JPH022375A - アルカリプロテアーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アルカリプロテアーゼ遺伝子に関する。

〔従来の技術〕

従来、黄麹菌の１種であるアスペルギルス・オリゼー（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のアルカ
リプロテアーゼ遺伝子の構造については、全く未知であ
り、また、該遺伝子の単離すらされていないのが実情で
ある。

アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水分解
物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵素
であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられている
。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、アルカリプロテアーゼ遺伝子を提供すること
を目的とするものである。

〔課題を解決するための手段］ そこで、本発明者等は、アスペルギルス・オリゼー由来
のアルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討した結
果、アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテア
ーゼ遺伝子を初めて単離及び構造決定することに成功し
、本発明を完成した。

本発明は、アスペルギルス属に属する微生物に由来し、
下記の制限酵素開裂地図で規定されるアルカリプロテア
ーゼ遺伝子である。

（式中、ＥはＥｃｏＲＩ、ＡはＡｆｌＩｒ、　ＫはＫｐ
ｎｌ。

ＸはＸｍｎ１．Ｓは５ａｉｌを示す） そして、このアルカリプロテアーゼ遺伝子は下記に示さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。

Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ 八ｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　　Ｇａｙ 八Ｉａ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　１ｌｉｓ　Ｇｌｙ Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　　Ｌｙｓ Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　　５ｅｒ Ａｓｐ　Ｔｙｒ　　１ｉｅ Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ Ａｒｇ　　Ａｌａ　　５ｅｒ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｈ４５ Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｐｒ。

１（ｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ Ｔｙｒ　　Ａｓｐ　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ Ａｓｐ　１ｌｉｓ　　Ｇｌｕ Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｔｙｒ Ｖａｌ　　Ａｓｐ　５ｅｒ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ ＩｔｅＡｌａ　Ｌｙｓ 八ｌａ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　
Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　ＧｉｎＡｓ
ｎ　　Ａｌａ 以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、本発明の遺伝子のドナーとして用いられるアスペ
ルギルス・オリゼーとしては、例えば、アスペルギルス
・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６）等が挙げられる。

次いで、上記微生物を、特公昭４８−３８８７３号公報
記載の方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培
養物から常法、例えば、濾過、遠心分離処理等によりア
スペルギルス・オリゼーの菌体を得る。

上記アスペルギルス・オリゼーの菌体よりトＲＮＡを調
製するには、例えば、菌体の破砕の際、ガラスピーズ及
びフェノールを用いる以外は、例えば、モレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃ＋ｏｎｉｎｇ）、
第１９６頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）及び分子遺伝学
実験法、小関治男、志村令部、第６６〜６７頁（１９８
３）記載の方法等により得ることができる。

得られたｍ−ＲＮＡよりアルカリプロテアーゼをコード
するｍ−ＲＮＡ（以下、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮ
　Ａという）を濃縮するには、例えば、バイオメディカ
ル・リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ）、第３巻、第５３４〜５４０頁（１９Ｂ２）記載の
方法により行なうことができる。

なお、この際、アルカリプロテアーゼに対する抗アルカ
リプロテアーゼ血清を使用するのであるが、該血清は、
例えば、免疫化学、山村雄−１第４３〜５０頁（１９７
３）記載の方法により得ることができる。

アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡよりｃ−Ｄ　Ｎ　Ａを
合成するには、例えば、モル・セル・パイオル（トｏ１
．ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（１９
８２）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２６３頁
（１９８３）記載の方法により行なうことができる。

次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＵｃ１１９Ｄ　Ｎ　Ａ（
宝酒造・社・製）等に組み込み、種々の組み換え体プラ
スミドＤＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例えば、大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（八ＴＣＣ３３８４９）、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１　（ＡＴＣＣ３３
６９４）等をハナハン（ｌｌａｎａｈａｎ）の方法〔デ
ィーエヌエイ・クローニング（Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）　、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）　
）により形質転換し、種々の形質転換株を得る。

