JPH02211869A - アルカリプロテアーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アルカリプロテアーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、黄麹菌の１種であるアスペルギルス・オリゼー（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のアルカ
リプロテアーゼ遺伝子の構造については、全く未知であ
り、また、該遺伝子の単離すらされていないのが実情で
ある。

アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水分解
物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵素
であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられている
。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、アルカリプロテアーゼの製造法を提供するこ
とを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、先にアスペルギルス・オリゼー
由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討し
た結果、アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロ
テアーゼ遺伝子及びプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺
伝子を初めて単離及び構造決定することに成功し、特許
出願を行なった（特願昭６３−５１７７７号及び特願昭
６３−２７９４０１号並びに特願昭６３−１７００１８
号及び特願昭６３−２８０３７０号特許出願明細書）。

その後、本発明者等は、プレプロ型アルカリ−ロチアー
ゼ遺伝子を用い、アルカリプロテアーゼを効率よく生産
すべく種々検討した結果、アスペルギルス・オリゼー由
来のプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子をプラスミ
ドベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、
アルカリプロテアーゼ生産能を有するチゴサッカロマイ
セス・ルーキシ−（Ｚｙｇｏｓｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙ
ｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）を培地に培養すれば、該酵母菌
体外に効率よ（アルカリプロテアーゼが分泌生産される
こと等の知見を得、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、アスペルギルス属の微生物に由来
し、下記の制限酵素地図で規定されるプレプロ型アルカ
リプロテアーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡを含み、アルカリプロテアーゼ生産能を有
するチゴサッカロマイセス属に属する微生物を培地に培
養し、培養物よりアルカリプロテアーゼを採取すること
を特徴とするアルカリプロテアーゼの製造法である。

（式中、ＥはＥｃｏＲＩ、ＡはＡｆｌｌｌ、　ＫはＫｐ
ｎｌ。

ＸはＸ５ｎｌ、Ｓは５ａ１１．ＢはＢｇｌＩ［、ＨはＨ
ｉｎｄ■を示す） 以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、本発明に用いられるアルカリプロテアーゼ遺伝子
のドナーとして用いられるアスペルギルス・オリゼーと
しては、例えば、アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ
２０３８６）等が挙げられる。

次いで、上記微生物を、特公昭４Ｂ−３８８７３号公報
記載の方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培
養物から常法、例えば、濾過、遠心分離処理等によりア
スペルギルス・オリゼーの菌体を得る。

上記アスペルギルス・オリゼーの菌体よりトＲＮＡを調
製するには、例えば、菌体の破砕の際、ガラスピーズ及
びフェノールを用いる以外は、例えば、「モレキュラー
・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｆａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、第１９６頁、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）及び「分子遺
伝学実験法」、小関治男、志村令部、第６６〜６７頁（
１９８３）記載の方法等により得ることができる。

得られたーＲＮＡよりアルカリプロテアーゼコードする
ａ＋−ＲＮＡ（以下、アルカリプロテアーゼトＲＮＡと
いう）を濃縮するには、例えば、「バイオメディカル・
リサーチ（ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ）　
Ｊ第３巻、第５３４〜５４０頁（１９８２）記載の方法
により行うことができる。

なお、この際、アルカリプロテアーゼに対する抗アルカ
リプロテアーゼ血清を使用するのであるが、該血清は、
例えば、「免疫化学」、山村雄−第４３〜５０頁（１９
７３）記載の方法により得ることができる。

アルカリプロテアーゼ−ＲＮＡよりｃ−ＤＮＡを合成す
るには、例えば、「モル・セル・パイオル」（Ｍｏ１．
Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．）、第２巻、第１６１頁（１９８
２）及び「ジーン」（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２６３
頁（１９８３）記載の方法により行うことができる。

次いで、このようにして得られたｃ−　Ｄ　Ｎ　Ａをベ
クターＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＨｃ１１９Ｄ　Ｎ
　Ａ（宝酒造社製）等に組み込み、種々の組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例えば、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ　１　（ＡＴＣＣ　３３８４
９）、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｔ）　Ｈ　Ｂ　１０１（ＡＴＣＣ　３３６９４）
等をハナハン（ｔｌａｎａｈａｎ）の方法〔「ディーエ
ヌエイ・クローニングＪ　　（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）　）によ
り形質転換し、種々の形質転換株を得る。

上記の種々な形質転換株よりアルカリプロテアーゼをコ
ードするｃ−ＤＮＡ（以下、アルカリプロテアーゼｃ−
　Ｄ　Ｎ　Ａという）を検出するには、ハイブリダイゼ
ーション・セレクション〔「モレキュラー・クローニン
グＪ　（ＭｏＩｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｆｎｇ）　、第
３２９〜３３３頁及び第３４４〜３４９頁、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇｌｌａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１
９８２年）〕により検出することができる。

次いで、不完全なアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを３
ｔｐを用いニックトランスレージタン法〔「モレキュラ
ー・クローニングＪ　　（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ）、第１０９　〜１１２頁、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２年）
、及び「ジェイ・モル・パイオルＪ　（Ｊ．Ｍｏ１．　
Ｂｉｏｌ．）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９
７７）　］により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプロー
ブとしてコロニーハイブリダイゼーション法〔「蛋白質
・核酸・酵素」、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９
８１）　）によりプラスミドｐＵｃ１１９Ｄ　Ｎ　Ａを
ベクターとして作成したｃ−ＤＮＡのシーンバンクのラ
イブラリーより１．　５　Ｋｂのアルカリプロテアーゼ
ｃ−ＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを得ることがで
きる。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡよりアスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプ
ロテアーゼをコードする遺伝子においてプレプロ領域を
有するもの（以下、プレプロ型アルカリプロテアーゼ遺
伝子という）を含有するＤＮＡを得るには、該プラスミ
ドＤＮＡに、制限酵素、例えば旦ｃｏＲＩを温度３０〜
４０°Ｃ、好ましくは３７°Ｃで１〜２４時間、好まし
くは２時間作用させ、得られた反応終了液を、アガロー
スゲル電気泳動法〔「モレキュラー・クローニング」（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第１５０頁
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）（１９８２）記載〕によりアスペルギルス・オ
リゼー由来のプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子を
含有するＤＮＡを得ることができる。

そして、このプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子の
塩基配列の決定を実施例の項目１１に示すような方法に
よって行ない（第５図に塩基配列を示す）、次いで、前
記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペブ
タイドのアミノ酸配列を確定する（第６図参照）。

次いで、後記実施例の項目１２に記載と同様にし、例え
ば種々のベクターＤＮＡに、制限酵素ＥｃｏＲＩ、　　
Ｐｓｔｌ、　Ｓ’ａｌ　Ｉ、　　ＰｖｕＩＩ及び５ｓｐ
Ｉ（いずれも宝酒造社製）を温度３０〜４０°Ｃ１好ま
しくは３７°Ｃで１〜１６時間、好ましくは２時間作用
させて、該ベクターＤＮＡを切断したものに、上記のよ
うにして得たプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子を
含有するＤＮＡ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
等のＤＮＡリガーゼを添加して常法により連結させて組
み換え体ＤＮＡを得る。

