MXPA04002847A - Metodo y aparato para la extrusion de vesiculas a presion alta. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere, en general, a los metodos y dispositivos para producir vesiculas, incluidas micelas, y particularmente liposomas, extruyendo soluciones que contengan materiales capaces de formar vesiculas a traves de una membrana tamiz a presion alta.

Description

MÉTODO Y APARATO PARA LA EXTRUSIÓN DE VESÍCULAS A PRESIÓN ALTA Esta solicitud reclama el beneficio bajo el 35 5 U.S.C. §119 de la solicitud provisional US No. 60/326,032, presentada el 28 de septiembre de 2001, la cual se incorpora en la presente como referencia en su entereza . 10 CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere, en general, a los métodos y dispositivos para producir vesículas, incluidas micelas, y en particular liposomas, mediante extrusión de soluciones que contienen materiales capaces de formar 15 vesículas a través de una membrana tamiz a presión alta.

ANTECEDENTES El uso de liposomas para suministro de medicamentos se ha propuesto para diferentes medicamentos, en 20 particular para los que se administran por vía parenteral. Los liposomas tienen el potencial de proporcionar liberación de "depósito" controlada del medicamento administrado durante un tiempo prolongado, y de reducir los efectos colaterales del medicamento 25 limitando la concentración del medicamento libre en el -na , ^.^aa^^a^^^ f¡¡|f torrente sanguíneo. Los liposomas también pueden alterar la distribución tisular y captación de medicamentos en una forma terapéutica favorable, y aumentar la conveniencia de la terapéutica permitiendo la administración del medicamento con menos frecuencia. Estos efectos pueden potenciarse mediante la unión de ligandos que dirigen los liposomas a ciertos tipos de células o tejidos dentro del cuerpo. Los sistemas de suministro de medicamentos por liposomas se revisan en Poznansky y col., 1984, Pharmacol. Rev. 36: 277-336.

En general, el tamaño óptimo del liposoraa que se utiliza en la administración parenteral es entre aproximadamente 70 y 300, y hasta aproximadamente 400 nm de diámetro. Los liposomas en este intervalo de tamaño pueden esterilizarse haciéndolos pasar a través de filtros con profundidad convencional que tengan discriminación por el tamaño de partículas de aproximadamente 200 nm. Este intervalo de tamaño de los liposomas también favorece la biodistribución en ciertos órganos elegidos como el hígado, bazo y médula ósea, y proporcionan velocidades de liberación del medicamento más uniformes y predecibles y estabilidad en el torrente sanguíneo. Los liposomas cuyos tamaños son menores que aproximadamente 400 nm también muestran menos tendencia a agregarse durante el almacenamiento, y de este modo por lo regular son más seguros y menos tóxicos durante el uso parenteral en comparación con los liposomas de tamaños más grandes.

Se ha propuesto una variedad de técnicas para preparar liposomas que incluyen, por ejemplo, la sonicación, extrusión, homogeneización a presión alta, microfluidización, diálisis con detergente, infusión inducida por calcio de vesículas liposomales pequeñas y métodos de infusión con éter. Véase, por ejemplo, Patente US No. 4,186,183; Patente US No. 4,217,344; Patente US No. 4,261,975; Patente US No. 4,485,054; Patente US No. 4,774,085; Patente US No. 4,946,787; Patente US No. 6,139,871; Publicación PCT No. WO 91/17424, Deamer y col., 1976, Biochim. Biophys . Acta, 443: 629-34; Fraley y col., 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 3348-52; Hoe y col. 1985, Biochim. Biophys. Acta, 812: 55-65; Mayer y col., 1986, Biochim. Biophys. Acta, 858: 161-68; Williams, y col., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 242-46 y Szoka, y col., 1980, Biochim. Biophys. Acta. 601: 559-71. Por lo regular, estos métodos producen liposomas que son heterodispersos , y principalmente mayores que aproximadamente 1 miera de tamaño. Estas suspensiones heterodispersas iniciales pueden reducirse de tamaño y de distribución de tamaño por algunos métodos conocidos. Un método de procesamiento del tamaño que es conveniente para la producción a gran escala es la homogeneizacion. En ésta, la preparación de liposomas heterodispersa, inicial, se bombea a presión alta a través de un orificio pequeño o cámara de reacción. La suspensión por lo regular se cicla a través de la cámara de reacción hasta que se obtiene un tamaño promedio deseado de las partículas liposomales. Una limitación de este método es que la distribución del tamaño del liposoma por lo regular es muy amplia y variable, en particular en el intervalo de tamaño de 100 nm de diámetro promedio de liposomas, dependiendo del número de ciclos de la homogeneizacion, más presiones y temperatura interna. Asimismo, el fluido procesado tiene el potencial de recoger contaminantes metálicos y oleosos de la bomba homogeneizadora, y además puede contaminarse por agentes químicos residuales que se utilizan para esterilizar las juntas de la bomba.

La sonicación, o irradiación ultrasónica, es otro método que se utiliza para reducir los tamaños de los liposomas. Esta técnica es útil en especial para preparar vesículas pequeñas unilamelares (SUV) , en el intervalo de tamaño de 25 a 80 nm. No obstante, una distribución de tamaño angosta de los liposomas solo puede obtenerse en tamaños de los liposomas de alrededor de 50 nm, es decir, después de que los liposomas hayan sido reducidos a sus tamaños más pequeños. Estos liposomas muy pequeños tienen limitada capacidad de carga o transporte del medicamento, y propiedades de biodistribución menos favorables que aquellos que están en el intervalo de tamaño de 100 a 400 nm, como se indica más adelante. La capacidad de procesamiento de este método también es muy limitada dado que se necesita sonicacion por tiempos prolongados de volúmenes relativamente pequeños. Asimismo, la acumulación de calor durante la sonicacion puede originar daño peroxidativo a los lipidos, y las sondas sónicas cubren las partículas de titanio que son potencialmente muy tóxicas in vivo.

Un tercer método general para el procesamiento del tamaño se basa en la extrusión de los liposomas a través de una membrana con tamaño de poro uniforme, elaborada de policarbonato u otro material similar. Véase, Szoka, y col., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 75: 4194-8. Este procedimiento tiene ventajas sobre los métodos de homogeneización y sonicacion anteriores en cuanto a que está disponible una variedad de tamaños de poros de la membrana para producir los liposomas en diferentes intervalos de tamaños elegidos, y además, la distribución del tamaño de los liposomas puede hacerse muy angosta, en particular ciclando varias veces el material a través del filtro de tamaño elegido. Se han reportado diversas técnicas para extruir liposomas. Por ejemplo, la Patente US No. 4,927,637 describe un método para extruir lipidos a través de un nailon de trayectoria sinuosa, TUFFRYN® (Pall Corp., East Hills NY) , polisulfona, polipropileno ó membrana de acero sinterizado a baja presión (por ejemplo 250 lbs/in2 (psi) 1.722 kPa) . La Patente US No. 5,008,050 enseña un método para extruir liposomas á través de un filtro de policarbonato a presiones entre 100 y 700 psi o más. La Patente US No. 4,737, 323 enseña un método para producir liposomas extruyendo una suspensión de lipidos a través de una membrana cerámica a 2C0 hasta 250 psi (1.378 a 1.722 kPa) .

No obstante, los métodos de extrusión a través de membrana tienen algunos inconvenientes en el procesamiento a gran escala. Una de ellas es que los poros en la membrana tienden a obstruirse, en particular cuando se procesan suspensiones concentradas y/o cuando los tamaños de los liposomas son considerablemente más grandes que los tamaños de los poros de la membrana. La mayor parte de los dispositivos de extrusión a escala de producción no permiten el contraflujo para limpiar las membranas. El reemplazo de la membrana obstruida por una membrana nueva abre el sistema de extrusión al ambiente y muestra un riesgo de contaminación del producto, incluso si las membranas se lavan en retroceso. Las membranas no pueden ser esterilizadas con vapor en el lugar, con un alto grado de confianza, por su fragilidad propia. Cualquier método que se emplee para corregir una membrana ocluida o incrustada adiciona tiempo y costos al proceso de extrusión.

Los inconvenientes de los métodos de extrusión de liposomas actualmente disponibles son particularmente agudos cuando se extruyen ciertos tipos de lipidos. Las bicapas lipidicas adoptan una fase cristalina por debajo de la temperatura T'c, una fase en gel entre las temperaturas T'c y Tc, y un estado cristalino liquido por encima de la temperatura Tc. Véase, Basic, 1997, Liposomes ín Gene Delivery, CRC Press LLC, Boca Ratón. 67-71. Los lipidos con valores Tc mayores que aproximadamente la temperatura ambiente pueden ser especialmente difíciles de extruir a través de las membranas de policarbonato . El valor de Tc para un lípido específico depende de diversos factores que incluyen la longitud y grado de saturación de las cadenas hidrocarburos de los lipidos. Los lipidos con cadenas hidrocarburos más largas, más saturadas, tienden a mostrar mayores valores Tc (y de este modo tienden a dificultar más la extrusión a través de las membranas de policarbonato) en comparación con lipidos de cadenas hidrocarburo más cortas, menos saturados. También puede ser difícil extruir los lipidos por las impurezas en las materias primas, por ejemplo, la contaminación con resinas que son un subproducto del proceso de fabricación. Los lipidos difíciles para extruir también tienen velocidades de flujo más lentas y obstruyen o se incrustan en las membranas con mayor facilidad qué otros lipidos. Como se explica en lo anterior, las membranas obstruidas o incrustadas deben ser limpiadas o sustituidas, aumentando el tiempo y costo de producción y la posibilidad de contaminación.

Así pues, serían convenientes los métodos y dispositivos para extruir lipidos, en particular lipidos que son difíciles de extruir, en una forma eficaz respecto al tiempo y costo, con incidencia reducida de obstrucción o incrustación en la membrana y con una probabilidad reducida de contaminación.

COMPENDIO DE IA INVENCIÓN Esta invención se refiere a los métodos y dispositivos que son particularmente útiles para la fabricación de vesículas, incluidas micelas, y en particular liposomas, y los productos farmacéuticos que contienen las vesículas, micelas o liposomas. Más específicamente, hemos descubierto que la extrusión de lípidos a través de membrana (s) tamiz, hidrofílicas , a presión alta da origen a mucho mejores velocidades de flujo produciendo todavía vesículas de tamaño y lamelaridad deseados. Las membranas tamiz, como se describirá con mayor detalle más adelante, son membranas que tienen poros cuyos canales a través de la membrana, en promedio, muestran líneas prácticamente rectas. Los métodos y dispositivos de la presente invención son particularmente útiles para producir vesículas de un tamaño y lamelaridad deseados a partir de lípidos difíciles de extruir utilizando las técnicas tradicionales .

Además hemos descubierto que la extrusión de una preparación lipídica a través de membranas PORETICS™ (Osmonics, Minnetonka N) permite velocidades de flujo muy incrementadas en comparación con la extrusión a través de otras membranas disponibles en el comercio.

Además hemos descubierto que el uso de una membrana hidrofílica de acuerdo con la invención y a presión de extrusión alta da origen a una disminución del tamaño de las vesículas que se producen por la extrusión.

Los métodos y dispositivos de la invención pueden operarse en una forma relativamente sin problemas con reducida obstrucción o incrustación de las membranas, a volúmenes de rendimiento altos y en una operación a gran escala. Asi pues, los métodos y dispositivos de la invención son muy adecuados para utilizarlos en la fabricación de liposomas.

En un aspecto, la invención proporciona un método para producir una suspensión de liposomas que consiste en extruir una suspensión acuosa de lípidos a través de una membrana hidrofílica, en particular membrana (s) tamiz, a presión alta. La invención proporciona un método para producir una suspensión de liposomas de una distribución de tamaño uniforme. Es decir, los liposomas creados por el método de la invención muestran poca varianza en la distribución promedio del tamaño. Además, la invención proporciona un método para producir liposomas de cualquier forma, por ejemplo, la suspensión en liposomas puede utilizarse para producir un polvo.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una suspensión de liposomas que consiste en extruir una suspensión acuosa de lipidos a través de una membrana tamiz de poros angulados, a presión alta. Las membranas tamiz de poros angulados, como se describirá con mayor detalle más adelante, son membranas tamiz en donde los ángulos que se forman por los poros en relación con el plano de las caras de la membrana son menores que aproximadamente 90°.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una suspensión de liposomas que consiste en extruir una suspensión acuosa de lipidos a través de una membrana tamiz hidrofilica, de poros angulados, a presión alta.

En otro aspecto, la invención proporciona un dispositivo para extruir una suspensión acuosa de lipidos a presión alta, que comprende membrana (s) tamiz hidrófila(s) en un soporte de cásete.

