JPH0216990A - Ｌ−トリプトファンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、固定化酵素源を用いてインドール及びＬ−セ
リンからＬ−トリプトファン（以下、単にトリプトファ
ンと称することがある）を製造する技術に関する。

更に詳しくは、反応液中に生成したトリプトファンを活
性炭により吸着分離後、反応に有効な成分を含む該反応
液を再び反応に使用するトリプトファンの製造技術に関
する。

〔従来の技術〕

トリプトファンは、アミノ酸の一種で、輸液成分として
医薬用に用いられているほか、飼料添加物としての用途
開発が進められており、多くの需要が見込まれている。

従来からトリプトファンは種々の方法で生産されており
、天然物からの抽出法、微生物発酵法、酵素法等が用い
られて来た。これらの生産方法の中でも、酵素法は副生
成物が少なく精製が比較的容品なこと、生産性が高く大
量生産に適していること等から、近年、酵素法について
の技術開発が盛に行われている。またこの酵素法では、
反応操作は一般に回分式の方法が取られる。

このような酵素法において、反応を触媒する酵素として
は、トリプトファン・シンターゼ又はトリプトファナー
ゼが用いられる。

これら酵素は、基質の一つであるインドールにより酵素
活性が所謂基質阻害効果を受け、また同様に生成物であ
るＬ−トリプトファンによっても所謂生成物阻害効果を
受け、逆に基質の一つであるし一セリンによっては基質
保護効果を受けて酵素活性が保護される特徴を存する。

従って、これらの酵素を用いてＬ−トリプトファンを生
成せしめる場合には、これらの特徴を考慮して反応条件
を適切に設定する必要があり、またこの適切な反応条件
を達せしめるプロセスを構築する必要が有る。

具体的には、し−セリンによる基質保護効果及び反応速
度の向上を意図して、反応液中のし一セリン濃度をイン
ドールに対して常に等モル以上に過剰に存在せしめる必
要がをる。その過剰量は最終反応完了時に於ても少なく
ともインドールに対して５〜１（ｍｔχの量が必要であ
る。従って、反応終了時でも反応生成液中には過剰分の
Ｌ−セリンが存在していることになる。

このようなことから、反応生成液中に残存するＬ−セリ
ンを回収することが、酵素法にょるＬ−トリプトファン
の工業的製造のためには極めて重要なことである。しか
し、この残存し一セリン量が少ない場合には分離回収に
かかる費用に比較して回収によるメリットが少ないので
、トリプトファンの分離、精製工程で廃棄されることと
なり、結果としてＬ−セリンの利用効率が低下するとい
う問題が有る。

また残存量が多いか、Ｌ−セリン供給源としてＤＬセリ
ンを使用する場合等には、ＤＬ−またはＤ−セリンを、
例えば、特開昭６１−１８９２６７に開示されているよ
うな方法で回収再使用しなければセリンの利用効率が著
しく低くなるという問題がある。

特開昭６１−１８９２６７に開示されている方法では、
反応液中のＬ−トリプトファン、ＤＬ−セリン、Ｄ−セ
リンを全て強酸性陽イオン交換樹脂に吸着させ、溶離操
作条件を変えることによってＤＬ−およびＤセリンをＬ
−）リブトフプンと別に溶離回収している。回収したＤ
−セリンはラセマーゼによりラセミ化し口Ｌ−セリンと
して反応に再使用してセリンの有効利用率の向上を図っ
ている。

しかしながら、この方法ではイオン交換樹脂からＤＬ−
またはＤ−セリンとＬ−トリプトファンとを別々に溶離
する操作が繁雑であるばかりでなく、回収されたセリン
の濃度も低くまた無機塩を含んでいるので、再利用する
には脱塩、濃縮等の操作が必要となり好ましくない。

