JPH0216454A - 血液成分の体外沈澱装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は全血清（Ｖ　ｏ　ｌ　ｌ　ｓｅｒｕｍ）または
血漿（Ｐ　Ｉａｓｍａ）から低密度リボ蛋白質（ｌｏｗ
　ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｌ　１ｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）を選択
的に体外沈殿させる（ｚｕｒ　５ｅｌｅｋＬｉｖｅｎ　
ｅｘ−ｔｒａｋｏｒｐｏｒａｌｅｎ　　Ｐ　ｒａｚｉｐ
ｉｔａｔｉｏｎ）装置に関する。

リポ蛋白質系の総合分析の分野における最近の進歩によ
って、古くからの伝染病掌上のデータにみられる血漿コ
レステリン濃度と初期のアテローム性動脈硬化症、特に
コロナール性動脈硬化症（Ｋ　ｏｒｏｎａｒｓｋｌｅｒ
ｏｓｓ）との間の密接な相関関係は実質上はコレステリ
ンに富んだβ−リポ蛋白質によって与えられることが判
明した。ヒトの血液中では、通常は全コレステリンの約
７０〜８０％が低密度またはβ−リポ蛋白質に結合して
おり、残りは他のリポ蛋白質成分（実質上はＶＬＤＬ、
ＨＤＬおよび乳状脂粉）に分配される（ＬＤＬ−低密度
リポ蛋白質、ＶＬＤＬ＝非常に低密度なリポ蛋白質、Ｈ
ＤＬ＝高密度リポ蛋白質）。脂肪代謝を妨げ、血漿脂質
濃度を高めながら進行し、しかも初期のアテローム性動
脈硬化症へ導く疾病経過においては、全コレステリンに
対するＬＤＬ−またはβコレステリン（ＬＤＬ−β−リ
ポ蛋白質）の割合はさらに増加する。即ち、高コレステ
リン血症（Ｈｙ−ｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｉｎｉｉｍｉｅ
）は通例、高β−リポ蛋白質血症によって引きおこされ
る。従って従来から低密度リポ蛋白質を選択的に測定し
て該リポ蛋白質を血液循環路からできる限り選択的に除
去する試みがなされていた。

これらの試みは技術的状況を考慮すると未だ十分解決さ
れていない。低密度リポ蛋白質を定量する常套の方法は
、超遠心分離機により密度クラスにおいてリポ蛋白質ス
ペクトルを分離する方法、または所謂リポ蛋白質電気泳
動に利用する電場でのリポ蛋白質スペクトルを分離する
方法に基づく。

さらに、アポーＢ−含有リポ蛋白質（Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌお
よびＬＤＬ）をポリアニオンと２価カチオンにより非ア
ポーＢ−含有リポ蛋白質から沈殿によって分離すること
に基づく沈殿方法によって決定することもできる。アポ
ーＢ−蛋白質の場合は、ＶＬＤＬおよびプレーβ−リポ
蛋白質および乳状脂粉よりも低密度またはβ−リポ蛋白
質の主要な蛋白質成分が問題となる。沈殿方法はＶＬＤ
Ｌｔ−ＬＤＬから分離するには従来は不適であった。前
述の超遠心分離法（Ｈａｖｅｌ　　Ｒ，Ｊ、、Ｅｄｅｒ
　　Ｈ，Ａ。

およびＢｒａｇｄｏｎ　　Ｊ、Ｈ，の報文「超遠心分離
機によって分離されたヒト血清中のリポ蛋白質の分布と
化学組成」、Ｊ　、ＣＩｉｎ、　Ｉ　ｎｖｅｓＬ、第３
４巻、第１３４５頁、１９５５年〕および電気泳動法（
Ｗｉｅｌａｎｄ　　Ｈ，およびＳ　ｅｉｄｅｌ　　Ｄ　
、の報文「リポ蛋白質試料の総合分析における進歩」、
Ｉｎｎ、Ｍｅｄ、、第５巻、第２９０頁〜第３００頁、
１９７８年〕はいずれも多数の常套のシリーズ（Ｒｏｕ
ｔｉｎｅ−ｓａｒｉｅｎ）に使用する場合は、コスト高
で時間がかかりすぎ、自動化できないという欠点がある
。さらに、低密度コレステリンの直接測定は、通常は超
遠心分離機を使用して成分を単離した後でのみ可能であ
る。

電気泳動による低密度コレステリン分の計算による評価
は蛋白質脂質組成が一定であることを前提とする。同様
のことが沈殿技術に用いられる方法にも適用される。常
套の沈殿技術はさらに、リポ蛋白質スペクトルをわずか
２種の主要成分（アポＢ含有分および非アポーＢ含有分
）に分離するにすぎないのでＶＬＤＬとＬＤＬを区別ま
たは分離できないという欠点を有する。

