador. 2.- Generador de vapor. La Letra A Indica El proceso en el cual se adiciona el medio de cultivo al fermentador. En la Letra B se indica el proceso en el cual se incorpora agua al generador de vapor. La Letra C indica el proceso de esterilización del fermentador con el medio de producción mediante la inyección de vapor.

La figura 2 es el proceso producción de 6. subtilis. 1.- Fermentador. 2 -Bomba. La Letra A indica la adición del preinoculo al Fermentador. Las condiciones del cultivo son, temperatura 28° C durante, agitación a 200 rpm con un flujo de aire estéril de 100 mL/min, tiempo 60 h. La Letra B indica la salida del producto del Fermentador mediante la utilización de una bomba. La letra C indica el embasamiento del producto y la toma de muestra para las pruebas de efectividad biológica in vitro.

MEJOR MÉTODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN A continuación se describen los procedimientos de producción y aplicación de 8. subtilis para el control del carbón de espiga.

PRODUCCIÓN Material de laboratorio Viales de 1.5 mL Caja de Petri de poliestireno de 100 X 15 mm Matraz erlenmeyer de 500 mL Pipetas de vidrio de 5 mL ! Hemocitómetro Portaobjetos Penicilindros Equipo Congelador a temperatura de -20°C Agitador orbital de plataforma de velocidad variable con temperatura controlada a 28° C, en el caso de que el agitador no cuenta con control de temperatura el equipo podrá ser colocado en un cuarto incubadora a 28°C. ¡ Incubadora de temperatura controlada a 28° C o cuarto incubadora a 28°Cj.

Fermentador de 20 L de acero inoxidable para cultivo aerobio con agitación mecánica. \ j Generador de vapor. ¡ Autoclave 121°C, 15 Lb de presión.

Microscopio óptico con objetivo de 100X. i Mecheros Bunsen i ; Medios de cultivo y Reactivos químicos j Agar Extracto de Levadura Peptona y Glucosa (Extracto de Levadura 1 %, ¡Peptona 2%, Glucosa 2% y Agar 2%). ? Caldo Extracto de Levadura Peptona y Glucosa (Extracto de Levadura 1 %, Peptona 2% y Glucosa 2%). ; Agar blando Extracto de Levadura Peptona y Glucosa (Extracto de Levadura 0.5%, Peptona 1%, Glucosa 1% y Agar 0.5%). i Caldo nutritivo (Extracto de carne 3g/L, Peptona 5g/L).

Agar nutritivo (Extracto de carne 3g/L, Peptona 5g/L, 20 g/L) ' Medio de producción. (1 L de infusión de papa, la cual, se prepara sometierjido a un proceso de cocción con 700 mL de agua de la llave por 25 min, 240g de, rodajas gruesas de papas. La infusión se pasa a través de una manta de cielo, posteriormente al filtrado se le adicionan 20 g de glucosa líquida y se afora a 1 L con agua de la llave). 1 Glicerol al 50% estéril.

Los medios de cultivo se esterilizan por calor húmedo en autoclave durante 15 min a 121 °C a 15 Ib de presión. ! Reactivos para tinción Gram Grenetina a granel | Conservación y condiciones de cultivo La cepa de B. subtilis es conservada en placas de agar nutritivo sembradas por estría cruzada e incubadas a 28° C hasta por 10 días y a -20° C en vialejs de 1.5 mL con glicerol al 25%, los cuales se preparan a partir de 100 mL de un cultivo de 18 h en caldo nutritivo contenido en un matraz erlenmeyer de 500 mL, inoculado con el crecimiento de una placa con agar nutritivo e incubado en agitación a 150 rpm a 28° C durante de 24 h. Se colocan 0.5 mL del cultivo en el vial estéril con 0.5 mL de glicerol al 50% estéril, esta solución se homogeniza por agitación y se guarda. En estas condiciones la bacteria se mantiene viable hasta por 1 Preparación del Pre-inóculo En 3 matraces de 500 mL se colocan 300 mL del medio de cultivo de producción, se inocula cada uno con el crecimiento de una placa en agar nutritivo de un cultivo fresco de la cepa de ß. subtilis. Se incuba durante 24 h a 28° C, en agitación a 150 rpm hasta alcanzar una densidad de población 1 x 108 células/mL, en este caso el conteo se hace directo en hemocitómetro, así mismo se verifica la pureza del cultivo mediante tinción de Gram. ? Inoculo y sistema de producción ' El proceso de producción se esquematiza en las figuras 1 y 2. [ El fermentador se esteriliza con 16 L del medio de producción con vapori caliente durante 30 min, utilizando un generador de vapor (FIG. 1). En condiciones de esterilidad haciendo uso de dos tres mecheros se adicionan al termentador el contenido de los tres matraces del preinóculo.

El termentador se coloca a 28° C durante 60 h. El cultivo es agitado a 200 rpm con un flujo de aire estéril de 100 mL/min (FIG. 2).

Una vez terminado el proceso de producción se toma una muestra para cuantificar la concentración de la bacteria por cuenta directa en un hemocitómetro, así como, para verificar la pureza del cultivo mediante tinciones Gram. La concentración del microorganismo deberá estar en 1 X 108 células/mL ¦ El producto se almacena en frascos agrícolas de plástico de 1 L, a temperatura ambiente, hasta por 1 mes. ! Pruebas de efectividad biológica ?? vitro" ¦ Se prepara un césped de S. reilianum en placas de Agar Extracto de lievadura Peptona y Glucosa de la siguiente manera: A partir de un cultivo de 24 h a 28° C en agitación a 150 r.p.m. de S. reilianum en Caldo Extracto de Levadura Peptona y Glucosa, se toma 1 mL y se adiciona a 5 mL Agar blando Extracto de Levadura Peptona y Glucosa fundido a 39°C. La mezcla se homogeniza y es vertida en placas con Agar Extracto de Levadura Peptona y Glucosa. Después de que el agar solidifique, se colocan 4 penjcilindros estériles sobre el césped en los cuales se adicionan 100 pL del cultivo de B. subtilis producido. Las cajas se colocan en la incubadora de 24 a 48 h, a 28° C y se observa y cuantifica el halo de inhibición.

Aplicación ¡ El producto obtenido es aplicado a la semilla, lo cual se realiza de la siguiente i manera.

Mezclar enérgicamente 1 Kg de semilla con 40 mL del producto y l 0 g de grenetina a granel. En costales extender la semilla tratada y dejar secarj durante 12 h a temperatura ambiente antes de uso.

A los 15 días después de aplicar el primer riego al cultivo, o cuando el cultivo tenga una edad de 15 días, aplicar un refuerzo por aspersión diluyendo el i producto en una relación 1 : 10 con agua. )

Claims (2)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1. Un proceso que se conforma de la producción de B. subtilis yj que se caracteriza por la obtención de un producto que contiene la bacteria que funciona como agente benéfico para el cultivo del maíz incrementando la producción de! cereal, así co o, a! presencia de metabolitos secundarios que permiten controlar el carbón de la espiga del maíz, por sú acción antifúngica contra el hongo S. reilianum. j

2. Un método que se conforma la aplicación de B. subtilis y que se caracteriza por utilización de grenetina como adherente para el tratamiento de la semilla maíz, antes de ser sembrada, así como la aplicación de un jrefuerzo a cultivos de 15 días de edad con el agente de control biológico que permite controlar el carbón de la espiga del maíz. j