更に、Ｌ〜トリプトファンの製造に於いて重要なことは
、Ｉ、〜トリプトファンの水への溶解度が高々２０〜３
０ｇ／　Ｉ！、と低いため、従来の方法では反応が進む
につれて反応液中にＬ−トリプトファンの結晶が析出し
、酵素の活性を阻害するばかりでなく、反応速度も著し
く低下させる。これは特に液中の、Ｌ−トリプトファン
の蓄積濃度が高くなるほど負の効果が大きい。また特に
固定化酵素源を用いる方法の場合には、固定化酵素源の
表面にＬ−トリプトファンの結晶が析出して基質及び生
成物の拡散移動速度が低下し、反応速度を低下させるば
かりでなく、固定化酵素源を連続反応で長時間使用しよ
うとする場合に酵素活性の寿命時間を著しく短縮させて
しまう。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、固定化酵素源を用いて、インドール及
びＬ−セリンからＬ−トリプトファンを製造するに際し
、上記の問題点、即ち　反応液中にセリンが残存する為
にセリンの利用効率が低いこと、Ｌ−トリプトファンと
残存セリンの分離収率が悪いこと、生成したＬ−トリプ
トファンにより酵素活性が阻害を受は固定化酵素源の活
性の寿命が短くなること等の問題点を解決することであ
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討し、反
応中にＬ−またはＤＬ−セリンをＬ−セリンとしてイン
ドールの当量より過剰に使用して、セリンの酵素活性保
護効果を発揮せしめなからセリンの過剰量に関係なくセ
リンの利用効率を向上せしめ、且つ反応液中のＬ−トリ
プトファンを逐次反応系外に分離することにより、結晶
が析出する濃度以下、更には、可能な限り低濃度に保つ
ことにより、Ｌ−トリプトファンによる生成物阻害効果
を減殺せしめるだけでなく、Ｌ−トリプトファンの結晶
析出による物質移動速度の低下を避けることによって反
応速度の低下を回避できることを見出し、本発明のＬ−
トリプトファンの製造方法を完成するに至った。

すなわち、本発明は、固定化酵素源を用いてインドール
及びＬ−セリンからＬ−トリプトファンを製造する方法
に於いて、反応液中に生成したＬ−トリプトファンを活
性炭により選択的に吸着分離し、Ｌ−トリプトファンを
実質的に含まない処理液を再び上記反応に使用すること
を特徴とする方法である。

以下に本発明を詳述する。

本発明に於ける固定化酵素源とは、酵素であるトリプト
ファン・シンターゼまたはトリプトファナーゼそれ自体
或いはこれら酵素を生産する微生物菌体を担体に固定化
した所謂固定化酵素を意味する。　例えばトリプトファ
ン・シンターゼの生産菌としてはエシェリヒア・コリＭ
Ｔ−１０２３２（ＦＥＲＭＢＰ−１９）、エシェリヒア
・コリＭＴ−１０２４２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２０）、ノ
イスボ・クラッサ　ＡＴＣＣ−１４６９２などを挙げる
ことが出来る。

またトリプトファナーゼ生産菌としては、例えば、プロ
テウス・ブルガリスＩＦＯ３１６７、エシェリヒア・コ
ＩＪ　ＩＡＭ　１２６８、アエロバクタ−・アエロバク
タＩＰＯ１２０１９、クラブシェラ・ニューモニアエＡ
ＴＣＣ８７２４、バチルス・アルヘイ　ＡＴＣＣ６３４
８などを挙げることが出来る。

」二記酵素または微生物菌体を、固定化するための方法
としては、−船釣に良く利用される方法でよい。例えば
、アルギン酸カルシウムゲル、アルギン酸アルミニウム
ゲル、に−カラギーナンゲル、アクリルアミド重合物な
どで包括固定化する方法、イオン交換樹脂などに結合さ
せる担体結合法、架橋法或いはこれらの方法の複合法な
どを挙げることが出来る。