低密度リポ蛋白質を効果的に沈殿させようとする治療上
の試みはことごとく不十分であった。低密度リポ蛋白質
濃度を薬剤によって左右することは、特に脂肪代謝障害
という遺伝学的形態の場合は非常にむずかしく、通常は
不十分である。薬剤によって達成された従来の結果では
、アテローム性動脈硬化症の危険性を減少させるという
治療上の効果は確実には証明されていない。異常な血液
循環状態の確認または腸のかなりの部分の移転に実質上
基づく外科手術は明らかに治療上の効果をもたらすが、
予想されたような強い副作用のために一般的に代替可能
な方法となっていない。確かにこのような思い切った治
療処置によって、低密度リポ蛋白質を十分に低減させる
場合にはアテローム性動脈硬化症の進行が停止されるば
かりでなく、既存のアテローム性動脈硬化症性の血管変
質が退縮される。

血液から低密度リポ蛋白質を「機械的に」除去する研究
は従来の実質上次の２つの道を辿ってきた。

一つの方法は病気患者を所謂プラズマフェレーゼ（Ｐ　
Ｉａｓｍａｐｈｅｒｅｓｅ）で治療して全体の血清を完
全に交換するものである。この方法によれば、病気患者
の低密度リポ蛋白質を減少させることができるが、同時
に、アテローム性動脈硬化症を阻止する高密度リポ蛋白
質も血液から除去するので全体として望ましくない治療
上の効果がもたらされる。

さらに血漿交換に際して、血漿のすべての他の蛋白質、
含有される凝固因子、グロブリンおよびホルモンも一緒
に除去される。しかしながら、血漿から低密度リポ蛋白
質を選択的に除去する試みの方が依然として優れている
が、この方法の方が従来および高β−リポ蛋白質血症と
いう特定の場合にはあ（までも役立つことが証明された
。血液から低密度リポ蛋白質を除去する第１の試みは、
マトリックスに結合した特殊な抗体を用いておこなうも
のである。抗体は羊または家うさぎの免疫化によって入
手していた。このような系（Ｈａｂｅｎ　１ｃｈｔＡ、
、ドクトル論文（１９７８年、ｌ＼イデルベルグ大学、
医学部）；５ｔｏｆｆｅｌ　　Ｗ、およびＤｅｍａｎｔ
Ｔｈ、の雑文「血漿からのアポリボ蛋白質Ｂ−含有血清
リポ蛋白質の選択的除去」、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ、第７８巻、第６１１頁〜第６１５
頁、１９８１年〕を用いることによってすべてのアポ−
ロー含有リボ蛋白質の著しい減少が得られたが、この方
法は、動物の体内で生産された抗体が治療に際して患者
の循環血液内に少量ではあるが入ることが避けられない
という欠点を有する。

これは長期にわたって追跡されなければならず、治療患
者にとっては免疫学的問題として解決されなければなら
ない。このような方法に対するこの大きな障壁は、脂肪
代謝障害の治療が生命にかかわる場合は一層重大な問題
となり、該治療は有効的かつ持続的に効果を及ぼすべき
である。家族性形態の場合には、初期に発生するアテロ
ーム性動脈硬化症性の血管疾病の進行を阻止または可測
的に遅延させるために青年時代に治療をおこなうことが
必要である。アポ−Ｂに対する固定された抗体を導入す
る方法の別の欠点は、すべてのアポＢ含有リポ蛋白質を
特異的に除去できないことである。この方法はまた、低
密度リポ蛋白質を唯一のアテローム性動脈硬化症性リポ
蛋白質（ａｔｈｅｒ。

ｇｅｎｅ　　Ｌ　１ｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅ）として選択
的に除去するのには不適である。ＶＬＤＬを同時に除去
することの重大な欠点は、肝臓内でのトリグリセリドと
コレステリンの合成がそれによって刺激されることであ
る。

血液から低密度リポ蛋白質を除去する第３の方法は、ア
ガロース微粒子上に結合させた硫酸塩化した多糖類、例
えばヘパリンまたはデキストラン硫酸塩（米国特許第４
１０３６８５号）に、全血からβ−およびプレーβ−リ
ポ蛋白質を選択的に吸収させることに基づくものである
。該米国特許の明らかな欠点は、この方法によるリポ蛋
白質の除去能が小さいことと、および低密度リポ蛋白質
ばかりでなく、非常に低密度のリポ蛋白質も除去するこ
とである。該米国特許明細書には生体外試験におけるコ
レステリンの低下が記載されているにすぎない。コレス
テリンの低下は、リン脂質とトリグリセリドが不随して
低下するように、選択的除去によるよりも患者の血液の
希釈によって引き起こされるものと考えられる。

リポ蛋白質を一般にその等電点において沈殿させる米国
特許第４２１５９９３号明細書に記載の方法は、リンタ
ングステン酸ナトリウムを使用する点で本発明方法とは
異なる。このポリアニオンは非生理学的であって、本発
明方法とは異なり、治療用に使用するには不適である。