Durante la práctica de los métodos de la invención, una suspensión de lipidos se extruye a través de una membrana tamiz hidrófila a presión alta. Los liposomas resultantes tienen un diámetro promedio de entre aproximadamente 50 y 400 nm y una distribución de tamaño normalizada de aproximadamente 50 nm, dependiendo del número de membranas que se utilice, el número de veces que se ciclen los liposomas a través de las membranas, los espesores de las membranas, la presión de la extrusión, el diámetro y densidad de los poros de las membranas, la composición química de las membranas, el uso de un método de reducción, el tipo de lípido que se utilice, el uso de un agente humectante, la presencia de ' un agente encapsulado en el liposoma o un agente asociado con el liposoma, etc., como se describirá con mayor detalle más adelante. Los métodos de la invención permiten controlar el tamaño y la distribución del tamaño de los liposomas que se producen.

La suspensión puede pasar a través de la membrana múltiples veces, cada vez en la misma dirección a través de la membrana. De otro modo, la dirección del flujo a través de la membrana puede invertirse para uno o más de los pasos. Es decir, la suspensión puede pasar a través de la membrana en una dirección de afuera hacia adentro para mantener la membrana en un estado no obstruido, permitiendo el procesamiento con rendimiento alto, incluso para una suspensión concentrada de liposomas. 1,1 ???? : i El tamaño deseado de los liposomas puede obtenerse utilizando un método "step-down". Es decir, una suspensión de lipidos se pasa a través de las membranas de tamaño de diámetro de poro decreciente, en una serie de pasos para producir liposomas de diámetro promedio cada vez más reducido.

Estos y otros aspectos y características de la presente invención serán evidentes cuando la siguiente descripción detallada de la invención se lea junto con los dibujos acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 presenta el volumen de extrusión como función del tiempo para dos diferentes membranas disponibles en el comercio (membranas de policarbonato con pistas grabadas (PCTE) con un diámetro de poro de 0.1 µp? de Osmonics ("O") y Whatman ("W") ) a 400 y 800 psi (2.756 y 5.512 kPa) .

La Figura 2 es una serie de gráficas que comparan la extrusión a través de una sola membrana de PCTE con la membrana de poliéster con pistas grabadas (PETE) individual, ambas membranas con diámetros de poro de 0.1 µp?. La Figura 2A es una gráfica que presenta el tamaño de partícula como función del número de pases . La Figura 2B es una gráfica que presenta la velocidad de flujo como función del número de pases.

La Figura 3A es una gráfica que compara el volumen extruido contra tiempo para la extrusión de 1-palmitoil-2-oleil-sr¡-glicero-3-fosfocolina (POPC) al 20% a través de membranas de PCTE y PETE con diámetro promedio de poro de 0.1 µ?? a 400 psi. La Figura 3B es una gráfica que compara el volumen extruido contra tiempo para la extrusión de POPC al 20% a través de membranas de PCTE y PETE con un diámetro promedio de poro de 0.1 µp? a 800 psi .

La Figura 4 es una serie de gráficas que describen los efectos del tamaño de la pila de membranas en la extrusión de POPC utilizando 1, 2, 5 y 10 membranas de PETE apiladas, con un diámetro promedio de poro de 0.1 µp?, a 800 psi. La Figura 4A es una gráfica que presenta el tamaño de partícula promedio de vesículas unilamelares grandes (LUV) como función del número de pases. La Figura 4B es una gráfica que presenta la velocidad de flujo como función del número de pases. La Figura 4C es una gráfica que relaciona el tamaño de la pila de membranas con el número de pases necesario para obtener un tamaño de partícula promedio de aproximadamente 120 nm.

La Figura 5 es una serie de gráficas que describen los efectos de la presión sobre la extrusión de POPC utilizando una pila de 5 membranas PETE con diámetro de poro de 0.1 µ?? a presiones de extrusión de 400, 600 y 800 psi (2.756, 4.134 y 5.512 kPa) . La Figura 5A es una gráfica que presenta el tamaño de partícula como función del número de pases. La Figura 5B es una gráfica que presenta la velocidad de flujo como función del número de pases. La Figura 5C es una gráfica que relaciona la presión de extrusión con el número de pases necesario para producir partículas con un tamaño promedio de aproximadamente 120 nm.

La Figura 6 presenta el volumen de extrusión máximo como función de la presión de extrusión para membranas PCTE y PETE PORETICS™ DE Osmonics y PCTE NUCLEPORE™ de hatman antes de la incrustación u obstrucción de la membrana .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona un método sencillo y rápido para producir vesículas de un tamaño deseado extruyendo una preparación de lípidos a través de una membrana tamiz hidrófila a presión alta. La preparación de lipidos puede extruirse a través de la membrana una o más de una vez, en múltiples "pasos" para producir vesículas del tamaño deseado. Cuando se utilizan múltiples pasos, la dirección de flujo de la suspensión a través de la membrana puede invertirse para uno o más de los pasos. La preparación de lipidos también puede extruirse a través de una pluralidad de membranas "apiladas" para disminuir el número de pasos necesarios para obtener partículas de tamaño deseado. De otro modo, la preparación de lipidos puede pasarse dentro del mismo paso a través de membranas arregladas en forma consecutiva que estén apiladas, no apiladas, o una combinación de apiladas y no apiladas en su arreglo consecutivo .

En otro aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo para producir liposomas de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 400 nm de diámetro extruyendo una suspensión acuosa de lipidos a través de una membrana tamiz hidrófila, a presión alta.

Una peculiaridad importante de los métodos y dispositivos de la presente invención es el uso de presión alta para impulsar la suspensión acuosa de los lipidos a través de la membrana. Se ha encontrado que el uso de presiones muy excesivas de la presión mínima necesaria para la extrusión proporciona resultados inesperadamente buenos en la obtención de liposomas de diámetro promedio deseado, evitando los problemas asociados con la obstrucción o incrustación de la membrana. El uso de presión alta es especialmente benéfico para la extrusión de lipidos difíciles de extruir utilizando los métodos tradicionales. Como se muestra en los ejemplos, a mayor presión utilizada, menor obstrucción e incrustación. Para esta relación no hay límite superior aparente. La presión que se utiliza se limita solo por la tolerancia del dispositivo de extrusión, los soportes de las membranas y las membranas que se utilicen. En un mínimo, la presión utilizada debe ser mayor que aproximadamente 400 psi. Con mayor preferencia, se utiliza una presión de más que aproximadamente 800 psi. Con mayor preferencia, se utiliza una presión mayor que ¦ aproximadamente 1000 psi (6.89 kPa) . Más preferentemente todavía, se utiliza una presión en exceso de aproximadamente 1500 psi (10.335 kPa) . Con mayor preferencia todavía, se utiliza una presión en exceso de aproximadamente 5000 psi (34.450 kPa) . Con mayor preferencia, se utiliza una presión en exceso de alrededor de 8000 psi (55.120 kPa) .

Cuando se utiliza en la presente, "liposoma", "vesícula" y "vesícula liposomal" se entenderá que indica estructuras que tienen membranas que contiene lípidos con un interior acuoso. Las estructuras pueden tener una o más membranas lipídicas, a menos que se indique de otro modo, aunque por lo regular los liposomas tendrán sólo una membrana. Estos liposomas de una sola capa se conocen en la presente como "unilamelares". Los liposomas unilamelares pueden clasificarse como vesículas unilamelares pequeñas (SUV), vesículas unilamelares grandes (LUV) o vesículas unilamelares gigantes (GUV) . Véase, Lasic, 1997, Liposomes in Gene Delivery, CRC Press LLC, Boca Ratón 67-71 a página 70. Las SUV por lo regular se definen como liposomas en donde los efectos de la curvatura son importantes para sus propiedades. ?1 utilizar esta definición, el tamaño de un liposoma que puede caracterizarse como SUV dependerá del lípido o los lípidos que contenga. En general, para una bicapa blanda, el límite superior para una SUV es aproximadamente 50 nm, mientras que para capas mecánicamente muy cohesivas, el límite superior puede abarcar desde aproximadamente 80 hasta aproximadamente 100 nm. Las GUV por lo regular se definen como liposomas con diámetros mayores que aproximadamente 1 µp?. Un experto en la técnica comprenderá que los linderos entre estas clases de vesículas no están exactamente definidos y que hay traslape considerable entre estos en sus márgenes.

En una modalidad, los liposomas de la invención pueden ser membranas que contienen lípidos conteniendo un interior acuoso, el interior acuoso consistente en un compuesto medicinal. En otra modalidad, el liposoma puede no contener medicamento en el interior acuoso, sino pueden ser la membrana que contiene lipido encerrando un medio interior. Estos liposomas que no contienen medicamento son útiles para eliminar colesterol del torrente sanguíneo y tratar o prevenir aterosclerosis .

Cuando se utiliza en la presente, "unido al liposoma" o "unión al liposoma" indica que el compuesto objeto se une en forma covalente o no covalente a la superficie del liposoma o esta contenido, completa o parcialmente, en el interior del liposoma.

Los términos "compuesto farmacéutico activo" y "medicamento" se entiende que indican un compuesto sintético conveniente para uso terapéutico sin portadores, adyuvantes, activadores o co-factores unidos, asociados. Los liposomas de la invención pueden contener un medicamento en el interior acuoso. En ciertas modalidades, los liposomas pueden no contener medicamento en el interior, y en tales modalidades, los propios liposomas pueden ser medicamentos o compuestos farmacéuticos activos. Estos liposomas "vacíos" pueden ser útiles para la eliminación de colesterol del cuerpo y tratar o prevenir aterosclerosis .

Las "membranas tamiz" son membranas que tienen poros cuyos canales a través de la membrana en promedio muestran líneas prácticamente rectas. Una membrana tamiz puede tener poros normales al plano de la membrana y/o poros en ángulos. "Membranas con poros en ángulos" son membranas tamiz en donde los ángulos formados por los poros en relación con el plano de la cara de la membrana son menores que aproximadamente 90°. La "longitud de los rizos" de un poro es la longitud del poro medida desde una cara de la membrana hasta la otra. Así pues, un poro que es normal al plano de la membrana tiene una longitud de los rizos igual al espesor de la membrana. Los poros con ángulos de poro más pequeños tienen mayores longitudes de los rizos.

Para una gotícula determinada sobre una superficie sólida, el "ángulo de contacto" es una medición del ángulo que se forma entre la superficie de un sólido y la tangente lineal al radio de la goticula desde el punto de contacto con el sólido. El ángulo de contacto se refiere a la tensión superficial por la ecuación de Young a través de la cual puede calcularse el comportamiento de las interacciones liquido-sólido especificas. Un ángulo de contacto de cero da origen a humectación, mientras que un ángulo entre 0o y 90° da origen a una dispersión de la gota (por la atracción molecular) . Ángulos mayores que 90° indican que el líquido tiende a aperlarse o encogerse para alejarse de la superficie sólida. Así pues, cuando más pequeño es el ángulo de contacto entre una superficie y una gota de agua, más hidrófila es la superficie. Véase, Martin, y col., 1983, Physical Pharmacy: Physical Chemical Principales in the Pharmaceutical Sciences, Lea & Febiger Publishers, Philadelphia; Gennaro y col., 1990, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania .

"Lípidos difíciles" son lípidos que son relativamente difíciles de extruir utilizando las técnicas tradicionales porque tienden a obstruir o incrustar la membrana de extrusión. Por el contrario, "lípidos fáciles" son lípidos relativamente fáciles de extruir utilizando las técnicas tradicionales. Por lo L,í A. regular, los lipidos que tienen una temperatura de transición (Tc) mayor que aproximadamente la temperatura ambiente son difíciles de extruir, mientras que los lipidos que tienen una Tc de aproximadamente la temperatura ambiente o menor son fáciles de extruir. Pocos lipidos difíciles tienen temperaturas de transición por debajo de la temperatura ambiente, por ejemplo 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) .

