JPH021499A - 核酸又は核酸フラグメントを固相で酵素的に又は化学的及び酵素的に反応させるための担体及び核酸の固相合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、核酸又は核酸フラグメントを固相で酵素的に
又は化学的及び酵素的に反応させるための不溶性ポリマ
ー担体に有する。

従来の技術 一般に、目的の核酸合成に当り、核酸フラグメン）、に
！ＩＪち核酸全体の断片、オリゴマーもしくは単加俸會
化学的反応及び酵素的反応の組合せにより相互に連結す
る。例えは、デオキシリボ＠Ｍ　（ＤＮＡ　）　２“合
成するために連鎖長約１５〜６０単位のオリゴデオキ７
リボヌクレオチドフラグメント會化学的に合成しかつこ
れら全５′−末端でホスホリル化後混もしかつＤＮＡ　
ＩＪガーセ゛による酵素触媒反応において二本Ｉａ核酸
に連結し、その際に各フラグメントの正しい配置は雑へ
形成に基づく相対するワトソン・クリック塩基対にニジ
、従って少なくとも部分的にフラグメントのオーバーラ
ツプにより達成される。

化学的に合成されたか又は酵素触媒反応において得らｇ
たオリコ９リボヌクレオチドを相応してＲＮＡ　リガー
ゼにエフ結合してリボ核酸（ＲＮＡ　）を形成すること
ができる。同様にして、ＤＮＡフラグメントもＲＮＡフ
ラグメントも含有する核酸も一本鎖として得られる。

以下核酸とは、ｂｊ能なすべての釉類及び形状のａ酸で
ある。デオキンリボ核酸並ひにリボ核酸、かつまたデオ
キシリボ核酸の率シ：体及びリボ核酸の単量体から成る
混合ポリヌクレオチドであってよい。更に、核酸は一本
鎖とじて又は二本鎖として存在してよい。

核酸の部分又はフラグメントはヌクレオ７ド又はヌクレ
オチドのＬうな単量体、また単ｍ・体単位２〜１００個
からのオリゴマーでめってよく、数百個の単量体単位含
有する丈に大きな重合体も可能である。

核酸フラグメントの酵素触媒反応による結合に関しては
、フラグメントの１つが重合体の不溶性担体に結合して
いると有利であることが明らかとなった。フラグメント
の１つがセルロースに結合している、ＤＮＡリガーゼに
よるＤＮＡフラグメントの結合についてコツツアレリ（
Ｃ０ＺＺａｒｅｌｌｊ　）及びその他が報告した〔Ｂ１
０−ｃｈｅｍ、　Ｂｊｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ
ｍ、　　、　２８巻、５７８〜５８６　ｖ邊　（１９６
７年〕　〕　。

セルロース粒子に結合しているデオキシリボチミジンの
オリゴマー’！ｌｌ−ＤＮＡポリメラーゼのプライマー
及び鋳型として使用することか記載されている（　Ｔ、
　Ｍ、　Ｊｏｖｉｎ及びＡ、　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ共著−
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　、　２４３巻、２５
０〜２５９′目（１９６８年ン〕。

セルロースに共有結合したオリゴデオキシリボヌクレオ
チドｔターミナルデオキンリボヌクレオチシルート２／
スフエラーゼにより連鎖伸長することについて報告され
ている（　Ｕ、　Ｂｅｒ−ｔａｚｚｏｎｉ及びその他共
著、　”　Ｂｊｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｖｓ。

Ａｃｔａ　　＋　２４０巻、５１５〜５２１頁（１９７
１年）〕。

Ａｓ　／＜ネト（Ｐａｎｅｔ　）及びＨ，（）、コシナ
（Ｋｈｏｒａｎａ　）はポリデオキシリボチミジンをセ
ルロースに結合しかつこの担体結合核酸ヲリガーゼに工
９他のＤＮＡフラグメントで伸長した。

この工うに生地したセルロース結合ポリヌクレオチド及
び短いプライマーで、ＤＮＡポリメラーゼ勿用いてポリ
ヌクレオチドの一部ケ複製した〔’　Ｊ、　Ｅｊｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　　、　２４９巻、５２１３〜５２２１自
（１９７４年ン〕。