また、発現ベクターＤＮＡとしては如何なるものでもよ
く、例えば、後記実施例の項目１２記載の組換え体プラ
スミドｐｓＲＴ３０３Ｐ及びｐＧＡＧ４１　Ｄ　Ｎ　Ａ
を組み換えることにより得られる組換え体プラスミドｐ
ＺＡＰ１０１Ａ　Ｄ　Ｎ　Ａによりプロプレ型アルカリ
プロテアーゼ遺伝子部分を取り除き連結して得られるプ
ラスミドベクター等が挙げられる。

そして、このようにして得られた組み換え体ＤＮＡを用
いて、チゴサッカロマイセス属に属する微生物例えば、
チゴサッカロマイセス・ルーキシ−（ＩＰｏ　１８７６
）等を、木材の方法〔組み換えＤＮＡ実験技術、第２４
３〜２５３頁（１９８５）　）により形質転換して、プ
レプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子をベクターＤＮＡ
に挿入した組み換え体ＤＮＡを含みアルカリプロテアー
ゼ分泌生産能を有するチゴサッカロマイセス属に属する
微生物を得る。

このようにして得たチゴサッ力ロマイセス属に属する微
生物より、純化された新規な組換え体ＤＮＡを得るには
、例えばブロク・ナトル・アカド・サイ（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）第６２巻、第１１５
９〜１１６６頁（１９６９）記載の方法等により得るこ
とができる。

次いで、上記微生物を培地に培養し、培養物よりアルカ
リプロテアーゼを採取するのである。

培地としては、例えば、チゴサッカロマイセス属に属す
る微生物の培養に用いられるものであれば、如何なるも
のでもよく、例えば、グルコース、ポリペプトン、酵母
エキスからなるＹＰＤ培地にゲンチシン（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｉｎ）　　（ギブコ・ラボラトリ−（ＧＩＢＣＯＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製、抗生物質Ｇ４１Ｂ硫酸塩の
商標名〕を含有させた培地等が挙げられる。

また、培養温度は、例えば、２５〜３５°Ｃ１好ましく
は３０°Ｃ程度で、培養時間は、例えば、６〜１００時
間、好ましくは７２時間程度である。

そして、培養物を、例えば、３，０００ｒ、ｐ、ｍ、で
２分間程度の遠心分離処理又はメンブランフィルタ−処
理し、培養液及び菌体を得、得られた培養液は、粗酵素
液として用いることができ、また、得られた菌体を、例
えば、ガラスピーズと共に、ボルテンクスミキサーによ
り３分間程度撹拌して破砕し、粗酵素液を得る。

そして、夫々の粗酵素液は、そのままでも使用可能であ
るが、必要により硫安分画、イオン交換クロマトグラフ
法（例えば、ＤＥＡＥ−バイオゲルＡ等による）ゲル濾
過法（例えば、ウルトロゲルＡｃＡ３４等による）によ
り精製して、純化されたアルカリプロテアーゼを得る。

このようにして得られたアルカリプロテアーゼの理化学
的性質は、「アグル・パイオル・ケム」（Ａｇｒ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第３７巻、第２６８５〜２６９４
頁（１９７３年）に記載されたものと全く同様である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明によれば、プレ
プロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子の組み込まれた組み
換え体ＤＮＡを含む、チゴサッ力ロマイセス属に属する
微生物を培地に培養することにより、極めて短期間のう
ちに、アルカリプロテアーゼを効率よく分泌生産させる
ことができるので、本発明は、産業上極めて有用である
。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。

実施例 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６
）由来のプレプロ型アルカリプロテアーセｃ−ＤＮＡの
クローニング １、菌体の取得 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６
）の胞子（１，２Ｘ　１０”個）を、アルカリプロテア
ーゼ生産培地〔３％（−ハ）加熱、加圧膨化処理した脱
脂大豆、３％（Ｗ／Ｖ）ＫＨｚＰＯ４）　５０ｍに接種
し、恒温振盪機（大洋科学工業社製、Ｍ−１００’　）
を用いて１２Ｏｒ、ｐ、ｍ、　、温度３０°Ｃで４５時
間振盪培養を行ない培養物を得、常法によりこの培養物
を濾過して菌体１０ｇを得た。

２．５−ＲＮＡの取得 項目１で得られた菌体１０ｇを、２０ｄのグアニジンイ
ソチオシアネート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシアネ
ート／３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）
１０．７５％（Ｗ／Ｖ）　Ｎ−ラうロイルザルコシンナ
トリウム１０．１５Ｍ　β−メルカプトエタノール〕に
添加したものを、カップ型プレンダー（日本精機製作所
社製）に入れ、更に、ｌｈのガラスピーズ（直径０．５
ｍｎ＋）を添加し、１０．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で５分間
処理したのち、また更に、１０ｍの水飽和フェノールを
添加し、１０．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１０分間処理して
菌体を破砕処理し、破砕物を得た。

このようにして得られた破砕物を冷却遠心機（日立１機
社製、１８ＰＲ−５２）を用いて５．００Ｏｒ、ｐ、ｏ
＋、で１０分間遠心分離処理して、菌体破砕液２０−を
得た。

次いで、超遠心分離機用チューブ（日立１機社製）４本
に、予め１．２ｄの５．７Ｍの塩化セシウム溶液を夫々
重層し、その上に、上記菌体破砕液を重層するように夫
々分注し、超遠心分離機（日立１機社製、５ＣＰ５５Ｈ
）を用いて温度１５°Ｃ１３０，００Ｏｒ、１８組で１
６時間遠心分離して沈澱物を得た。

得られた沈澱物を、冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを用
いて洗浄したものを、１０μｌＭトリス緩衝液（１０＋
＋＋Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１５ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ／　１％ドデシル硫酸ナトリウム〕４戚に懸濁し
たものに、同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを
４対ｌ　（容量比）となる如く混合したものを添加して
抽出し、常法により３，０００ｒ、ｐｌｍ、で１０分間
遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機溶
媒層に上記１０ｍＭ　）リス緩衝液４−を添加し、上記
抽出及び分離操作を行う操作を２回繰り返して得られた
水層に、１７１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２
）及び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−２
０’Ｃで２時間放置したのち、常法により８゜００Ｏｒ
、ｐ、ｍ、で２０分間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱させ、
得られたＲＮＡを４ｄの水に溶解し、上記エタノール沈
澱操作を行ない、得られたＲＮＡを１−の水に溶解し、
１２■のＲＮＡを得た。

このＲＮＡ中よりトＲＮＡを選択するために、１２■の
ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースにューイングラ
ンドバイオラボ社製）カラムクロマトグラフィーにかけ
た。