Diversos factores pueden influir para que un lípido específico sea difícil de extruir. El factor más importante es la rigidez de la cadena acilo del lípido. Los lipidos que tienen cadenas acilo más rígidas, por ejemplo los lipidos que contienen una cadena acilo monoinsaturada, tienden a ser más difíciles de extruir utilizando los métodos y aparatos tradicionales. Las impurezas en la preparación de los lipidos, por ejemplo, las resinas que se introducen durante el proceso de fabricación de los lipidos, también pueden dificultar más la extrusión de un lípido. Además, las impurezas pueden afectar la conformación de los lipidos en solución o la propiedad de los lipidos para deformarse a través de los poros de la membrana. Estos problemas pueden superarse si se utilizan membranas con áreas superficiales más grandes o porosidad más grande, por ejemplo, las membranas ANOPORE™ de hatman. Los lipidos asociados a medicamentos, los lipidos con carga o los lipidos con proteínas también pueden ser lipidos difíciles. Algunos lipidos que son fáciles para extruir a escala de laboratorio pueden ser difíciles de extruir a una escala de fabricación nás grande. Los ejemplos de lipidos difíciles de extruir incluyen, pero no se limitan a, POPC, dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilglicerol y di-estearoil-fosfatidiletanolamina . Los ejemplos de lipidos fáciles incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolina de la yema de huevo (EPC) , fosfatidilglicerol de huevo y di-olei1-fosfatidilcolina .

Membranas Una membrana útil para practicar la presente invención es una membrana tamiz hidrófila. Una membrana tamiz hidrófila útil para practicar la invención reclamada puede elaborarse de cualquier material hidrófilo. La membrana puede elaborarse de un solo material hidrófilo, o de más de un material hidrófilo, o una mezcla de materiales hidrófilos y no hidrófilos. En una modalidad preferida, la membrana se fabrica de un material hidrófilo natural. En otra mocalidad preferida, la membrana se elabora de material que se hace hidrófilo durante la producción de la membrana, por ejemplo poliéster. En una modalidad preferida, las membranas tamiz hidrófilas útiles para practicar la presente invención tienen un ángulo de contacto superficial con el agua de menos que 120°, preferentemente menor que 70°, con mayor preferencia menor que 50°, con mayor preferencia 40° o menos. En otra modalidad preferida, las membranas tamiz hidrófilas útiles para practicar la invención reclamada tienen una tensión superficial antes del mordentado de aproximadamente 41 cinas/cm o mayor, preferentemente 42 dinas/cm o mayor, y con mayor preferencia 43 dinas/cm o mayor. Las membranas hidrófilas especificas, útiles para practicar la presente invención incluyen, pero no se limitan a, tereftalato de polietileno (poliéster) , óxido de aluminio, poliacrilonitrilo, acetato de celulosa, éster mixto de celulosa, vidrio, poliéster sulfota, polisulfona y polihexametilen adipamida (nailon) . Debe señalarse que hemos determinado que el poliéster actualmente es la membrana disponible en el comercio más conveniente para utilizarla en los métodos y dispositivos de la invención.

Las membranas elaboradas de materiales más hidrófobos también pueden utilizarse, siempre que se modifiquen para que muestren propiedades más hidrófilas. Los métodos para aumentar la hidrofilicidad de las membranas son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento de la membrana con un tensoactivo, recubrir la membrana con un agente humectante o la aplicación de una película delgada de un polímero diferente o sistema de monómeros para formar una nueva superficie a través de la formación compuesta, por ejemplo, polivinil pirrolidona (PVP) , la formación de un injerto químico de un grupo activo de peso molecular bajo (monómero) a la membrana, la formación de la membrana a partir de una combinación de dos o más polímeros y la modificación por plasma. Véase, por ejemplo, Martin y col., 1983, Physical Pharmacy: Physical Chemical Principies in the Pharmaceutical Sciences, Lea & Febiger Publishers, Philadelphia ; Gennaro, y col., 1990, Remington' s Pharmaceuticals Sciences , 18a edición, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania .

En otra modalidad preferida, una membrana tamiz útil para practicar la presente invención se fabrica a partir de TEFLON® (Du Pont, Wilmington, DE). En una modalidad más preferida, la membrana consiste en o contiene principalmente TEFLON®. En otra modalidad más preferida, la membrana contiene TEFLON® y una o más sustancias diferentes .

Las membranas tamiz tienen canales "pasantes rectos" (también denominados poros tipo capilares) . Es decir, el canal del poro muestra o describe una linea considerablemente recta a través de la membrana. Si la linea es perpendicular, o normal, al plano de la cara de la membrana, entonces tiene un ángulo de poro de 90°. Las membranas con poros en ángulos tienen un ángulo de poro menor que aproximadamente 90°.

Las membranas tamiz fabricadas utilizando algún método pueden utilizarse en los métodos y dispositivos de la presente invención. Las membranas tamiz por lo regular se fabrican en un procedimiento de mordentado de pistas en dos pasos, véase, por ejemplo Wagner, 2001, Membrana Filtratíon Handbook : Practica! Tips and Hints, 2a edición, Impreso en Osmonics, Inc., Minnetonka, MN . En el primer paso, la membrana se expone a radiación ionizante. Esta radiación forma pistas dañadas que se distribuyen aleatoriamente a través de la cara de la membrana. Las pistas dañadas se mordentan en poros a través de la membrana sumergiéndola en la solución mordente, por ejemplo, una solución fuertemente alcalina como hidróxido de sodio. El ángulo en el que las partículas con carga golpean y pasan a través de la membrana en el primer paso determina el ángulo del poro del canal resultante. Así pues, es posible producir un filtro con un ángulo de poro promedio deseado controlando el ángulo en el que las partículas con carga golpean la membrana.

El proceso de mordentado puede afectar la hidrofilicidad de la membrana. Para muchos tipos de membranas, incluidas las membranas de policarbonato y poliéster, la inmersión en el baño mordiente aumenta la hidrofilicidad de las membranas. Algunas membranas, como las membranas de poliéster, se vuelven más hidrófilas con más rapidez que otras membranas, como puede ser las membranas de policarbonato tratadas en condiciones de mordentado similares. Véase, por ejemplo Kroschwitz, 1990, Concíse Enciclopedia of Polymer Science and Engineering, Wiley, New York, 363-67, 558-60; Domininghaus , 1993, Plástic for Engineers : Material , Properties , Applications , Hanser Publishers, New York, Cap. 14; Zeronian y col., 1990, J. Appl. Polym. Sci. 41: 527-34; Gillberg, y col., 1981, J. Appl. Polym. Sci. 26: 2023-51.

Hemos encontrado que la extrusión a través de membranas PORETICS™ de Osmonics da origen a velocidades de flujo muy incrementadas en comparación con la extrusión a través de otras membranas disponibles en el comercio, y que esta diferencia es particularmente grande cuando el lipido extruido es un lipido difícil. Sin apegarnos a ninguna teoría específica, observamos que la velocidad de flujo y el tamaño de la partícula de liposoma se ven influidos por diversos factores que incluyen, pero no se limitan a, el diámetro del poro, densidad de los poros, ángulo promedio de los poros, intervalo de los ángulos de los poros, el espesor de la membrana y el material que se utilice para elaborar o recubrir la membrana, como se describe en la presente. Las propiedades del poliéster, policarbonato y otras membranas se describen en, por ejemplo, Kroschwitz, 1990, Concise Enciclopedia of Polymer Science and Engineering, Wiley, New York, 363-67, 558-60; Domininghaus , 1993, Plástic for Engineers: Material , Properties , Applications , Hanser Publishers, New York, Cap. 14; Zeronian y col., 1990, J. Appl . Polym. Sci. 41: 527-34; Gillberg, y col., 1981, J. Appl. Polym. Sci. 26: 2023-51.

En una modalidad preferida, las membranas son membranas con poros en ángulos. En una modalidad más preferida, los poros de la membrana tienen un ángulo promedio en relación con el plano de la cara de la membrana (es decir, un ángulo de poro promedio) de menos que aproximadamente 56°. En una modalidad más preferida, el ángulo promedio de los poros es aproximadamente 45°. En otra modalidad preferida, el ángulo promedio de los poros es alrededor de 90° para llevar al mínimo la longitud de los rizos del poro a la misma distancia que el espesor de la membrana.

Las membranas de poliéster disponibles en el comercio, convenientes para utilizarlas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las membranas PETE NUCLEPORE™, Nos. de Catálogo 188607, 188107, 188606, 188106, 188605, 188105 y 188604 (Whatman) , membrana PETE CYCLOPORE™ Nos. de Catálogo 7061-2504, 7061-4704, 7061-4702, 7061-2501 y 7061-4701 (Whatman) y membranas PETE PORETICS™ Nos. de Catálogo T01COP02500, T04CP04700, T02CP02500, T01CP04700, T01CP02500 y T01CP04700 (Osmonics ) .

En los métodos y dispositivos de la presente invención es posible utilizar una membrana de cualquier espesor. Un experto en la técnica apreciará que una membrana más gruesa produce vesículas más pequeñas y tiene una velocidad de flujo más lenta en comparación con una membrana más delgada en condiciones de otro modo similares. El limite superior del tamaño del espesor de la membrana útil en los métodos y dispositivos de la presente invención se determina por la tolerancia del dispositivo de extrusión que se utilice. El limite inferior del espesor de la membrana útil en los métodos y dispositivos de la presente invención se determina por la fragilidad de la membrana y su capacidad para soportar la presión de la extrusión. En una modalidad preferida, la membrana tiene un espesor entre aproximadamente 3 y aproximadamente 50 pm. En una modalidad más preferida, la membrana tiene un espesor entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20 µp?. En una modalidad más preferida, la membrana tiene un espesor entre aproximadamente 3 y aproximadamente 12 µ??.

En los métodos y dispositivos de la presente invención puede utilizarse una membrana de cualquier tamaño y forma. El tamaño y forma de la membrana se limita solo por la tolerancia del dispositivo de extrusión. En general, a mayor área de superficie de la membrana mayor la velocidad de flujo a través de la membrana. Una membrana de cualquier tamaño o forma deseada puede cortarse a partir de una hoja de membrana más grande. Una membrana puede ser, por ejemplo, circular, cuadrada o rectangular con un área de superficie de aproximadamente 1 cm2. En una modalidad preferida la membrana es circular y tiene un diámetro de alrededor de 25 mm. En otra modalidad preferida la membrana es circular y tiene un diámetro de aproximadamente 47 mm. En otra modalidad preferida, la membrana es circular y tiene un diámetro de alrededor de 90 mm. En otra modalidad preferida, la membrana es circular y tiene un diámetro de aproximadamente 142 mm. En todavía otra modalidad preferida, la membrana es circular y tiene un diámetro de aproximadamente 293 mm.

En los métodos y dispositivos de la presente invención es posible utilizar una membrana de cualquier topología limitada solo por la tolerancia del dispositivo de extrusión que se emplee. Un experto en la técnica sabe como manipular la topología de la membrana para aumentar el área de superficie de la membrana que está en contacto con la preparación que va a ser extruida, y que esto reduce la obstrucción o incrustación de la membrana. En una modalidad preferida, la membrana es plana. En otra modalidad preferida, la membrana se pliega.

En los métodos y dispositivos de la presente invención es posible utilizar una membrana con cualquier diámetro promedio de poros. Una membrana con un diámetro promedio de poros más grande producirá vesículas más grandes y tendrá mayor velocidad de flujo, en comparación con una membrana con un diámetro promedio de poro más pequeño en condiciones de otro modo similares. En una modalidad preferida, la membrana tiene un diámetro promedio de poros que es aproximadamente igual al diámetro de la vesícula que va a ser producida. En otra modalidad preferida, el diámetro promedio de los poros es entre aproximadamente 50 y aproximadamente 400 nm. En una modalidad más preferida, el diámetro promedio de los poros es entre aproximadamente 75 y aproximadamente 200 nm. En todavía otra modalidad preferida, el diámetro promedio de los poros es entre aproximadamente 100 y aproximadamente 125 nm. En una modalidad más preferida, el diámetro promedio de los poros es alrededor de 100 nm.

En los métodos y dispositivos de la presente invención es posible utilizar una membrana con cualquier densidad de poros. Una membrana con una densidad de poros más grande tendrá menos incrustación u obstrucción y una velocidad de flujo más grande en comparación con una membrana con menor densidad de poros en condiciones de otro modo similares. Así pues, en general, se prefiere una densidad de poros más grande. No obstante, las densidades de poros grandes se asocian con diversas desventajas. Primera, una densidad de poros alta puede comprometer la resistencia a la tracción de la membrana, comprometiendo asi su capacidad para soportar la presión de extrusión a que será sometida. Segunda, en una membrana con poros distribuidos al azar el número de poros traslapantes aumenta con el aumento de la densidad de los poros. Los poros traslapantes tienen diámetros de poros mayores que el tamaño clasificado de la membrana, de este modo pueden provocar un aumento en el diámetro promedio de las vesículas extruidas a través de la membrana. En consecuencia, se prefiere una densidad de poros que sea tan alta como pueda obtenerse sin comprometer la resistencia a la tracción de la membrana o aumentar considerablemente el diámetro promedio de las partículas de las vesículas extruidas. La densidad máxima de los poros que pueda lograrse o que sea deseable se limita por el diámetro promedio de los poros de la membrana. Una membrana con un diámetro promedio de poros más grande tiene menor densidad máxima de los poros en comparación con una membrana de otro modo semejante con un diámetro de poros promedio más pequeño. En una modalidad preferida, la densidad de los poros es entre aproximadamente 8 x 105 y 9 x 109 poros/cm2 distribuidos en forma aleatoria. En una modalidad más preferida, la densidad de los poros es entre aproximadamente 8 x 106 y 5 x 109 poros/cm2 distribuidos en forma aleatoria. En una modalidad más preferida, la densidad de los poros es entre aproximadamente 1.5 x 107 y 2.6 x 109 poros/cm2 distribuidos en forma aleatoria.