と９わけ、固定化し一７Ｃ核酸フラグメントヲ酵素によ
る核酸＠地並ひに全く一般的にその酵素反応に使用する
ことによる利点’ｒＪ−１ｉ！’ｉ定化した反応生成物
が反応に必女な他の物質及び反応の間に生地した他の物
質から藺単に分陰される点に認めらｎる。Ｆ９ｒ望の反
応生成物を年比するためのこの簡単なＴ＝Ｊ能性に基つ
いて、酵素及び／又は固定化されない丞負を過剰倉で使
用することにより、固定化反応生成物２例えは連鎖伸長
されｆＣ生底物のエフ烏い収ぷへの平衡移動が達成され
、その除に引続いて行なう精製はそれによって者しく困
難になることはない。

膨潤性の不溶性ポリサツカリドのようなゲルは固定化さ
れた核酸又は核酸フラグメントの酵素触媒反応に好適な
担体であるが、このような材料は核酸を化学的方法で重
合体の不溶性担体で−８−成あるいは変化させるには全
く好適ではないＯ 例えは、一般にヌクレオシド又はヌクレオチドの工つな
相応する単量体から出発する核酸の作字的合成では、通
常、基本的には伸長化すべき核酸部分の活性化、場合に
よる生成物の単離。

新しいヌクレオシド又はヌクレオチドの添加及び縮合及
び生成物の単離という工程より取るサイクルを循環させ
る。

核酸合成のそのような化学的方法の一部あるいは先金自
動化は１相法の尋人により達成された。その際に、伸長
すべき核酸フラグメントは不溶性担体に固定されている
。１成長する”核酸部分の画定化によシ、その都度固相
を単に洗浄することによシ所望の反応生成物を精製する
ことができる。’ｃ＋Ｊ溶性の反ＬＥ、成分子（支）相
と接触させかつ反応の終結後に洗浄して除去する。

短いＤＮＡＮラフメントを化学的に合成するための固相
として枚葉紙の形（ディスク“ｄｊ　ｓｋｓ“）のセル
ロースを使用することが記載されている（　Ｒ，Ｆｒａ
ｎｋ及びその他共著、″’　Ｎｕｃｌ、　ＡｃｊｄｓＲ
ｅｓ、＋１１巻、４３６５〜４３７７自（１９８３年）
〕。しかし紙、セルロース及び一般にすべてのポリサツ
カリドは、合成サイクルが妨害されない１うに核酸又は
核酸フラグメントの固定に会費ではないすべての反応、
８：基。

例えはヒドロキフル基＊ｍ断しなけれはならないという
基本的な欠点に有する。担持材料として使われるポリサ
ツカリドの、ヌクレオチドアンカーとして会費ではない
すべての反応、性基の完全な遮断は不可能であり、反応
サイクル會なん回も繰り返す際に例えば屯裂形底により
そのような固体の膨潤性担体の巨視的搗造がしはしは変
化し、それ故初めは到達しかたい反応性基も反より＆分
にとって接近し易くなりかつ反応の経過を妨害したシあ
るーは副反応を惹起し得るのでなおさらのことである。

特に核酸のイビ学合欣に担持材料として紙を使用する場
合には故多くの誤まった配列が生じ得る。丈に、長時間
の薬剤の負荷で紙が何つ不十分な機械的安定性が機械的
な合成において国難をもたらし、それ故従来は塩基２０
〜２５個より多くの配列は缶底されなかった。

膨潤性（は体では反応性媒体に応じて材料の膨潤もしく
は縮イヒにエフ者しく長い洗浄時間及び反応−時間が生
じ得る。丈に、拡散性の問題も起り得る。これらの欠点
のために、通常は非膨潤性担体を作字反応に、待に核酸
又は核酸フラグメントの合成に使用する。このための常
用の材料はシリカゲルである。シリカゲルは核酸の化学
的＠賊にしはしは使われる不溶性担体である。