カラムとして２．５１ｄテルモシリンジ（テルモ社製）
を用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液（１０ｎ＋Ｍトリ
スー塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，６）　／　Ｉｎ＋Ｍ　ＥＤ
Ｔ八１へ、１％（−／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム
〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液〔１
０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，６）／１ｍＭ　ＥＤＴＡ
／　０．４　Ｍ　ＮａＣ１／　０．１％ドデシル硫酸ナ
トリウム〕で平衡化したものである。

１２ｍｇのＲＮＡに、同量の緩衝液（１０ｍＭ　トリス
塩酸（ｐＨ７，６）／ＩＩＭ　ＥＤＴＡ、１０．８　Ｍ
　ＮａＣ１／　ｏ、　１％ドデシル硫酸ナトリウム］を
添加し、温度６５℃で１０分間加熱処理し、水中で急冷
し、オリゴ（ｄＴ）−七ルロースカラムにかけたのち、
結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及びｔ
−ＲＮＡを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−ＲＮ
Ａを溶出し、９０Ｍｇの５−ＲＮＡを得た。

３、アルカリブロテアーゼトＲＮＡの濃縮衣に、ショ糖
密度勾配遠心分離法によりアルカリプロテアーゼトＲＮ
Ａを濃縮した。

１０〜２５％（Ｗ／Ｖ）のショ糖密度勾配は、ベックマ
ン社製のローターＳ　Ｗ４１用ポリアロマチューブに４
０％（Ｗ／Ｖ）　’ｉ　ａ　ｔｉｔ液（５０ｍＭ　）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／２２Ｍ　ＮａＣ１７１
ｗＭ　ＥＤＴＡ／４０％（Ｗ／Ｖ）　　ショ糖〕０、５
　ａｄ！を入れ、その上に２．４　ｄずつ２５％（Ｗ／
Ｖ）、２０％（Ｗ／Ｖ）　、１５％（讐／Ｖ）及び１０
％作／Ｖ）のショ糖液を重層し、温度４°Ｃで２４時間
放置することにより作製した。このシ！１１！密度勾配
に、項目２で得たｍ−ＲＮ　Ａ５０μｇを重層し、ベッ
クマン社製の５Ｗ４１０−ターを用い、常法により３０
．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、温度１８°Ｃで１８時間遠心分
離を行った。遠心分離操作ののち、０．５　ｄずつ分画
し、エタノール沈澱法によりｍ−ＲＮＡを回収し、１０
μｌの水に溶解した。

次に、ｓ−ＲＮ　Ａにコードされている蛋白質を調べる
ことにより、アルカリプロテアーゼトＲＮＡが濃縮され
ている両分の同定を行なった０分画した＋ｗ−ＲＮＡＩ
μ１１ウサギ網状赤血球ライセード（アマジャム社製）
９μ２及び（３５３）メチオニン１μ！（アマジャム社
製）を混合し、温度３０°Ｃで３０分間反応させたもの
に、１５０μｌのＮＥＴＩＩ衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣ
１１５ｗ＋Ｍ　ＥＤＴＡｌｏ、０２％（−ハ）　ＮａＮ
３／２０１１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）　１
０．０５％（Ｗ／Ｖ）ノニデットＰ−４０（ベセスダリ
サーチラボラトリー社製、界面活性剤））を添加し、更
に、１μｌの抗アルカリプロテアーゼ血清（後述のよう
にして調製したもの。）を添加し、温度４°Ｃで１８時
間放置したものに、１０■のプロティンＡセファロース
（ファルマシア社製）を添加し、温度２０°Ｃで３０分
間放置したものを、常法により１２，０ＯＯｒ、ｐ、ａ
、で１分間遠心分離処理し、樹脂、すなわち、上記プロ
ティンＡセファロースを回収した。

回収した樹脂を、２００ｕ１のＮＥＴ緩衝液で３回洗浄
し、この樹脂に、４０μ２の５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプ
ル緩衝液（６２，５ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ
６，８）　／　１０％（Ｖ／ν）グ’Ｊ　（’　Ｃ１／
Ｌ’　／　２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム７５
％（Ｖ／Ｖ）メルカプトエタノール１０．０２％（Ｗ／
Ｖ）ブロムフェノールブルー〕を添加し、温度１００’
Ｃで３分間煮沸し、常法により１２．０ＯＯｒ、ｐ、＋
ｍ、で１分間遠心分離処理し、上清を回収し１．全量を
１２％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲルに乗せた。

ゲル電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法〔
「ネーチェアーＪ　Ｎａｔｕｒｅ）　、第２２７頁、第
６８０頁（１９７０）　）で行ない、泳動したのちのゲ
ルは、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋白
質を固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍサ
リチル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して乾
燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フィルム社製、Ｒ
Ｘ）を用いてフルオログラフィーを行った。

以上の操作により、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡの
存在する両分の−ＲＮＡを用いた場合にのみ、アルカリ
プロテアーゼ蛋白質のバンドがＸ線フィルム上に認めら
れ、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されている
両分が同定できた。

４、アルカリプロテアーゼ血清の調製 精製アルカリプロテアーゼに対するウサギの抗アルカリ
プロテアーゼ血清は、以下の方法により調製した。

４０■／ｄ濃度のアルカリプロテアーゼ溶液０．７−を
、等量のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバント
で懸濁したもの２８■を、抗原として体重２ｋｇの日本
内色種ウサギの視床部に投与し、飼育２週間経過したの
ち、初回と同量の抗原を背部及内へ投与し、更に、飼育
１週間経過したのち、同様の操作を行い、また更に、飼
育１週間後全採血を行った。

そして、得られた血液を、温度４°Ｃで１８時間放置し
たものを、常法により３＋００Ｏｒ、ｐ、ａ＋、で１５
分間遠心分離し、上清として抗アルカリプロテアーゼ血
清を得た。

５、ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの合成は、アマジャム社製キットを用い
て行ったものである。

上述の如くして得られたｍ−ＲＮＡ１．６μｇを用いて
アマジャム社の指示する「モル・セル・パイオルＪ　（
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁
（１９８２）及び「ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、第２５巻
、第２６３頁（１９８３）記載の方法に従い実施した結
果、１６０１ｇの２本積ｃ−ＤＮＡが得られた。

このようにして得たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ　１６０ａｇに、ア
マジャム社製ｃ−Ｄ　Ｎ　Ａクローニングキッドを用い
、アマジャム社の指示する方法により制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ切断部位のメチル化を行い、更にｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの両
端にＥｃｏＲＩ　リンカ−を付着させた。

６、ｃ−ＤＮＡバンクの作製 プラスミドｐＵｃ１１９　Ｄ　Ｎ　Ａ　（宝酒造社製）
１００ｎｇを、８μ２の水に溶解したものに、１μｉの
Ｍａｄ緩衝液（１００ａＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）／１００ｍＭＭｇＣ１をへＯｓ＋Ｍジチオスレ
イトール１５００ａＭ　ＮａＣ１）を添加したのち、更
に、これに、１０ユニツト　（１μ！、）の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ（宝酒造社製）を添加し、温度３７°Ｃで２時
間切断処理を行った。