Es posible obtener densidades más grandes de poros en una membrana sin aumentar considerablemente su diámetro promedio de poro utilizando una distribución no aleatoria de los poros. Es posible crear una membrana tamiz con un arreglo de poros modelado en donde la incidencia de los poros traslapantes se elimine casi por completo, incluso con densidades de poros muy altas. Asi pues, en una modalidad preferida, la densidad de los poros es entre aproximadamente 8 x 105 y 9 x 109 poros/cm2 distribuidos no en forma aleatoria. En una modalidad más preferida, la densidad de los poros es entre aproximadamente 8 x 106 y 5 x 109 poros/cm2 no distribuidos en forma aleatoria. En una modalidad más preferida, la densidad de los poros es entre aproximadamente 1.5 x 107 y 2.6 x 109 poros/cm2 no distribuidos en forma aleatoria.

Un aparato para manejar eficientemente y/o sustituir las membranas durante el proceso de extrusión puede utilizarse con los métodos de la invención. Un aparato como este puede ser un soporte que contenga, por ejemplo, membrana (s) y un anillo (s) de soporte para sostener la(s) membrana (s) en un solo plano y evitar que se plieguen o adhieran. El aparato de soporte puede estar compuesto de membranas de diferente diámetro de tamaño de poro o similares, arregladas en una configuración de sándwich o apiladas. El aparato de la invención puede proporcionar facilidad y conveniencia cuando se trabaja con membranas, por ejemplo, el aparato puede retirarse fácilmente o sustituirse durante el proceso de extrusión y puede ser esterilizado .

Métodos de la invención De conformidad con ios métodos de la invención, un material capaz de formar una vesícula, micela o liposoma se extruye a través de una membrana tamiz a presión alta para producir una suspensión de vesículas, micelas o liposomas. Los materiales ejemplares convenientes para la extrusión, utlizando los métodos y dispositivos de la presente invención, se describen más adelante.

Los métodos y dispositivos de la presente invención se practican utilizando una presión de extrusión alta. Una extrusión realizada a presión superior tendrá una velocidad de flujo mayor, se obstruirá o incrustará menos fácilmente, permitirá a la membrana tolerar un mayor grado de incrustación u obstrucción durante la producción y producirá vesículas de tamaño más pequeño en comparación con la extrusión de otro modo idéntica realizada a menor presión. La presión que puede realizarse se limita solo por la tolerancia del dispositivo de extrusión y la membrana que se utilice. En una modalidad preferida, se utiliza una presión mayor que aproximadamente 400 psi. En otra modalidad preferida, se utiliza una presión mayor que aproximadamente 800 psi. En una modalidad más preferidas, se utiliza una presión mayor que aproximadamente 1500 psi. En todavía una modalidad más preferida, se utiliza una presión mayor que aproximadamente 5000 psi. En una modalidad más preferida, se utiliza en la inmersión una presión mayor que aproximadamente 8000 psi.

La presente invención puede practicarse a cualquier temperatura. En una modalidad preferida, la extrusión se realiza a temperatura controlada. En una modalidad más preferida, la temperatura controlada es una temperatura constante. En otra modalidad, la temperatura constante es alrededor de la temperatura ambiente. En otra modalidad, la temperatura constante es igual a o mayor que la Tc del lípido que se extruye. En otra modalidad, la mezcla que se extruye contiene una pluralidad de lipidos, y la temperatura constante es igual a o mayor que la Tc más alta de los lipidos que se extruyen. En otra modalidad, la temperatura constante es entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 35°C. En- una modalidad más preferida, la temperatura constante es entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 30°C. En una modalidad más preferida, la temperatura constante es entre aproximadamente 23°C y aproximadamente 27 °C. En una modalidad más preferida, la temperatura constante es alrededor de 25°C.

Los métodos y dispositivos de la presente invención pueden utilizarse para fabricar vesículas de cualquier diámetro promedio deseado. En general, se elige una membrana que tenga un diámetro de poro promedio semejante al diámetro promedio deseado de la vesícula, cómo se explicó en lo anterior. El tamaño promedio de la vesícula puede reducirse, por ejemplo, extruyendo las vesículas extruídas otra o más veces, utilizando una pila de membranas, utilizando una membrana más gruesa, aumentando la presión de la extrusión o procesando las vesículas, como se describe en la presente. El tamaño de las vesículas puede determinarse utilizando cualquier técnica conocida. Por ejemplo, la dispersión de luz cuasieléctrica (QELS) , también conocida como Dispersión de Luz Dinámica (DLS) , puede utilizarse como se describe en Bloomfield, 1981. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10: 421-50. En una modalidad preferida, las vesículas tienen un diámetro promedio de entre aproximadamente 50 y 400 nm. En una modalidad más preferida, el diámetro promedio es entre aproximadamente 50 y 150 nm. En todavía otra modalidad más preferida, el diámetro promedio es entre aproximadamente 100 y 150 nm. En una modalidad más preferida, el diámetro promedio es alrededor de 169 ± 37 nm, 150 ± 39.5 nm, 136 ± 42 nm, 153.6 ± 45.2 nm, 138.6 + 35.6 nm, 114.4 ± 35.8 nm ó 118.1 ± 36.2 nm.

Los métodos y dispositivos de la presente invención pueden utilizarse para fabricar vesículas de una lamelaridad deseada. Una vesícula unilamelar tiene una sola capa de membrana. Una vesícula multilamelar (MLV) contiene una pluralidad de capas de membranas. Véase, Lasic, 1997, Liposomes in Gene Delivery, CRC Press LLC, Boca Ratón 67-71. En una modalidad preferida de la invención, una suspensión de MLV se extruye utilizando los métodos o dispositivos de la presente invención para producir una suspensión de vesículas unilamelares de diámetro promedio deseado. En otra modalidad preferida, se extruye una emulsión utilizando los métodos ó dispositivos de la presente invención.

Las vesículas que se producen utilizando los métodos o dispositivos de la presente invención además pueden procesarse utilizando cualquier técnica de procesamiento. En una modalidad preferida, el diámetro promedio d& vesículas de una suspensión de vesículas producida utilizando los métodos o dispositivos de la presente invención se altera después de que éstas son extruídas. En una modalidad más preferida, las vesículas extruídas se extruyen una o más veces adicionales. En todavía otra modalidad más preferida, la extrusión adicional se hace utilizando los métodos o dispositivos de la presente invención. En una modalidad más preferida, las vesículas se extruyen en múltiples pasos utilizando un procedimiento "step-down" o de reducción, es decir, en donde cada extrusión sucesiva es a través de una membrana de diámetro de poro promedio más pequeño. En otra modalidad más preferida, la suspensión pasa a través de la membrana en forma alterna en las direcciones hacia delante y hacia atrás para reducir la cantidad de oclusión o incrustación de la membrana.

En otra modalidad preferida, el diámetro promedio de las vesículas extruídas se reduce más por sonicación. En otra modalidad preferida, los ciclos de sonicación intermitentes se alteran con evaluación QELS para guiar la síntesis eficiente de las vesículas.

En otra modalidad preferida, las vesículas extruídas se procesan para retirar contaminantes o impurezas. En' otra modalidad preferida, la suspensión que va a extruirse contiene una sustancia que se va a incorporar en las vesículas, y el paso de procesamiento elimina aquella parte de la sustancia que no se incorpora en las vesículas. En una modalidad más preferida, la sustancia que ha de ser incorporada en las vesículas es una sustanc 1 .r.acéut i ca activa, como puede ser un medicamento de moléculas pequeñas, proteína, péptido, ácido nucleico u oligonucleótido .

Los métodos y dispositivos de la presente invención pued practicarse utilizando cualquier número de membranas apiladas. Un experto en la técnica aprecia que una extrusión a través de un número más grande de ¡r,.;:.L anas apiladas tendrá una velocidad de flujo menor y producirá vesículas con un diámetro promedio más pequeño que una extrusión de otro modo semejante a través de un número más pequeño de membranas apiladas. El número de membranas que puede utilizarse en una pila se limita solo por la tolerancia del dispositivo para extrusión. En una modalidad preferida, la pila contiene entre 2 y 10 membranas. En una modalidad más preferida, la pila contiene entre 2 y 5 membranas. En otra modalidad preferida, las membranas apiladas son prácticamente idénticas. En otra modalidad preferida, al menos una de las membranas en la pila es diferente de al menos una de las demás membranas en la pila. La diferencia puede ser en cualquier propiedad que afecte la extrusión. La diferencia puede ser, por ejemplo, en la composición de la membrana, el recubrimiento, el tamaño de poro, la densidad de los poros, el ángulo de los poros, la forma de los poros o el tamaño de la membrana, como se describe en la presente.

En otra modalidad preferida, la extrusión se realiza utilizando múltiples pases a través de una membrana o pila de membranas. Si se utiliza una modalidad de membranas apiladas en la extrusión, las múltiples pases pueden no necesariamente estar en orden para obtener liposomas de un diámetro deseado. En una modalidad particularmente preferida se emplea el método de reducción. En un método de reducción, múltiples pases de la suspensión se realizan a través de las membranas de diámetro de poro decreciente. En una modalidad particularmente preferida del método de reducción, una primera pase se realiza a través de una membrana con un diámetro de poro de aproximadamente 0.4 µ?t?, una segunda pase se hace a través de una membrana con un diámetro de poro de aproximadamente 0.2 µp?, y si es necesario, una tercera, una cuarta, una quinta y una sexta pase se hacen a través de una membrana con un diámetro de poro de aproximadamente 0.1 µp?.

En otra modalidad preferida, la membrana se trata con un agente de lavado, en una modalidad más preferida, la membrana se trata con un agente de lavado antes de la extrusión. En una modalidad más preferida, la membrana se trata con el agente de lavado después de que al menos una pase a través de la membrana se haya completado y antes de que el menos una pase más se realice a través de la membrana. El agente de lavado puede ser cualquier sustancia o composición que retire material de un poro de la membrana ocluida o incrustada o evite que las membranas ocluyan o incrusten o que cree un "efecto de cribado". En una modalidad preferida, el agente de lavado consiste en un alcohol orgánico. En una modalidad más preferida, el agente de lavado consiste en etanol.

Dispositivos de extrusión Para practicar los métodos y dispositivos de la invención reclamada puede utilizarse cualquier dispositivo de extrusión capaz de albergar una membrana adecuada y soportar una alta presión de extrusión. En una modalidad preferida, el dispositivo de extrusión de la presente invención y los dispositivo útiles para practicar los métodos de la presente invención contienen una membrana tamiz hidrófila, con poros en ángulo o con poros en ángulo, hidrófila. En una modalidad más preferida, la membrana es una membrana de poliéster con pistas grabadas (PETE) . En otra modalidad más preferida, el dispositivo de extrusión además contiene un alojamiento y un recipiente para recolección, en donde el alojamiento se une de manera operante a un primer lado de la membrana mediante una junta resistente a la presión y a los líquidos y el recipiente para recolección se coloca para recibir la suspensión extruida después de que ésta sale por un segundo lado de la membrana. En todavía otra modalidad más preferida, el dispositivo además consiste en un soporte o aparato de membranas. En otra modalidad preferida, el dispositivo de extrusión se configura de modo que la suspensión acuosa pueda ser extruida en forma alterna a través de la membrana en las direcciones hacia delante y hacia atrás. En otra modalidad preferida, el dispositivo de extrusión utiliza un flujo tangencial. Los dispositivos disponibles en el comercio que pueden ajustarse con las membranas adecuadas y utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, THE MINI -EXTRUDER™ No. Catálogo 610000 (AVANTI® Polar Lipids, Inc., Alabaster AL), véase Subbarao y col., 1991, Biochim. Biophys. Acta. 1063: 147-54, Liposome Extruder No. Parte ER-1 (Eastern Scientific, Rockville, MD) , véase EMULSIFLEX®-C50 Extruder, No. Cat . EFC50EX (Avestin, Inc., Ottowa, Ontario, Canadá), véase LIPOSOFAST™ (Avestin, Inc.), LIPEX™ Extruders (Northern Lipids Inc., Vancouver, British Columbia, Canadá) . Otros dispositivos de extrusión útiles para practicar la presente invención incluyen aquellos que están descritos en las Patentes US Nos. 5,948,441; 5,556,580 y 6,217,899 Bl.

