ES2230550T3

ES2230550T3 - Hongo de la especie gliocladium catenulatum para el control biologico de enfermedades de las plantas.

Info

Publication number: ES2230550T3
Application number: ES95933445T
Authority: ES
Inventors: Risto Tapio Tahvonen; Hanna Helena Avikainen; Milja Tuulikki Keskinen; Marja-Leena Lahdenpera; Pekka Tapani Seiskari; Esa Petri Teperi; Ulla Anita Tuominen
Original assignee: Verdera Oy
Current assignee: Verdera Oy
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2015-09-29
Also published as: CA2201336C; AU3610295A; FI101631B; EP0792348B1; NZ293626A; DE69533807D1; WO1996010626A1; ATE283347T1; FI944557A0; FI944557A; JPH10506288A; DE69533807T2; EP0792348A1; CA2201336A1; US5968504A; FI101631B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL CONTROL BIOLOGICO DE ENFERMEDADES DE PLANTAS Y CONCIERNE A UN NUEVO HONGO GLIOCLADIUM CATENULATUM Y A SU USO PARA CONTROLAR INFECCIONES FUNGICAS EN PLANTAS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN NUEVAS CEPAS DE GLIOCLADIUM CATENULATUM Y A SU USO PARA DICHO PROPOSITO.

Description

Hongo de la especie Gliocladium catenulatum para el control biológico de enfermedades de las plantas.

Área de la invención

La presente invención se refiere al control biológico de enfermedades de las plantas y se refiere específicamente a microorganismos nuevos que pertenecen al género Gliocladium así como a su utilización para controlar las infecciones fúngicas en las plantas. La invención también se refiere a composiciones que comprenden cepas nuevas de Gliocladium y a su utilización para el propósito mencionado.

Antecedentes de la invención

Los cultivos cultivados están afectados por diferentes enfermedades fúngicas, bacterianas y víricas así como por varias plagas de insectos. Con el fin de controlarlos se han desarrollado muchos métodos técnicos, químicos y biológicos para el control de los cultivos. El propósito de dichos métodos es prevenir las pérdidas cualitativas y cuantitativas en la cosecha producidas por enfermedades de las plantas y otras plagas.

En general, el término control biológico de las enfermedades de las plantas significa el control de los patógenos de las plantas por otro organismo, que se denomina entonces un organismo de control biológico de las enfermedades de las plantas, y la preparación fabricada a partir de él un agente de control biológico o un bioplaguicida. Los mecanismos del control biológico de las enfermedades de las plantas varían, y normalmente el efecto se basa en la acción cooperativa de muchos mecanismos diferentes. El efecto de control puede estar basado en agentes químicos inhibitorios producidos por el organismo, algunas veces el organismo de control parasita el patógeno o compite con él por el espacio de crecimiento y/o por los nutrientes disponibles.

La necesidad de descubrir agentes de control biológico nuevos se ha incrementado por el hecho de que se ha visto que muchos de los plaguicidas químicos tradicionales son perjudiciales para el medioambiente y para los seres humanos. Además, una desventaja de los productos químicos es el hecho de que muchas plagas se han vuelto resistentes a uno o incluso a varios plaguicidas. Si embargo, el desarrollo de resistencia a bioplaguicidas es improbable debido a que su efecto está basado en varios mecanismos de diferentes clases. Normalmente, los productos químicos afectan más rápido y de manera más eficaz que los bioplaguicidas. Por su parte, normalmente los bioplaguicidas tienen una acción más duradera que los productos químicos ya que su efecto está basado en un microorganismo viable y reproducible.

El grupo más importante de bioplaguicidas son productos bacterianos dirigidos frente a los insectos. Los bioinsecticidas basados en la bacteria Bacillus thuringiensis pueden ser los que se utilizan más habitualmente. En Finlandia, se produce un biofungicida basado en el actinomiceto Streptomyces que es eficaz frente a varias enfermedades fúngicas de las plantas transmitidas a través del suelo o de las semillas. Los hongos del género Trichoderma también tienen actividad fungicida.

Se han estudiado mucho las bacterias del género Pseudomonas, especialmente de las especies Pseudomonas fluorescens, y actualmente se conocen muchas cepas de P. fluorescens que tienen actividad fungicida. Véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente publicadas WO 92/18613, FI 92 1722 y WO 90/01327, así como la patente EP 228.457.

Se sabe que los hongos del género Gliocladium tienen actividad fungicida. Las cepas de Gliocladium virens, especialmente la cepa de G. virens G1-3, se han descrito en la literatura de patentes. Sin embargo, un problema en la utilización de estas especies ha sido que nadie ha sido capaz de producir una formulación de este hongo, en la que la viabilidad del hongo se mantenga a un nivel satisfactorio durante el almacenamiento de la formulación. En las patentes de EEUU 4.668.512, 4.724.147 y 4.818.530 se describe, además de otras cepas de hongos, la utilización de cepas de Gliocladium virens para la preparación de formulaciones biofungicidas. También se ha descrito la utilización de cepas de Gliocladium virens como biofungicidas en las patentes de EEUU 5.165.928, 5.194.258 y 5.268.173.

También se sabe que algunas cepas de la especie Gliocladium catenulatum tienen actividad biofungicida. La solicitud de patente SU 1836907 A1 describe una cepa de Gliocladium catenulatum para utilizarse para controlar patógenos de la patata, por ejemplo, Fusarium sambucinum. Huang (Can. J. Botany, 56: 2243-46, 1978) discute el modo de acción de G. catenulatum frente a hongos patógenos de los géneros Sclerotia y Fusarium. Un estudio similar lo describe Turhan (J. Phytopathology, 138: 283-292, 1993), que demuestra que varios géneros de hongos, que incluyen Gliocladium, son parásitos en Alternaria.