この材料は独々の孔径の広範な分布と不規則な孔栴造’
（＋−有する。

化学的かつま７′ｃ＃素的反応工程の適用下に二本鎖Ｄ
ＮＡ勿台戟するために、孔径１０ＣＩ０１のシリカゲル
である７ラクトクル（Ｆｒａｃｔｏｓｉｌ］１０００Ｒ
と、デキストラン直鎖をＮ、Ｎ’　−メチレン−ビス（
アクリルアミド）で三元架橋することにエリ得られる親
水性のｒル形成性の、即ち膨潤性材料であるセファクリ
ル（８ｅｐｈａ−ｃｒｙｌ）　−５０ＯＲとが、担持材
料としてのその適性に１殉して比較された［　Ｚ、　Ｈ
ｏｓｔｏｍｓｋｙ及びに　ｓｍｒｔ共者、　”　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ＲｅｓｅａｒｃｈＳｙｍｐ、　
８ｅｒ、　　＃　１８巻、２４１〜２４４良（１９８７
年〕〕。その際に、非膨潤性シリカゲルがｒル形成性担
体に比べて酵素反応、連結もしくは最終ａｐＨの担付胴
科から遊離を部分的に又は完全に阻害することが餡めら
ｎた〇それ故、不溶性のポリマー担持材料で核酸又は核
酸フラグメントを反応させるための化学的方法及び酵素
的方法を組合せて適用するための担持材料に対して、化
学的反応に当っては膨潤性担体の欠点ｔ１ｇｌ避しかつ
有利に酵素反応に使用することのできるという資求が依
然として今日もなお存在する。

発明が解決しようとする腺租 不発明の線順は、前記の嶽件全すべて？Ｍ７′Ｃす、核
酸又はａ酸フラグメントを固相で＃素的に又は化学的及
び酵素的に反応させるのに好適な担体を開示することで
あった。

課Ｎ？解決するための手段 この課題は、本発明によジ待粁訪求の範囲に記載の発明
により解決される。

核酸又は硫酸フラグメントの化学的及び酵素的反応のた
めの本発明による担体は、場合により核酸化学で常用の
保護基含有する核酸又は核酸の部分が固定さｎている、
不治性で非膨潤性又はほぼ非膨潤性の多孔性重合体より
成９、その際に油９合体の孔は一定範囲の規定された大
きさ’ｋＮする。孔は、一方では酵素が固定された反応
すべき核酸又は核酸フラグメントに殆んど妨害されずに
到達するぐらい大きくなければならす、また他方ではで
きるたけ小さな担持材料でできるたり多くの核酸分子ｔ
−質換し得るように、担体が多数の反応位置全供給する
大きな表面積を有するぐらい孔は小さくなけれはならな
いＯこの点で１一定の大きさ１４００〜１００００ｘの
孔七有する担体が優れていることが明らかになった。孔
がほぼ一定の大きさ２０００〜５０００Ｘ、特に２５０
０又エク大きく５０００スまでである重合体が優れてお
り、その際に”規定された”大きさの最大誤差は記載の
数値の±１０％でるる。

これらの孔径条件を満たしかつその組成によって、核酸
の化学的及び＃素的反応に必要な薬剤に対して耐性であ
るような重合体が手や又に自動的に笑施することのでき
る、例えは核酸の合成のエラな化学的かつ１だ酵素的反
応に極めて好適であることが明らかになり予想外であっ
た。特に担体重合体が、酵素反応の媒体としての水溶液
２％に緩衝溶液上中空から排除しない材料であると、リ
ガーゼによる連結又は例えは制限酵素による核酸又は核
酸フラグメントの切断のような酵素反応が迅速かつ完全
に進行する。

優れｆｃ担体重合体として、無機材料９％に主に珪素原
子及び酸素原子より成るものを使用する。

ａ峨又はａｒ４１１．フラグメントの化学的反応及び特
に酵素的反応には制御された孔径約６０００スのガラス
が特に好適であることが明らかになった・ ポリマー担持材料の種類が、核酸又は核酸フラグメント
ラ変換するための化学的方法と酵素的方法とを組合せて
通用する際の本発明による担体の有利な使用可能性にと
って決定的である。

例えは、核酸連鎖の化学的合成の終結後にこの核酸上便
用した同相から分離しかつ酵素的連鎖伸長のために他の
担持材料を選択する必要かない。損失の多い分離反応及
び結合反応を本発明による担体を用いて回避することが
できる。酵素的反応には本発明による担体が特に好適で
ある。