次いで、この切断処理物に、１μｌのＩＭ　トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）及び０．３ユニツト（ｌμりの
アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加し、温
度６５°Ｃで１時間酵素反応処理し、切断処理物の両端
の脱リン酸化を行い、これに、１２μ２の水飽和フェノ
ールを添加して除蛋白を行ったのち、回収した水層に、
１μ２の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８）及び２６μ
Ｅの冷エタノールを夫々添加し、温度−７０℃で１５分
間放置し、微量遠心機［■トミー精工、ＭＲＸ−１５０
］を用い、１２，０ＯＯｒ、ｐ、ａｉ。

で５分間遠心分離処理を行いＤＮＡを回収した。

このようにして得られた制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、
かつ両端を脱リン酸化したプラスミドベクターｐＵｃ１
１９　Ｄ　Ｎ　Ａ　１１００ｎと、項目５で調製したＣ
−ＤＮＡ　１６０ｎｇを混合したものを、８μｌの水に
懸濁したのち、これに、１μｌのＸＩＯライゲーション
緩衝液〔２０抛Ｍ　ＭｇＣｈ　／６６０ｍＭ　）リス−
塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，６）　／　１０μＥＭ　ＡＴＰ
／　１５（ｌｓＭジチオスレイトール〕を添加したもの
に、１ユニツト　（１ｕ　ｌ）のＴ４　ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製））を添加し、温度１６°Ｃで１６時間放
置し、上記プラスミドベクターＤＮＡ及びｃ−ＤＮＡの
ライゲーションを行ない反応物を得た。

この反応物を用いて、ハナハン（）ｌａｎａｈａｎ）の
方法〔「ディーエヌエイ・クローニングＪ　　（ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５真（１９
８５）　）により大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８４９
）を形質転換し、プラスミドｐ［Ｉｃ１１９　Ｄ　Ｎ　
Ａをベクターとしたｃ−ＤＮＡバンクを作製した。

７、アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの断片の検索
ハイブリダイゼーション・セレクション〔「モレキュラ
ー・クローニングＪ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、第３２９頁、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−（１９８２）　）に従ってアルカリプロ
テアーゼｃ−ＤＮＡの検索を行った。以下に、詳述する
。

項目６で得られたｃ−Ｄ　Ｎ　Ａバンクより任意な大腸
菌７０株を選び夫々について以下の操作を行った。

「モレキュラー・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃ１Ｃ１ｏ−ｎ１ｎ　、第８６頁、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２）記載の方
法により、ｃ−ＤＮＡバンク中の大腸菌から組み換え体
プラスミドＤＮＡ５００μｇを夫々得た。このうち１０
０μｇを、水２００μｌに溶解し、温度１００°Ｃで１
０分間放置したのち、水中に移して急冷したものに、２
００μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加、し、室温にて
２０分間放置し、組み換え体プラスミドＤＮＡの変性液
を得た。

次いで、このようにして得た変性液に、２００μ！の中
和液（１Ｍ塩化ナトリウム１０．３Ｍクエン酸ナトリウ
ム７０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）／ＩＭ
塩酸）をすばやく添加、混和したのち、氷中へ移して急
冷した。この溶液を、直径５ｍの円形ニトロセルロース
フィルター（ミリボア社製、カタログナンバー〇ＡＷＰ
　０２５００）を用いて濾過し、変性した組み換え体プ
ラスミドＤＮＡをニトロセルロースフィルター上に吸着
させたものを、常法により風乾したのち、６　Ｘ５ＳＣ
（０，９Ｍ塩化ナトリウム１０．０９Ｍクエン酸ナトリ
ウム）を用いて洗浄し、更に常法により風乾したのち、
温度８０℃に保った真空オーブン中で２時間放置し、組
み換え体プラスミドＤＮＡをニトロセルロースフィルタ
ーへ固定させた。

次いで、１０μｌのハイブリダイゼーション溶液〔１０
０μｇ／ｄ　＠−ＲＮ　Ａ　（項目２で調製したもの）
７６５％（Ｖ／Ｖ）脱イオン化したホルムアミド／２０
ｍＭ１．４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ｐＨ６，
４）１０．２％ドデシル硫酸ナトリウム１０．４Ｍ塩化
ナトリウム７１００μｇ／ａｔ酵母ｔ−ＲＮＡ）に、上
記の如くして得た組み換え体プラスミドＤＮＡを固定し
たニトロセルロースフィルターを浸し、温度５０°Ｃに
て３時間放置し、フィルター上の組み換え体プラスミド
ＤＮＡとｍ−ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを行っ
た０反応終了したフィルターを取り出し１１１１の洗浄
液１　（１抛Ｈトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）　１
０．１５Ｍ塩化ナトリウム／１ｍＭ　ＢＤＴＡｌｏ、　
５％ドデシル硫酸ナトリウム）で９回洗浄したのち、１
ｄの洗浄液１１（１０μＥＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，６）１０．１５　Ｍ塩化ナトリウム／Ｉｎ＋Ｍ　Ｅ
ＤＴＡ　）にて２回洗浄を行い、フィルター上に固定し
たプラスミドＤＮＡとハイブリダイズしていないｍ−Ｒ
ＮＡを除去した。

次いで、このニトロセルロースフィルターを、１００μ
２の水中へ移し、１０μｇの酵母ｔ−ＲＮＡを添加して
、１分間１００°Ｃの湯中へ放置し、ドライアイスで冷
却したエタノール中へ移したのち、室温中で放置し溶解
した。このようにしてハイブリダイズしたｔａ−ＲＮ　
Ａをニトロセルロースフィルターより剥離した。得られ
た水溶液に、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，
２）及び３００μ２の冷エタノールを添加し、温度−７
０°Ｃにて１時間放置し、エタノール沈澱を行ったのち
、微量遠心機〔■トミー精工、ＭＲＸ−１５０１を用い
て１２，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心分離処理して
上記ハイブリダイズしたｍ−ＤＮＡを回収した。

次いで、項目３に記載したと同様にして、回収した上記
ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を合成し、項目４
で得られた抗アルカリプロテアーゼ血清を用いて、合成
した蛋白質がアルカリプロテアーゼか否かを分析した。

その結果７０株中１株についてポジティブな結果が得ら
れた。この株の保有する組み換え体プラスミドＤ　Ｎ　
Ａ　（ｐＯＡＰ３と命名）にはアスペルギルス・オリゼ
ー（ＡＴＣＣ２０３８６）由来のアルカリプロテアーゼ
ｃ−ＤＮＡの断片が挿入されていると結論できる。

次いで、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３ＯＮＡｌμｇ
を項目６に記載の方法により制限酵素ＥｃｏＲＩで処理
しアガロースゲル電気泳動法により移動度パターンを分
析し、得られたパターンとプラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　
Ｎ　Ａ　（宝酒造社製）を制限酵素Ａｌｕ■により消化
して得られたＤＮＡ断片の標準パターンと対比すること
により、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３ＤＮＡに挿入
されているアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ断片の
大きさは７５０ｂｐであることが判明した。