リンタングステン酸塩を使用したのでは低密度リポ蛋白
質を選択的に除去または定量することはできないので本
発明の主要な目的を達成することはできない。この方法
がうまくいかないことは米国特許第４２１５９９３号明
細書等に示されている。即ち、全コレステリンおよびト
リグリセリドを考慮して所謂ＨＤＬ−コレステリンから
計算式（Ｆ　ｒ　１ｅｄｅｖａ　ｌｄ式）によって低密
度リポ蛋白質を計算することが推薦されている。本質的
には、米国特許第４２１５９９３９明ｍ書に開示されて
いるようなリンタングステン酸を使用する等電点沈殿法
は、２価カチオンを併用する常套のポリアニオン沈殿法
とはその結果において異なる。この方法におけるＶＬＤ
ＬとＬＤＬの完全な沈殿は、分子量の正確に定義された
ポリマー、例えばポリビニルピロリドンまたはポリエチ
レングリコールを沈殿溶液に添加するときにのみ達成さ
れる。この方法を体外系で実施できないことは疑問の余
地がない。

さらに、米国特許第４２１５９９３号明細書においては
、β−リポ蛋白質、プレーβ−リポ蛋白質および乳状脂
粉の合計を低密度リポ蛋白質とする誤った結果に導かれ
ることが示されている。米国特許第４２１５９９３号明
細書に説明された目的は血清中の高密度リポ蛋白質を決
めることなので、その価値は高密度リポ蛋白質と共に存
在するＶＬＤＬ、乳状脂粉およびＬＤＬがこの沈殿法に
よって除去されることである。有効な低密度リポ蛋白質
またはβ−リポ蛋白質の特異的な沈殿は意図されておら
ず、達成されてもいない。

本発明の課題は、血液、即ち全血清または血漿のような
血液成分から低密度リポ蛋白質またはβ＝リポ蛋白質を
選択的かつ高能率で除去する装置を提供することで、こ
の原理は治療目的にも診断目的にも適用される。

この課題はこれに適した装置を使用することによって解
決された。

即ち本発明は、患者の血液または血液成分が第１ポンプ
を経て供給される貯蔵器、および該貯蔵器に接続され、
濾液排出口が患者へ再び導く導管に連結されたフィルタ
ーを備えた血液成分の体外沈殿装置において、フィルタ
ー（２１）が貯蔵器（１６）へ導く回帰導管（２２１）
に連結された沈殿物用の第２の排出口を有し、貯蔵器（
１６）が第２ポンプ（１３）を経て処理剤を含んだ第１
容器（１５）の排出口に連結され、輸送出力が第１ポン
プと第２ポンプの輸送出力の合計に実質上一致する第３
ポンプにフィルター（２１）の濾液排出口（２１１）が
接続されたことを特徴とする血液成分の体外沈殿装置に
関する。

また本発明は、緩衝液中のヘパリンを全血清または血漿
に加え、生成したβ−リポ蛋白質−ヘバリン−コンプレ
ックスをｐＨ５，０５〜５．２５の等電点て沈殿させ、
次いで分離することを特徴とする低密度リポ蛋白質また
はβ−リポ蛋白質を全血清または血漿から特異的に体外
沈殿させる方法にかかわる。

この方法は、ヘパリンと結合させた後でβ−リポ蛋白質
をｐＨ５，０５〜５．２５、特に５．１３のコンプレッ
クスの等電点において完全に特異的に沈殿させることに
基づく。特異性のほかに、この方法の別の特徴は低密度
リポ蛋白質の沈殿剤として、体内で生産される物質（ヘ
パリン）を添加することである。緩衝液を用いてｐＨを
低下させることによる等電点での沈殿物は適当な濾過に
付し、等電点沈殿後の−様なｐＨは容易に生理学的な状
態に補正される。特に本発明方法の場合、ヘパリンとβ
−リポ蛋白質とのコンプレックスはｐＨ５。

１３で沈殿する。

ヘパリンは緩衝液に溶解させ、全血清または血漿と混合
する。緩衝液は所定のｐＨ−値の調整と安定化のために
使用する。所定のｐＨ−領域での安定化を保証するすべ
ての緩衝液混合物が原則的にはこの方法に使用し得る。

治療用に適した緩衝液としてはリン酸塩緩衝液、リン酸
塩−クエン酸塩−緩衝液、乳酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液
またはこれらの混合物が挙げられる。

血清、血漿または血液体積に対する緩衝液の割合はｌ：
５〜５：１である。最も有効な濃度範囲としては該割合
を１＝１とする（これらの体積割合は治療用の除去にも
適用される）。診断の目的で血液から低密度リポ蛋白質
を選択的に除去するのに最も有効な体積割合としては、
血清に対する緩衝液の割合を２〜ＩＯ：Ｉとする。