上記の種々な形質転換株よりアルカリプロテアーゼをコ
ードするｃ−ＤＮＡ（以下、アルカリプロテアーゼｃ−
Ｄ　Ｎ　Ａという）を検出するには、ハイブリダイゼー
ション・セレクション〔モレキュラーΦクローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第３２９〜
３３３頁及び第３４４〜３４９頁、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ｌ１ａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２年
）〕により検出することができる。

次いで、不完全なアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを３
２Ｐを用い二ツクトランスレーション法〔モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第１０９〜ｉ１２　頁、コールド・スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌ
ａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）、及
びジェイ・モル・パイオル（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９
７７）　）により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプロー
ブとしてコロニーハイブリダイゼーション法〔蛋白質、
核酸、酵素、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９８１
）　］によりプラスミドｐＵｃ１１９　Ｄ　Ｎ　Ａをベ
クターとして作成したｃ−ＤＮＡのシーンバンクのライ
ブラリーより１．ＩＫｂのアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ
ＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを得ることができる。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡよりアスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプ
ロテアーゼをコードする遺伝子（以下、アルカリプロテ
アーゼ遺伝子という）、を含有するＤＮＡを得るには、
該プラスミドＤＮＡに、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを
温度３０〜４０°Ｃ１好ましくは３７°Ｃで１〜２４時
間、好ましくは２時間作用させ、得られた反応終了液を
、アガロースゲル電気泳動法〔モレキュラー・クローニ
ング（Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１
５０頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ
−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）　（１９８２）記載〕によりアスペルギル
ス・オリゼー由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子を含有
するＤＮＡを得ることができる。

そして、このアルカリプロテアーゼ遺伝子の塩基配列の
決定を実施例の第９項目に示すような方法によって行な
い（第２図参照）、ついで、前記塩基配列を有する遺伝
子によって翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を
確定する（第３図参照）。

このようにして確定されたアミノ酸配列をコードする遺
伝子が本発明の遺伝子である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明によれば、本発
明アルカリプロテアーゼ遺伝子の組み込まれた組み換え
体ＤＮＡを含む、例えば微生物を培地に培養することに
より、極めて短期間のうちに、アルカリプロテアーゼを
効率よく得ることができ、また上記遺伝子は、蛋白質工
学用試料と用いることができるので本発明は産業上極め
て有用なものである。

［実施例］ 以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。

実施例 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６
）由来のアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａのクロー
ニング １、菌体の取得 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６
）の胞子（１，２Ｘ　１０”個）を、アルカリプロテア
ーゼ生産培地〔３％（Ｗ／Ｖ）加熱、加圧膨化処理した
脱脂大豆、３％（Ｗ／Ｖ）ＫＨｚＰＯ，）　５０ｒｄに
接種し、恒温振Φ機（大洋科学工業・社・製、Ｍ−１０
０’）を用いて１２Ｏｒ、ｐ、ｍ、　、温度３０″Ｃで
４５時間振盪培養を行ない培養物を得、常法によりこの
培養物を濾過して菌体１０ｇを得た。

２、ｍ−ＲＮＡの取得 項目１で得られた菌体１０ｇを、２０ｒｎｌのグアニジ
ンイソチオシアネート溶？ｆｆｌ（６Ｍグアニジンイソ
チオシアネート／３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，０）１０．７５％（Ｗ／Ｖ）　Ｎ−ラウＯイルサ
ルコシ７ナトリウム１０．１５Ｍ　β−メルカプトエタ
ノール〕に添加したものを、カップ型ブレンダー（日本
精機製作所・社・製）に入れ、更に、１０ｇのガラスピ
ーズ（直径０．５　ｍｍ）を添加し、１０，０ＯＯｒ、
ｐｌｍ、で５分間処理したのち、また更に、ｌＯ艷の水
飽和フェノールを添加し、１０．００Ｏｒ、ｐｌｍ、で
１０分間処理して菌体を破砕処理し、破砕物を得た。

このようにして得られた破砕物を冷却遠心機（日立１機
・社・製、１ＢＰＲ−５２）を用いて５．００Ｏｒ、ｐ
。

ｍ、で１０分間遠心分離処理して、菌体破砕液２０ｍ／
を得た。

次いで、超遠心分離機用チューブ（旧立工機・社・製）
４本に、予め１．２　ｍｆの５．７Ｍの塩化セシウム溶
液を夫々重層し、その上に、上記菌体破砕液を重層する
ように夫々分注し、超遠心分離機（日立１機・社・製、
５ＣＰ５５１（）を用いて温度１５°Ｃ１３０、００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、で１６時間遠心分離して沈澱物を得た。