Es más, Reyes y Dirks (Phytoprotection 66: 23-29, 1985) estudiaron la supresión de la podredumbre de la raíz de guisante producida por Fusarium y Pythium por microorganismos antagonistas, que incluyen a Gliocladium catenulatum.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a cepas fúngicas de Gliocladium catenulatum que se ha visto que son muy activas frente a varios hongos perjudiciales.

La invención se refiere además a una composición biofungicida preparada a partir de una cepa microbiana que comprende como un ingrediente activo las cepas fúngicas que pertenecen a la especie Gliocladium catenulatum de acuerdo con la invención y, de manera opcional, aditivos o vehículos convencionales en el campo como una formulación apropiada. Los ejemplos de dichas formulaciones son composiciones adecuadas para el abono de semillas, composiciones en polvo o granuladas para extenderse en los sustratos de crecimiento de las plantas o formulaciones líquidas para tratar el suelo.

Descripción detallada de la invención

En lo que sigue se describen con detalle las cepas fúngicas de la invención así como su aislamiento y caracterización. Además se describe la formulación de las composiciones biofungicidas formuladas a partir de estas cepas y sus características, y los ensayos de eficacia con las cepas fúngicas aisladas y las composiciones preparadas a partir de ellas.

Aislamiento de los microorganismos

Las muestras de suelo, a partir de las cuales se han aislado las cepas fúngicas de la invención, se recogieron en los años 1989 a 1991 de diferentes partes de Finlandia, principalmente de las estaciones de investigación de MTT (Agricultural Research Center), a partir de diferentes tipos de suelos y diferentes rotaciones de cultivos utilizando cebada y trigo como plantas cebo. Las muestras se tomaron de la capa de la raíz (desde una profundidad de 0 a 15 cm). Se tomaron numerosas submuestras de cada campo, que se juntaron en muestras de 1 a 2 litros.

Los aislamientos se hicieron bien por un método de dilución (aislamientos de suelo) o por un método de plantas cebo (aislamientos de raíces), cuyos resultados se describen en detalle más adelante en la presente memoria en la sección Métodos.

Caracterización de los microorganismos

Las cepas fúngicas aisladas a partir de las muestras de suelo se ensayaron con el método de cribado descrito en la solicitud de patente FI 94 0463. Después, se encontraron cinco cepas que dieron muy buenos resultados. Las cepas, que se denominaron Gliocladium catenulatum J1446, Gliocladium catenulatum M67-6, Gliocladium catenulatum J2734, Gliocladium catenulatum M2423 y Gliocladium catenulatum M3081, se caracterizaron en DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) en Alemania. Estas cepas se han depositado el 19 de mayo de 1994 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el depósito de DSM con los números de referencia DSM 9212, DSM 9213, DSM 9214, DSM 9215 y DSM 9216, respectivamente.

Las características morfológicas de los microorganismos son las siguientes:

Morfología: Los conidiofóros primarios son semejantes a los de Verticillium y los secundarios semejantes a los de Penicillium. Sus longitudes varían entre 50 y 125 \mum. Cuando se observan directamente aparecen arrugados, pero suaves en soportes líquidos. En los conidióforos secundarios los conidios pueden permanecer unidos los unos a los otros para formar cadenas largas (incluso de 150 \mum). Los conidios son verdes y tienen un tamaño de 4-7,5 x 3-4,5 \mum. Pueden estar presentes clamidosporas hialinas, terminales o intercaladas, de 7-10 \mum de diámetro.

Colonias: En las placas las colonias se expanden de forma bastante extensa. En agar de extracto de malta crecen en diez días hasta un tamaño de 2,5-3,5 cm de diámetro a una temperatura de 20ºC. Las colonias son semejantes a las de G. roseum pero las áreas de los conidios se vuelven verdes (claro-oliva) cuando tienen de 7 a 10 días. En cultivos viejos las áreas de los conidios son verde oscuro. El lado opuesto de los cultivos es incoloro o amarillento.

A partir de estas cepas se pueden preparar formulaciones con una duración razonable a temperatura ambiente, es decir, composiciones biofungicidas de la invención, que se pueden extender fácilmente en plantaciones que requieren control de enfermedades. Se puede producir una formulación, por ejemplo, en la forma de polvo. El cultivo de un microbio puede empezarse a partir de un inóculo, que es una colonia en PDA que incluye una suspensión de esporas y que se haya mantenido a -80ºC. El microbio puede cultivarse bien como un cultivo líquido o en un soporte sólido. El medio nutritivo comprende azúcar, por ejemplo, sacarosa, y nitrógeno así como cantidades pequeñas de otros nutrientes. Un medio nutritivo adecuado para el cultivo es, por ejemplo, GYM (glucosa 4 g/l, extracto de levadura 4 g/l, extracto de malta 10 g/l) o PDB (caldo de patata y dextrosa). El cultivo se lleva a cabo durante un poco menos de una semana hasta más de una semana. Entonces el hongo forma esporas. La masa celular puede separarse del caldo bien por filtrado a través de papel de filtro o por centrifugación. Si se ha utilizado un cultivo líquido se mezcla un vehículo, por ejemplo, sacarosa, leche en polvo, caolín, almidón, lignina y/o CMC (carboximetilcelulosa) con la masa celular. La masa se seca a temperatura ambiente y se muele hasta convertirla en polvo.

