DE2013644A1

DE2013644A1 - Triglyceride and cholesterol determination in blood serum

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Publication number: DE2013644A1
Application number: DE19702013644
Authority: DE
Inventors: auf Nichtnennung M GOIn 33 16 Antrag
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1970-03-21
Filing date: 1970-03-21
Publication date: 1971-10-14
Also published as: DE2013644B2

Abstract

beta-Lipoproteins dissolved in blood serum are precipitated with dextran sulphate with formation of an at least temporarily stable suspension of even particle size, and the turbidity of the solvent caused by pptn is opt. measured. Pref. reagent is dextran sulphate of >=200,000 (>=1,000,000) mol.wt., nd pref. its S content is 15-20 (17%). Pref. reagent also contains a fungicide, more pref. NaN3 (to raise stability). Preferred reagent compsn contains on 100 ml of a 0.5 molar aqs. CaCl2 soln 0.5g dextran sulphate and 0.1g NaN3. This reagent can be used with blood serum in 1:1 ratio. It is pref. mixed with 50 times isotonic NaCl soln as diluent.

Description

Verfahren und Reagens zur ß-Lipoproteinbestimmung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der ß-Lipoproteine im Blutserum durch Ausfällen der gelösten Lipoproteine mit einem makromolekularen Fällungsmittel. Method and reagent for β-lipoprotein determination The invention relates to a method for determining the ß-lipoproteins in blood serum by precipitating the dissolved lipoproteins with a macromolecular precipitant.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Reagens für diese Lipoproteinbestimmung.The invention further relates to a reagent for this lipoprotein determination.

Voraussetzung einer rechtzeitigen Behandlung bei pathologisch erhöhten Cholesterin- und Triglyceridwerten im Blutserum ist deren frühzeitige Erkennung. Sie ist praktisch nur dann gewährleistet, wenn sie mit einer Methode durchgeführt werden an, die so einfach und wenig aufwendig ist daß sie routinemäßig auch im kleinen Labor" praktisch tätiger Ärzte ausführbar ist. Da sich alls chemisch-analytischen Verfahren hlerzu nicht eignen, soll nun eine Reaktion und eine Methode entwickelt und standardisiert werden, mit der es gelingt, auf einfache photometrische Weise die Transportform von Cholesterin und Triglyceriden im Serum quantita tiv zu bestimmen.Prerequisite for timely treatment in the case of pathologically increased Cholesterol and triglyceride levels in the blood serum are their early detection. It is practically only guaranteed if it is carried out with a method that is so simple and inexpensive that it can also be routinely implemented on a small scale Laboratory "practically active doctors can be carried out. Since everything is chemical-analytical Processes not suitable for this purpose, a reaction and a method are now to be developed and be standardized with it succeeds in simple photometric Way the transport form of cholesterol and triglycerides in the serum quantita tively to determine.

Sowohl bei normaler als auch erhöhter Konzentration sind die Lipide (Cholersterin, Triglyceride, Phosphatide) im Blutserum in Form von Lipoproteinen durch Vermittlung bestimmter Proteine gelöst.Both at normal and increased concentration are the lipids (Cholesterol, triglycerides, phosphatides) in the blood serum in the form of lipoproteins solved by mediating certain proteins.

In diagnostischer Hinsicht interessieren von den verschiedenen Lipoproteinen im Serum nur die sogenannten ß-Lipoproteine (=ß + prä-ß-Lipoproteine), deren Konzentration sowohl bei erhöhtem Cholesterin- als erhöhtem Triglyceridgehalt ansteigt. Ihre Menge läßt sich auf verschiedene Weise, wie durch Ultrazentrifugieren, Lipidelektrophorese, Immunpräzipitation und durch selektive Präzipitatlon mit makromclekularen Fällungsmitteln feststellen. Die erstgenannten drei Methoden sind als Suchreaktion für die Praxis zu aufwendig. Demgegenüber sind die Verfahren. bei denen die ß-Lipoproteine mit hochmolekularen Molekülen, die eine selektive Affinität zu den ß-Lipoproteinen haben, gefällt werden, relativ einfach und ohne großen technischen Aufwand durchfUhrhar. Sie unterscheiden sich im sesentlichen nur durch die zur Präzipitation der ß-,.ipoproteine verwendete makromolekulare Verbindung und die Art der quantitativen Bestimmung des Präzipitats.From a diagnostic point of view, we are interested in the various lipoproteins in the serum only the so-called ß-lipoproteins (= ß + pre-ß-lipoproteins), their concentration increases with both increased cholesterol and increased triglyceride content. Your crowd can be done in various ways, such as by ultracentrifugation, lipid electrophoresis, Immunoprecipitation and selective precipitation with macromolecular precipitants determine. The former three methods are as a search response for practice too expensive. In contrast, the procedures. in which the ß-lipoproteins with high molecular weight molecules that have a selective affinity for the ß-lipoproteins, can be carried out relatively easily and without great technical effort. They differ essentially only in that they are used to precipitate the β and ipoproteins macromolecular compound used and the method of quantitative determination of the Precipitate.