得られた沈澱物を、冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを用
いて洗浄したものを、１０ｍＭ　トリス緩衝液（１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ／　１％ドデシル硫酸ナトリウム〕４ｍｌに懸濁した
ものに、同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを４
対１（容量比）となる如く混合したものを添加して抽出
し、常法により３．００Ｏｒ、　ｐ、ｍ、で１０分間遠
心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機溶媒
層に上記１０ｍＭ　）リス緩衝液４ｒｎｌを添加し、上
記抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得ら
れた水層に、１／１０ｉの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５
，２）及び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度
−２０″Ｃで２時間放置したのち、常法により８．００
Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２０分間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱さ
せ、得られたＲＮＡを４ｍｌの水に溶解し、上記エタノ
ール沈澱操作を行なったのち、得られたＲＮＡを１ｍＺ
の水に溶解し、１２■のＲＮＡを得た。

このＲＮＡ中よりｍ−ＲＮ　Ａを選択するために、１２
■のＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースにューイン
グランドバイオラボ・社・製）カラムクロマトグラフィ
ーにかけた。

カラムとして２．５　ｒｒｉテルモシリンジ（テルモ・
社・製）を用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液〔１０ｍ
Ｍ）リスー塩酸￥夏街？夜（ｐＨ７，６）／１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ／　０．１％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリ
ウム〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝＞
（１（１０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７，６）／１ｍＭ
　ＥＤＴＡ／　０．４　Ｍ　ＮａＣｌ／　Ｏ，１％ドデ
シル硫酸ナトリウム］で平衡化したものである。

１２■のＲＮＡに、同量の緩衝液（１０ｍＭ　）リス塩
酸（ｐＨ７，６）／１ｍＭ　ＥＤＴＡ／　０．８　Ｍ　
ＮａＣ１／　ｏ、　１％ドデシル硫酸ナトリウム〕を添
加し、温度６５°Ｃで１゜分間加熱処理し、水中で急冷
し、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかけたのち、
結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及びｔ
−ＲＮＡを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−ＲＮ
Ａを溶出し、９０ｕｇのｍ−ＲＮＡを得た。

３、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮ　Ａの濃縮次に、シ
ョ糖密度勾配遠心分離法によりアルカリプロテアーゼｍ
−ＲＮＡを濃縮した。

１０〜２５％（Ｗ／Ｖ）のショ糖密度勾配は、ベックマ
ン・社・製のローターＳ　Ｗ４１用ポリアロマチューブ
に４０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖液（５０ｍＭ　トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）／２０ｍＭ　ＮａＣ１／１ｍＭ　
ＥＤＴＡ／４０％（Ｗ／Ｖ）ショＦ）０．５／を入れ、
その上に２．４ｄずつ２５％（Ｗ／Ｖ）　、２０％（Ｗ
／Ｖ）　、１５％（Ｗ／Ｖ）及び１０％（Ｗ／Ｖ）のシ
ョ糖液を重層し、温度４°Ｃで２４時間放置することに
より作製した。このショ糖密度勾配に、ｍ−ＲＮＡ５０
μｇを重層し、ベックマン・社・製の５Ｗ４１０−ター
を用い、常法により３０，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、、温度１
８°Ｃで１８時間遠心分離を行なった。遠心分離操作の
のち、０．５　ｍｆずつ分画し、エタノール沈澱法によ
りｍ−ＲＮＡを回収し、１０μｌの水に溶解した。