Métodos Aislamiento de los microbios a) Método de dilución (aislamientos de suelo)

Se mezclaron 10 g de suelo con 100 ml de agar agua 0,5% (Bactoagar). Se hicieron diluciones 10^{-1}y 10^{-2}a partir de la mezcla en agar agua 0,5%,en triplicado. Las diluciones se agitaron (en un baño de agua) en un agitador durante 20-30 min. Se pipeteó 1 ml de la dilución en una placa petri vacía y se vertieron 20 ml de Agar Littman Oxgall (LOA). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 3 a 7 días. Las colonias fúngicas que crecieron se aislaron como puras en placas PDA (Agar Patata y Dextrosa).

b) Método de las plantas cebo (aislamientos de raíces)

La muestra de suelo se puso en los pocillos de una bandeja de macetas en serie (bandeja de macetas en serie Vefi-VP96), 15 pocillos/muestra de suelo (pocillos 40x40x60 mm). Se sembraron en los pocillos trigo, cebada y rábano, 5 pocillos/especie. Se sembraron 4 semillas de trigo, cuatro semillas de cebada y 10-20 semillas de rábano por pocillo. Las semillas se cubrieron con arena. La semilla y la superficie del suelo se regaron, con 10 ml/maceta. Se cultivó a la temperatura de +15ºC. Después de dos semanas de cultivo las plantas se cogieron y se lavaron en agua corriente o se limpiaron con un cepillo sin agua. Se cortaron pequeños trozos de las raíces y se pusieron en placas. Los medios utilizados: LOA (10 g peptona, 10 g dextrosa, 15 g Bacto-Oxgall, 0,01 g cristal violeta B, 0,03 g estreptomicina, 20 g agar, hasta 1.000 ml de agua), PCNB (15 g peptona, 1 g KH_{2}PO_{4}, 0,5 g MgSO_{4}.7H_{2}O, 2 g Avicol, 3 ppm estreptomicina, 20 g agar, hasta 1.000 ml de agua) y PDA-Estreptomicina (39 g preparación PDA, 300 ppm estreptomicina, hasta 1.000 ml de agua). Después de unos pocos días de incubación los hongos se transfirieron a placas PDA.

Las cepas se almacenaron cogiendo colonias de las placas PDA y congelando las colonias en ampollas (Nalgene 5000-0012, PP Estéril 1,2 ml) a -80ºC.

Los ensayos de invernadero que se incluyen en el método de cribado utilizado en la selección de las cepas se llevaron a cabo como se describe en la solicitud de patente FI 94 0463 y estos ensayos se describen brevemente más adelante en la presente memoria.

Ensayo en arena

Las semillas de un cereal se siembran en una capa de arena. En primer lugar se pipetean los micelios y las esporas del patógeno y después las esporas del hongo a ensayar en una suspensión de agua en las semillas y en el sustrato de crecimiento, después de lo cual las semillas se cubren con arena. Después de dos semanas y media se examina la intensidad de los síntomas de la enfermedad en los brotes (escala 0-5). A partir de experimentos adicionales se rechazan aquellos hongos que no afectan a la intensidad de la enfermedad o los que demuestran ser patógenos en sí mismos.

Ensayo en turba

Una semilla de un cereal se humedece en una suspensión de esporas de un patógeno, y se seca. Después de esto, la semilla se humedece con la suspensión de esporas del hongo a ensayar, se seca y se siembra. Se utiliza como sustrato de crecimiento turba vaporizada. Después de dos semanas y media de cultivo se realizan observaciones sobre la salud de los brotes. Las cepas de hongos que previenen claramente la enfermedad se utilizan en el ensayo de campo en
suelo.

Ensayos de campo en suelo

Se pone suelo molido y humedecido en macetas de 1,5 l y se siembran 36 semillas de cereal en cada maceta. Los tratamientos de las semillas antes de la siembra se realizan de la misma manera que en el ensayo en turba. Por ejemplo, se utilizan tres réplicas de macetas en el ensayo. Después de cuatro semanas de cultivo se examinan los síntomas en los brotes.

Las cepas que se han visto que son buenas en estos ensayos se utilizan en los ensayos de campo, que proporcionan la certeza final del efecto bioplaguicida de los aislados microbianos seleccionados.

Patogenicidad de las cepas fúngicas

Se ha ensayado la eficacia de la cepa fúngica J1446 en el control de las enfermedades de las plantas en varios ensayos en ocho especies de plantas en total. Ninguno de los ensayos mostró un efecto perjudicial de J1446 en el desarrollo de las plantas aunque en algunos ensayos las semillas de las plantas se trataron a veces con dosis bastante altas. En base a esto, es evidente que J1446 no impide el desarrollo de las plantas. Con el fin de obtener una verificación adicional, se comenzó una serie de ensayos nueva para mostrar la eficacia de J1446 en 32 especies de plantas diferentes pero no hay resultados de éstos disponibles en este momento. Las otras cepas de Gliocladium catenulatum de la invención no se han ensayado tan ampliamente como J1446. En los ensayos de eficacia en los que se han ensayado las cepas mencionadas (J2734, M67-6, M2423 y M3081) no se ha visto que éstas sean patógenas.

Experimental

Los experimentos siguientes ilustran la utilización de la invención. En el apartado (A) se describe la preparación de las formulaciones hechas a partir de las cepas de Gliocladium catenulatum de la invención, en el apartado (B) los resultados de la eficacia del control de la cepa fúngica J1446 frente a la infección por Rhizoctonia+, Pythium +, Alternaria + o Fusarium en coliflor, pepino, eneldo y trigo como una suspensión de esporas y como formulaciones diferentes, en el apartado (C) la eficacia de las cepas fúngicas frente a hongos que producen podredumbre (Rhizoctonia, Pythium, Fusarium, Phomopsis y Alternaria) en tomate, coliflor, remolacha, pepino y lechuga, en el apartado (D) los ensayos comparativos del efecto de las cepas fúngicas de la invención, especialmente de la cepa J1446, y del efecto de la formulación comercial, respectivamente, en los patógenos siguientes: Fusarium y Gaueumannomyces graminis en cebada y trigo, y en el apartado (E) el modo de acción de las cepas.