活性炭層に通液してトリプトファンを吸着せしめる反応
液としては、上記酵素源を用いてインドール及びセリン
から生成した溶解度濃度以下のトリプトファンを含む反
応液であれば特に制限は無い。反応液中に固定化酵素源
より漏洩した酵素、微生物菌体、或いはそれらの分解物
、その他の不溶解物が含まれる場合には、限外ろ過膜、
メンブレンフィルター等の適切なろ過装置でろ過処理を
した後、活性炭層に通液すると良い。

活性炭層に通液する液のｐｌ＋は特に制限は無いが、ト
リプトファンの溶解度が低い中性付近が望ましい。

吸着操作時の液の温度についても特に制限は無いが、温
度と吸着量の関係を考慮して５０’Ｃ以下、更に好まし
くは２５〜４０°Ｃが良い。

本発明で使用する活性炭としては、本発明の原理から言
って特に制限は無い。例えば、粒状活性炭、粉末活性炭
、活性炭繊維であり、原料面から言えば、ヤシ殻活性炭
、石炭由来の活性炭など特にその種類は問わない。好ま
しい形態としては、吸着したトリプトファンをアンモニ
ア水等の薬剤で脱着回収する必要があるので、高い脱着
効率を上げる為には薬剤再生用として開発された活性炭
を挙げることができる。例えば、東洋カルボン社製ＡＰ
Ｃ炭、クラレケミカル社製ＧＬＣ炭、成田薬品工業社製
にＬ炭、北越炭素工業社製ＣＬ−Ｈ，ＣＫ−に炭等が適
している。これらの活性炭は熱賦活時に通常の活性炭よ
りも高賦活化処理することにより、平均細孔径を上げ、
薬剤による吸着物質の脱離を容易ならしめた活性炭であ
る。

本発明の活性炭吸着装置の形式は、通常の固定床、流動
床、移動床、擬億移動床などを採用することができ、特
にその形式は問わない。従って液の通液方式も連続式、
回分式を問わず、通液方向も上向流、下向流を特に問わ
ない。

通液速度は、例えば、固定床式の場合、充填した活性炭
の容量に対して１時間当り０．５〜２倍の通液量が好ま
しい。

活性炭へのトリプトファンの吸着量には一定の限界があ
るので、破過した場合には他の活性炭層に通液を切り替
えれば反応液を連続的に処理することが出来る。

活性炭に吸着しているトリプトファンはアンモニア水等
により脱着回収後、濃縮、精製する。活性炭は再びトリ
プトファンの吸着に使用される。

活性炭によりトリプトファンを吸着除去された処理液に
はし一セリンまたはＤＬ−及びＤ−セリンが含まれてい
るので再度トリプトファンの合成反応に使用することが
出来る。但しＤ−セリンはラセミ化処理をしてＤＬ−セ
リンとする必要がある。この時トリプトファンの合成反
応に再使用するセリンを含んだ液は最初の反応器に循環
しても良いし、或いは新たな反応器に供給しても良い。

この時、反応器に供給する前にセリンを必要量添加して
も良いし、或いは別途反応器にセリンを供給しても良い
。

プロセスを組み立てる上で反応器と活性炭吸着装置との
組み合わせ方法は種々考えられる。例えば、第１図に示
した如く活性炭吸着装置からの流出液を反応器に戻す方
法、成るいは第２図に示した如く第２の反応器に供給し
、第２の反応器の流出液は第２の活性炭吸着装置で処理
し、処理液は最初の反応器に循環再使用することもでき
る。或いはこの反応器と活性炭吸着装置との組み合わせ
を数段続けても良く、最終段の吸着装置の流出液を最初
の反応器にＶａｍ再使用することも出来る。

〔作用および効果〕

本発明の効果はつぎのようである。即ち、反応液中のＬ
−１−リプトファンとセリンを容易に分離することが出
来、回収したセリンを反応に使用することが出来るので
、セリンの利用効率が高い。セリンの回収効率は反応液
中の残存セリン世に関係がないので、反応はセリン濃度
の高い条件で実施出来、セリンの基質保護効果を発揮さ
せることが出来る。更にＬ−セリンを含んだ液を何回循
環使用しても、常に反応液中のＬ−トリプトファン濃度
を低く保つことが出来るので、生成物阻害効果を回避す
ることが出来る。従ってこれらの効果によって酵素活性
を安定的に長期間保つことが出来るので、固定化酵素源
を用いた反応では酵素活性の寿命時間が長くなり、酵素
源の利用効率が高くなる。また以上の工程を連続化する
ことが可能になるので装置の稼動率を上げ、運転要員も
少なくて済む等の利点が生ずる。