ヘパリンの濃度は特に臨界的ではない。しかしながら、
β−リポ蛋白質をほとんど完全に沈殿させるようにヘパ
リン濃度を調整するのが有効である。例えば、最も有効
な場合は、所定量の血清を約１０容量％のヘパリン−緩
衝液（５００〜５，０００Ｅ／１１１２）と混合する。

例えばヘパリンが溶解されてｐＨ−値が約５．１３に調
整されたリン酸塩−クエン酸塩−緩衝液と全血清または
血漿との等景況合物を使用する場合には沈殿は即座にか
つ完全に生じ特異的である。

このことはβ−リポ蛋白質または低密度リポ蛋白質のみ
が沈殿されることを意味する。沈殿したβリポ蛋白質は
例えば孔径約２μｍまで、特にＯ１４〜０．８μｍの膜
フィルターまたは連続流動法（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　
−Ｆ　ｌｏｗ　−Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ）における簡単な
遠心分離法によって残留血清から分離することができる
。

本発明方法は治療および診断にも適する。

治療の場合は、例えば患者から採取される血液から血漿
を分離し、本発明により緩衝液中のヘパリン溶液と混合
する。これによってβ−リポ蛋白質はヘパリン−β−リ
ボ蛋白質−コンプレックスとしてｐＨ５，０５〜５．２
５、特に５，１３において沈殿される。残留血清は濾過
によって沈殿物から分離され、循環血液へ戻される。

診断の場合は、β−リボ蛋白質から分離された血清残渣
およびβ−リボ蛋白質−ヘバリン−コンプレックスはそ
の後の分析に付される。

本発明方法の特異性は定量的な免疫学的技術、超遠心分
離法、並びに定量的なリポ蛋白質電気泳動法によって再
検査された。ここに記載した低密度リポ蛋白質の特異的
なｐＨ−沈殿法は、β−リポ蛋白質クラスの完全な沈殿
に導く。残留濾液中にはリポ蛋白質としてはＨＤＬとＶ
ＬＤＬが存在するにすぎない。

本発明方法の特異性および生理学的物質のみの使用によ
ってまず第１に高リポ蛋白質血症またはリポ蛋白質血症
障害に煩う患者の体外血液循環が可能となり、第２には
生体外での血漿からＬＤＬの選択的除去は全コレステリ
ンと残留濾液との差の計算、または沈殿物についての直
接的なコレステリンの決定あるいは生成する沈殿物の濁
度測定によって該成分の定量を可能にする。ＬＤＬ＝ま
たはβ−コレステリンのこの直接的な決定法は新規であ
り、これと競合する方法は従来はなかった。

同様にこの方法は治療のための全血漿からの選択的除去
にも有効である。

本発明方法は分取的な超遠心分離法（ｄｉｅ　　ｐｒ≧
−ｐａｒａｔｉｖｅ　　Ｕ　ｌｔｒａｚｅｎｔｒｉｆｕ
ｇｅ）および定量的なリポ蛋白質電気泳動法と比較した
ところ、１００Å以上の患者の血清系列に関し、両方法
に対し０゜９８以上の相関係数を示した。本発明方法の
特異性は超遠心分離法を明らかに凌駕する。本発明方法
は電気泳動法に比べて、β−リボ蛋白質のコレステリン
を直接決定できる利点を有する。本発明方法は不連続自
動装置（Ｄ　ｉｓｋｒｅｔａｕｔｏｍａｔｅｎ）内にお
いても、また連続流動自動装置（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ
Ｆ　ｌｏｗ　−Ａｕｔｏｍａｔｅｎ）内においても機械
化された方法で容易に実施することができる。この系列
における日毎の精度（Ｐ　ｒａｚｉｓｉｏｎ）は２％以
下である。

本発明はさらに、患者の血液または血漿のような血液成
分が第１ポンプを経て供給される貯蔵器、および該貯蔵
器に接続され、濾液排出口が患者へ再び導く導管に連結
されたフィルターを備えた血液成分の体外沈殿装置に関
する。

本発明はこの種の装置を、患者にかかる負荷をできるだ
け少なくしかつ高価で故障しやすい調整システムを避け
るために、稼動相における費用のかさむ流量調整をせず
に連続的に作動できるように構成することを課題とする
。

この課題を解決するために本発明による装置においては
、フィルターが貯蔵器へ導く回帰導管に連結された沈殿
物用の第２の排出口を有し、貯蔵器が第２ポンプを経て
処理剤を含んだ第１容器の排出口に連結され、輸送出力
が第１ポンプと第２ポンプの輸送出力の合計に実質上一
致する第３ポンプにフィルターの濾液排出口が接続され
る。