核酸又は核酸フラグメントを様々の方法で担持材料に固
定させることかでさる。しかしながら、担体が核酸の固
相合成に当って、不治性で非膨尚性の多孔性ｌＬ付体に
共有結合している、場合によっては核酸化学で常用の保
護基を有する核酸フラグメントを含有する場合は特に有
利である。その際に、核酸の化学的合成のために、公知
のようにたいていの場合相応する核酸の保護されていて
もよい単蓋体から出発するが、オリゴマー會使用するこ
ともできる。酵素的反応では、しはしは比較的大きな少
酸フラグメントがポリマー担持材料に結合している。し
かし小さな核酸フラグメントのＭ素的反応もしばしは全
く同様に可能でるることは当然である。

優扛た実施堰の本発明による担体では核酸フラグメント
はスペーサー忙介してｌ＋ｉ体に結合している。スペー
サーとしては多数の物質が挙けられ、当業者が該当する
反応に応じて選択することができる。轡に、その選択の
ための視点は、化学的反応かつ”また酵素的反応のその
都度選択された反応条件に対する安定性でめる。化学的
核酸合成法のうち今日最も多く使われるホスファイト法
に関しては、場合によりｖ；、酸化学で常用の保護基を
有する反応させるべき核酸又は核酸の部分がアミノデロ
ビルンリルースペー結合していると特に有利であること
が明らかになった。特に、一般式１： 〔式中ポリマーは、２５００久ニジも大きく５ｏｏｏ久
まで１％に約５ｏｏｏ久の制御された孔径を有するガラ
スであり、Ｒ及びｙは同じη１又ｒＬ１４なっていでよ
＜　＋　Ｃｌ−６−アルキル又はポリマーを表わし、か
つＮｕｋｌ、は場合により少数化学で常用の保護基を有
する核酸フラグメン）１−表わす〕の担体が組合せ九核
酸の化学的及び酵素的合成に優れていることが判明した
。

これにぶり、特に酵素的反応を有利に実施することかで
きる。

Ｎｕｋｌにエフ表わされるａ敗フラグメントはそれぞれ
のヌクレオチドであっても又は単量体単位２〜１００個
からのオリゴマーであってもあるいは数百個の単量体単
位金有するより大きな重合体であってもよい。

核酸フラグメントのＮｕｋｌ、としては、酵素的反応に
は特にヌクレオチド６〜３０個からのオリゴヌクレオチ
ドが有効であることが判明した〇ヌクレオチド１５〜２
５個からのオリゴヌクレオチドが特に優れている。

Ｍ、Ｊ、シャイト（Ｇａｊｔ　）編、Ｔ、アトキンメン
（Ａｔｋｉｎｓｏｎ　）及びＭ、スミス（Ｓｍ１ｔｈ　
）共著。

６オリゴヌクレオチド・シンシシズーア・デラクテカル
・アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅ　５ｙｎ
−ｔｈｅＳｊｓ　−ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒ
ｏａｃｈ　）”、４５〜４９頁（ＩＲＬプレス、オック
スフォード、ワシントンＤ、　Ｃ！、在、１９８４年ン
に記載の方法と同様にして、その工つな全く優れた担体
は制御された孔径ガラス３０００　Ｘ　（ＣＰ（）　３
０００゜５ｅｒｖａ社、西ドイツ国ハイデルベルク在ン
のアミンｆｏピルイヒ及び３′−末端でｐ−ニトロフェ
ニルスクシニルにエフ置換され、場合により核酸イヒ学
で常用の保護基ケ有する相応する核酸７ラグメ／トとの
反応にＬジ製造することができる。ポリマー担持側科１
ｇ当ジ核酸又は核酸フラグメント約１μｍｏｔ〜６０μ
ｍｏｔの負荷密度で製造することができる。負荷密度５
〜１１μｍｏｔの担体が特に浚れている。

不発明の他の目的は、同相法による核酸の合成法であり
、その際に固相として、孔が主として規定された大きさ
１４００〜１００００１を刹する不浴性の非膨潤性の多
孔性重合体を使用する。孔は殊に制御さγした大きさ２
０００〜５０００え１％に２５００１よジ犬きく　ｓｏ
ｏ。

久まで勿有する。

同相法とは、不均一に進行するすべての核酸の合成法で
あり、即ち場合にＬクシ酸化学で常用の保護基？！″有
するヌクレオ７ド又はヌクレオチドのような単量体もし
くは数個の単量体単位りり成り、場合にニジ同様に保護
されている核酸フラグメントである核酸の部分を不溶性
担持材料に固定し、化学的及び酵素的反応により又は酵
素的反応たけによシ単麺体単位１個以上を伸長しかつ合
成の終結後に最終核酸？場合により固相から分離する。