〔実施例〕

以下、本発明の詳細な説明するが、本発明は言うまでも
なくこれら実施例に限定されるものではない。

参考例１ トリプトファン・シンターゼ生産菌であるエシェリヒア
・コリＭＴ−１０２３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９）を５
００ｍ　ｌの坂ロフラスコ中の第１表に示す組成の培地
１００ｍ　ｌに接種し、３５°Ｃで２４時間培養した。

この培養液２００ｍｊ！　（フラスコ２本）を３０ｆｆ
ｉのジャーファーメンタ−中の第２表に示す組成の培地
１５！に接種し、３５°Ｃ，ｐＨ６，８（２８χアンモ
ニア水で調整）で３０時間培養した。

培養終了後、培養液を遠心集菌して湿菌体を約６００ｇ
得た。これを密封容器に入れ、４°Ｃの冷蔵庫に保管し
、固定化酵素源の作製に使用した。

第１表　培養培地の組成 ａＣＩ ｇ 蒸留水ＩＰに希釈して使用（ｐＨ６，８）第２表　増殖
培地の組成 蒸留水１Ｎに希釈して使用（ｐｌ＋　６．８）固定化方
法 上記湿菌体１部と生理食塩液１部とを撹はん混合した。

一方蒸留水７．７６部と、アルギン酸ナトリウム（記文
フードケミファ社製Ｎ５ＰＬＬ　）　０．２４部とを撹
はん混合しｐｌ＋を８．５に苛性カリで調整した。

菌体の懸濁液２部と、上記のアルギン酸ナトリラムの溶
解１８部を撹はん混合し、注射器に充填、内径が０．５
〜０．８ｍｍ程度の注射針の先端より、ゲル化液に滴下
した。

ゲル化液は、０．５モル濃度の塩化カルシウムニ水塩水
溶液を６規定苛性カリ水溶液でｐＨを８．５に調整し、
１０゛Ｃに保った液を５０部使用した。

ゲル化液に滴下されて生成した粒子は液中で約１時間撹
はん熟成後、液中より取り出し以下のテストに使用した
。

実施例１ ５００ｍ　ｌの撹はん機付きガラス製反応器に第３表に
示した組成からインドールだけを除いた溶液１００ｍ　
ｌと参考例１で作製した固定化酵素源５０ｍ　ｌを仕込
み、この反応器を温水浴中に保持して温度を常に３０°
Ｃに保った。

次に第３表で示した組成の反応供給液を、内容を攪拌し
ている反応器に毎時５０ｍ　ｌの速度で連続的に供給し
、一方反応器からも同速度で連続的に抜液を行ない、次
に示した活性炭充填塔に通液した。活性炭塔からの流出
液は反応器に循環再使用した。活性炭塔の仕様は、下部
に目皿を備えた内径２８ｍｍの透明塩ビ製円筒に、東洋
カルボン社製粒状活性炭／ＩＰｃ炭を５０ｍ　ＩＶ、充
填したものを２塔用い、２４時間毎に交互に使用した。

尚その際吸着したトリプトファンは、常法により活性炭
がら溶離後、再吸着に使用した。

各段階での液中の各成分の濃度を高速液体クロマトグラ
フィーで分析し、その結果を第４表に示した。この装置
を２００時間連続運転した結果、Ｌセリンの物質収支は
９８χ、消費したＬ−セリンに対する生成したＬ−トリ
プトファンの収率は９５χであった。