この場合、貯蔵器はフィルターおよび回帰導管と共に閉
鎖回路を形成し、該回路内を流体が循環する。外部流体
は、貯蔵器内へ血液または血液成分を送り込む第１ポン
プ、および処理剤（この場合はヘパリン）を貯蔵器内へ
送り込む第２ポンプを経てこの回路内に達する。第３ポ
ンプを用いてこの閉鎖回路から流体を、フィルターの濾
液排出口を通して取り出す。第３ポンプの輸送出力を第
１ポンプと第２ポンプの輸送出力の合計と一致させるこ
とによって、回路内の流体平衡が実質上保持されるので
、貯蔵器内の流体の準位は常にほぼ一定に保たれる。従
って、第１ポンプのスイッチの頻繁な開閉は不要となる
ので患者から一様に血液を採取することができる。この
場合、前記の３つのポンプに関しては、輸送容量が駆動
回転数に比例する容量ポンプ（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｓｃ
ｈｅｎ　　Ｐｕｍｐｅｎ）が重要である。ポンプ輸送さ
れる流体の汚染をさけるためにホース付きポンプ（６ｃ
ｈｌａｕｃｈｐｕｍｐｅｎ）を使用するのが有効である
。

第１ポンプの輸送出力は、患者からあまり多く、またあ
まり早く血液を採取することはさけなければならないの
で、患者の身体状態によって決定するのが標準的である
。従って、循環系の平衡を失なわせることなく第１ポン
プの輸送出力を変えることができるような系を構成する
のが有効である。

さらに、本発明の好ましい態様においては、第１ポンプ
の輸送出力が患者からの血液採取割合に応じて変化し、
第１ポンプ、第２ポンプおよび第３ポンプが、これら３
台のポンプの輸送出力の関係が一定に保たれるように相
互に駆動する。

この場合の長所は、流体の平衡を失なうことなく輸送量
を時間的に変化させながら系を稼動できることである。

ポンプはそれらの伝動装置を経て機械的または電気的に
接続され、第１ポンプが先導し、他の２台のポンプの回
転数は自動的にこれに適合する。

３台のポンプの輸送出力を相互に調整するにもかかわら
ず、装置をかなり長く稼動させる場合には貯蔵器内の液
体の準位が徐々に上昇する。この上昇を制限するために
貯蔵器は少なくとも１つの充填準位検出器を備えており
、該検出器は流体が上部充填準位になると第１ポンプの
輸送出力を下げるか、またはこれを停止させる。

他方、貯蔵器内の流体の準位が過度に低下するのを避け
るために、流体が下部充填準位に達すると、充填準位検
出器によって第３ポンプの輸送出力は低下するか、また
は停止する。このように充填準位を上限値と下限値の間
の領域に制限調整することは、循環回路の流体平衡にお
いて常に増大するずれ（Ｆ　ｅｈ　ｌａｂｗｅ　ｉｃｈ
ｕｎｇａｎ）の影響を制限するのに役立つ。

フィルターは経時的に詰まるので本発明の好ましい態様
においては洗浄段階（Ｓ　ｐｔｉ　Ｉｐｈａｓｅ）を設
ける。この装置は、流動抵抗が上限になったときに第２
ポンプを稼動させ、溶剤を含んだ第２容器から溶剤を貯
蔵器へ輸送させ、排出口と流出口の間を連絡させる、フ
ィルターの流動抵抗測定器を備える。このようにして、
流体の循環回路はフィルターの背後で中断または閉塞さ
れ、貯蔵器並びにフィルターには洗浄溶剤が貫流し、該
洗浄溶剤は濾過残渣と共に流出口へ導かれる。

低密度リポ蛋白質の沈殿を伴うプラズマフエレーゼを実
施するための本発明装置の実施例を図面を参照にして以
下にさらに詳細に説明する。

第１図は稼動状態で貫流する導管を太線で示した系の模
式図である。

第２図はフィルターの洗浄に際して貫流する導管を太線
で示した第１図の系の模式図である。

これらの図において、破線から上部は患者側の周知の血
液採取系および血液回帰系を示す。圧力測定計（３）を
用いて常に監視しながら患者への接続具（１）を経て患
者から血液を採取する。採取された血液はポンプ（４）
を経て血漿フィルター（６）へ導かれた後、容器（５）
からの血液凝固阻止剤と混合される。はぼ一定量の血漿
が減少した血液はフィルター（６）から空気トラップ（
７）および磁気弁（９）を経て患者への回帰接続具（２
）へ導かれる。

回帰圧力は圧力測定計（８）によって監視する。

分離された血漿はフィルターの濾液排出口（６１）を経
てフィルター（６）から排出される。フィルター（６）
においては、例えば血液が貫流する毛細管フィルターが
重要で、この場合微細な血液成分は膜壁を通って横方向
に漏れ、粗大な血液成分はさらに空気トラップ（７）へ
送られる。

