JPH02238890A - 甘味料の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、ルブソサイドを出発原料とする新規な甘味
料の製造方法に関するものである．（従来の技術） 近年、人工甘味料であるサッカリン、ズルチン、チクロ
等が安全性の点から、一般食品への使用が禁止され、ま
たは規制される傾向にある．一方では、近年砂糖の採り
過ぎによる健康上の影響が問題にされはじめたことから
、よりカロリーの少ない天然甘味料の開発が熱望されて
いる。

これに対して、南米パラグアイ原産のキク科植物である
ステビアから得られるカウレン系ジテルベン配糖体ステ
ビ才サイドは砂糖と異なり、低カロリーの甘味料であり
、しかも甘味度は砂糖の約１４５倍と高く、砂糖に替わ
る甘味料として注目されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、ステビ才サイドの甘味の質には、若干の苦味、
嫌味があり、更に残味が長く尾を引くという欠点がある
ため、αまたはβグルコシル転移酵素でグルコシル化す
ることにより、これらの欠点を改善した製品が生産され
ているが、未だに充分な成果を収めるに至っていない． 一方、中国南部広西、広東地方に野生するバラ科キイチ
ゴ属の潅木、甘葉懸鈎子の葉からはルブソサイドが得ら
れるが、このルブソサイドは下記の構造式（１）で示さ
れるように、その骨格がステビオサイドと同じ、ジテル
ペン系甘味配糖体である． （式中、β一ｇｌｕｅ　：β−グルコシル基を表わす）
このルブソサイドは甘味質においてステビ才サイド同様
、苦味、嫌味があるなどの欠点があるが、その反面ステ
ビア中にはステビオサイド以外にも６種類の構造の異な
る甘味物質が存在するのに対して甘葉懸鈎子の葉中には
ルブソサイド１種類しか存在せず、ルブソサイドを単離
し易いという特徴がある． （問題点を解決するための手段） 本願発明者らは、この点に注目してルブソサイドを出発
原料として味質、甘味度ともに優れた甘味料を開発する
目的で、鋭意研究した結果、ルブソサイドとα−ガラク
トシル糖化合物（以下、糖供与体と記す）とを含有する
水溶液または懸濁液に、α−ガラクトシル転移酵素を作
用させ、ルブソサイドの１３位のＯＨにエーテル結合す
るβ−グルコシル基（以下、１３位のグルコシル基と記
す）乃至１９位のＣＯＯＨにエステル結合するβ−グル
コシル基（以下、１９位のグルコシル基と記す）の一方
或は両方にガラクトシル基が１乃至２分子結合させた構
造のα−ガラクトシルルブソサイド及びα一ガラクトビ
オシルルブソサイドを甘味成分とする甘味料の製造方法
を提案するものである。

上記構造のα−ガラクトシルルブソサイド及びａ−ガラ
クトビ才シルルブソサイドは、具体的には下記の構造式
（　ＩＩ　）で表わされる。

（式中、Ｒ．．Ｒ．　　：β−ｇｌｕｃ．β−ｇｌｕｅ
−ａ　−　ｇａｌ．β−ｇｌｕｃ−ａ−ｇａｌ−　ａ−
ｇａｌから選ばれた基、β一ｇｌｕｅ：β−グルコシル
基、α−ｇａｌ　：α−ガラクトシル基を表わす） この発明に用いるルブソサイドは、精製されたルブソサ
イドに限定されることなく、例えば甘葉懸鈎子の抽出液
または中間精製物でも良い．また糖供与体はメリビ才−
ス、ラフィノース、スタキ才一ス、ガラクチノール等α
結合したガラクトシル基を含むオリゴ糖または配糖体等
が使用される． この発明に用いるα−ガラクトシル転移酵素は、ルブソ
サイドと糖供与体を含有する水溶液に作用させるとき、
糖供与体を分解し、そのα−ガラクトシル基、１乃至２
分子をルブソサイドの１３位又は１９位のグルコシル基
に選択的に、また酵素によっては１３位及び１９位のグ
ルコシル基にガラクトースを転移させ、α−ガラクトシ
ルルブソサイド及びα−ガラクトビオシルルブソサイド
を生成するものであれば何れも使用可能である。