(A) Preparación de las formulaciones a partir de las cepas fúngicas

Las formulaciones en polvo a partir de la cepa fúngica J1446 se prepararon como sigue:

(a) Cultivo con agitación

El cultivo se llevó a cabo en un erlenmeyer de 1 l con 0,5 l de medio nutritivo, que incluía sacarosa 4 g/l, extracto de levadura 4 g/l, extracto de malta 10 g/l y CMC 10 g/l. El pH no se ajustó antes de la esterilización en el autoclave. Como inóculo se utilizó una colonia de agar (medio agar de patata y dextrosa) que incluía esporas que había sido almacenada a -80ºC. La velocidad del agitador fue 150 rpm, la temperatura de crecimiento fue temperatura ambiente (22-26ºC) y el tiempo de cultivo de 3 a 7 días. Las células se separaron por centrifugación (9.000 rpm, 20 min). Se mezclaron con la masa celular uno o más de los materiales siguientes: sacarosa, leche en polvo, caolín, almidón, lignina y CMC.

Formulación 1

células	40% (materia seca)
sacarosa	20%
caolín	35%
CMC (7% disolución en agua)	5%

La mezcla se secó a temperatura ambiente en placas petri abiertas en una campana de humos durante 4 a 7 días. El espesor de la capa fue 1 a 2 cm. Las placas secas se molieron hasta que se convirtieron en polvo. La viabilidad de la formulación fue 10^{7} cfu/g de polvo. (cfu = unidades formadoras de colonias). cfu (unidades formadoras de colonias) es una unidad que se utiliza en las determinaciones de viabilidad de microbios. La suspensión diluída de microbios se extendió en placas de agar y se contaron las colonias después de unos pocos días. Cuando la dilución es conocida, se puede contar la cantidad de colonias, es decir, la cantidad de células microbianas en la muestra original.

Formulación 2

células	40% (materia seca)
leche en polvo	40%
sacarosa	20%

Se secó y se molió como se ha descrito más arriba. La viabilidad de la formulación fue 10^{7} cfu/g de polvo.

Formulación 3

células	40% (materia seca)
almidón	35%
sacarosa	20%
CMC (7% disolución en agua)	5%

Formulación 4

células	40% (materia seca)
lignina	35%
sacarosa	20%
CMC (7% disolución en agua)	5%

Se secó y se molió como se ha descrito más arriba. La viabilidad de la formulación fue 10^{9} cfu/g de polvo.

(b) Cultivos en fermentadores

Formulación 5

Los cultivos se llevaron a cabo en fermentadores aireados Braun Biostat de 10 y 30 l, en los que los volúmenes de líquido fueron 10 l y 25 l, respectivamente. El medio nutritivo y las condiciones fueron similares a las de los cultivos en matraz con agitación. El tiempo de cultivo fue 4 días y la separación y la formulación así como el secado se realizaron como se describe más arriba. La viabilidad de la formulación después del molido fue de 10^{7} a 10^{8} cfu/g de polvo.

(c) Cultivo en un medio sólido

Formulación 6

La cepa J1446 se cultivó en un medio sólido que incluía un vehículo de sílice. El medio de crecimiento incluía 50 ml de caldo de Patata y Dextrosa (Difco, 24 g medio PD/l agua destilada), 20 g de sílice (Sipernat 22S, Degussa) y 0,2 g de CaCO_{3} (p.a. Merck). Los sustratos se mezclaron en un vaso de precipitado y se autoclavaron durante 20 min a 120ºC. El medio enfriado se inoculó en 4 ml de una suspensión de esporas de J1446 que se obtuvo mediante raspado de las esporas de una placa PDA en agua estéril.

El medio se transfirió de manera aséptica a placas petri y se incubó durante 10 días a 16ºC hasta que el hongo formó esporas. Después de esto, se secó el medio en placas petri abiertas a temperatura ambiente durante 2 días. La viabilidad de la preparación seca fue 7*10^{7} cfu/g.

De manera similar, se pueden preparar formulaciones a partir de las otras cepas de la invención.

(B) Resultados del efecto de control de la cepa fúngica J1446, utilización como suspensiones de esporas y como diferentes formulaciones

En las Tablas 1 a 12 se muestran los resultados de los experimentos del efecto de control, que se realizaron con la cepa J1446 como sigue.

Control del hongo Rhizoctonia solani en coliflor: En la Tabla 1 se muestra el efecto de control de la cepa fúngica J1446 a dos temperaturas diferentes, en la Tabla 2 se puede ver la diferencia de los efectos de las preparaciones de J1446 (varios lotes obtenidos en diferentes fermentadores de diferentes tamaños) y del cultivo en placa, y en la Tabla 3 se ve el efecto de la preparación líquida fermentada con diferentes cantidades y modos de utilización.

Control del hongo Pythium : En la Tabla 4 se muestra el efecto de diferentes preparaciones en pepino utilizando tratamiento en el riego, en la Tabla 5 se muestra el efecto de control de los abonos seco y líquido en eneldo cuando se utiliza la preparación líquida fermentada, y en la Tabla 6 se muestra el efecto de diferentes concentraciones en el efecto de control cuando se utiliza el tratamiento en el riego. La planta de ensayo es el pepino.