次に、ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡが濃縮され
ている両分の同定を行なった。分画したＲＮＡＩμ尼、
ウサギ網状赤血球ライセード（アマジャム・社・製）９
μ！及び（３５ｓ）メチオニン１μｌ（アマジャム・社
・製）を混合し、温度３０°Ｃで３０分間反応させたも
のに、１５０μｌのＮＥＴ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣ
１１５ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、０２％（讐／ν）ＮａＮｚ
／　２０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐｔ（７，４）１
０゜０５％（Ｗ／Ｖ）ノニデットＰ−４０（ヘセスダリ
サーチラボラトリー・社・製、界面活性剤）］を添加し
、更に、１μ２の抗アルカリプロテアーゼ血清（後述の
ようにして調製したもの。）を添加し、温度４°Ｃで１
８時間放置したものに、１１０ｌｌ１のプロティンＡセ
ファロース　（ファルマシア・社・製）を添加し、温度
２０°Ｃで３０分間放置したものを、常法により１２．
０ＯＯｒ、ｐｌｍ、で１分間遠心分離処理し、樹脂、す
なわち、上記プロティンＡセファロースを回収した。

回収した樹脂を、２００μｌのＮＥＴ緩衝液で３回洗浄
し、この樹脂に、４０μｌの５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプ
ル緩衝液（６２，５ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ
６，８）　／　１０％（Ｖ／Ｖ）グリセｃ＋　−／Ｌ／
／　２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム１５％（Ｖ
／Ｖ）メルカプトエタノール１０．０２％（Ｗ／Ｖ）ブ
ロムフェノールブルー〕を添加し、温度１００°Ｃで３
分間煮沸し、常法により１２．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１
分間遠心分離処理し、上清を回収し、全量を１２％（Ｗ
／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲルに乗せた。

ゲル電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（
ネーチュアー（Ｎａ　Ｌｕｒｅ）、第２２７頁、第６８
０頁（１９７０）　）で行ない１、泳動したのちのゲル
は、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋白質
を固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍサリ
チル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して乾燥
ゲルを得、χ線フィルム　（フジ写真フィルム・社・製
、ＲＸ）を用いてフルオログラフィーを行なった。

以上の操作により、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡの
存在する両分のＲＮＡを用いた場合にのみ、アルカリプ
ロテアーゼ蛋白質のバンドがＸ線フィルム上に認められ
、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されている両
分が同定できた。

４、抗血清の調製 精製アルカリプロテアーゼに対するウサギの抗アルカリ
プロテアーゼ血清は、以下の方法により調製した。

４０■／ｒｎｌ濃度のアルカリプロテアーゼ溶液０．７
ｄを、等量のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバ
ントで懸濁したもの２８ｍｇを、抗原として体重２　ｋ
ｇの日本内色種ウサギの指軍部に投与し、飼育２週間経
過したのち、初回と同量の抗原を背部皮肉へ投与し、更
に、飼育１週間経過したのち、同様の操作を行ない、ま
た更に、飼育１週間後全採血を行なった。

そして、得られた血液を、温度４°Ｃで１８時間放置し
たものを、常法により３，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１５分
間遠心分離し、上清として抗アルカリプロテアーゼ血清
を得た。

５、ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの合成は、アマジャム・社・類キットを
用いて行なったものである。

上述の如くして得られたｍ−ＲＮＡ　１．６μｇを用い
てアマジャム社の指示するモル・セル・パイオル・（Ｍ
ｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（
１９Ｂ２）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２６
３頁（１９８３）記載の方法に従い行なった結果、１６
０ｎｇの２木鎖ｃ−ＤＮＡが得られた。

このようにして得たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ　１６０ｎｇに、ア
マジャム・社・ＷＣ−Ｄ　Ｎ　Ａクローニングキッドを
用い、アマジャム社の指示する方法により制限酵素Ｅｃ
。

Ｒ１切断部位のメチル化を行ない、更にｃ−ＤＮＡの両
端にＥｃｏＲＩ　リンカ−を付着させた。

６、ｃ−ＤＮＡバンクの作製 プラスミドｐＵｃ１１９　Ｄ　Ｎ　Ａ　（宝酒造・社・
製）１００ｎｇを、８μρの水に溶解したものに、１μ
ρのＭｅｄ緩衝液（１，ｏＯｍＭ　トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５）／１．００ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１０ｍＭ
ジチオスレイトール１５００ｍＭ　ＮａＣＩ）を添加し
たのち、更に、これに、１０ユニツト　（１μりの制限
酵素旦ｃｏＲｒ（宝酒造・社・製）を添加し、温度３７
°Ｃで２時間切断処理を行なった。