選択可能な量の血漿をポンプ（第１ポングＸ１ｌ）によ
って血漿フィルター（６）から排出させる。

第１ポンプの場合は、この系で使用する他のポンプの場
合と同様に、自動的に吸引し、駆動回転数に比例する量
の血漿を容量的に輸送するホース付きポンプまたは駆動
ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｓｃｈｅ　　Ｐｕｍｐａ
）が重要である。血漿フィルター（６）と第１ポンプ（
１１）の間には血液漏洩検出器（ｌＯ）と圧力測定計（
１２）を設ける。第１ポンプ（ｌ　ｌ）の排出口は貯蔵
器（１６）の入口と接続する。

貯蔵器（１６）の別の入口は第２ポンプ（１３）の排出
口と接続し、第２ポンプの入口は弁（１４）を介してヘ
パリン含有酢酸塩緩衝溶液の入った容器（１５）と接続
し、また弁（３０）を介して洗浄液の入った容器（２９
）と接続する。貯蔵器（１６）はさらに充填準位検出器
（１７）を備えており、該検出器は一定の準位に達する
と応答する。

貯蔵器（１６）の下部端に備わった排出口は、弁（３１
）と並列に接続されたさらに別のポンプ（１８）に接続
される。ポンプ（１８）の排出口はフィルター（２１）
に接続され、該フィルターの排出口は弁（２２）と回帰
導管（２２１）を経て貯蔵器（１６）の別の入口と接続
される。フィルター（２１）の入口と出口における圧力
は圧力計（１９）および（２０）によって監視される。

フィルター（２Ｉ）の濾液排出口（２１１）は第３ポン
プ（２３）と弁（２５）を経て透析器（２６）の入口と
接続され、該透析器の洗浄液側は透析装置（２７）から
の透析洗浄液が貫流する。透析器（２６）内においては
、貯蔵器（１６）からの酢酸塩緩衝液と残存するヘパリ
ンが除去され、一方、血漿はポンプ（２８）を経て空気
トラップ（７）、従って体外血液循環路へ流される。ポ
ンプ（２８）はポンプ（ｌ　ｌ）と同じ速度で回転し、
これによって被治療患者の流体バランスは維持される。

透析装置（２７）からの透析洗浄液によって、フィルタ
ー（２６）内では回帰された血漿のｐＨ値と温度が同時
に身体の値にまで増加する。

透析装置の代りに、開放循環路を経て透析器（２６）へ
流体を導くことができる。

第１図に示した駆動態様の場合はまず第一に、ポンプ（
ｌ　ｌ）によって血漿は貯蔵器（１６）内へ輸送され、
同時にポンプ（１３）によってヘパリン含有酢酸塩緩衝
液は弁（１４）を開放して輸送される。

この状態では第３ポンプ（２３）は停止される。貯蔵器
（１６）内において所定の充填準位に達すると充填準位
検出器（１７）が応答してポンプ（２３）を作動させる
。ポンプ（２３）は、ポンプ（１１）および（１３）の
回転速度の和に相当する速度で回転する。第３ポンプ（
２３）はフィルター（２１）から血漿を流出させ、一方
沈殿物は選定された孔径によってフィルター（２１）内
に残される。循環路内の流体循環を維持する別のポンプ
（１８）は比較的太きな輸送出力を有するので、低密度
リボ蛋白質含有沈殿物は回帰導管（２２１）を経て貯蔵
器（１６）内へ再び戻される。

低密度リポ蛋白質を除去した血漿は第３ポンプ（２３）
および開放された弁（２５）を経て透析器（２６）へ導
かれる。

貯蔵器（１６）とフィルター（２１）内の沈殿物は常に
増加するので、沈殿物は貯蔵器（１６）と再循環路から
一定の距離隔てることが必要である。このことは第２図
に示した態様の装置の場合もおこなわれる。第１ポンプ
（１１）を経由する血漿の供給および第２ポンプ（１３
）を経由するヘパリン含有酢酸塩緩衝液の供給は、これ
らのポンプを停止させることによって中止させる。ポン
プ（１８）が停止し、迂回弁（３１）が開放する。場合
によってはポンプ（１８）を回転させたままにすること
も可能である。この場合は迂回弁（３１）は省かれる。

第３ポンプ（２３）は、低密度リポ蛋白質を除いた血漿
をフィルター（２１）を通してのみ吸引し、該血漿を透
析器（２６）を通してポンプ（２８）へ輸送する。貯蔵
器（１６）が漏洩すると、フィルター（２１）の入口と
排出口の間の圧力差が高くなる。この圧力差の増大は、
圧力計（１９）と（２０）のシダナル間の差を生じさせ
るデイファレンツビルドナ−（Ｄ　１ｆｆｅｒｅｎｚｂ
ｉｌｄｎｅｒＸ　２０１　）によって確認される。圧力
差が一定の限界値を越えると、ポンプ（１３）が駆動し
、弁（３２）が開き、弁（２５）が閉じる。さらに弁（
１４）が閉じ、弁（３０）が開く。