ジ酸の作字的合成には、リン醒ジエステル法。

リン酸トリエステル法及びホスファイト法が常法であり
、その際に２つの後者の方法及びこのうちの特にホスフ
ァイト法が核酸の固相合成に有利であることか明らかに
なった。

化学的方法により、約６０イーまでの年蚕体単位からの
オリゴヌクレオチドを最も良好に合成することができ、
これを酵素的方法により既に技術水準の説明に記載した
ように数百個の単量体単位からの核酸に伸長することが
できる。例えは、常用の酵素はキナーゼ、ポリメラーゼ
及びリガーゼである。固相で最終的に合成された核酸上
担持材料から分離するためにも酵素１例えは制限エンド
ヌクレアーゼを使用することができる。

従来、化学的方法工程と酵素的方法工程上官む、場合に
より自動化し得る有効な核酸の合成は、膨潤性固相全使
用する場合は不十分な機械的安定性、長い洗浄−及び反
応時間差ひに場合により起る副反応という欠点を甘受し
、あるいは非膨向性同相全使用する場合は使用した酵素
が場合により阻害され、それ故不完全な反応を甘受する
場合にのみ可能である。いくつかのこれらの欠点を回避
するために、化学的な合成工程を非膨崗性担持材料上で
及び酵素的曾厄工程を膨潤性材料上で実施することがで
きた。しかし、これは合成の間に担持材料金５２：換し
かつ損失の多い分離−及び連結反応を実施しなければな
らないことを意味した。

場合にエフ保護基を有する核酸フラグメントを不溶性で
非膨潤性の多孔性重合体に固定し、この固定化核酸フラ
グメン）ｋ他の核酸フラグメントに工９伸長しかつ場合
により最終核酸を不溶性重合体から外端するという工程
より成る本発明方法にこれらの欠点を有していない。こ
れは化学的方法と酵素的方法と全組合せた核酸橋築に好
適で、極めて有利である。化学的な合成工程と酵素的な
合成工程と全組合せる際に担持材料′Ｉ＆：交換する必
要がない。この方法は酵素的なＶ；、Ｏ合成には特に好
適である。

本発明では担持材料として主に珪素原子及び酸素原子よ
り成る重合体が優れており、これは大きな機械的安定性
並ひにその高い永久多孔度及び低い膨側多孔度により優
れている。特に規定さ扛た孔径１４００〜１００００に
のガラスが該当する。特に、規定された孔径約２０００
〜５０００又、殊に２５００又より大きく５０００又１
でのガラス、％に制御さ扛た孔径がノロ０００久のもの
が、場合により目動化ｉ」能な固相法の非膨國性多孔性
材料として４４月である後れ友？＋質を示す。軸に、核
酸又は核酸フラグメントの固定化への適性及び固相に結
合したこのような物質の酵素基質としての適性′？ｔ＠
調すべきである。

残酸フラグメントを実に様々に担持材料に固定すること
ができる。しかし、場合により保循基を有していてもよ
い秩緻フラグメントを不溶性の非膨潤性重合体に、殊に
スペーサー勿介して共有結合させると有利であり、その
際にスペーサーとしては該当する反応条件に応じて当業
者が選択することのできる多数の物質が該当する。場合
により＠酸作字で常用の保護基により保臆されていても
よい核酸フラグメントが例えは（０２Ｈ５０）　３８１
−０−　（ＣＨｇ　）　３−Ｎａ３にエクアミノデロを
介して担持材料に結合する場合に待に有利であることが
明らかになった。この点で前記の一般式Ｉの担体は本発
明方法に特に好適でめる。

七の際に、酵素による阻害は認められない。

これは翁にポリヌクレオチドキナーゼ、　ＤＮＡ　−ポ
リメラーゼ、　ＲＮＡ−及びＤＮＡ　−ＩＪガーゼ並び
制限エンドヌクレアーゼに該当する。それ故、本発明方
法は固定化され友核酸又は核酸フラグメントの＃素層媒
作用反応に特に好適である。

そのぶつな＃素的反応の例は次の通りでおる：オリゴヌ
クレオチドフラグメントの酵素的ホスホリル化１例えば
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼによるオリゴデオキシ
チミジレートの反応。