El dispositivo de extrusión debe ser capaz de soportar altas presiones de extrusión. Como regla general, las presiones más grandes conducen a un mejor funcionamiento, por ejemplo, tasas de flujo aumentadas, menos incrustación y oclusión de la membrana y una reducción más rápida en el tamaño de las vesículas extruídas. En un mínimo, el dispositivo de extrusión debe poder soportar presiones de extrusión mayores que aproximadamente 400 psi. En una modalidad preferida, el dispositivo de extrusión puede soportar una presión de extrusión más grande que aproximadamente 800 psi. En una modalidad más preferida, el dispositivo de extrusión puede soportar una presión de extrusión más grande que aproximadamente 1000 psi. En otra modalidad más preferida, el dispositivo de extrusión puede soportar una presión de extrusión mayor que aproximadamente 1500 psi. En una modalidad más preferida, el dispositivo de extrusión puede soportar una presión de extrusión mayor que aproximadamente 500 psi. En una modalidad más preferida, el dispositivo de extrusión puede soportar más grande que aproximadamente 8000 psi.

Para hacer óptima el área de superficie disponible también es posible utilizar un soporte o alojamiento para las membranas siempre que éste pueda soportar la presión de extrusión a la que éstas se someten. En una modalidad preferida, la membrana se pliega. En otra modalidad preferida, el soporte o alojamiento utiliza posicionamiento tridimensional de las membranas. La invención además propone los métodos y un aparato para manejar eficientemente las membranas y/o sustituir las membranas durante un proceso de extrusión. Las membranas de policarbonato con pistas grabadas (PCTE) y poliéster con pistas grabadas (PETE) disponibles en el comercio son frágiles y con carga estática. Estas membranas se doblan fácilmente y se adhieren entre si dificultando su manejo y colocación en los soportes para membranas utilizados para la extrusión. Esto es especialmente evidente cuando las membranas o los soportes de membranas están húmedos. Además, las membranas PCTE, PETE y otro tipo de membranas son muy delicados y necesitan un manejo cuidadoso. Para facilitar este problema, la invención propone los métodos y un aparato para manejar eficientemente y cargar las membranas en los soportes mediante el uso de un soporte o alojamiento de membranas. Un soporte de membranas puede ser, por ejemplo, un soporte de cartucho.

En una modalidad, el soporte de cartucho puede estar compuesto de anillo (s) de soporte capaces de ajustar la membrana o las membranas al perímetro del anillo (s) de soporte en un solo plano para evitar el doblez y adhesión a presiones altas. El aparato puede soportar la membrana o membranas en diferentes configuraciones, por ejemplo, las membranas pueden estar alojadas en una configuración "sándwich" o en una configuración apilada. Si se alojan múltiples membranas en el cartucho, las membranas pueden ser del mismo diámetro de tamaño de poro o diferente. El aparato o cartucho puede tener diversas características, por ejemplo el soporte de cartucho puede estar precargado con membranas, el aparato puede esterilizarse e incorporarse fácilmente en un sistema automatizado para el cambio de membranas.

El aparato soporte de cartucho proporciona las ventajas de llevar al mínimo el manejo de las membranas y mayores eficiencias en la carga de las membranas. Además, el aparato soporte de cartucho proporciona una mejor eficiencia general durante la producción porque, por ejemplo, una membrana ocluida o incrustada puede cambiarse mientras el flujo del producto se desvía a un nuevo aparato de soporte de cartucho mientras el aparato de soporte de cartucho ocluido o incrustado se cambia .

Lípidos Los métodos y dispositivos de la presente invención pueden utilizarse para extruir vesículas, micelas o liposomas de cualquier sustancia conveniente. En una modalidad preferida, los métodos y dispositivos de la presente invención se utilizan para producir liposomas a partir de un lípido o combinación de lípidos. Puede utilizarse cualquier lípido o combinación de lípidos. En una modalidad preferida, el lípido extruído es difícil de extruir utilizando los métodos y dispositivos tradicionales. En una modalidad más preferida, el lípido difícil tiene una Tc mayor que aproximadamente la temperatura ambiente. En otra modalidad preferida, el lípido difícil consiste en una cadena acilo rígida. En una modalidad más preferida, la cadena acilo rígida es una cadena acilo monoinsaturada. En otra modalidad preferida, el lípido difícil contiene una impureza o contaminante. En una modalidad más preferida, la impureza o contaminante es una resina o la impureza que dificulta que el lípido se extruya. En una modalidad más preferida, la impureza o contaminante es una resina introducida durante el proceso de fabricación. En otra modalidad preferida, el lípido difícil se asocia con otra molécula. En una modalidad más preferida, la molécula es un fármaco. En otra modalidad más preferida, la molécula es una proteína. En otra modalidad preferida, el lípido difícil es un lípido con carga. En otra modalidad preferida, el lípido difícil es difícil de extruir a escala de fabricación. En una modalidad particularmente preferida el lípido difícil se elige del grupo que consiste en l-palimotil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) , dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatídilglicerol y di-estearoil-fosfatidiletanolaraina .

En otra modalidad preferida, el lípido es un lípido fácil. En una modalidad más preferida, el lípido fácil se elige del grupo que consiste en fosfatidilcolina de yema de huevo (EPC) , fosfatidilglicerol de huevo y di-oleoil- fosfatidilcolina . Otros fosfolípidos convenientes para utilizarlos con la presente invención incluyen, pero no se limitan di-lauroilfosfatidilcolina, di- lauroilfosfatidilglicerol, oleoil- palmitoilfosfatidilcolina, fosfolípidos ligados a glucolípidos , fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol , lecitina, á, á-dipalmitoil-á-lecitina, esfingomielina, fosfatidilserina , ácido fosfatídico, cloruro de N-(2,3- di ( 9- (Z) -octadeceniloxi ) ) -prop-l-il-N,N,N- trimetilamonio, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, + lisofosfatidiletanolamina, fosfatidílinos itol, cefalina, cardiolipina, cerebrósidos , dicetilfos fato , dioleoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilglicerol, palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina, di-estearoil- fos fatidilcolina , estearoil-palmitoil-fosfatidilcolina, di -palmitoil-fosfatidiletanolamina, di-estearoil- fosfatidiletanolamina, di-miristoil-fosfatidilserina, di-oleil-fosfatidilcolina, y similares.

En una modalidad más preferida, el lípido es fosfatidilcolina o esfingomielina .

Los lípidos que no contienen fósforo también pueden utilizarse en los liposomas de las composiciones de la presente invención. Estos incluyen, pero no se limitan a, colesterol, otros esteróles, estearilamina , docecilamina [sic], palmitato de acetilo y amidas de ácidos grasos.

Los lipidos adicionales convenientes para utilizarlos en los liposomas de la presente invención son bien conocidos para los trabajadores expertos en la técnica y se mencionan en diversas fuentes bien conocidas, por ejemplo McCutcheon' s Detergents and Emulsifiers and McCutcheon' s Functional Materials, Allured Publishing Co., Ridgewood, N. J.

Los lipidos que se utilizan en los métodos y dispositivos de la presente invención incluyen lipidos químicamente modificados. En una modalidad preferida, el lípido está unido en forma covalente a un grupo modificador. El grupo modificador puede afectar cualquier propiedad o propiedades del lípido. Por ejemplo, el grupo modificador puede alterar la temperatura de transición del lípido, las propiedades de ensamble, las propiedades de extrusión, las propiedades de encapsulación, las propiedades de orientación in vivo, las propiedades del procesamiento in vivo, los efectos fisiológicos, la estabilidad o vida media. En una modalidad preferida, el lípido modificado está unido a polietilen glicol (PEG-ligado) . En otra modalidad preferida, el lipido modificado es un fosfolipido PEGilado.

En otra modalidad preferida, es posible utilizar combinaciones de lipidos en los métodos y dispositivos de la presente invención. Por ejemplo, un fosfolipido y lipido ligado a PEG puede utilizarse en los métodos y dispositivos de la invención.

La preparación que ha de ser extruida también puede contener otros tipos de moléculas. Los ejemplos de otras moléculas o iones que pueden estar asociados con los lipidos incluyen, pero no se limitan a, colesterol u otros esferoides o derivados de esferoides, disolventes, amortiguadores, ácidos, bases, sales, metales, queladores, azúcares, proteínas, ácidos nucleicos y fármacos, como está descrito más adelante. Véase, por ejemplo Lasic, 1997, Liposomes in Gene Delivery, CRC Press LLC, Boca Ratón 67-71.

Para la preparación de los liposomas que han de administrarse a un individuo, por lo regular se desea que los liposomas estén compuestos de lipidos que sean líquidos cristalinos a 37°C, con frecuencia a 35°C e incluso a 32°C. En vista de que los individuos por lo regular tienen una temperatura corporal de aproximadamente 37°C, los liposomas compuestos de lipidos que son líquidos cristalinos a 37°C por lo regular están en un estado liquido cristalino durante el tratamiento.

En los métodos se utiliza la calidad más alta de las materias primas, en parte por las elevadas presiones que se emplean. Los lipidos materia prima deben cumplir ciertas normas de control de calidad antes de utilizarse en el proceso de extrusión. Por ejemplo, desde el proceso de producción debe controlarse el pH, tamaño del polvo, forma del polvo anhidro, tamaño de la partícula humedecida, osmolalidad, nivel de calcio, nivel particulado, condiciones de secado y niveles de aditivos, residuos o impurezas. Estos parámetros pueden afectar las características físicas de los lipidos en solución o suspensión dificultando la extrusión de los lipidos. En particular, el pH debe estar controlado y ser consistente, los niveles de calcio deben ser bajos y las materias primas deben secarse bien y tener buenas características visuales.

Preparación de los lipidos Cualquier preparación que contenga una o más sustancias que se puedan extruir para formar vesículas, micelas o liposomas puede utilizarse en los métodos y dispositivos de la presente invención. En una modalidad preferida, se utiliza una preparación que contiene uno o más lipidos. En una modalidad particularmente preferida, la preparación es una suspensión acuosa que contiene uno o más lipidos. Puede utilizarse cualquier método de fabricación de una preparación como esta. Véase, por ejemplo, Lasic, 1997, Liposomes in Gene Delivery, CRC Press LLC, Boca Ratón 67-71 a páginas 88-91; Szoka, y col., 1980, Biochim. Biophys , Acta. 601: 559-71. Estos métodos por lo regular incluyen la preparación de una suspensión acuosa de lipidos. En una modalidad preferida, los lipidos forman vesículas multilamelares (MLV) en la suspensión. Las suspensiones de MLV pueden extruirse para producir vesículas de tamaño y lamelaridad deseados, por ejemplo SUV ó LUV. Por lo regular, se utiliza una concentración de lipidos de entre aproximadamente 5 y 50 mM, aunque son posibles concentraciones de lipidos de hasta aproximadamente 400 mg/mL o mayores. Cuando se utiliza una pluralidad de lipidos, los lipidos por lo regular primero se mezclan en un disolvente orgánico como cloroformo, una mezcla 3:1 (v/v) de cloroformo: metanol ó butanol terciario. Los lipidos se disuelven en el disolvente, por lo regular a una temperatura de entre aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 50°C, después se congelan con rapidez, por ejemplo incubando en un baño de hielo seco-etanol ó hielo seco-acetona. El disolvente orgánico entonces se evapora y la película de lípidos seca, torta o polvo se rehidrata en una solución acuosa adecuada. La rehidratacion por lo regular se lleva a cabo a una temperatura mayor que la Tc del lípido con la Tc más alta (si se utiliza más de un lípido) en una solución acuosa, por ejemplo, agua destilada, agua destilada amortiguada, solución salina o una solución de azúcar u otra solución de no electrolitos disueltos. El paso de hidratación preferentemente dura más de aproximadamente una hora y se acompaña por agitación, aunque puede llevarse a cabo en tan poco tiempo como algunos minutos, dependiendo del lípido. El intervalo de tamaño de las MLV formadas durante el proceso de hidratación por lo regular abarca desde aproximadamente 500 nm hasta aproximadamente 10,000 nm (10 mieras) o mayor. Por lo regular, la agitación más vigorosa durante la hidratación favorece la formación de las MLV más pequeñas. La hidratación, como una opción, es seguida por el reposo de la mezcla durante la noche, lo cual puede facilitar la formación ulterior de vesículas unilamelares . En un método preferido para producir una suspensión acuosa de lípidos, una solución de lípidos en cloroformo se agita con vórtice y el disolvente se elimina bajo una corriente constante de ¾ . La muestra se seca al alto vacio. La película de lipidos anhidra resultante se rehidrata en NaCl 150 mM y ácido [4- (2-hidroxietil) ] -piperazin-etansulfónico 20 mM (Hepes, pH 7.4).