この時容器（２９）から溶剤が貯蔵器（１６）へ供給さ
れる。弁（２２）が開き、再循環ポンプ（１８）が作動
する。溶剤の再循環によって導管とフィルター（２１）
内に残留する沈殿物は溶解される。貯蔵器（１６）内が
作動準位に達すると第３ポンプ（２３）が駆動し、溶解
沈殿物と共に溶剤は開放された弁（３２）を経て貯蔵器
（３３）へ送給される。沈殿物が十分溶解されていると
、デイ７アレンツビルドナー（２０１）によってより低
い圧力値が確認される。これに基づいてポンプ（１３）
は停止し、弁（３０）は閉じる。同様の工程は圧力計（
２４）が比較的小さな圧力を示すことによってもおこな
われる。貯蔵器（１６）と循環回路内の内容物が貯蔵器
（３３）へ送給されるまで第３ポンプ（２３）は駆動す
る。この後で、低密度リポ蛋白質を沈殿させる新たなサ
イクルが開始される。

本発明をさらに以下の実施例によって説明する。

実施例１ 血漿を同量のクエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液または
酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ、ｐＨ４，１５）と混合した
。この混合液に加えた血漿の１／１０の量のヘパリン（
５０００Ｅ／ｍ（１）を添加すると黄白色の沈殿が生成
した。この沈殿物は沈殿したβ−リポ蛋白質および特に
フイブリノゲンから成る。

実施例２ ０．０６４１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５，０４）
および１％のリケミン（Ｌ　ｉｑｅｍｉｎ）２５０００
（Ｒｏｃｈｅ）から成る溶液１ｍＱと血清１００／７（
２を混合した。この混合物をエペンドルフ（Ｅ　ｐｐａ
ｎｄｏｒｆ）遠心分離機を用いて１０分間遠心分離した
。上澄みのコレステリン含量はＶＬＤＬとＨＤＬのコレ
ステリン含量に相当した。ＬＤＬは沈殿され、全血清コ
レステリン−（Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌコレステリン＋ＨＤＬコ
レステリン）から計算される。

さらに、２価カチオンを併用するリポ蛋白質沈殿法に使
用できる他のすべてのポリアニオンが診断用に適してい
ることが判明した。

ポリアニオンとしては分子量１００００〜２０ｏｏｏｏ
ｏのデキストラン硫酸塩およびリンタングステン酸ナト
リウムが挙げられる。

従って本発明はまた、緩衝液中のポリアニオンを全血清
または血漿に加え、生成したβ〜リボ蛋白質−ポリアニ
オン〜コンプレックスｔ＝ｐＨ５，０５〜５．２５の等
電点て沈殿させ、次いで分離し、沈殿物および濾液を所
望によりさらに分析することを特徴とする低密度リポ蛋
白質またはβ−リポ蛋白質を全血清または血漿から診断
のために選択的に体外沈殿させる方法にかかわる。

この方法の特に好ましい態様においては、ポリアニオン
、例えばデキストラン硫酸塩またはリンタングステン酸
ナトリウムとβ−リポ蛋白質とのコンプレックスはｐＨ
５，１３で沈殿させる。

ポリアニオン、例えばデキストラン硫酸塩は緩衝液に溶
解させ、全血清または血漿と混合させる。

緩衝液は所定のｐＨ値に調整し、安定化させるのに役立
つ。原則的には、所定のｐＨ領域の安定化を保証する全
ての緩衝液混合物がこの方法に使用できる。適当な緩衝
液としてはリン酸塩緩衝液、リン酸塩−クエン酸塩緩衝
液、乳酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液またはこれらの混合物
が例示される。

血清、血漿または血液体積に対する緩衝液の割合はｌ：
５〜１０００：ｌである。診断のために血液から低密度
リポ蛋白質を選択的に除去するのに最も好適な血清に対
する緩衝液の体積比は２〜ＩＯ：ｌである。

ポリアニオン濃度は特に限定的ではない。しかしながら
、β−リポ蛋白質と共にほぼ完全に沈殿するようなポリ
アニオン濃度にするのが好ましい。

例えば最も好適な場合は、所定量の血清を６％デキスト
ラン硫酸塩緩衝液または４０％リンタングステン酸ナト
リウム緩衝液ＩＯ容量％と混合する。

等量の全血清または血漿と、ポリアニオンを溶解してｐ
Ｈを約５．１３に調整したリン酸塩−クエン酸塩緩衝液
を混合すると完全かつ特異的に沈殿が即座に生じる。

このことは、β−リポ蛋白質または低密度リポ蛋白質の
みが沈殿することを意味する。沈殿したβ−リポ蛋白質
は例えば膜フイルタ−（孔径的０゜２〜２μｍ）または
連続流動法における簡単な遠心分離によって残留血清か
ら分離することができる。