オリゴヌクレオチドへのＤＮＡフラグメントの連結１例
えは対向鎖フラグメントの存在においてＤＮＡリガーゼ
によるオリゴデオキシチミジレートの連結。

６′−リボ末端を有するＤＮＡ　７ラグメンｈ錨１定化
オリゴヌクレオチド、例えばオリゴデオキゾチミゾレー
トにＲＮＡ　！ｊガーゼにエリー本鎖結合することにエ
フ連鎖伸長。

固定化ＲＮＡ　−ＤＮＡ−ハイブリッド銀金、一般的に
使用口」能なプライマーオリゴヌクレオチド、例えはオ
リゴデオキシアデニレートのＤ在ＩＣおいてフレノウＤ
ＮＡポリメラーゼによＶ複製、又は 固定化オリゴヌクレオチド二本鎖’ｋ　ＩＩＪ限酵素に
より切断。

本発明の他の目的は、主に１４００〜１００００穴の規
定された孔径（Ｉ−１する不溶性で非膨＠注の多孔性重
合体を核酸又は核酸フラグメント？固定什するための担
持材料として使用することであり、特に担体に固定した
そのような化合物を１固相で核酸又は核酸フラグメント
を酵素的に又は作字的及び酵素的に反応させるために使
用する場合である。そのような重合体は核酸會構築する
ための合成の自動化に使用するのにも好適である。それ
というのも重合体は烏い機械的安定性及び交換さ０る試
薬及び溶剤による耐久的な負荷可能性により優れている
からでるる。しかし前記の重合体はＭ素的反応の担体と
して特に好適でめる。七ｔしというのも反応が妨害され
ずに進行するからである。

無機重合体１％に主に珪素原子及び酸素原子より取るも
のか優れている。そのような重合体か規矩された大きさ
２０００〜５０００Ｘ、殊に２５００Ｘよりも太きく５
０００穴までの孔？有すると有利である。制御された孔
径約６０ＬｌＯｉｋ有するガラスは特に有利であること
が明らかになった。

そのような広孔径の非膨潤性重合体は、それが簡単に洗
出可能であり、それ故試薬の過剰分及び溶剤を良好に除
去し得るのでイヒ学曾瓜に好適である。史に、本発明に
よる担持材料にｊ、九（１１−学的縮合工程で非常に高
いほぼ定を的収ぶが達成される。

本発明にニジ広孔径の非膨潤性重合体全担跨材料で核酸
を禍築しあるいは分離するための酵素反応に使用すると
特に有利であることが明らかになった。

実施例 次に本発明を実施例に↓り詳説するが、これによって限
定されるものではない。

実施例で使用する略語： Ｔｒｊｇ　　　）リス（ヒドロキシメチル）−アミンメ
タン ジチオトレイトール アデノシン−５′−トリホスフエート エチレンジアミン−テトラ酢酸 １分間当りの放射カウント数 ４−（２−ヒドロキシエチル）−１ ＴＴ ＴＰ ＥＤ’Ｉ’Ａ ０９ｍ ｇＰＥＳ −ピペラジンーエタンスルホン酸 ジメチルスルホキ７ド ポリエチレングリコール トリス／　ＥＤＴＡ緩衝液 午血清アルブミン ５′位でジメトキシトリチル基で置換 されたデオキシチミジン １−（メ７テレンスルホニル）−３ −二トロー１．２．４−トリアゾー ル ｄＮＴＰ　　　デソキシヌクレオンドトリホス７エート ＴＥＡ　　　）リエテルアミン 例　　１ 固定化（ｄＴ）＋ｏオリコ９ヌクレオチド幻　固定化ｊ
４ｉｎ体デオキ７チミジンの合成ａ）担持材料コンドロ
ールド・ボア・グラス（ＣＰＧ　）　（５ｅｒｖａ社、
西ドイツ国、ハイデルベルク在） アミノプロピル化： ＭＳＯ ＥＧ Ｅ ＳＡ ＭＴｒｄＴ ＭＳＮ’ｒ 担持材料のアミノプロピル化はマッテウチ（Ｍａｔｔｅ
ｕｃｃｊ　）及びカルーサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）
共著、　”　Ｊ、　Ａｍｐｒ、　Ｃｈｅｍ、　８ｏｃ、
　　、　１Ｑ　３巻。