En otra modalidad preferida, la preparación que debe extruirse consiste en una emulsión de uno o más lipidos. La emulsión puede formarse utilizando cualquier técnica conocida y dispositivo mecánico como un homogeneizador, microfluidizador o mezclador, como un rotor-estator. Véase, Martin y col., 1983, Physical Fharmacy: Physical Chemical Principies ín the Pharmaceutical Sciences , Lea & Febiger Publishers, Philadelphia; Gennaro, y col., 1990, Re ington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania . La preparación de los lipidos también puede utilizar otras técnicas de formación de liposomas que no sea capaz de alcanzar el diámetro promedio final deseado de las vesículas o que alcance un intervalo angosto de diámetros de vesículas dentro de una preparación de liposomas que incluye, pero no se limita a, la homogeneización, microfluidización, sonicación, mezclado con alto cízallamiento o extrusión a través de fritas metálicas o filtros de cerámica. Véase por ejemplo, New, 1990, Liposomes : A Practical Approach, f Oxford University Press, New York, Cap. 2. En otra modalidad preferida, los liposomas se forman en condiciones de elevada eficiencia de encapsulacion. Se prefiere un método en fase de evaporación inversa. Las vesículas por evaporación en fase inversa (REV) formadas por este método se caracterizan por: (a) una o más bicapas, (b) una eficiencia de encapsulacion por lo regular entre aproximadamente 20-50%, y (c) un espectro amplio de tamaños entre aproximadamente 500 y hasta 20,000 nm (20 mieras) . Estos y otros métodos de preparación de liposomas han sido revisados. Véase Szoka, y col., 1980, Biochim. Biophys. Acta. 601: 559-71.

La preparación que va a ser extruída también puede contener cualquier sustancia que se desee encapsular o unir a la vesícula, micela o liposoma. En una modalidad preferida, la sustancia es colesterol u otro esferoide o derivado de esferoide, disolvente, búfer, ácido, base, sal, metal, quelador, azúcar, proteína, ácido nucleico o fármaco. Véase, Lasic, 1997, Liposomes in Gene Delivery, CRC Press LLC, Boca Ratón 67-71 a páginas 88-91; Szoka, y col., 1980, Biochim. Biophys, Acta. 601: 559-71. En una modalidad más preferida, la sustancia es colesterol, polietilen glicol, un alquilsulfato , bromuro de amonio o albúmina. En otra modalidad más preferida, la sustancia es un fármaco. Los liposomas pueden utilizarse, por ejemplo, para alterar la distribución en tejidos y captación de medicamentos, en una forma favorable desde el punto dé vista terapéutico, y pueden aumentar la conveniencia de la terapia, permitiendo administración de medicamentos menos frecuente. Véase, por ejemplo, Poznansky, y col., 1984, Pharmacol . Rev. 36: 277-336. En una modalidad todavía más preferida, el medicamento es un agente antihiperlipidémico . Véase, The Physicians' Desk Referente (54a edición, 2000). En una modalidad aún más preferida, el agente antihiperlipidémico es clorhidrato de colestipol, 2- (p-clorofenoxi) -2-metil-proprionato de etilo [sic] , gemfibrozil, fenofibrato, cerivastatína de sodio, fluvastatina de sodio, atorvastatina de calcio, lovastatina, pravastatina de sodiio, simvastatina ó ácido nicotínico. Véase id. En otra modalidad más preferida, el fármaco es un antibiótico. En una modalidad todavía más preferida, el antibiótico es doxorubicina . Véase id, en 508. En otra modalidad todavía más preferida, el antibiótico es anfotericina Bl. Véase id en 1653. En otra modalidad preferida, el fármaco anticáncer es vincristina, mitoxantrona u otro medicamento anticáncer. Véase, por ejemplo Bally y col., 1990, Biochim. Biophys . Acta 1023: 133-9, Sugarman, y col., 1992, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 12: 231-42, Kim y col., 1993, Drugs 46: 618-38; Lim, 1997 , J. Pharmacol. Exp . Ther. 281: 566-73; Fielding, 1991, Clin. Pharmacokine . 21: 155-64.

Para liposomas destinados para uso in vivo, puede utilizarse un búfer acuoso que contenga un portador aceptable para uso farmacéutico. Las composiciones pueden contener las sustancias auxiliares aceptables para uso farmacéutico según sea necesario para aproximar las condiciones fisiológicas, como ajustadores de pH y agentes amortiguadores, agentes ajustadores de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Una modalidad preferida utiliza un búfer acuoso que tiene aproximadamente una osmolalidad fisiológica (es decir, 290 mOsm/kg) . Los ejemplos de estos amortiguadores o búfers incluyen soluciones de salina al 0.9%, dextrosa al 5% y sacarosa al 10%. Es posible emplear muchos otros portadores aceptables para uso farmacéutico. En general, la solución salina normal se empleará como el portador aceptable para uso farmacéutico. Otros portadores convenientes pueden ser, por ejemplo agua, agua amortiguada, salina al 0.4%, glicina al 0.3% y 'Similares , incluidas las glucoproteinas para mejorar la estabilidad, como la albúmina, lipoproteina, globulina, etcétera.

La preparación que ha de ser extruida también puede contener impurezas o contaminantes, aunque en una modalidad preferida estas sustancias se eliminan de la solución acuosa antes, durante o después del proceso de extrusión .

Estas composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas tradicionales de esterilización bien conocidas. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para uso o filtrarse en condiciones asépticas y ser liofilizadas , la preparación liofilizada puede combinarse con una solución acuosa estéril antes de la administración .

Usos de los liposomas Las vesículas, micelas y liposomas producidos con los métodos y dispositivos de la presente invención pueden utilizarse en cualquier forma que las vesículas, micelas y liposomas producidos con las técnicas tradicionales puedan utilizarse. En una modalidad preferida, los liposomas producidos utilizando los métodos y dispositivos de la presente invención se utilizan para suministrar un medicamento o sustancia farmacéutica activa a un paciente. Véase, por ejemplo, las Patentes US Nos. 4,769,250; 4,906,477; 5,736,155; 6,060,080; Poznansky, y col., 1984, Pharmacol. Rev. 36: 277-36; Lim, 1997, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281: 566-73; Kim, 1993, Drugs 46: 618-38; Fielding, 1991, Clin. Pharmokinet . 21: 155-64; Sugarman, y col., 1992, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 12: 231-42; Bally, y col., 1990, Biochim. Bíophys . Acta. 1023: 133-39. En una modalidad más preferida, el liposoma preferentemente suministra el medicamento o sustancia farmacéutica activa a un tipo de tejido o célula en el individuo. En otra modalidad preferida, los liposomas encapsulan un ácido nucleico. Véase, Lasic, 1997, Liposomes in Gene Delivery, CRC Pres LLC, Boca Ratón 67-71. En una modalidad especialmente preferida, el ácido nucleico es un ácido nucleico antisentido utilizado para inhibir la expresión de un gen. En otra modalidad especialmente preferida, el liposoma que contiene ácido nucleico se utiliza en un protocolo de terapia génica para tratar, por ejemplo, una enfermedad genética (como puede ser fibrosis quistica, enfermedades de Gaucher, anemia de células falciformes, talasemia, hemofilia o hipercolesterolemia familiar) , cáncer (por ejemplo potenciando la inmunogenicidad de un tumor, favoreciendo la actividad de las células inmunitarias insertando un gen suicida en un tumor, insertando un gen supresor de tumor en un tumor, bloqueando la expresión de un gen, protegiendo las células progenitoras o insertando genes que codifican toxinas bajo el control de un promotor especifico del tumor) , una enfermedad infecciosa (como puede ser el síndrome de inmunodeficiencia adquirida, hepatitis o herpes) , una enfermedad neurológica (como puede ser la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o esclerosis lateral amiotrófica) , una enfermedad cardiovascular (como puede ser aterosclerosis , reestenosis, trombosis o isquemia cardiaca) , otra enfermedad o estado (como puede ser artritis, asma, diabetes, osteoporosis y estados anormales asociados con el envejecimiento). Véase, Lasic, 1997, Liposomes in Gene Delivery, CRC Pres LLC, Boca Ratón 67-71 a páginas 8-13.

En una modalidad especialmente preferida, los métodos y dispositivos de la presente invención se utilizan para preparar liposomas útiles para tratar aterosclerosis, como está descrito en las Patentes US Nos. 5,746,223; 6,367,479; 6,079,416; 6,080,422; 5,736,157; 5,948,435; 5,858,400; 5,843,474; 6,312,719 y 6,139,871. El liposoma puede unirse a una próteína o polipéptido para aumentar la forma de transferencia de colesterol o la capacidad portadora del colesterol del liposoma. Es particularmente útil la unión de las apolipoproteinas a los liposomas. La apolipoproteína Ai, apolipoproteina A2 y apolipoproteína E, o fragmentos, derivados, agonistas, análogos o péptidos miméticos de estos, por lo regular serán las apolipoproteinas más útiles para unirse a los liposomas. Véase, por ejemplo, la Patente US No. 6,037,323; 6,004,925 y 6,046,166. Estas apolipoproteinas favorecen a transferencia de colesterol y ésteres colesterílieos al hígado para el metabolismo. La lecitin-colesterol aciltransferasa también es útil para metabolizar colesterol libre a ésteres colesterílieos . Los liposomas pueden estar unidos a las moléculas de apolipoproteína Ax, apolipoproteína ?2, y lecitin-colesterol aciltransferasa, o fragmentos, derivados, agonistas, análogos o péptido mimético de estos, en forma individual o en cualquier combinación y relación molar.

En una modalidad preferida, los liposomas para el tratamiento de un paciente elaborados de acuerdo con los métodos y dispositivos de la presente invención estarán presentes en un búfer, portador o diluyente aceptable en el medio fisiológico. La concentración de los liposomas en el búfer, portador general, la concentración por lo regular alrededor de 100-300 mg/mL, y más comúnmente alrededor di 100-200 mg/mL. Los expertos en la técnica pueden modificar estas concentraciones para optimizar el tratamiento con diferentes componentes liposomales o de pacientes específicos. Por ejemplo, la concentración puede aumentar o reducir la carga líquida asociada con el tratamiento. Esto puede ser particularmente útil en pacientes que tengan falla cardiaca congestiva asociada con aterosclerosis o hipertensión grave. De otro modo, los liposomas compuestos de lípidos irritantes pueden diluirse a concentraciones bajas para aminorar la inflamación en el sitio de la administración.

EJEMPLOS 1. Extrusión de POPC al 20% a través de membranas de policarbonato de pistas grabadas, de 0.1 µ?? a 600 psi El siguiente ejemplo demuestra que un lípido difícil puede ocluir o incrustar la membrana de exclusión utilizando los métodos y dispositivos tradicionales, pero que puede emplearse convenientemente un agente de lavado.

Dos g de l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPO (Genzyme, Cambridge, MA, No. Cat. LP-04-031) se adicionaron a 8 mL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) (salina 140 mM, fosfato 20 nM, pH 7.4) en un tubo cónico de 50 mL y se agitó vigorosamente a mano durante aproximadamente 5 minutos para formar una suspensión homogénea de 200 mg/mL de MLV de POPC en PBS. Un extrusor LIPEX™ de 10 mL (Northern Lipids, Vancouver, Columbia Británica, Canadá) se adaptó con una pila de membranas dobles NUCLEPORE™ de policarbonato con pistas grabadas (PCTE) de 0.1 µp? ( hatman, Ann Arbor, MI; No. Cat. 110605) de acuerdo con las instrucciones del fabricante del extrusor y se lavó con PBS. La suspensión POPC-PBS LMV pasó a través de la pila de membranas a 600 psi. El tiempo total necesario para extruir el volumen de 10 mL fue de 17 minutos 32 segundos. Se intentó un segundo pase a través de la misma pila de membranas pero se interrumpió después de 25 minutos. En esta ocasión sólo aproximadamente 2.5 mL de la suspensión pasó a través de la pila de membranas, indicando que ésta se habla ocluido o incrustado. Este hecho se comprobó adicionando etanol al sistema y continuando la extrusión. Se adicionó etanol al 100% al depósito del extrusor para llevar la concentración final a 10% de etanol. Aproximadamente 0.8 mL de etanol al 100% se adicionó al cilindro,,. llevando su contenido a aproximadamente 10% de etanol, creando turbulencia en el cilindro durante 2 minutos. La aplicación de 600 psi al extrusor permitió continuar la extrusión, indicando que los filtros se habían ocluido o incrustado por las MLV POPC. 2. Extrusión de POPC al 20% a través de membranas PCTE PORETICS™ Y NUCLEPORE™ doble apiladas a 400 y 800 psi Este ejemplo demuestra que la extrusión de una suspensión al 20% de POPC procede con oclusión o incrustación mucho menor con membranas PORETICS™ PCTE (Osmonics, Minnetonka, MN) que con membranas PCTE NUCLEPORE™, y que la diferencia en el funcionamiento de estas dos membranas aumenta con el aumento de la presión.