８、大きなアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの検索項目
７で得られたアガロースゲルより７５０ｂｐのアルカリ
プロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを切
り出し、透析チューブに入れたものに、５００μｌのＴ
ＥＩｌ衝液〔１０ＩＩＩＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）／　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）　）を添加したのち、
透析チューブをシールし、電気泳動により、ゲル中より
緩衝液中にＤＮＡを溶出して得た溶液に、等容量の水飽
和フェノールを添加して撹拌し、水層を回収し、常法に
従ってエタノール沈澱により１１００ｎのアルカリプロ
テアーゼのｃ−Ｄ　Ｎ　Ａを回収した。この１００ｎＨ
のアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａを、〔α−”　
Ｐ　）　ｄＣＴＰ　（アマジャム社製）を用いてニック
トランスレーション法により標識した。

ニックトランスレーションは、宝酒造社の指示する「ジ
エイ・モル・パイオルＪ　（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）
、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）及び「
モレキュラー・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＣＩｏｎｉｎｇ）、第１０９〜１１２頁（１９８２）記
載の方法に従った。このようにして調製した３ｔＰで標
識したアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片をプローブ
として用い、項目６で得たｃ−ＤＮＡバンクに対しコロ
ニーハイブリダイゼーション法［「蛋白質・核酸・酵素
」、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９８１）　］よ
り検索し、アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを有するコ
ロニーを得た。そのうち１個のコロニーの有する組み換
え体プラスミドＤＮＡをｐＯＡＰ　５と命名し、項目７
に従い組み換え体プラスミドＤＮＡを調製した。

該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（ｐＯＡＰ　５）と命名
した。

なお、該形質転換株は、工業技術院微生物工業技術研究
所゛に、微工研菌寄第９８７０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９８
７０）として寄託されている。

組み換え体プラスミドｐＯＡＰ５ＤＮＡを項目６に記載
の方法と同様にして制限酵素ＥｃｏＲ１，で処理し、ア
ガロースゲル電気泳動を行ったところ、挿入ＤＮＡ断片
の大きさは１．１００ｂｐであることが判明した。そし
て、項目８記載の方法と同様にしてこの１　、１００ｂ
ｐのアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａを含むＤＮＡ
断片０．１μｇを分離、精製した。組み換え体プラスミ
ドｐＯＡＰ５ＤＮＡを制限酵素Ａｆｌｌｌ、１並Ｒ１，
に飢１．５ａｌＩ及びＸｍｎ１の単一または二重消化を
行い、項目７に記載したと同じ方法にて、現われた断片
の大きさを分析することにより、組み換え体プラスミド
ｐＯＡＰ５ＤＮＡの制限酵素地図を作製し、該地図を第
１図に示した。

９、アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの塩基配列の決定 項目８で得られた夫々のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮ
Ａ断片を、同−又は同一ののりしろの制限酵素により切
断したプラスミドｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９ＤＮＡ　（
宝酒造社製）にクローニングした。シーフェンシングは
、プラスミドＤＮＡを榊の方法〔「ベクターＤＮＡＪ　
、第７０頁、講談社（１９８６年）〕に従ってアルカリ
変性させたのち、Ｍ１３シークエンスキット（宝酒造社
製）を用いて常法によりダイデオキシ・チェーン・ター
ミネーション法で行った。

このようにしてアスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２
０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のうち、マチュ
アーなアルカリプロテアーゼに対応する遺伝子の塩基配
列を第２図に、また、前記第２図に示す塩基配列を有す
る遺伝子から翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列
を第３図に夫々示した。

このＤＮＡ塩基配列より推測されるアミノ酸配列のＮ末
端には精製したアルカリプロテアーゼのＮ末端のアミノ
酸配列１６個（Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｕＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　５ｅｒ）が確認され
た（第３図下線部）。

以上の知見より第２図に示した塩基配列は、マチュアー
なアルカリプロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部分宿
をコードしていると結論できる。

１０、アルカリプロテアーゼ完全長ｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの検
索項目９での塩基配列決定の結果、項目８で得られた組
み換え体プラスミドｐＯ＾Ｐ５はマチュアーなアルカリ
プロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部分宿をコードし
ていたが、それより上流にあると考えられるプレプロ領
域が欠如していた。そこで、項目８と同様に組み換え体
プラスミドｐＯ＾Ｐ５のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮ
Ａ断片を単離した後、ニックトランスレーション法によ
りｆｆＺｐで標識し、これをプローブとして項目６で得
たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａバンクに対して再度コロニーハイブリ
ダイゼーション法により検索し、更に長いアルカリプロ
テアーゼｃ−ＤＮＡを有するコロニーを得た。そのうち
１個のコロニーの有する組み換え体プラスミドをｐＯ＾
Ｐ１０と命名し、該組み換え体プラスミドを有する大腸
菌を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（ｐＯＡＰｌｏ
）と命名した。

項目７に従い、純化された組み換え体プラスミドｐＯＡ
Ｐ１０　Ｄ　Ｎ　Ａ　、　１００　ｕ　ｇを調製した。

組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａを項目
７に記載の方法と同様にして制限酵素足並Ｒ１で処理し
、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、挿入ＤＮＡ
断片の大きさは１　、５００ｂｐであることが判明した
。更に組み換え体プラスミドｐＯ＾ＰＩＯＤＮＡを制限
酵素地図■、１匹Ｒ１，ｂｒ、Ｓ旦Ｉ、Ｘ　ｍｎ　Ｉ　
、　１訂ＩＩ　、旦１ｎｄＩ［［の単一または二重消化
を行い、項目７に記載したと同じ方法にて、現れた断片
の大きさを分析することにより、組み換え体プラスミド
ｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａの制限酵素地図を作製し、該
地図を第４図に示した。

１１、アルカリプロテアーゼ完全長ｃ−ＤＮＡの塩基配
列の決定 項目１０で得られた組み換え体プラスミドρ０ＡＰＩＯ
から現れたアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ断片を
項目９と同様に、同−又は同一ののりしろの制限酵素に
より切断したプラスミドρＵＣｌ３およびｐＵｃ１９　
ＤＮＡにクローニングした。シーフェンシングは項目９
と同様にダイデオキシ・チェーンターミネーション法で
行った。

このようにしてアスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２
０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ
の塩基配列を決定し、第５図は、実施例項目１１に記載
の完全長アルカリプロテアーゼ（プレプロ型）に対応す
る遺伝子の塩基配列を示す。また、前記第５図に示す塩
基配列を有する遺伝子から翻訳されるポリペブタイドの
アミノ酸配列を第６図に夫々示した。図中、塩基番号５
３　（Ａ）〜４１５　（Ｔ）がプレプロ領域を、塩基番
号４１６（Ｇ）〜１２６１（Ｔ）がマチュアーなアルカ
リプロテアーゼ遺伝子領域を示す。