次いで、この切断処理物に、１μｌのＩＭ　トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）及び０．３ユニツト　（１μｌ
）のアルカリフォスファターゼ（宝酒造・社・製）を添
加し、温度６５°Ｃで１時間酵素反応処理し、切断処理
物の両端の脱リン酸化を行ない、これに、１２μｌの水
飽和フェノールを添加して除蛋白を行なったのち、回収
した水層に、１μ！の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８
）及び２６μｌの冷エタノールを夫々添加し、温度−７
０°Ｃで１５分間放置し、微量遠心機〔味トミー精工、
ＭＲＸ−１５０）を用い、１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で
５分間遠心分離処理を行ないＤＮＡを回収した。

このようにして得られた制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、
かつ両端を脱リン酸化したプラスミドベクターｐＵｃ１
１９ＤＮＡ　１１００ｎと、項目５で調製したＣ−Ｄ　
Ｎ　Ａ　１６０ｎｇを混合したものを、８μ！の水に懸
濁したのち、これに、１μｌのライゲーション緩衝液（
２０ｍＭ　ＭｇＣｈ／　６６ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，６）／１ｍＭ＾ＴＰ／１５ｍＭジチオスレイ
トール）を添加したものに、１ユニツト　（１μりの７
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造・社・！！り）を添加し、温
度１６°Ｃで１６時間放置し、プラスミドベクターＤＮ
Ａ及びｃ−ＤＮＡのライゲーションを行ない反応物を得
た。

この反応物を用いて、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方
法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡＣＩ。

ｎｉｎｇ）　、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５
）　〕により大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８４９）を
形質転換し、プラスミドｐＵｃ１１９　Ｄ　Ｎ　Ａをベ
クターとしたＣ−ＤＮＡバンクを作製した。

７、アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの断片の検索
ハイブリダイゼーション・セレクション〔モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第３２９頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−（１９Ｂ２）　）に従ってアルカリプロテア
ーゼｃ−ＤＮＡの検索を行なった。以下に、詳述する。

項目６で得られたｃ−Ｄ　Ｎ　Ａバンクより任意な大腸
菌７０株を選び夫々について以下の操作を行なった。モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１
゜ｎｉｎｇ）　、第８６ＮＬコールド・スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−（１９８２）記載の方法により、
ｃ−ＤＮＡバンク中の大腸菌から組み換え体プラスミド
ＤＮＡ５００μｇを夫々得た。このうち１１００ｕを、
水２００μｌに溶解し、温度１００　’Ｃで１０分間放
置したのち、水中に移して急冷したものに、２００μ２
の１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、室温にて２０分間放
置し、組み換え体プラスミドＤＮＡの変性液を得た。

次いで、このようにして得た変性液に、２００μｌの中
和液（１Ｍ塩化ナトリウム１０．３Ｍクエン酸ナトリウ
ム／　０．５　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
／ＩＭ塩酸塩酸型ばやく添加、混和したのち、氷中へ移
して象、冷した。この溶液を、直径５　＋ｎ＋ｎの円形
ニトロセルロースフィルター（ミリポア・社・製、カタ
ログナンバーＨＡＷＰ　０２５００）を用いて濾過し、
変性した組み換え体プラスミドＤＮＡをニトロセルロー
スフィルター上に吸着させたものを、常法により風乾し
たのち、６　Ｘ５ＳＣ（０，９Ｍ塩化ナトリウム１０．
０９Ｍクエン酸ナトリウム）を用いて洗浄し、更に常法
により風乾したのち、温度８０℃に保った真空オーブン
中で２時間放置し、組み換え体プラスミドＤＮＡをニト
ロセルロースフィルターへ固定させた。

次いで、ｌＯμｌのハイブリダイゼーション溶液Ｃｌ０
０μｇ／ｍＺ　ｍ−ＲＮＡ　（項目２で調製したもの）
７６５％（Ｖ／Ｖ）脱イオン化したホルムアミド／２０
ｍＭ１　。