Control del hongo Alternaria brassicicola en coliflor: En las Tablas 7 y 8 se muestra el efecto de la cepa fúngica J1446 como abono líquido (2 concentraciones diferentes) a 4 valores de pH diferentes, y en la Tabla 9 se describe el efecto de diferentes preparaciones cuando se utiliza abono líquido. De manera similar, en la Tabla 10 se muestran los efectos de las diferentes preparaciones cuando se utiliza abono líquido, en los que la infección fue más potente que en el ensayo de la Tabla 9.

Control del hongo Fusarium culmorum en trigo en dos sustratos de crecimiento diferentes: La Tabla 11 muestra el efecto de control de la cepa fúngica cultivada en una placa y de una preparación en fase sólida cuando se utiliza abono líquido. Temperatura 15ºC. Turba como sustrato de crecimiento. El ensayo descrito en la Tabla 12 es similar excepto en que el sustrato de crecimiento utilizado fue arena, y en el que además de la infección artificial por F. culmorum también hubo una infección natural derivada a partir del suelo del campo.

TABLA 1 El efecto de control de la cepa fúngica J1446 frente al hongo Rhizoctonia solani en coliflor a dos temperaturas diferentes (20ºC y 25ºC)

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

TABLA 4 El efecto del tratamiento en el riego con J1446 (10^{6}/ml, 4 ml/planta) frente al hongo Pythium en pepino. Ensayo en maceta, turba como sustrato de crecimiento. R = cultivo con agitación en líquido, N = líquido fermentado, KF = crecido en fase sólida y M = microbio crecido en placa. El resultado del cultivo con agitación como media de 2 lotes y el resultado de la fermentación líquida como media de 3 lotes

4

TABLA 5 El efecto de los tratamientos con abono con J1446 frente al hongo transmitido por el suelo Pythium sylvaticum en eneldo. F = crecido en un fermentador de 30 litros, muestra 2/94 (7 x 10^{8} cfu/g)

5

TABLA 6 El efecto del tratamiento en el riego con J1446 frente al hongo transmitido por el suelo Pythium con concentraciones diferentes. Pepino como planta de ensayo. R = cultivo con agitación lote 57/93/1 7d (1,7 x 10^{8} cfu/g)

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7 El efecto de control de la cepa fúngica J1446 (abono líquido 10^{5}/ml) frente a podredumbre producida por Alternaria brassicicola en coliflor. 4 ensayos en maceta a diferentes valores de pH, turba como sustrato de crecimiento

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8 El efecto de control de la cepa fúngica J1446 (abono líquido 10^{6}/ml) frente a podredumbre producida por Alternaria brassicicola en coliflor. 4 ensayos en maceta a diferentes valores de pH, turba como sustrato de crecimiento

8

TABLA 9 El efecto de control de preparaciones de J1446 frente al hongo Alternaria en coliflor. R = cultivo con agitación en líquido, N = fermentación en líquido, KF = cultivado en fase sólida, y M = microbio cultivado en una placa. Los resultados del cultivo con agitación como la media de 2 lotes y los resultados de la fermentación en líquido como la media de 4 lotes. Ensayo en maceta, turba como sustrato de crecimiento

9

TABLA 10 Efecto de control de preparaciones de J1446 (abono líquido 10^{6}/ml) frente al hongo Alternaria brassicicola en coliflor. R = cultivo con agitación en líquido, KF = cultivado en fase sólida, y M = microbio cultivado en una placa. Los resultados del cultivo con agitación como la media de 7 lotes. Ensayo en maceta, turba como sustrato de crecimiento

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 11 El efecto de J1446 (abono líquido 10^{6}/ml) frente al hongo Fusarium culmorum en trigo Polkka como la media de tres ensayos en maceta (pH 5,6, 6,3 y 7,0). Turba como sustrato de crecimiento. Temperatura 15ºC. M = microbio cultivado en una placa, y KF = cultivado en fase sólida (3,8 x 10^{8} cfu/g)

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 12 Efecto de J1446 (abono líquido 10^{6}/ml) frente al hongo Fusarium culmorum en trigo Polkka como la media de cinco ensayos en maceta (pH 5,3, 6,5, 7,1, 7,4 y 8,0). Arena como sustrato de crecimiento. Temperatura 15ºC. M = microbio cultivado en una placa, y KF = cultivado en fase sólida

12

(C) El efecto de las cepas fúngicas de la invención frente a hongos que producen podredumbre Enfermedades y plantas de ensayo

Alternaria: transmitido por las semillas; coliflor

Rhizoctonia: transmitido por el suelo; coliflor

Pythium: transmitido por el suelo; remolacha, lechuga, pepino

Fusarium: transmitido por el suelo; tomate

Diluciones: 1 placa/litro de turba, en la que la cantidad de esporas es aproximadamente 10^{6}/ml de turba.

Mezclado y almacenamiento: Los micelios y las esporas fúngicos se rasparon de una placa (edad no menor de 3 semanas) con un porta y se mezclaron con agua destilada con Ultra Turrax, 100 ml/litro de turba (1 placa/100 ml de agua/1 litro de turba), la suspensión se mezcló con turba y la turba se almacenó a temperatura ambiente durante 1 día, 1 semana, 2 semanas o 1 mes dependiendo del ensayo.

Turba: En todos los ensayos la turba se fertilizó utilizando 800 g de dolomita y 150 g de turba Y-lannos/100 l de turba (Y-lannos = marca registrada de un fertilizante universal Finés), y se vaporizó. La turba de inoculación se preparó mezclando 1 placa PDA de hongo patógeno con el agar con agua utilizando Ultra Turrax y mezclando la suspensión con la turba vaporizada (1 placa PDA de hongo/100 ml de agua/litro de turba). La turba se almacenó a temperatura ambiente. La turba contaminada se mezcló con la turba vaporizada para los ensayos en la proporción de 1:19 antes de la mezcla de la suspensión antagonista.