６１８５〜６１９１貞（１９８１年ンと同様に行なった
。

パッチ：　ｃｐａ　１４００もしくはＣ’ＰＧ　３００
０ｇ ６−アミツデロビルートリエトキ７ ７ラン　　　　　　　　　　２．６Ｍ トリメチルクロルンラン　　６九 ＣＰＧ　１４００もしくはＣＰＧ　３０００　’ｋ　ト
ルエン５０ｍ中で６−アミツデロビルートリエトキクシ
ランと反応させることにより官能性にする。

反応混合物を室温で１２時間振盪し、引続いて１８時間
還流下に沸騰加熱する。担体を吸引線取しかつ１回当ｖ
２０ｍｂのトルエンで６回、１回当り２０ｍ番のメタノ
ールで３回及び１回当９２Ｑｍｂの５０％−メタノール
水浴液で２回洗浄する。ＣＰ（）　２−晩水性メタノー
ル溶液中で振盪する。准相七分離しかつＣＰＧ　’ｉ　
１回当り２０１ｕのメタノールで２回洗浄する。引続い
てＣ’ＰＧ　を初めに空気乾燥し、次に真空乾燥する。

ガラスの反応しなかったヒドロキシル基は無γピリジン
１０ｎ中のトリエチルアミンランとの反応にエフｍｍす
る。懸濁液上−晩振盪し、引続いて吸引濾取しかつガラ
スを１回当９２０ｍのメタノールで５回及び１回当ジ２
Ｑｍｂのジエチルエーテルで６回洗浄する。空中乾燥後
にアミノプロピル化ＣＰＧ　ｗ　Ａ空中で完全乾燥する
。

５’−０−ＤＭＴｒ　−３’−０−スクシニルーヌクレ
オンド： 前記文献記載の方法と同様にして、 ＤＭＴｒｄＴ　　　　　　　　　　　２．５　ｍｍｏＬ
無水コハク酸　　　　　　　　２．ＯｍｍｏＡ（２ＱＯ
〜） バッチを室己で１２時間情押し、その後で薄層クロマト
グラフィにより試験する。十分な変換率でピリジン全除
去しかつ残渣をジクロルメタン６０ｍ中に溶解する。こ
のジクロルメタン漬液を氷冷し′ｆｃ１０％−水性クエ
ン酸に対して振出し、引続いて有＠布を１回当ジ１５ｔ
ｔｔｂの水で２回洗浄する。ジクロルメタン層葡硫酸ナ
トリウム上で乾燥させた後で、浴液を１歓式蒸発器で濃
縮しかつ石油エーテル２５　Ｑ　ｔｎｂ中で析出させる
。沈殿を吸引歯数しかつ１回当り２Ｑｍｇの石油エーテ
ルで２１俊洗浄する。収率は理論前の９０％である。

ｐ−ニトロフェニルエステル（’Ｊ　生成：前記文献記
載の方法と同様にして、 無水ピリジン　　　　　　　　　５計 上反応させる。５’　−０−ＤＭＴｒで保護されたデオ
キシチミジンをピリジン中に溶解し、２回無水化しかつ
ＤＭＡＰ並びに無水コ／Ｓり＃！ヲ加える。

無水ジオキサン ６Ｍ 無水ピリジン　　　　　　　　　０．２Ｍを反応させる
。５′−〇−ジメトキシトリチルー６′−〇−スクシニ
ル−デオキシチミジンをピリジン含有ジオキサン溶液中
に溶解しかつＤＣＣ’（Ｈ箔加する。初めは泄明な溶液
から、短時間でシンクロヘキシル尿素が沈殿する。２時
間の反応後に、反応混合物全薄層クロマトグラフィによ
り試験する。シンクロヘキシル尿素を濾別しかつａＳ　
＊　＊直ちに予めＶ＠製した担持材料と反応させる。