前記第５図に示す塩基配列から翻訳されるポリペブタイ
ドは４０３アミノ酸からなり、精製したアルカリプロテ
アーゼのＮ末端のアミノ酸配列１６個（ＧｌｙＬｅｕ　
ＴｈｒＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒ
ｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　
５ｅｒ）は１２２番目からのアミノ酸配列に一致した（
第６図下線部）、シたがって、Ｎ末端から１２１番目ま
でのアミノ酸配列は、アルカリプロテアーゼの分泌に必
要なプレプロ領域であり、１２２番目から４０３番目ま
でのアミノ酸配列はマチュアーなアルカリプロテアーゼ
をコードする領域である。

以上の知見より第５図に示した塩基配列は、プレプロ領
域までを含んだアルカリプロテアーゼの全ポリペブタイ
ドをコードしていると結論できる。

１２、組み換え体プラスミドｐＺＡＰ１０１Ａ　Ｄ　Ｎ
　Ａ　ノ構築チゴサッカロマイセス・ルーキシ−におけ
る組換え体プラスミドｐＺＡＰ１０１＾ＤＮＡを構築す
るために、先ずアンピシリン耐性を有するプラスミドｐ
Ｕｃ１９ＤＮＡ（全酒造社製）１μｇを制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ■及びＰｓｔＩ　（いずれも全酒造社製）を用いて、
温度３７“Ｃで１６時間反応し、完全切断させた。その
完全切断物全量を０．７％アガロースゲル電気泳動によ
り、ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉによるアンピシリン耐性
遺伝子を含む長いＤＮＡ断片と耐性遺伝子を含まない短
いＤＮＡ断片とに分離した。アンピシリン耐性遺伝子を
含むＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　ＩによるＤＮＡ断片をゲル
から抽出し、常法によりフェノール処理及びエタノール
沈澱を行った。

同様にして、チゴサッカロマイセス・ルーキシ−のグリ
セロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰ
ＤＨという）のプロモーター配列を有するプラスミドｐ
ＴＴ４１ＤＮＡ　（広島大学　工学部醗酵工学科　東江
昭夫氏より入手）ｌＩ！ｇを前記と同様にしてＥｃｏＲ
Ｉ及び１旦■で完全切断し、０、７ｋｂｐのＧＡＰＤｌ
ｌのプロモーターを含む１匹Ｒ１−ヱ１１によるＤＮＡ
断片を得た。

先のプラスミドｐＵＣ１９Ｄ　Ｎ　Ａのアンピシリン耐
性遺伝子を含む旦ｃｏＲＩ−Ｐ■ＩによるＤＮＡ断片と
、ｐＴＩ４１　Ｄ　Ｎ　Ａ由来のＧＡＰＤＨプロモータ
ーを含むＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　ＩによるＤＮＡ断片と
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造社製）を加え、温
度１６°Ｃで１６時間放置し、両断片の連結を行った。

この反応物を用い、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法
〔「ディーエヌエイ・クローニングＪ　（ＤＮＡ　Ｃ１
ｏｎｉｎｓ）、第１巻　第１０９〜１３５頁（１９８５
）　）により大腸菌ＤＨ■株（ＡＴＣＣ３３８４９）を
形質転換し、得られた形質転換株よりアルカリ法〔リコ
ンビナント・ディーエヌエイ・テクニ・ンクス（Ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、
第５０〜５１頁（１９８３）　）にてプラスミドＤＮＡ
を抽出し、プラスミドｐＵｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａの足並Ｒ
Ｉ−ヱ１１によるＤＮＡ断片中に、プラスミドｐＴＩ４
１　Ｄ　Ｎ　ＡのＥｃｏＲＩ−上１０によるＤＮＡ断片
が挿入されているプラスミドＤＮＡをｐＵＧ４１と命名
した。

このプラスミドｐＵＧ４１　Ｄ　Ｎ　Ａ　１μｇを前述
のようにしてＥｃｏＲＩで切断し、この切断処理物にア
ルカリフォスファターゼを添加し、温度６５℃で１時間
酵素反応処理し、切断処理物の両端の脱リン酸化を行っ
た。その後、常法によりフェノール処理及びエタノール
沈澱を行い、両端を脱リン酸化したプラスミドｐＵＧ４
１　Ｄ　Ｎ　ＡのＥｃｏＲＩによるＤＮＡ断片を得た。

一方で、項目１０で得られ、麹菌アルカリプロテアーゼ
ｃ−ＤＮＡを含む組換え体ｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａ　
１　ｕｇを前述の如くしてＥｃｏＲＩで切断し、０．７
％アガロースゲル電気泳動で１．５ｋｂｐの麹菌アルカ
リプロテアーゼｃ−ＤＮＡを含むＥｃｏＲＩによるＤＮ
Ａ断片を分離、抽出し、常法によりフェノール処理及び
エタノール沈澱を行い、先のプラスミドｐＵＧ４１　Ｄ
　Ｎ　ＡのＥｃｏＲＩ断片と混合した。

これに前述の方法でＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、連結
したのち、大腸菌Ｄ　Ｈ１（ＡＴＣＣ３３８４９）を、
前記ハナハンの方法により形質転換し、得られた形質転
換株より、前述のアルカリ法にてプラスミドを抽出して
、ＩＩ及びｆｉｌＩＩ　（いずれも全酒造社製）による
２重切断ＤＮＡパターンを夫々アガロースゲル電気泳動
法を用いて分析した。この分析によりＧＡＰＤＨプロモ
ーターに対して順方向にアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮ
Ａが組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮＡを選択し
、この組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＧＡＰ４１と命
名した。

得られた組み換え体プラスミドｐＧＡＰ４１　Ｄ　Ｎ　
Ａ　１μｇを前述の如くして制限酵素釦■（全酒造社製
）で切断し、常法によりフェノール処理及びエタノール
沈澱を行った。一方、抗生物質Ｇ４１８耐性遺伝子を有
するプラスミドｐＡＴ１３６　Ｄ　Ｎ　Ａ　（広島大学
工学部醗酵工学科東江昭夫氏より入手）１μｇを前述の
如くして制限酵素ＰｖｕｌＩ（宝酒造社製）で切断し、
０．７％アガロースゲル電気泳動で分離、抽出したのち
、フェノール処理及びエタノール沈澱を行って１．７ｋ
ｂｐの６４１８耐性遺伝子を含むＰｖｕ■によるＤＮＡ
断片を得た。このＰｖｕＩＩによるＤＮＡ断片と先の組
換え体プラスミドｐＧＡＰ４１　Ｄ　Ｎ　Ａの旦■Ｉに
よるＤＮＡ断片を混合し、前述の方法でＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより連結したのち、これを用い大腸菌Ｄ　ＨＩ　
（ＡＴＣＣ３３８４９）株を形質転換し、得られたカナ
マイシン耐性形質転換株より前述のアルカリ法でプラス
ミドＤＮＡを抽出し、組換え体プラスミドｐＧＡＰ４１
　Ｄ　Ｎ　Ａの釦１部位にプラスミドｐＡＴ１３６のＧ
４１８耐性遺伝子を含むＰｖｕＩＩによるＤＮＡ断片が
挿入された組換え体プラスミドｐＧＡＧ４１　ＤＮＡを
得た。