α−ガラクトシル転移酵素は自然界にかなり広範に存在
している．例えばハタンキョウ、アーモンド、アンズ、
コーヒーの種子等の植物、カタツムリの消化液、哨乳動
物の臓器等に含まれている。

また微生物の場合はアブシジア・リフレキサ（Ａｂｓｉ
ｄｉａ　ｒｅｆｌｅｘａ）　．アブシジア・ラモーサ（
Ａｂｓｉｄｉａ　ｒａｍｏｓａ）、シルシネラ・キネン
シス（（：ｉｒＣｉｎｅｌｌａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）
、シルシネラ・ムコロイデス［Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　
ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓｌ，モルチェレラ・ラマニアナ（
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｒａｍａｎｉａｎａｌ　．モ
ルチェレラ“ヴイナセア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｖ
ｉｎａｃｅａｌ等の糸状菌、エシエノキア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、バシラス・アエロゲ
ネス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓｌ等の細
菌、サツ力ロミセス゜ウバラム（Ｓａｃｃａｒｏｎ＋ｙ
ｃｅｓ　ｕｖａｒｕｍ）、サツ力ロミセス・ルキシー（
ＳａｃｃｈａｒｏＩＩＩｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）、ビ
キア・ギルラーモンデ４−（Ｐｉｃｈｉａ　ｇｕｉｌｌ
ｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）等の酵母等、各種微生物から生産
されるα−ガラクトシダーゼを使用することができる． これらα−ガラクトシル転移酵素は前記の条件を満足す
るものであれば良い．例えば、モルチェレラ・ラマニア
ナの生産するα−ガラクトシダーゼの場合、ルブソサイ
ドの１３位のグルコシル基にのみ選択的に１乃至２分子
のガラクトースが転移することを確認した。

この発明に使用するα−ガラクトシル転移酵素の調整方
法としては、該微生物の固体培養及び液体培養物のいず
れも使用することができるが、最近では一般に液体培養
が主流となっている。

この場合、その培養液は通常不溶物を除去した上澄液を
酵素として使用するが、菌体内酵素である場合は分離し
た菌体をそのまま使用するか、酵素を抽出して分離上澄
液を使用すれば良い．また必要に応じて上記抽出液を更
に公知の方法により、精製した酵素を用いてもよい．動
植物起源の酵素を使用する場合は、公知の方法により抽
出，精製すればよく、目的に応じて粗製、精製品の何れ
かを選択すれば良い． 反応に用いるルブソサイドは水に溶解させ、反応液中の
濃度を約１〜４０％（Ｗ／１１とし、糖供与体は約０．
５〜５０％ｆＷ／１１とすることが好ましく．また反応
系でのルブソサイドに対する糖供与体の比率は使用する
糖供与体によっても異なり、０．１〜５０倍の節囲で用
いられるが、好ましくは１〜１０倍の範囲である． 反応液のｐＨと温度は、通常ｐｌ｛５．０〜８．０、温
度３０〜６０℃が適当である．　使用酵素活性量は反応
時間と密接な関係があり、通常は５〜１２０時間、好ま
しくは５〜４８時間で反応が終了する酵素活性量にすれ
ばよいが、これらに限定されるものではない． （発明の効果） 以上のような方法により、反応させて得られた液を例え
ば高速液体クロマトグラフィーにかけて分画、分取した
後、１３Ｃ−ＮＭＲにより構造解析し、また１９位のエ
ステル結合部をヨウ化リチウム、２．６−ルチジン，メ
タノール試薬を用いて分解し、その分解した糖部を単離
精製して薄層クロマトにより定性分析した結果、上記構
造式（Ｉ１）に示すようなガラクトシル転移生成物であ
ることを確認した． 上記のようにして得られた反応生成物の甘味度は原体の
ルブソサイドと比較して改良され、更に苦味、嫌味を有
する味質も改善されることを確認した。したがって、こ
のようにしてガラクトース転移生成物を生成せしめた反
応溶液はそのまま甘味料として使用できるが、必要に応
じて酵素を失活させ、濾過後その溶液をイオン交換樹脂
、例えばＨ型強酸性イオン交換樹脂及びＯＨ型弱塩基性
イオン交換樹脂を用いて脱塩し、濃縮してシラツブ状の
甘味料とするか、または乾燥、粉末化して粉末状の甘味
料とすることもできる。