In der Regel wird als Fällungsreagens Heparin - ein sulfuriertes Polysaccharid - verwandt. Hierbei entstehen bei Anwesenheit von Ca-Ionen zwar Präzipitate, die ausschließlich aus ß-Lipoproteinen bestehen, die aber je nach dem darin enthaltenen Lipidgehalt mehr oder weniger rasch zu verzchieden großen flockigen Gebilden fUhren, die keine konzentrationsbestimmung durch physikalische Methoden, wie Messung der dabei entstehenden Trübung, ermöglichen.As a rule, heparin - a sulfurized polysaccharide - is used as the precipitating reagent - related. In the presence of Ca ions, precipitates arise that consist exclusively of ß-lipoproteins, but depending on what they contain Lipid content lead more or less quickly to different large flaky structures, which do not determine the concentration by physical methods, such as Measurement the resulting cloudiness.

Es ist bei Verwendung von Heparin als Fällungsreagens deshalb erforderlich, das Präzipitat durch Zentrifugitren zu sedimentieren, im Sediment den Cholesteringehalt zu bestimmen und aus dessen Konzentration über einen Umrechnungsfaktor (2,63) die ß-lipoproteine zu errechnen. Da aber der Cholesteringehalt des Präzipitates je nach Zusammensetzung der ß-Lipoproteine stark schwankt, ist der Faktor nur dann exakt verwendbar, wenn die Menge von ßzu prä-ß-Lipoproteinen in etwa der Norm entspricht, d.h.When using heparin as a precipitation reagent, it is therefore necessary to to sediment the precipitate by centrifugation, the cholesterol content in the sediment to be determined and from its concentration via a conversion factor (2.63) the to calculate ß-lipoproteins. But since the cholesterol content of the precipitate depends on If the composition of the ß-lipoproteins fluctuates strongly, the factor is only exact can be used if the amount of ß to pre-ß-lipoproteins roughly corresponds to the norm, i.e.

das Verhältnis 1 2 beträgt, Um die chemische Cholesterinbestimmung jin Sediment zu umgehen und die zusätzliche Fehlermöglichkeit bei der Umrechnung zu meiden, wird erfindungsgemäß ein Fällungsreagens für Lipoproteine geschaffen, das eine für egne bestimmte Zeit stabile Suspenw sion von annähernd gleicher Partikelgröße entstehen läßt, wobei der Brechungsexponent der Partikel möglichst stark von dem es Lösungsmittels differiert. An der Suspension wird ann eine photometrische Messung der entstandenen Trübung, vorzugsweise im durchfallenden Licht, d.h. ohne zusätzliche Streulichtmeßvorrichtung, vorgenommen.the ratio is 1 2, To the chemical determination of cholesterol jin sediment and the additional possibility of errors in the conversion to avoid, a precipitation reagent for lipoproteins is created according to the invention, the suspension of approximately the same particle size, which is stable for a certain period of time can arise, the refraction exponent of the particles as much as possible from that it differs solvent. A photometric measurement is then carried out on the suspension the resulting cloudiness, preferably in transmitted light, i.e. without additional Scattered light measuring device made.

Als Fällung@mittel ür eine derartige Bestimmungsweise eignet sich hochmolekulares Dextransulfat besonders gut.A suitable precipitation agent for such a method of determination is high molecular weight dextran sulfate is particularly good.

Das Dextransulfat hat ein Molekulargewicht von über 200 000, vorzugsweise mindestens ca 1 000 0000 Hierdurch wird eine weitgehende Stabilisierung der aus gefällten Partikel ermöglicht. Der Schwefelgehalt des Dextransulfats liegt vorteilhafterweise zwischen ca. 15 und 20, insbesondere bei etwa 17 Prozent. Es sollte auf einen niedrigen Gehalt an freiem SO4 geachtet werden d.h. er sollte unter etwa 0,5% liegen.The dextran sulfate has a molecular weight in excess of 200,000, preferably at least approx. 1 000 0000 This will largely stabilize the out allows precipitated particles. The sulfur content of the dextran sulfate is advantageously between about 15 and 20, especially about 17 percent. It should be on a low The content of free SO4 should be observed, i.e. it should be below about 0.5%.

Das Reagens enthält das Dextransulfat in wässriger Lösung.The reagent contains the dextran sulfate in aqueous solution.

Um die Haltbarkeit einer solchen Lösung zu erhdhen, enthält. diese vorteilhafterweise eine geringe Menge eines Fungizids. Natriumazid eignet sich als zusätzlicher Bestandteil für das Reagens. Weiterhin enthält das Reagens noch Calciuiionen in geeigneter Konzentration.To increase the shelf life of such a solution, contains. these advantageously a small amount of a fungicide. Sodium azide is useful as additional component for the reagent. The reagent also contains calcium ions in a suitable concentration.