Realización

Los ensayos en coliflor y en remolacha: (Rhizoctonia, Alternaria, Pythium) Las semillas se sembraron en macetas de plástico de 0,5 litros, 25 semillas/maceta. Se utilizaron cinco réplicas. El cultivo se llevó a cabo a la temperatura de 18-20ºC, en una luz continua de aproximadamente 6.000-8.000 lux.

Análisis: La emergencia de las plántulas se contó después de 9 días después de la siembra. Las muertas se contaron y se desecharon en intervalos de dos días hasta el final del ensayo. El ensayo se paró después de aproximadamente tres semanas desde la siembra (18-22 días). Después, se analizaron los daños en las plántulas en la escala de 0-3:

0 = sanas

1 = podredumbre en las hojas de los cotiledones

2 = las raíces y la base de la plántula ligeramente enfermas

3 = la base de la plántula muy enferma, la plántula muerta.

A partir de los resultados se contó la cantidad de plántulas sanas como porcentaje de las semillas sembradas (por lo tanto, las semillas no emergidas también se tuvieron en consideración). También se pesó el peso seco de la plántula (17 horas a 105ºC).

Ensayos con abono: Las semillas de coliflor se abonaron con tres concentraciones antagonistas: 1 placa de hongo/25 ml de agua (10º, con 10^{7}cfu) y diluciones de ésta 10^{-1} (cfu 10^{6}) y 10^{-2} (cfu 10^{5}). Para la remolacha se utilizaron diluciones 10º y 10^{-2}. Se pipetearon 5 ml de suspensión en las semillas, que se dejaron actuar durante un minuto. Las semillas se secaron en un papel de filtro hasta el día siguiente, en el que se plantaron. La realización y el análisis del ensayo se llevaron a cabo de manera análoga a los otros ensayos con col y remolacha.

Tomate: En los ensayos se utilizaron 10 réplicas, cada réplica con una plántula. Las semillas se plantaron en turba no vaporizada.

Ensayo 1: En el fondo de una maceta de plástico de 1 litro se puso un papel de filtro, en el que se pusieron 10 g de turba contaminada y la maceta se llenó con turba antagonista. Cuando tuvieron 12 días, las plántulas se plantaron en macetas. El tiempo de cultivo fue 2 meses.

Análisis: Se cortó una pieza de 10 cm de la base del tallo y a la altura de aproximadamente un metro. La superficie cortada se examinó visualmente. Si no se observó claramente un oscurecimiento de los haces vasculares, se pusieron piezas del tallo de 0,5 cm de grosor en medio maíz-estreptomicina (4 piezas/placa). Se examinaron los medios después de dos semanas. La escala de gradación en el ensayo fue 0-5:

0 = base sana

1 = sin enfermedad visualmente, pero enfermedad en las piezas de la base en los cultivos en agar

2 = la base está claramente marrón (ocularmente)

3 = la base está claramente enferma, en los cultivos en agar enfermedad también a la altura de 1 metro

4 = enfermedad visualmente también a la altura de 1 metro

5 = la planta estaba muerta.

Ensayo 2: El cultivo inicial como en el ensayo 1. Las plántulas se plantaron cuando tenían 15 días en macetas de un litro en turba, en la que se habían mezclado turba contaminada (1:19) y suspensión antagonista. Cultivo durante 47 días. Análisis: se cortó una pieza del tallo en la base y a la altura de 50 cm. Ambas piezas se pusieron en medio maíz-estreptomicina. Se examinaron los cultivos después de dos semanas. En el análisis se utilizó la escala 0-4:

0 = sana

1 = en agar crecimiento en las piezas de la base

2 = la enfermedad detectable visualmente en la base

3 = enfermedad a 50 cm, descenso del crecimiento

4 = la planta está muerta

Pepino

Pythium: 10 réplicas, 1 planta/réplica. Se germinaron las plántulas en turba pura durante 11 días, se plantaron en turba contaminada y tratada. El tiempo de cultivo después del tratamiento fue 24 días, en los que el grado de la enfermedad de la base y de las raíces de la plántula se analizó mediante la escala 0-5:

0 = sana

1 = raíces ligeramente enfermas, la base sana

2 = las raíces y la base ligeramente dañadas

3 = las raíces y la base claramente enfermas

4 = las raíces casi muertas, la base enferma

5 = la planta está muerta

Además, se midió la longitud de las plántulas y se pesó el peso seco.

Phomopsis: 3 réplicas, 3 plantas en cada una. Se sembraron las semillas pregerminadas en macetas de 0,5 litros, en la base de las cuales se pusieron 10 g de turba contaminada, y las macetas se llenaron con turba antagonista. Después de 19 días las plántulas se transfirieron a macetas de 3 l con turba vaporizada. Las plántulas se cultivaron en luz artificial a aproximadamente 20ºC. Se realizó una fertilización adicional 2 veces a la semana. El ensayo se paró después de tres meses después de la siembra.

Análisis: El grado de la enfermedad de los brotes de pepino se examinó en la escala 0-5:

0 = planta sana

1 = en las raíces unos pocos síntomas de enfermedad, la base sana

2 = raíces ligeramente enfermas, la base ligeramente dañada

3 = las raíces y la base claramente dañadas

4 = la planta marchita, raíces dispersas, la base marrón

5 = la planta está muerta

Lechuga: La semillas (35) se sembraron en una bandeja de macetas en serie (Vefi-VP 96) en turba contaminada con Pythium y tratada con un antagonista. Las plántulas se cultivaron durante 6 semanas, después de las cuales se analizaron la salud y el espesor de las raíces de las plántulas en la escala 0- 3:

0 = raíces sanas

1 = ligeramente más delgadas

2 = claramente más delgadas y raíces oscurecidas

3 = la plántula casi muerta

Se pesó el peso fresco de las plántulas.