更に、脱塩した反応溶液をカラムクロマト法にて精製し
、ガラクトース転移生成物のみを分離採取して、これを
甘味料とすることもできる．この際、濃縮、乾燥、粉末
化は公知の方法によればよい． この発明により得られたガラクトシル転移生成物は味質
がよいので、低カロリーの飲食物、嗜好物等、いわゆる
美容食、健康食、ダイエット食の甘味付けに好適である
．また，うがい藁．練り歯磨等、虫歯予防用の経口用途
医薬部外品への添加にも好適であり、その他医薬品を含
めて甘味を必要とする分野に自由に使用することができ
る．（実施例） 以下、この発明の実施例を示す． 実施例ｌ （１）酵素の調製 グルコース１％、ラクトース１％、Ｃ．Ｓ．Ｌｌ％、リ
ン酸カルシウム０．３％、硫酸マグネシウム０．２％、
硫酸アンモニウム０．６％、食塩０，２％、炭酸カルシ
ウム０．３％の組成からなるｐＨ５．０の培地を調製し
、５００ｍｌの坂口フラスコ１０本にｌｏＯｍｌ宛分注
、滅菌し、アプシジア・リフレキサの胞子懸濁液をｌ　
Ｏ　”／，．　．接種し、３０℃にて７２時間振盪培養
を行なった．この培養液を濾過し、ペレット菌体を集め
、この菌体にケイ砂を加え、乳鉢に磨砕し、水を加えて
酵素を抽出する。

この抽出液を遠心分ｉｉｉ１　（５．００Ｏｒ．ｐ．ｍ
．　１０分間）して菌体を除去し、この分離液に硫酸ア
ンモニウムを飽和度８０％となるように加え、析出した
固形分を濾別した．この塩析物をｐＨ６．０の酢酸緩衝
液に溶解し、セルロースフィルムを用い、同緩衝液に対
し、透析処理を行なった後、ＵＰ膜にてａｔｍし、酵素
液とした。

（２）転移反応 乾燥甘葉懸鈎子の葉を粗砕し、温水を加えて抽出してか
ら、濾過助剤を添加し、充分撹拌後、その液を濾過して
清浄液とした。更に、吸着樹脂（商品名：ダイヤイ才ン
ＨＰ−２０、三菱化成社製）にて、吸着させ溶離後、再
結晶して、純度９７％のルブソサイド（試料１）を調製
した。

上記の方法で調製したルブソサイド３．０ｇ、ラフィノ
ース３３．　４ｇを５０ｎｌＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６
．０Ｈ９１Ｉ＋１にて溶解した後、（１）において調製
した酵素液をＰＮＰＣ活性で１．２４５Ｕを添加し、５
０℃にて４時間反応させた。反応後に酵素を加熱失活さ
せた溶液を吸着樹脂に吸着後、８０％メタノールで溶出
し、未反応ルブソサイドと転移反応生成物（試料２）を
分取した。更に、この転移反応生成物をシリカゲルクロ
マト及び高速液体クロマトグラフにより（Ａ）、（Ｂ）
２点を分画、分取した． この転移生成物（Ａ）、（Ｂ）についてヨウ化リチウム
、２．６−ルチジン、メタノール試薬を用いて、１９位
のエステル結合を選択的に分解し、その分解した糖部を
単離精製し、薄層クロマトにより、糖を調べた結果、（
Ａ）がメリビオース、（Ｂ）がグルコースであることが
明かとなり、更に１３Ｃ　−　Ｎ　Ｍ　Ｒにより解析を
行なった結果、（Ａ）は１９位のグルコシル基にガラク
トースが１分子、（Ｂ）は１３位のグルコシル基にガラ
クトースが１分子転移した化合物であることを確認した
。なお．　１３位．１９位の転移比率はｌ：１であった
。