Una suspensión al 20% de POPC GE ZYME™ se preparó y extruyó a través de un extrusor LIPEX™ de 10 mL como está descrito en el Ejemplo 1. En pruebas separadas, el extrusor se configuró con una pila doble de membranas PCTE PORETICS™ ó NUCLEPORE™, con un tamaño de poro promedio de 0.1 µp\ (Osmonics PORETICS™, No. Cat. K01CP02500 y Whatman NUCLEPORE™ Cat. No. 110605, I respectivamente) . En pruebas separadas, las extrusiones se realizaron a 400 u 800 psi. Como se muestra en la Figura 1, incluso a 400 psi, las membranas PCTE PORETICS™ se ocluyen o incrustan mucho menos fácilmente que las membranas PCTE NUCLEPORE™. Esta diferencia también se observa a 800 psi. 3. Extrusión de POPC al 20% a través de membranas de poliéster con pistas grabadas (PETE) Este ejemplo demuestra que un lipido puede pasar a través de una membrana de extrusión hidrófila sin incrustar u ocluir la membrana.

En pruebas separadas, 10 mL de una suspensión con 200 mg/mL de MLV de POPC en PBX (preparada como se describe en el Ejemplo 1) se extruyó a través de membranas de poliéster con pistas grabadas (PETE) PORETICS™ Nos. Cat . T04CP02500 (diámetro de poro promedio 0.4 µp?, diámetro de membrana 25 mm) , T02CP047FX (diámetro promedio de poro 0.2 µ??, diámetro de membrana 47 mm (cortada a mano) a 25 mm de diámetro) y T01CP02500 (diámetro promedio de poro 0.1 µp?, diámetro de membrana 25 mm) . Los resultados se presentan en la Tabla 1. Para cada prueba se preparó un lote nuevo de MLV de POPC. El extrusor se lavó con salina entre cada prueba . El tamaño promedio de partícula de la suspensión extruída se determinó por QELS utili zando un medidor de tamaño de partículas 380 ZLS (Nicomp, Santa Barbara, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante .

Tabla 1 Estos resultados demuestran que las membranas PETE no se ocluyen o incrustan en condiciones donde las membranas de PCTE se ocluyen o incrustan . Además , estos resultados demuestran que el tamaño de partícula resultante de la extrusión de un lípido puede reducirse aumentando la presión de la extrusión. 4. Extrusión de EPC al 20% a través de membranas PETE apiladas en 5 a presión alta y baja Este ejemplo demuestra que un lípido relativamente fácil puede extruírse a través de una membrana hidrófila.

Una solución al 20% de EPC se preparó colocando 6 g de LIPOID EPC® (Lipoid, Lud igshafen, Alemania) , una fosfatidilcolina de yema de huevo, para un total de 30 mL en solución salina (Abbot, Abbot Park, IL) en un matraz cónico de 50 mL. El matraz se agitó a mano durante aproximadamente 5 minutos hasta homogeneidad visual . Un extrusor LIPEX™ de 10 mL se preparó con una pila de 5 membranas PETE PORETICS™ de diámetro promedio de poro 0.1 µp?, diámetro de membrana 25 mm (No. Cat. T01CP02500) . En dos pruebas separadas, 10 mL de la suspensión de EPC se pasó 10 veces a través del filtro a 400 u 800 psi. El extrusor de limpió entre pruebas. Los resultados de estas pruebas se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Prueba Pase No. Presión Tiempo Tamaño prom. de (psi) (min: seg) partícula (nm) 1 1 400 1:52 n.d. 2 0:32 n.d. 3 0:27 n.d. 4 0:25 n.d. 5 0:24 181.0 ± 50.9 6 0:25 n.d. 7 0:27 n.d. 8 0:28 n.d. 9 0:30 n.d. 10 0:33 153.6 + 45.2 2 1 800 0:42 n.d. 2 0 : 17 n.d. 3 0:16 n.d. 4 0: 15 n.d. 5 0: 18 138.6 + 35.6 6 0: 18 n.d. 7 0:19 n.d. 8 0: 19 n.d. 9 0:22 n.d. 10 0:25 114.4 ± 35.8 Asi pues, la extrusión a presión alta de EPC a través de membranas de PETE aumenta las velocidades de flujo y reduce el tamaño de la partícula. 5. Extrusión de POPC al 20% a través de una membrana individual de PCTE ó PETE a 800 psi Este ejemplo demuestra que la extrusión a través de una membrana de PETE produce una velocidad de flujo mayor que la extrusión a través de una membrana de PCTE.

Una suspensión al 20% de POPC GENZY E™ se preparó y extruyó a través de un extrusor LIPEX™ de 10 mL como está descrito en el Ejemplo 1. En pruebas separadas, el extrusor se configuró con una membrana individual de PETE PORETICS™ con un tamaño de poro promedio de 0.1 µp?, o una sola membrana de PCTE PORETICS™ con un tamaño promedio de poro de 0.1 µp? (Osmonics, Nos. Cat. T01CP02500 y K01CP02500, respectivamente) . Como se muestra en la Figura 2, en estas condiciones la membrana de PCTE produjo partículas más pequeñas con menos bases que la membrana de PETE (Figura 2A) . No obstante, la extrusión a través de la membrana de PETE ocurrió con una velocidad de flujo que fue aproximadamente tres veces mayor que las velocidades de flujo obtenidas con la membrana de PCTE (Figura 2B) . 6. Extrusión de POPC al 20% a través de una pila de 5 membranas PETE a 600 psi Este ejemplo demuestra que una suspensión de un lipido difícil puede convertirse eficientemente en una suspensión de SUV por extrusión a través de una membrana hidrófila a presión moderadamente alta.

Una suspensión al 20% de POPC GENZY E™ se preparó como está descrito en el Ejemplo 1. Un extrusor LIPEX™ de 10 mL se preparó con una pila de 5 membranas de PETE PORETICS™ con un tamaño promedio de poro de 0.1 µp? (Cat. No. T01CP02500) . La suspensión de POPC se extruyó a través de las membranas en 5 pases a 600 psi. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 Prueba Presión Tiempo Tamaño prom. de (psi) (min : seg) partícula (nm) 1 600 2:37 n.d. 2 1:19 n.d. 3 1:02 n.d. 4 0:59 n.d. 5 0:55 118.1 ± 36.2 7. Extrusión de POPC a través de una pila de 2 membranas de PCTE y PETE a 400 y 800 psi Este ejemplo demuestra que las membranas de PETE ocluyen o incrustan mucho menos fácilmente que las membranas de PCTE con poros en ángulo a presión alta.

En algunos de los experimentos anteriores una parte de la suspensión lipidica extraída se perdió después de la extrusión debido al exceso de gas nitrógeno que escapaba a altas velocidades fuera de la tubería de recolección de salida al término de las extrusiones llevadas a cabo a presión alta. Este gas desprendido con frecuencia provocó que la tubería de salida se desprendiera de la base del extrusor y también provocó que algo de la solución del producto se salpicara hacia fuera del envase de recolección. Para solucionar este problema colocamos un tubo de seguridad para evitar que el tubo de recolección de salida se desprendiera de la base del extrusor. Este tubo de seguridad fue prácticamente una pieza de tubería de diámetro más grande que el tubo de recolección de salida más delgado que estaba enroscado a través de éste. El tubo de seguridad proporcionó fricción adicional al tubo de recolección de salida desde la placa base. Para más control de la solución en extrusión, se colocó un soporte anular que actuara como guia, obligando al tubo a permanecer en la orientación correcta, con lo que la suspensión extruida se recolectó adecuadamente en nuestro recipiente para recolección. Estas dos adiciones al aparato permitieron bastante control adicional sobre el tubo de recolección de salida para evitar que una buena parte del producto se perdiera .

Una suspensión al 20% de POPC GE ZYME™ se preparó como está descrito en el Ejemplo 1. En pruebas separadas, un extrusor LIPEX™ de 10 mL se preparó con una pila de 2 membranas de PETE PORETICS™ de tamaño promedio de poro 0.1 µp? (No. Cat. T01CP02500) ó de PCTE (No. Cat. K01CP02500) . Para cada una de estas instalaciones, la suspensión de POPC se extruyó a través de las membranas a 400 u 800 psi, y el volumen de la suspensión extruida que pudo ser procesado en una pase se midió como una función del tiempo. Los resultados se presentan en la Figura 3. La Figura 3A muestra que a 400 psi no hubo diferencia importante entre las membranas de PETE y la de PCTE. La Figura 3 muestra que a presión alta la configuración de las membranas de PETE puede procesar un volumen mucho mayor que la configuración con la membrana de PCTE antes de que la membrana quede ocluida o incrustada. 8. Extrusión de POPC al 20% a través de una pila de 1, 2, 5 y 10 membranas de PETE El siguiente ejemplo demuestra los efectos del número de membranas en la eficiencia para producir LUV con POPC.

Una suspensión al 20% de POPC GENZY E™ se preparó y extruyó a través de un extrusor LIPEX™ de 10 mL como está descrito en el Ejemplo 1. En pruebas separadas, el extrusor se configuró con 1, 2, 5 ó 10 membranas apiladas de PETE PORETICS™ con un tamaño promedio de poro de 0.1 um (Osmonics Poretics No. Cat . T01CP02500) . Todas las extrusiones se llevaron a cabo a una presión de 800 psi. Los resultados se muestran en la Figura 4. La Figura 4A muestra la relación entre el número de pases y el diámetro promedio de partícula de las LUV producidas. En general, hay una correlación inversa entre el número de membranas en la pila y el número de pases necesarios para producir las LUV de un diámetro promedio deseado. La Figura 4B muestra la relación entre el número de pases y la velocidad de flujo. Para cualquier número de pases determinado, la velocidad de flujo es inversamente proporcional al número de filtros en la pila. Como se muestra en la Figura 4C, el número de pases necesario para producir las LUV de diámetro promedio de 120 nm es ligeramente menor para la pila de 5 (4 pases) que para la pila con 10 (5' pases) . 5 9. Extrusión de POPC al 20% a través de una pila con 5 membranas de PETE a 400, 600 y 800 psi Este ejemplo demuestra los efectos de la presión sobre la eficiencia de producir LUV con POPC. 10 Se preparó y extruyó una suspensión al 20% de POPC GE ZYME™ a través de un extrusor LIPEX™ de 10 mL como está descrito en el Ejemplo 1. El extrusor se configuró con una pila con 5 membranas de PETE PORETICS™ con un 15 tamaño de poro promedio de 0.1 pm (Osmonics PORETICS™ No. Cat. T01CP02500) . En pruebas separadas, la extrusión se llevó a cabo a 400, 600 u 800 psi. Como se muestra en la Figura 5A, las partículas de tamaño más pequeño se obtuvieron después de 5 pases utilizando 600 u 800 psi en 20 comparación con 400 psi. La Figura 5B muestra que la velocidad de flujo para un pase determinado fue aproximadamente del doble de grande a 800 psi que a 600 psi. Y la velocidad de flujo a 600 psi fue aproximadamente el doble de grande que la velocidad de 25 flujo a 400 psi. La Figura 5C muestra que para producir -· ¦'• ^^^ fl SüSÍ '3 í · · -- "'·¦ ' f ""- "*iH i Mt¾BNHtfftlrt las LUV con un diámetro promedio de aproximadamente 120 n , se necesitan 8 pases a 400 psi, 5 pases a 600 psi y 4 pases a 800 psi. 10. Extrusión de POPC GENZYME™ a través de una pila con dos membranas de PCTE y PETE PORETICS™ y PCTE NUCLEPORE™ a 400 hasta 1500 psi Este ejemplo demuestra que el aumento de la presión de extrusión a través de una membrana de PETE provoca una disminución inesperadamente grande en la incrustación u oclusión de la membrana, y de este modo un aumento inesperadamente grande en la capacidad de procesamiento de los lipidos de la membrana, en comparación con la extrusión a través de una membrana de PCTE. Este ejemplo además demuestra que no hay limite superior aparente para este efecto.