Ensayos con J1446 en polvo Cantidad de ensayos aplicados

Plantas de ensayo: coliflor y remolacha.

Cantidades aplicadas

1	gJ1446 en polvo/litro de turba
0,5	g/litro de turba
0,1	g/litro de turba
0,05	g/litro de turba
0,01	g/litro de turba
0,001	g/litro de turba.

El polvo se mezcló con agua (100 ml/litro de turba) utilizando Ultra Turrax, se mantuvo durante una hora y se mezcló con la turba. La siembra, la gestión y el análisis del ensayo se llevaron a cabo de manera similar a los otros ensayos con coliflor y remolacha.

Resultados TABLA 13 El efecto de los antagonistas mezclados con turba frente a podredumbre producida por Pythium en remolacha. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{5}-10^{6}/ml de turba). Los ensayos se sembraron un día y una semana o un mes después del tratamiento con el antagonista

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 14 El efecto de los antagonistas mezclados con turba frente a podredumbre producida por Pythium en remolacha. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{5}-10^{6}/ml de turba). Los ensayos se sembraron un día y un mes después del tratamiento con el antagonista

\vskip1.000000\baselineskip

15

TABLA 15 El efecto de antagonistas mezclados con turba frente a podredumbre producida por Pythium en remolacha. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{5}-10^{6}/ml de turba). Los ensayos se sembraron un día y un mes después del tratamiento con el antagonista

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 16 El efecto de antagonistas mezclados con turba frente a podredumbre producida por Pythium en remolacha. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{5}-10^{6}/ml de turba). Los ensayos se sembraron un día y un mes después del tratamiento con el antagonista

\vskip1.000000\baselineskip

17

TABLA 17 El efecto de antagonistas mezclados con turba frente a podredumbre producida por Rhizoctonia transmitido por el suelo en coliflor. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{5}-10^{6}/ml de turba). Los ensayos se sembraron un día y una semana o dos semanas después del tratamiento con el antagonista

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 18 El efecto de antagonistas mezclados con turba frente a podredumbre producida por Rhizoctonia transmitido por el suelo en coliflor. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{5}-10^{6}/ml de turba). Los ensayos se sembraron un día y un mes después del tratamiento con el antagonista

\vskip1.000000\baselineskip

19

TABLA 19 El efecto de antagonistas mezclados con turba frente a podredumbre producida por Rhizoctonia en coliflor. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{5}-10^{6}/ml de turba). Los ensayos se sembraron un día y un mes después del tratamiento con el antagonista

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 20 El efecto de antagonistas mezclados con turba frente a podredumbre producida por Alternaria transmitido por el suelo en coliflor. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{6}/ml de turba)

\vskip1.000000\baselineskip

21

TABLA 21 El efecto del abono de antagonista frente a enfermedades producidas por Rhizoctonia y Pythium transmitidos por el suelo

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 22 El efecto de antagonistas mezclados con turba frente al hongo Fusarium en tomate. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{5}-10^{6}/ml de turba)

\vskip1.000000\baselineskip

23

TABLA 23 El efecto de antagonistas mezclados con turba frente a la enfermedad producida por Pythium en lechuga. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{5}-10^{6}/ml de turba)

24

TABLA 24 Los antagonistas mezclados con turba frente a la enfermedad producida por Phomopsis en pepino. Concentración 1 placa/litro de turba (cfu 10^{6}/ml de turba)

31

TABLA 25 El efecto de J1446 en polvo frente a podredumbre producida por Rhizoctonia en coliflor. El polvo se mezcló con turba como una suspensión de agua

25

TABLA 26 El efecto de J1446 en polvo frente a podredumbre producida por Pythium en remolacha. El polvo se mezcló con turba como una suspensión de agua

26

(D) Comparación entre el aislado J1446 y preparaciones comerciales en ensayos de invernadero y de campo (a) Ensayos de selección con J1446 frente al hongo Fusarium culmorum

Ensayo en arena: J1446 que obtuvo las clasificaciones 0, 0, 0, 0, 0 y 1 se utilizó en las etapas siguientes del ensayo.

Ensayo en turba

32

Ensayo de campo en suelo

33

(b) Ensayos de invernadero y de campo en suelo con J1446 TABLA 27 Ensayo de invernadero con cebada contaminada de manera natural (Fusarium nivale)

35

TABLA 28 Ensayo de campo con trigo infectado artificialmente (Fusarium culmorum) en el verano de 1992

27

TABLA 29 Ensayo de campo con cebada contaminada de manera natural (Fusarium nivale) en el verano de 1992

28

TABLA 30 Ensayo de campo con trigo infectado artificialmente (F. culmorum) en el verano de 1993. El tamaño fue una fila de 1,4 m

36

TABLA 31 Ensayo de campo con trigo "contaminado de manera natural" (F. culmorum) en el verano de 1993. Las semillas se produjeron en el verano previo y se infectaron durante la floración con una suspensión de conidios de Fusarium. Las diferencias entre los resultados del rendimiento no son significativas estadísticamente

29

TABLA 32 Ensayo de campo frente a causas de podredumbre de la base transmitidas por el suelo (Fusarium spp. / Gaueumannomyces graminis) en trigo en el verano de 1993