次いで、プラスミドｐＵｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａ　（宝酒造
社製）ｌμｇを前述の如くして釦Ｉで切断し、フェノー
ル処理及びエタノール沈澱し、Ｐｓｔｌリンカ−（宝酒
造社製）と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼで連結して、前
記大腸菌ＤＨＩ株を形質転換したのち、得られた形質転
換株より前記アルカリ法でプラスミドＤＮＡを抽出し、
プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡの）且ＩによるＤＮＡ断片
部位にＰｓｔＩリンカ−が挿入したプラスミドｐＵｃＰ
Ｉ９　Ｄ　Ｎ　Ａを得た。このｐＵｃＰ１９　Ｄ　Ｎ　
Ａ　１μｇを制限酵素狂Ｉ　（宝酒造社製）で切断し、
フェノール処理及びエタノール沈澱によりプラスミドｐ
ＵｃＰ１９　Ｄ　Ｎ　Ａの５エロによるＤＮＡ断片を得
た。一方、プラスミドｐｓＲＴ３０３Ｄ（大阪大学工学
部醗酵工学科　大嶋泰治氏より入手）ＤＮＡＩμｇをＳ
ａｌ　Ｉで切断し、０．７％アガロースゲル電気泳動で
分離、抽出したのち、フェノール処理及びエタノール沈
澱を行ないチゴサン力ロマイセス・ルーキシ−の自己増
殖プラスミドｐｓＲ１（ゼイ・モル・パイオルｒ　Ｊ、
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　Ｊ第１８２巻、第１９１〜２０３
頁（１９８５）　）の塩基配列を含む５ａｉｌ断片を得
た。得られたプラスミドｐｓＲＴ３０３ＤＤＮＡの５ａ
ｌｌによるＤＮＡ断片及び先のプラスミドρＵＣＰ１９
ＤＮＡ（ＤＳユＩによるＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼにより連結したのち、前記大腸菌ＤＨＩ株を形質転
換し、得られた形質転換株より前記アルカリ法でプラス
ミドＤＮＡを抽出し、プラスミドｐｓＲＴ３０３Ｄ　Ｄ
　Ｎ　Ａの５ａｉｌによるＤＮＡ断片部位にプラスミド
ｐＵｃＰ１９　Ｄ　Ｎ　Ａが挿入された組換え体プラス
ミドｐｓＲＴ３０３Ｐ　Ｄ　Ｎ　Ａを得た。

得られたｐｓＲＴ３０３Ｐ　Ｄ　Ｎ　Ａを前記上１０で
切断し、０．７％アガロース電気泳動で分離及び抽出し
たのち、フェノール処理及びエタノール沈澱を行ないプ
ラスミドｐｓＲＩＤＮＡの塩基配列を含むＰｓｔｌによ
るＤＮＡ断片を得た。

更に前述した組換え体プラスミドｐＧＡＧ４１　Ｄ　Ｎ
　Ａを同様にＰｓｔｌで切断し、前述の方法でアルカリ
フォスファターゼ処理し、両末端のリン酸を除去したの
ち、フェノール処理及びエタノール沈澱して、両端が脱
リン酸化されたｐＧＡＧ４１　Ｄ　Ｎ　ＡのＰｓｔＩ断
片を得た。この断片及び先の組換え体プラスミドｐｓＲ
Ｔ３０３ＰＤ　Ｎ　Ａ　Ｎ　（Ｄ　Ｐ　ｓｔ　Ｉ　ニよ
る断片とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した
のち、前記大腸菌ＤＨＩ株を形質転換し、得られた形質
転換株よりアルカリ法でプラスミドを抽出し、ｐＳＲＴ
３０３Ｐ　Ｄ　Ｎ　ＡのｐｓＲＩＤＮＡの塩基配列を含
む旦Ｃ」によるＤＮＡ断片とｐＧＡＧ４１　Ｄ　Ｎ　Ａ
の江Ｉによる断片が連結した組換え体プラスミドＤＮＡ
をｐＺＡＰｌｏｌＡと命名し、該ｐＺＡＰ１０１Ａプラ
スミドＤＮＡの制限酵素地図を第７図に示した。

１３、組み換え体プラスミドｐＺＡＰ１０１Ａ　Ｄ　Ｎ
　Ａによる酵母の形質転換 組み換え体プラスミドｐＺＡＰ１０１Ａ　Ｄ　Ｎ　Ａを
用い、チゴサッカロマイセス、ルーキシ−（ＴＰＯ１８
７６）を前記木材の方法により形質転換し、形質転換株
、チゴサッカロマイセス・ルーキシ−（（Ｚｙｇｏｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）ＩＰｏ　１８
７６（ｐＺＡＰｌｏｌＡ）〕を得た。

なお、チゴサッ力ロマイセス・ルーキシ−（Ｚｙｇｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）ＩＦｏ　１
８７６　（ｐＺＡＰｌｏｌＡ））は、工業術院微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第１０５１４号（ＦＥＰＭ　
ｐ−１０５１４）として寄託されている。

１４、形質転換株チゴサッカロマイセス・ルーキシ−（
（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ
）ＩＰｏ　１８７６（ｐＺＡＰｌｏｌＡ）によるアルカ
リプロテアーゼ産 チゴサッカロマイセス・ルーキシ−（（Ｚｙｇｏｓａｃ
−ｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）ＩＰｏ　１
８７６（ｐＺＡＰｌｏｌＡ）（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５１
４）　）を抗生物質Ｇ４１８硫酸塩（１００ｕ　ｇ／Ｉ
ｎｊりを含むＹＰＤ培地（グルコース２０ｇ／　ｌ、ポ
リペプトン２０ｇｅｌ及び酵母エキスＬｏｇ／　ｌ　）
　１０Ｉｎｊ！に接種し、温度３０°Ｃで、７２時間振
盪培養し、得られた培養物５戒を、０．４５μｍメンブ
ランフィルタ−で除菌し、培養濾液を得た。

得られた培養濾液についてアンソン−萩原変法〔ワイ、
フクシマ（Ｙ、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ）アゲリック・パイ
オル・ケル（八ｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、）第４
９巻、第１６４３〜１６４８頁（１９８５）　）を用い
てアルカリプロテアーゼ活性を測定したところ、アルカ
リプロテアーゼ活性は、７０　Ｐ、Ｕ、／ｄであった。