４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ｐＨ６，４）１０
．２％ドデシル硫酸ナトリウム１０．４Ｍ塩化ナトリウ
ム／１１００ｕ　１ｍｌ酵母ｔ−ＲＮＡ）に、上記の如
（して得た組み換え体プラスミドＤＮＡを固定したニト
ロセルロースフィルターを浸し、温度５０°Ｃにて３時
間放置し、フィルター上の組み換え体プラスミドＤＮＡ
とｍ−ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを行なった。

反応終了したフィルターを取り出し１の耐洗浄液１　（
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）１０．１５
Ｍ塩化ナトリウム／１ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、　５％ドデ
シル硫酸ナトリウム〕で９回洗浄したのち、１−の洗浄
液Ｉ［（１０ｍＭｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）
／　０．１５　Ｍ塩化ナトリウム／１ｍＭ　ＥＤＴＡ　
）にて２回洗浄を行ない、フィルター上に固定したプラ
スミドＤＮＡとハイブリダイズしていないｍ−ＲＮＡを
除去した。

次いで、このニトロセルロースフィルターを、１００μ
ｌの水中へ移し、１０μｇの酵母ｔ−ＲＮＡを添加して
、１分間１００°Ｃの湯中へ放置し、ドライアイスで冷
却したエタノール中へ移したのち、室温中で放置し溶解
した。このようにしてハイブリダイズしたｍ−ＲＮＡを
ニトロセルロースフィルターより剥離した。得られた水
溶液に、１０μでの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ　Ｈ５，２
）及び３００μ！の冷エタノールを添加し、温度−７０
°Ｃにて１時間放置し、エタノール沈澱を行なったのち
、微量遠心機〔■トミー精工、ＭＲＸ−１５０）を用い
て１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心分離処理して
上記ハイブリダイズしたｍ−ＲＮＡを回収した。

次いで、項目３に記載したと同様にして、回収した上記
ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を合成し、項目４
で得られた抗アルカリプロテアーゼ血清を用いて、合成
した蛋白質がアルカリプロテアーゼか否かを分析した。

その結果７０株中１株についてポジティブな結果が得ら
れた。この株の保有する組み換え体プラスミドＤ　Ｎ　
Ａ　（ｐＯＡＰ３と命名）にはアスペルギルス・オリゼ
ー（ＡＴＣＣ２０３８６）由来のアルカリプロテアーゼ
ｃ−ＤＮＡの断片が挿入されていると結論できる。

次いで、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３ＤＮＡ１μｇ
を項目６に記載の方法により制限酵素ＥｃｏＲ■で処理
しアガロースゲル電気泳動法により移動度パターンを分
析し、得られたパターンとプラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　
Ｎ　Ａ　（全酒造・社・製）を制限酵素ＡハＩにより消
化して得られたＤＮＡ断片の標準パターンと対比するこ
とにより、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３ＤＮＡに挿
入されているアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片の大
きさは７５０ｂｐであることが判明した。

８、大きなアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの検索
項目７で得られたアガロースゲルより７５０ｂｐのアル
カリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片を含むアガロースゲル
を切り出し、透析チューブに入れたものに、５００ｕｆ
のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）／　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）を添加したのち、透析
チューブをシールし、電気泳動により、ゲル中より緩衝
液中にＤＮＡを溶出して得た溶液に、等容量の水飽和フ
ェノールを添加して撹拌し、水層を回収し、常法に従っ
てエタノール沈澱により１０００ｇのＤＮＡを回収した
。この１１００ｎのアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　
Ａを、Ｃα−”Ｐ　３　ｄＣＴＰ　（アマジャム・社・
製）を用いてニックトランスレーション法により標識し
た。ニックトランスレーションは、全酒造・社の指示す
るジェイ・モル・パイオル（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）
、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）及びモ
レキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ）、第１０９〜１１２頁（１９８２）記載の方
法に従った。このようにして調製した３２ｐで標識した
アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ断片をプローブと
して用い、項目６で得たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａバンクに対しコ
ロニーハイブリダイゼーション法〔蛋白質・核酸・酵素
、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９８１）　）より
検索し、アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを有するコロ
ニーを得た。そのうち１個のコロニーの有する組み換え
体プラスミドＤＮＡをｐＯＡＰ　５と命名し、項目７に
従い組み換え体プラスミドＤＮＡを調製した。