（３）転移反応生成物の味質試験 試料Ｎｏ．１．２を用いて甘味質について比較テストを
行なった． 試料はそれぞれ３％．５％．８％の砂糖水溶液に相当す
る甘味度に調整した．５％を１例に挙げれば、試料Ｎｏ
．　１は０．０５％、試料Ｎｏ．２は０．　０４５％水
溶液として比較テストを行なった．第１表に示す結果に
よれば、転移反応生成物は、全ての濃度において、甘味
の質は苦味、嫌味がなく、まろやかとなり、明らかに対
照のルブソサイドより優れていた． 第１表 実施例２ （１）酵素の調製 酵素液は菌をモルチェレラ・ラマニアナに替える以外、
実施例ｌの（１）に同じく培養・抽出・塩析・透析を行
ない調製した． （２）転移反応 実施例１で調製したルブソサイド３．０ｇ、ラフィノー
ス２０．　８ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６．０
１２９．５ｍｌにて溶解した後、（１）において調製し
た酵素液をＰＮＰＧ活性で１．３４０Ｕを添加し、５０
℃にて１２時間反応させた．反応後に酵素を加熱失活さ
せ溶液を実施例１の（２）と同じ《処理して転移反応生
成物を分画、分取し、転移生成物２点について、その構
造を調べたところ、これら転移生成物は全て１３位のグ
ルコシル基に選択的に転移されており、そのうち１点は
ガラクトースが１分子、他の１点はガラクトースが２分
子結合して転移した化合物であることを確認した。

この分画前の転移反応生成混合物について甘味質を調べ
たところ、苦味、嫌味がな《まろやかに改善され、実施
例ｌに同じく明らかに対照のルブソサイドより優れてい
た。

実施例３ 実施例ｌで調製したルブソサイド２．０５ｇ　．ラフィ
ノース９，５ｇを５０１ＩＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６
．０１２９ｍｌにて溶解した後、市販のエシエリキアコ
リ起源のα−ガラクトシダーゼをＰＮＰＧ活性で８００
Ｕを添加し、４０゜Ｃにて６時間反応させた．反応後に
酵素を加熱失活させた溶液を実施例ｌの（２）と同じく
処理して転移生成物を分画、分取し、その構造を調べた
ところ、１３位のグルコシル基及び１９位のグルコシル
基の両方にガラクトースが１分子転移した化合物である
ことを確認した。

この分画前の転移生成混合物について、甘味質を調べた
ところ、実施例１と同じ《、苦味、嫌味がなくまろやか
となり、明らかに対照のルブソサイドより優れていた． 実施例４ 実施例ｌで調製したルブソサイド２．０５ｇ　．ラフィ
ノース９．５ｇを５抛Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　６．Ｏｌ
２９ｍｌにて溶解した後、市販のコーヒーの種子起源の
α一ガラクトシダーゼをＰＮＰＣ活性で４００Ｕを添加
し、４０℃にて６時間反応させた．反応後に酵素を加熱
失活させた溶液を実施例１の（２）と同じく処理して転
移生成物を分画、分取し、その構造を調べたところ、実
施例２に同じく、１３位のグルコシル基に選択的にガラ
クトースが転移していることを確認した。なお、この場
合の転移したガラクトースの分子数はｌであった． この分画前の転移生成混合物について甘味質を調べたと
ころ、実施例ｌに同じく苦味、嫌味がなく、まろやかに
改善され、明らかに対照のルブソサイドより優れていた
． 特許出願人　北海道糖業株式会社 同　代理人　弁理士　田中　昭雄 手続補正書（自劃 平成元年７月１３日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ルブソサイドとα−ガラクトシル糖化合物とを含有する
   水溶液または懸濁液に、α−ガラクトシル転移酵素を作
   用させ、ルブソサイドの１３位のＯＨにエーテル結合す
   るβ−グルコシル基乃至１９位のＣＯＯＨにエステル結
   合するβ−グルコシル基の一方或は両方ににガラクトー
   スが１乃至２分子結合させるようにしたことを特徴とす
   る甘味料の製造方法。