なお、比較のため対照としてプラスミドベクターｐｓＲ
Ｔ３０３Ｄを有するチゴサッ力ロマイセス・ルーキシ−
株〔（チゴサッ力ロマイセス・ルーキシ−（ＩＦｏ　１
８７６）及び前記プラスミドベクターｐｓＲＴ３０３Ｄ
を用い、前記木材の方法により形質転換された菌株であ
る。）］を用い、上記と同様にして培養及びプロテアー
ゼ活性の測定を行なったところ、０．ＩＰ、Ｕ、＃＋１
であった。

以上より明らかな如く、本発明により得られる培養液は
、対照に比し、プロテアーゼ活性が著しく増加している
ため、本発明に従い上記したチゴサッカロマイセス属に
属する酵母菌体を培養することにより、培地中にアルカ
リプロテアーゼが大量分泌生産されていることが判明し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ５ＤＮＡの制
限酵素地図を示す図であり、第２図は、実施例の９項目
に記載のマチュアーなアルカリプロテアーゼに対応する
遺伝子の塩基配列を示す図であり、また、第３図は、第
２図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳されるポリ
ペブタイドのアミノ酸配列を示す図である。 第４図は、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ
　Ａの制限酵素地図である。 第５図は、実施例１１１項目記載の完全長アルカリプロ
テアーゼ（プレプロ型）に対応する遺伝子の塩基配列を
示す。図中、塩基番号５３　（Ａ）〜４１５（Ｔ）がプ
レプロ領域を、塩基番号４１６（Ｇ）〜１２６１　（Ｔ
）がマチュアーなアルカリプロテアーゼ遺伝子領域を示
す。 第６図は、第５図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻
訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を示す。 第７図は、組み換え体プラスミドｐＺＡＰ１０１Ａ　Ｄ
　Ｎ　Ａの制限酵素地図を示す図である。 出願人　食品産業酵素機能変換技術研究組合代理人　弁
理士　平　木　祐　輔 同　　弁理士　石　井　真　次 −ｐＵ（ｊ１９ ０＝コ　ｃ−ＤＮＡ 第２図 ＧＧＣ ＡＡＣ ＣＡＴ ＡＧＴ ＡＧＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＧＴ ＣＴＴ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＡ ＡＣＣ ＡＧＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＡＣＣ ＡＧＴ ＡＧＴ ＡＣＣ ＣＣＴ ＣＣＴ ＡＡＣ ＴＣＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＣＣＴ ＡＧＴ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＡＴＣ ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＡＴ ＡＡＣ ＣＡＴ ＡＣＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＧＴ ＡＧＴ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＡＧ　　ＡＧＴ　　ＧＣＣＣＣＣＴＧＧ　　ＧＧＴ　
　ＣＴＧ　　ＧＧＣＡＧＣＡＴＴ　　ＴＣＣＣＡＣＡＡ
Ｇ　　ＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＴ ＧＴＣＧＡＣＣＡＴ　　ＧＡＧ ＣＡＴ　　ＧＴＧ　　ＧＡＣＡＧＣ ＧＧＴ　　ＡＴＣＧＣＣＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＣＣＡ
ＧＣＡＴＣＣＴＴ　　ＴＣＧ　　ＧＴＣＡＡＡ　　ＧＴ
Ｔ　　ＴＴＣＣＡＧ３３０　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　：５６０Ａ
ＣＴ　　ＴＣＣＧＴＣＡＴＴ　　ＣＴＴ　　ＧＡＣＧＧ
ＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧ　　ＧＣＴ　　ＧＣＣＡＡＣＧＡ
ＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧ　　ＧＣ丁 ＧＣＧ　　ＧＴＣＧＡＧ　　ＡＡＣ ＴＣＴ　　ＧＡＴ　　ＧＣＣＧＧＣ ＣＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＧＣＡＡＣ ＣＣＣＧＧＴ　　ＣＡＡ　　ＧＡＴ ＧＧＴ　　ＡＣＣＴＣＣＡＴＧ ＡＡＣＣ丁ＣＧＡＴ　　ＧＧＣ ＧＴＣＡＡＧ　　ＧＡＴ　　ＣＴＴ　　ＡＡＧ　　ＧＧ
ＣＡＧＣＣＣＴ　　ＡＡＣ（：ＴＧ　　ＣＴＴ　　ＧＣ
Ｃ丁ＡＣＡＡＣＧＧＴｐｕｃ　＋１９ 二二＝＝：コ ＤＮＡ 第６図（その１） Ｍｅ↑　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　ｒｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ａ
ｒｇ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｃ’ｕ　　Ｌｅｕ　　
Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　ＬｅｕＰｒ
ｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ
　Ｖａｔ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　
Ａｌａ　ＡｌａＧｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ
　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　
　Ｔｏｙ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　
　ｌ１ｅＡｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇ
ｌｎ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｔｌｙ　Ｔｏｙ　Ｔｒｐ　Ａｌ
ａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｉｔｅｌ（ｉｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ
　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　
Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＬｅｕＰｒ
ｏ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ
　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ｒｌｅ　Ａｓｎｔｙｓ　Ｐｈｅ　Ａ
ｌａ　ＡｌａＴｙｒ　’Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｈ
ｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ
　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　ＬｙｓＡｓｎ　　Ｇｌｕ　
　Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ　
　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ｇｉｎ　　Ｔｌｅ　
　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ　　ＬｅｕＡｓｐ　Ｇｌｙ　ＬｅＵ
Ｔｌｙ　Ｔｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｑ　Ｇｌｙ　５ｅｒ１１ｅ
　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　
Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ｋ　Ｔｙ　Ａｓｐ　
ＴｈｒＳｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｉｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈ
ｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ
　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ八ｓへ　　Ｖａｌ　　Ａｓｐ
　　Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ
　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ
　　Ａｌａ　　ＴｙｒＡｓｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　
ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｔｌｙロ　　　　　
　０ ：２　　記 ＣＬ　　　　　Ｌ １／ｌ　　　　　　ｃｕ く　　の （Ｌａ く 函　占 と　５ Ｑ。 ク　　　い 〉く コシ Ｌ　　　　　　Ｌ　　　　　　Ｃ 謂　　旨　　曜 ＣＬ− Ｉｎ　　　　　　　（１３１■ く　　＝　　の 〕 」 コ　　　　Ｏ Ｌ 」く Ｌ−ｔ／１ 為島 ド」

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アスペルギルス属の微生物に由来し、下記の制限
   酵素地図で規定されるプレプロ型アルカリプロテアーゼ
   遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを
   含み、アルカリプロテアーゼ生産能を有するチゴサッカ
   ロマイセス属に属する微生物を培地に培養し、培養物よ
   りアルカリプロテアーゼを採取することを特徴とするア
   ルカリプロテアーゼの製造法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＥはＥｃｏＲ I 、ＡはＡｆｌII、ＫはＫｐｎ
   I 、ＸはＸｍｎ I 、ＳはＳａｌ I 、ＢはＢｇｌII、
   ＨはＨｉｎｄIIIを示す）
2. （２）プレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子が下記に
   示されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請
   求項３記載のアルカリプロテアーゼの製造法。 【遺伝子配列があります】