Se preparó una suspensión al 20% de POPC como se describe antes. En pruebas separadas, un extrusor LIPEX™ de 10 mL se preparó con una pila de 2 membranas de PETE ó PCTE PORETICS™ o de PCTE NUCLEPORE™ con un tamaño de poro de 0.1 µs? (Osmonics PORETICS™ No. Cat . T01CP02500, K01CP02500 y W atman Nuclepore No. Cat. 110605, respectivamente). Para cada una de estas instalaciones, la suspensión de POPC se extruyó a través de las membranas a presiones que abarcaban desde 400 psi hasta 1500 psi. El peso de la suspensión de POPC extruida se midió como función del tiempo y se calculó la cantidad máxima de suspensión que cada membrana pudo pasar a la presión determinada. Estos cálculos se graficaron contra la presión de extrusión como se muestra en la Figura 6. Para cada tipo de membrana utilizado, la cantidad máxima de suspensión procesada antes de que la membrana quedara completamente ocluida aumentó linealmente con la creciente presión de extrusión. No hay limite superior aparente para la linealidad de este aumento. La pendiente de la gráfica de cada membrana es una medida del grado de mejoramiento para la membrana conforme aumenta la presión. Las pendientes para las gráficas de los resultados para las membranas de PETE PORETICS™, de PCTE PORETICS™ y PCTE NUCLEPORE™ son 0.051, 0.0285 y 0.015, respectivamente. 11. Extrusión de POPC al 20% a través dé una reducción de 2 membranas apiladas de PETE a presiones hasta 5000 y 8000 psi.

Este ejemplo demuestra que el uso de mayores presiones de extrusión reduce el tamaño de partícula con ái-si isatis - "T' ífif A! -¦' ¦·-] -: j- ¦*·¦- !---faim#¾ i¾ll¾iiit-MM¾-¾'i¾¾ más rapidez y, por tanto, el tamaño de partícula deseado se obtiene con menores pases de extrusión. El ejemplo es semejante al descrito en el Ejemplo 9 (Figura 5C) , excepto que en este ejemplo se utilizó un método de procesamiento de extrusión por reducción en combinación con mayores presiones de extrusión y el material se pasó a través de pilas dobles de membranas con diámetros del tamaño del poro decrecientes. Por las mayores presiones de extrusión son necesarios menos pases de extrusión para llegar al tamaño de partícula deseado y por tanto el tiempo del procesamiento general se reduce significativamente .

En pruebas separadas, se prepararon suspensiones al 20% de POPC hidratando el POPC en solución salina amortiguada con fosfatos. Las soluciones resultantes luego se pasaron como pases diminutos a través de membranas de extrusión a presiones de extrusión de hasta 5000 u 8000 psi. El primer pase de extrusión fue a través de una pila de dos membranas de PETE PORETICS™ de 0.4 µp\, el segundo pase fue a través de una pila con 2 membranas de PETE PORETICS™ de 0.2 µp?, y los pases restantes fueron a través de 2 membranas de PETE PORETICS™ de 0.1 µp? apiladas. Las mediciones del tamaño de partícula se realizaron después de cada pase de extrusión. Los datos de la Tabla 4 muestran que el número de pases necesario para obtener un diámetro promedio del tamaño de partícula de menos que 140 nm se reduce por las presiones mayores.

Tabla 4 12. Extrusión de POPC al 20% a través de 2 membranas ANOPORE™ de Whatman, apiladas, a presiones de hasta 1500 psi Este ejemplo demuestra que el uso de mayores presiones de extrusión aumenta el volumen de extrusión y reduce la oclusión o incrustación. En este ejemplo se preparó una suspensión al 20% de POPC y se extruyó a través de una pila de 2 membranas inorgánicas de óxido de aluminio ANOPORE™ de W atman a diferentes presiones. Un volumen más grande de material pudo fluir a través de las membranas a presión mayor.

Tabla 5 Se han descrito algunas modalidades de la invención. Las descripciones y ejemplos están destinados para ser ilustrativos de la invención y no limitantes. En realidad, será evidente para los expertos en la técnica que pueden hacerse modificaciones a las diferentes modalidades de la invención descritas sin apartarse del espíritu de la invención o el alcance de las reivindicaciones anexas establecidas más adelante.

Todas las referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en sus enterezas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para producir una suspensión de vesículas que consiste en extruir una mezcla que contiene un lípido a través de una membrana tamiz hidrófiia a presión alta. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la suspensión de vesículas es una suspensión de liposomas. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla consiste en una suspensión de vesículas unilamelares . El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla es una emulsión. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla contiene una pluralidad de lípidos El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófiia tiene un ángulo de contacto con el agua de alrededor de 70 grados o menos . El método de la reivindicación 6, caracterizado porque la membrana tamiz tiene un ángulo de contacto con el agua de alrededor de 50 grados o menos. El método de la reivindicación 6, caracterizado porque la membrana tamiz tiene un ángulo de contacto con el agua de alrededor de 40 grados o menos. 9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila contiene al menos un material seleccionado del grupo que consiste en poliéster, óxido de aluminio, acetato de celulosa, éster mixto de celulosa, vidrio, poliétersulfona, polivinil pirrolidina y polisulfona. 10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila es una membrana de poliéster. 11. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila es una membrana con pistas grabadas. 12. método de la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila omprende recubrimiento . El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el recubrimiento es un recubrimiento hidrófilo . El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el recubrimiento es un recubrimiento hidrófobo . El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio de entre 50 nm y 400 nm. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio de entre 50 nm y 150 nm. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio de entre 100 nm y 150 nm. 18. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 169 ± 37 nm. método ce la reivindicación 1, caracterizado rque las vesículas tienen un diámetro promedio en intervalo de aproximadamente 158 ± 39.5 nm. método de la reivindicación 1, caracterizado rque las vesículas tienen un diámetro promedio en intervalo de aproximadamente 136 ± 42 nm. método de la reivindicación 1, caracterizado rque las vesículas tienen un diámetro promedio en intervalo de aproximadamente 153.6 ± 45.2 nm. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 138.6 ± 35.6 nm. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 114.4 ± 35.8 nm. 24. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 118.1 ± 36.2 nm. 25. El método de la ¾eivindicación 1, caracterizado porque el lipido tiene una temperatura de transición a o por debajo de la temperatura ambiente. 26. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el lipido tiene una temperatura de transición por encima de la temperatura ambiente. 27. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el lipido consiste en una cadena acilo rígida . 28. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque la cadena acilo rígida es una cadena acilo monoinsaturada . 29. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla contiene impurezas o contaminantes. 30. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el lipido es un lipido asociado con un medicamento . 31. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el lipido es un lipido con carga. 32. El método ce la reivindicación 1, caracterizado porque el lípido está asociado con una proteina. 33. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el lipido se selecciona del grupo que consiste en: l-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina, di-palmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilglicerol di-estearoil-fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina de yema de huevo, di-oleoil-fosfatidilcolina, di-lauroilfosfatidilcolina, di-lauroilfosfatidilglicerol, oleoil-palmitoilfosfatidilcolina, fosfolipidos ligados a glucolipidos , fosfatidilcolina , fosfatidilglicerol , lecitina, á , a-dipalmitoil-á-lecitina , esfingomielina , fosfatidilserina, ácido fosfatidico, cloruro de N-(2,'3-di (9- (Z) -octadeceniloxi) ) -prop-l-il-N , N , N-trimetilamonio, fosfatidiletanolamina, lisolecitiná, lisofosfatidiletanolamina , fosfatidilinositol, cefalina, cardiolipina , cerebrósidos , dicetilfosfato, di-oleoil-fosfatidilglicerol, di-oleoil-fosfatidilcolina , palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina, di-estearoil-fosfatidilcolina, estearoil-palmitoil-fosfatidilcolina, di-palmitoil-fosfatidiletanolamina , di-estearoil-fosfatidiletanolamina, di-miristoil-fosfatidilserina, di-oleil-fosfatidilcolina . 34. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque el lipido es fosfatidilcolina o esfingomielina 35. El método ce la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila tiene un diámetro promedio de poro de aproximadamente 0.4 .m o menor. 36. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila tiene un diámetro promedio de poro de aproximadamente 0.2 .m o menor. 37. El método de la reivindicación 36, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila tiene un diámetro promedio de poro de aproximadamente 0.1 .m o menor. 38. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la extrusión se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 400 psi o mayor. 39. El método de la reivindicación 38, caracterizado porque la extrusión se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 800 psi o mayor. 40. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque la extrusión se lleva a cabo a una presión aproximadamente 1500 psi o mayor. El método de la reivindicación 40, caracterizado porque la extrusión se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 5000 psi o mayor. El método de la reivindicación 41, caracterizado porque la extrusión se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 8000 psi o mayor. El método de la reivindicación 42, caracterizado porque la suspensión acuosa de lipidos se extruye a través de una pluralidad de membranas apiladas. El método de la reivindicación 43, caracterizado porque cada membrana apilada tiene el mismo diámetro promedio de poro. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque al menos una membrana apilada tiene un diámetro promedio de poro diferente del diámetro promedio de poro de al menos otra membrana apilada. método de la reivindicación 45, caracterizado porque las membranas apiladas se ordenana de modo que la mezcla sea extruida a través de las membranas de tamaño promedio de poro progresivamente más pequeño . El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la extrusión se lleva a cabo a temperatura controlada 48. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque la temperatura controlada es la temperatura aproximadamente constante. El método de la reivindicación 48, caracterizado porque la temperatura aproximadamente constante es alrededor de la temperatura ambiente. El método de la reivindicación 49, caracterizado porque la temperatura aproximadamente constante es entre aproximadamente 20°C a alrededor de 30°C. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque la temperatura aproximadamente constante es alrededor de 20°C. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla se extruye a través de la membrana hidrófila a una velocidad de flujo entre aproximadamente 0.0001 y aproximadamente 40 mL/min/mm2. El método ce la reivindicación 1, caracterizado porque las vesículas contienen una sustancia farmacéutica activa. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la extrusión consta de múltiples pases. El método de la reivindicación 54, caracterizado porque la extrusión consiste en extrusión por reducción . El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla se extruye a través de la membrana tamiz hidrófila en forma alterna en las direcciones hacia delante y hacia atrás. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila tiene una 5 densidad de poros mayor que aproximadamente 8x10 poros/cm' El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila tiene un espesor entre aproximadamente 3 y aproximadamente 50 .m Un dispositivo para extruir una suspensión acuosa de lipidos a presión alta que contiene una membrana tamiz hidrófila y medios para la entrada y salida de liquido a presión alta. 60. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana tamiz hidrófila se enjuaga con un agente de lavado antes de la extrusión. El método de la reivindicación 60, caracterizado porque el agente de lavado quita de los poros de la membrana el material ocluido o incrustado. El método de la reivindicación 60, caracterizado porque el agente de lavado previene los poros de la membrana contra material ocluido o incrustado El método de la reivindicación 61 ó 62, caracterizado porque el agente de lavado consiste en etanol . Un método para producir liposomas que consiste en extruir una mezcla que contiene un lipido a través de una membrana hidrófila a presiones mayores que aproximadamente 8000 psi. 65. El método de la reivindicación 64, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio entre 50 nm y 400 nm. 66. El método de la reivindicación 65, caracterizado porque los liposomas tienen un diámetro promedio entre 50 nm y 150 nm. El método de la reivindicación 65, caracterizado porque los liposomas tienen un diámetro promedio entre 100 nm y 150 nm. método de la reivindicación 64, caracterizado rque las vesículas tienen un diámetro promedio en intervalo de aproximadamente 169 ± 37 nm. 69. El método de la reivindicación 64, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 158 ± 39.5 nm. 70. El método de la reivindicación 64, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 136 + 42 nm. método de la reivindicación 64, caracterizado rque las vesículas tienen un diámetro promedio en intervalo de aproximadamente 153.6 ± 45.2 nm. método de la reivindicación 64, caracterizado rque las vesículas tienen un diámetro promedio en intervalo de aproximadamente 138.6 ± 35.-6 nm. 73. El método de la reivindicación 64, caracterizado porque las vesículas tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 114.4 ± 35.8 nm. 74. método de la reivindicación 64, caracterizado rque las vesículas tienen un diámetro promedio en intervalo de aproximadamente 118.1 + 36.2 nm.