30

(E) El mecanismo de acción de las cepas

La detección de las vías por las que las cepas fúngicas de Gliocladium catenulatum de la invención actúan sobre otros hongos acaba de comenzar. Actualmente, sólo se tienen observaciones microscópicas de la interacción de los micelios en cultivos dobles, en los que un aislado de los hongos siguientes se cultivó con la cepa fúngica J1446: Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum y Pythium sp. Los micelios de todos estos hongos patógenos para las plantas empiezan a degradarse cuando los micelios de la cepa fúngica J1446 crecen cerca de ellos. Primero, se forman vacuolas grandes en las células, después las células se vacían y finalmente se degradan las paredes celulares. Esta clase de reacciones es debida, de manera evidente, a sustancias semejantes a antibióticos o a enzimas que J1446 secreta en su entorno. Obviamente, R. solani es el hongo más sensible de los hongos mencionados a las sustancias que produce J1446. En medios nutritivos delgados el crecimiento de las colonias de este hongo se detiene totalmente cerca de las colonias de J1446 y, como consecuencia de esto, se puede observar a simple vista una pequeña zona de inhibición. Una parte de los micelios de los tres hongos estudiados permanece sin degradar antes del contacto de los micelios. También parece que éstos se degradan más adelante, cuando los micelios de la cepa fúngica J1446 los envuelve. La potencia de esta envoltura parece depender del medio de crecimiento utilizado. No se ha visto que los micelios de la cepa fúngica J1446 penetren en los micelios de otros hongos.

La interpretación de los resultados

Se ha probado que las cepas fúngicas de Gliocladium catenulatum que son objeto de la invención son prometedoras para utilizarse en el control biológico de las enfermedades de las plantas. Por encima de todas las cepas se ha detectado la posible utilización de la cepa J1446. Ésta actúa bien frente a tres causas de podredumbre habituales transmitidas por el suelo: los hongos Rhizoctonia solani, Pythium y Fusarium. De manera adicional, se han obtenido buenos resultados con la misma en el control de las enfermedades transmitidas por las semillas producidas por los hongos Alternaria y Fusarium. Con las cepas fúngicas y las formulaciones de la invención se han obtenido buenos resultados utilizando cantidades que son evidentemente realistas en los cultivos en la práctica. También es muy prometedor que cuando se mezclan con el medio de crecimiento mantienen su capacidad de controlar las enfermedades transmitidas por el suelo en los ensayos durante periodos de tiempo largos.

De acuerdo con las observaciones hechas hasta ahora, parece que las cepas fúngicas de la invención podrían incluso promover la emergencia y el crecimiento de las plantas y mejorar su calidad. También se ha visto que el tratamiento del medio de crecimiento con estas cepas disminuye el crecimiento de los hongos que son perjudiciales en sí mismos, lo que promueve la emergencia de las plantas con semillas pequeñas y que brotan lentamente.

Microorganismos depositados

Las cepas fúngicas siguientes se depositaron en el depósito DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, D-38124 Alemania.

Microorganismo	Número de referencia	Fecha del depósito
Gliocladium catenulatum J1446	DSM 9212	19 de Mayo de 1994
Gliocladium catenulatum M67-6	DSM 9213	19 de Mayo de 1994
Gliocladium catenulatum J2734	DSM 9214	19 de Mayo de 1994
Gliocladium catenulatum M2423	DSM 9215	19 de Mayo de 1994
Gliocladium catenulatum M3081	DSM 9216	19 de Mayo de 1994

Claims

1. Un cultivo puro de la cepa fúngica Gliocladium catenulatum J1446 (DSM 9212).

2. Un cultivo puro de la cepa fúngica Gliocladium catenulatum M67-6 (DSM 9213).

3. Un cultivo puro de la cepa fúngica Gliocladium catenulatum J2734 (DSM 9214).

4. Un cultivo puro de la cepa fúngica Gliocladium catenulatum M2423 (DSM 9215).

5. Un cultivo puro de la cepa fúngica Gliocladium catenulatum M3081 (DSM 9216).

6. Una sustancia biofungicida, que comprende una cepa fúngica de Gliocladium catenulatum seleccionada de Gliocladium catenulatum J1446, M67-6, J2734, M2423 y M3081 que tienen los números de referencia DSM 9212, DSM 9213, DSM 9214, DSM 9215 y DSM 9216, respectivamente.

7. Una composición biofungicida para controlar las enfermedades de las plantas, que comprende una cepa fúngica de Gliocladium catenulatum seleccionada de las cepas fúngicas de Gliocladium catenulatum de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y vehículos y/o aditivos convencionales en el campo.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que se utilizan como vehículos y aditivos uno o más de los siguientes: sílice, caolín, leche en polvo, carboximetil celulosa, sacarosa, lignina y almidón.

9. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, que se prepara mediante

(a) cultivo de una cepa fúngica de Gliocladium catenulatum en un medio de crecimiento adecuado, separación de la masa celular y adición de vehículos y/o aditivos, secado de la masa obtenida y molido hasta convertirla en polvo, o

(b) cultivo de una cepa fúngica de Gliocladium catenulatum en un medio de crecimiento adecuado con sílice y adición, si se desea, de vehículos y/o aditivos, secado de la masa obtenida y molido hasta convertirla en polvo.

10. Un método para inhibir una infección fúngica de una planta, que comprende aplicar a la planta o a las semillas de ésta una sustancia de acuerdo con la reivindicación 6 o una composición de cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 o añadir lo mismo al sustrato de crecimiento antes o después de sembrar las semillas.

11. Utilización de una cepa de Gliocladium catenulatum de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para controlar enfermedades de las plantas.