Ein Reagens mit besonders guten Eigenschaften und guter Spezifität, das sich zudem in haltbarer Lösung herstellen läßt, enthält auf 100 ml einer 0,5 molaren wässrigen Calciumchlorid-Lösung ca. 0.5g Dextransulfat und ca. 0,1g Natriumazid. Ein solches Reagens kann im Verhältnis 1 : 1 mit Blutserum verwendet werden, wobei noch zusätzlich ein Verdünnung@mittel verwendet wird. So kann die zu verwendende Menge des Reagens vor dem Vermischen mit dem Serum mit ungefähr der fünfzigfachen Menge einer im wesentlichen isotonischen Kochs@lzlösung vermengt werden.A reagent with particularly good properties and good specificity, which can also be prepared in a durable solution, contains a 0.5 per 100 ml molar aqueous calcium chloride solution approx. 0.5g dextran sulfate and approx.0.1g sodium azide. Such a reagent can be used in a 1: 1 ratio with blood serum, whereby a thinner @ medium is also used. So can the to use Approximately fifty fold amount of reagent before mixing with serum Amount of an essentially isotonic saline solution are mixed.

Beispiel a) Reagens: Dextransulfat mit einem Molekul@rgewicht 2 x 106 und einem Schwefelgehalt von 17% mit weniger als 0,5S freier S04, in 1% wässriger Lösung wird mit gleichen Teilen einer 1 M CaCl2-Lösung gem@scht. Auf 100 ml dieser Mischung werden 0.1g Natriumazid (NaN3). zugesetzt. Example a) Reagent: dextran sulfate with a molecular weight of 2 × 106 and a sulfur content of 17% with less than 0.5S free SO4, in 1% aqueous The solution is mixed with equal parts of a 1 M CaCl2 solution. On 100 ml of this Mix 0.1g sodium azide (NaN3). added.

b) Ausführung der ß-Lipoproteinbestimmung: In ein Reagensglas werden eingefüllt: 0,1 ml Serum + 4,5 ml 0,9% NaCl-Lösung + 0,1 ml Reagens.b) Carrying out the ß-lipoprotein determination: Place in a test tube filled in: 0.1 ml serum + 4.5 ml 0.9% NaCl solution + 0.1 ml reagent.

Danach wird durchgemischt und nach 30 Minuten Stehen bei Zimmertemperatur die Extinktion im durchfallenden Licht, bei 10mm Schichtdicke und einem Filter mit Schwerpunkt bei 470nm gegen Wasser, abgelesen. It is then mixed thoroughly and after standing for 30 minutes at room temperature the extinction in transmitted light, with a 10mm layer thickness and a filter Center of gravity at 470nm against water, read.

Berechnungs Extinktion x 900 + 100 - mg% ß-Lipoproteine. Calculation absorbance x 900 + 100 - mg% ß-lipoproteins.

Eine weitere Vereinfachung, vor allem für kleinere Labors, läßt sich dadurch erreichen, daß in Sml Flaschen bereits das mit 0,9% NaCl-Lösung verdünnte Reagens abgefüllt geliefert wird0 Es genügt in diesem Falle, den Verschluß der Flasche zu beseitigen und 0,1ml des zu untersuchenden Serums dem fertigen Reagensgemisch zuzusetzen und ebenso, wie vorher beschrieben, do Extinktion der entstehenden Trübung nach 3Q Minuten abzulesen etcAnother simplification, especially for smaller laboratories, can be achieve that in Sml bottles already that with 0.9% NaCl solution diluted reagent is delivered in a bottle from the bottle and add 0.1 ml of the serum to be tested to the finished reagent mixture add and also, as previously described, do the extinction of the resulting turbidity read after 3Q minutes etc

Claims

Claims C3 method for determining the ß-lipoproteins in blood serum by precipitating the dissolved lipoproteins with a macromolecular precipitant, characterized in that the lipoproteins are formed with the help of dextran sulfate an at least temporarily stable suspension of essentially the same Particle size are precipitated and the cloudiness of the solvent caused by the precipitation is measured optically.

2. reagent for performing the method according to claim 1 with a Content of a sulfurized polysaccharide and a suitable amount of calcium ions, characterized in that the polysaccharide is dextran sulfate.

3. Reagent according to claim 2, characterized in that the dextran sulfate has a molecular weight of at least 200,000, preferably at least 1,000,000.

4. Reagent according to claim 2 or 3, characterized in that the The sulfur content of the dextran sulfate is between approx.

15 and 20%, preferably about 17X.

5. Reagent according to one of claims 2 to 4, characterized by an additional content of a fungicide.

6. Reagent according to one of claims 2 to 5, characterized by an additional level of sodium azide.

7. reagent according to one of claims 2 to 6, containing ».r 100 ml an approx. 0.5 molar aqueous calcium chloride solution approx. 0.5 g of dextran sulfate and approx. 0.1g sodium - @@ ld.

8. The reagent of claim 7 mixed at about fifty times Amount of a substantially isotonic saline solution.