第３表　反応供給液の組成 ｐ）Ｉ ８．５ 第４表　各工程液の組成 比較例１ 第３表に示した反応供給液のし一セリンの濃度を２．５
ｇ／ｌとした以外は実施例１と同様の操作を行ったとこ
ろ、約１００時間でインドール当りのＬ−トリプトファ
ンの収率が５０χに低下した。

実施例２ 実施例１と同様の反応器と活性炭吸着塔との組合わせを
４＆１１直列につなぎ、各反応器の初期仕込液組成は実
施例１と同様とした。第１段目の反応器には第３表で示
した反応供給液からインドールを除いた組成の液を毎時
４８ｓｊ２の速度で供給した。またインドールはメタノ
ールに６２．５ｇ／Ｉ−の濃度で溶解させた液を毎時２
＋ａｊ！の速度で各段反応器に供給した。４段目の活性
炭塔流出液から通常の蒸留によりメタノールを分離除去
後、回収したし一セリンを含む液に不足のし一セリン、
ピリドキサールリン酸を加えて第１段目の反応供給液組
成に調合し、第１段目の反応器に供給した。活性炭塔は
実施例１と同様に使用した。この方法によりトリプトフ
ァン合成反応を連続的に実施したところ、各段のインド
ールに対するトリプトファンの収率が５０χに低下する
までの時間を測定したところ、いずれの段の反応器も約
７５０時間以上であった。

比較例２ ５００ｍ　ｌの撹はん機付きガラス製反応器に第３表に
示した組成からインドールだけを除いた溶液１００＋ｎ
Ｉ！、と参考例１で作製した固定化酵素源５０ｍ　ｊ！
を仕込み、この反応器を温水浴中に保持して温度を常に
３０°Ｃに保った。

次に第３表で示した組成の液にＬ−トリプトファンを８
．６ｇ／　１の濃度となるように添加した反応供給液を
、撹はんしている反応器に毎時５０＋ｎ　ｌの速度で連
続的に供給し、一方反応器からも同速度で連続的に抜液
を行なって、反応器流出液中のＬ−トリプトファン濃度
を高速液体クロマトグラフィーで分析した。インドール
に対するＬ−トリプトファンの収率が５０χに低下する
迄の時間を求めたところ約３８０時間であった。

〔発明の効果〕

これらの実施例および比較例から、生成した反応液を活
性炭充填塔に通液し、！、−トリプトファンを活性炭に
吸着させ、インドールおよびＬ−トリプトファンを含ま
ず、Ｌ−セリンを含む流出液を循環再使用し連続運転し
て、Ｌ−セリンの酵素活性保護効果を発揮せしめながら
、トリプトファンを長時間、高い収率で生成せしめうる
ことが明らかである。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明の方法を実施する反応のプロセス例を示
す図である。 第１図は本発明の方法を適用して、反応器と活性炭吸着
装置とをそれぞれ１基ずつ用いて組合わせたプロセスの
例を示す図である。 第２図は第１図と同様に、反応器と活性炭吸着装置との
組合わせを２組直列に接続したプロセスの例を示す図で
ある。 なお、図１および２において、 りである。 １ば原料の供給 ２は反応器 ３は活性炭吸着装置 各符号は次の通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、固定化酵素源を用いてインドール及びＬ−セリンか
   らＬ−トリプトファンを製造する方法に於いて、反応液
   中に生成したＬ−トリプトファンを活性炭により吸着分
   離し、活性炭により処理した該反応液を再びＬ−トリプ
   トファン合成反応に使用することを特徴とするＬ−トリ
   プトファンの製造方法。 ２、固定化酵素源を用いてインドール及びＬ−セリンか
   らＬ−トリプトファンを製造する方法に於いて、反応液
   中に生成したＬ−トリプトファンを活性炭により吸着分
   離し、活性炭により処理した該反応液にＤＬ−またはＬ
   −セリンを加え再びＬ−トリプトファン合成反応に使用
   することを特徴とするＬ−トリプトファンの製造方法。 ３、活性炭が高賦活化活性炭である請求項１または２記
   載の方法。