該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（ｐＯＡＰ　５　）と命
名した。

なお、該形質転換株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第９８７０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９８７
０）として寄託されている。

組み（桑えイ本プラスミドｐ〇へＰ５ＤＮＡを項目６に
記載の方法と同様にして制限酵素旦ｃｏＲＩで処理し、
アガロースゲル電気泳動を行なったところ、挿入ＤＮＡ
断片の大きさは１　、１００ｂｐであることが判明した
。そして、項目８記載の方法と同様にしてこの１，１０
０ｂｐのアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａを含むＤ
ＮＡ断片０．１μｇを分離、精製した。組み換え体プラ
スミドｐＯＡＰ５ＤＮＡを制限酵素Ａｆｌ■、足並Ｒ■
、入江Ｉ、５ａｌｒ及び又肌Ｉの単一または二重消化を
行ない、項目７に記載したと同じ方法にて、現われた断
片の大きさを分析することにより、組み換え体プラスミ
ドｐＯＡＰ５ＤＮＡの制限酵素地図を作製し、該地図を
第１図に示した。

９、アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの塩基配列の
決定 項目８で得られた夫々のアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　
Ｎ　Ａ断片を、同−又は同一ののりしろの制限酵素によ
り切断したプラスミドｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９ＤＮＡ
　（全酒造・社・製）にクローニングした。

シーフェンシングは、プラスミドＤＮＡを榊の方法〔ベ
クターＤＮＡ、第７０頁、講談社（１９８６年）］に従
ってアルカリ変性させたのち、Ｍ１３シークエンスキッ
ト（全酒造・社・製）を用いて常法によりダイデオキシ
・チェーン・ターミネーション法で行なった。

このようにしてアスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２
０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のうち、マチュ
アーなアルカリプロテアーゼに対応する塩基配列を第２
図に、また、前記第２図に示す塩基配列を有する遺伝子
から翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を第３図
に夫々示した。

このアミノ酸配列をコードする遺伝子が本発明の遺伝子
である。

このＤＮＡ塩基配列より推測されるアミノ酸配列のＮ末
端には精製したアルカリプロテアーゼのＮ末端のアミノ
酸配列１６個（Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｕＬｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｔｒｐ　
　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　
　５ｅｒ）が確認された（第３図下線部）。

以上の知見より第２図に示した塩基配列は、マチュアー
なアルカリプロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部分宿
をコードしていると結論できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミｌ”ｐＯＡＰ５ＤＮＡの
制限酵素地図を示す図であり、第２図は、実施例の９項
目に記載のマチュアーなアルカリプロテアーゼに対応す
る遺伝子の塩基配列を示す図であり、また、第３図は、
第２図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳されるポ
リペブタイドのアミノ酸配列を示す図である。 出願人　食品産業酵素機能変換技術研究組合代理人　弁
理士　乎　末　祐　輔 第２図 ＧＧＣ ＡＧ ＴＧ ＧＧＣ ＣＴ ＧＧＣ ＧＧＣ ＡＣ ＡＧ ＡＣ ＡＧ ＴＣ ＧＴ ＡＣ ＧＧＣ ＡＣ ＧＧＣ ＣＴ ＧＧ ＧＴ ＧＴ ＧＧＣ ＴＧ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＧＣ ＴＴ ＧＧＣ ＡＣ ＡＧ ＧＧＣ ＡＧ ＣＴ ＡＣ ＴＧ ＴＴ ＧＧＣ ■ＡＣ ＡＣ Ｌｉｌ ＡＣ ＣＴ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アスペルギルス属に属する微生物に由来し、下記
   の制限酵素開裂地図で規定されるアルカリプロテアーゼ
   遺伝子。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＥはＥｃｏＲ I 、ＡはＡｆｌII、ＫはＫｐｎ
   I 、ＸはＸｍｎ I 、ＳはＳａｌ I を示す）