本発明方法のこの実施態様は診断的検査に適する。

診断法においては、β−リポ蛋白質を除去した血清残渣
並びに沈殿したβ−リポ蛋白質とポリアニオンとのコン
プレックスをさらに検査に付すことができる。本発明方
法のこの実施態様の特異性は、定量的な免疫学的技術お
よび超遠心分離並びに定量的なリポ蛋白質電気泳動法に
よって調べられる。低密度リポ蛋白質のこの特異的なｐ
Ｈ−沈殿法はこれらのβ−リポ蛋白質クラスの完全な沈
殿法をもたらす。残留濾液中のリポ蛋白質としてはＨＤ
ＬとＶＬＤＬとが存在するだけである。

血漿からのＬＤＬの体外での選択的除去は、全コレステ
リンと残留濾液との差の計算または沈殿物についての直
接的なコレステリン定量あるいは生成する沈殿物の濁度
測定によってこの成分の定量を可能にする。ＬＤＬ−ま
たはβ−コレステリンの直接的な定量法は新規で、これ
に競合する方法は従来知られていなかった。

本発明方法のこの実施態様は、分取的な超遠心分離法お
よび定量的なリポ蛋白質電気泳動法と比較したところ、
１００Å以上の患者の血清系列について両方法と０．９
８以上の相関係数を示した。

本発明方法のこの実施態様の特異性は超遠心分離法より
も明らかに優れている。電気泳動法に比べて、本発明方
法のこの実施態様は、β−リポ蛋白質のコレステリンを
直接的に定量できる利点がある。本発明方法のこの実施
態様は不連続な自動装置または連続的な自動装置内にお
いて機械化された方法として容易におこなうことができ
る。上記系列における日毎の精度は２％以内である。

本発明のこの実施態様を以下の実施例によってさらに説
明する。

実施例３ 血漿を等量のクエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液または
酢酸塩緩衝液（０，００５Ｍ、ｐＨ４，１５）と混合し
た。この混合物に６％デキストラン硫酸塩緩衝液を約Ｉ
Ｏ容量％添加すると黄白色の沈殿が生じた。この沈殿物
は沈殿したβ−リポ蛋白質および特にフイブリノゲンか
ら成る。

実施例４ ０．０６４１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５，０４）
および４０％リンタングステン酸ナトリウム１容量％を
含む溶液’１ｍＱと血清１００μＱとを混合した。混合
物をエペンドルフ遠心分離機内で遠心分離した。上澄み
のコレステリン含量はＶＬＤＬとＨＤ　Ｌのコレステリ
ン含量に相当した。ＬＤＬは沈殿され、全血清コレステ
リン−（Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌコレステリン＋ＨＤＬコレステ
リン）から計算できる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は低密度リポ蛋白質の沈殿を伴うプ
ラズマフエレーゼを実施するための本発明装置の実施態
様を示す模式図である。 （１）は患者への接続具、（２）は患者への回帰接続具
、（６）は血漿フィルター、（７）は空気トラップ、（
１１）は第１ポンプ、（１３）は第２ポンプ、（１５）
は処理剤含有容器、（１６）は貯蔵器、（２１）はフィ
ルター、（２３）は第３ポンプ、（２６）は透析器、（
２９）は溶剤含有容器を示す。 特許出願人　インターメディカット・ゲゼルシャフト・
ミツト・ベシュレンクテ ルーハフラング

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、患者の血液または血液成分が第１ポンプを経て供給
   される貯蔵器、および該貯蔵器に接続され、濾液排出口
   が患者へ再び導く導管に連結されたフィルターを備えた
   血液成分の体外沈殿装置において、フィルター（２１）
   が貯蔵器（１６）へ導く回帰導管（２２１）に連結され
   た沈殿物用の第２の排出口を有し、貯蔵器（１６）が第
   ２ポンプ（１３）を経て処理剤を含んだ第１容器（１５
   ）の排出口に連結され、輸送出力が第１ポンプと第２ポ
   ンプの輸送出力の合計に実質上一致する第３ポンプにフ
   ィルター（２１）の濾液排出口（２１１）が接続された
   ことを特徴とする血液成分の体外沈殿装置。 ２、第１ポンプ（１１）の輸送出力が患者からの血液採
   取割合に応じて変化し、第１ポンプ（１１）、第２ポン
   プ（１３）および第３ポンプ（２３）が、これら３つの
   ポンプの輸送出力の関係が一定に保たれるように相互に
   駆動する第１項記載の装置。 ３、貯蔵器（１６）が、上部充填準位になったときに第
   １ポンプ（１１）をより小さな輸送出力に変えるか、ま
   たは該ポンプを停止させる充填準位検出器（１７）を少
   なくとも１個有した第２項記載の装置。 ４、流動抵抗が上限になったとはに第２ポンプ（１３）
   を駆動させ、溶剤を含んだ第２容器（２９）から溶剤を
   貯蔵器（１６）へ輸送させ、フィルター（２１）の排出
   口（２１１）と貯蔵器（３３）の間を連絡させる、フィ
   ルター（２１）の流動抵抗測定器（１９）、（２０）、
   （２０１）および（２４）を備えた第３項記載の装置。