活性エステルとアミノプロピル化担体との反応： １１記文献と同様にして、 担持材料　　　　　　　　　　２．５ｇ無水ジメチルホ
ルムアミ）”　　　８ｍｓ無水トリエチルアミン　　　
　　１ｒｒＬ８無水酢酸　　　　　　　　　　　１ｒＩ
Ｌ６無水ピリジン　　　　　　　　　５　ｍｅ；を反応
させる。アミノプロピル化ＣＰＧ　七ゾメチルホルムア
ミド中に懸濁させる。単量体のニトロフェニル−活性エ
ステルの俗液金范加し、トリエチルアミンを加えかつ反
応混合物を注意深〈振盪する。１２時間の反応後に担体
勿吸引濾取しかクシメチルホルムアミド、メタノール及
びジエチルエーテルで洗う。仝気乾燥後に物質を真空中
で貯蔵する。

未反応アミノ基のマスキングは無水ピリジン中の無水酢
酸との反応により行なう。触媒としてＤＭＡＰ　ｋ加え
る。６０分後に担体を吸引濾取し、メタノールで洗い、
空中及び真壁中で乾燥する。

ｂ）担持材料セルロースもしくはセファロース有機担持
制科’！１１−３’　−０−スク７ニル化ヌクレオンド
で負荷： Ｒ，フランク（ｐｒａｎｋ　）及びその他共著。

”　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　＋　１１巻
、４３６５〜４６７７向（１９８３年ンと同様にして、
ミシン ｉ　　ｍｍｏＬ １−メチルイミダ１戸−ル　　　　　０．２ｆｉ＆無水
ピリジン　　　　　　　　　　１５０ｆｆｉｚピリジン
　　　　　　　　　　　　５ＱｍＬクロロホルム　　　
　　　　　　　５０ｍｂエーテル　　　　　　　　　　
　　　５（Ｊｎｔ乙無水ｐ［２ＯｒＬｌ ｔ反応させる。

担持材料に１回当り約２０１ｕの無水ピリジン全６回加
えかつ無水化する。その後、６１−　ｏ　−スクシニル
化ヌクレオ／ド、　ＭＩＮＴ及び１−メチルイミダ・ｔ
−ルを絡加しかつバッチ？室温で６時間振盪する。この
間に黒く呈色した反比、耐液全７ユレ／り（５ｃｈｌｅ
ｎｋ　）のフリット中で殆んど担持から吸引症別しかつ
畑持桐料全ピリジン、クロロホルム及びエーテルで白色
になるまで洗浄しかつ乾燥させる。未反応のヒドロキフ
ル基金遮断するために、担体をピリジンＢ□ｔＬ。

無水酢酸２０成及びＤＭＡＰ　１　＆からの混会物４０
ａｈと２時間振盪する。その後、材料を再びピリジン、
クロロホルム及びエーテルで洗いかつ乾燥させる。

Ｃ）担体負荷の測定 担体の単蚕体負荷はジメトキ７トリチル（ＤＭＴｒ　）
カチオンの色を分光測光法により定置することＶＣＣシ
タ定する。試料１卿を採取しＤＭＴｒカチオンを酸処理
により遊離しかつ４９８ｎｍで吸元度七測定する。デオ
キシリボヌクレオシド負荷は次式により引算する： ｔｒ　ｉｔ　（ＩｎＱ） ヌクレオチド×μｍｏｔ　／担体Ｉ Ｅａｏａ　−７Ｘ　１０’　ｃｍ”　ｍｍｏＬ−”次の
負荷が測定されｆｃ＝ Ｂ）　　ＣＰＧ−（ｄＴｚｏ）　ｅセルロース−（ｄ’
ｒ２０）及びセファロース−（ｄＴｚｏ）の合成 ａ）　　ＣＰＧ−（ｄＴｚｏ）の合成 前記のＡＪで製造したデオ牛７チミジン（６′末端ンで
負荷さｎているＣＰＧ材料それぞれ２０〜５ＤｊｎＱ’
ｌｆ：、緊締系により固定されかつＳＡＭ　１−シンセ
サイず−（ＢｉｏＳｐａｒｃｈ社〕と結合している鋼カ
ラム又はカートリッジ中に装填する。

試桑： 睨トリチル：ジクロルメタン中の３％−トリクロロ酢酸 縮　　　合　　：　Ｒ−イ、ヶ。ピｔｖＱ　ＤＭＴｒｄ
Ｔｐ”（ＮＲ２、Ｍｐ　）無水アセトニトリ ル１０Ｒδ中のテトラを戸−ル ５０ｒｎｑ 無水アセトニトリル 酸　　化　：テトラヒドロフラン１２５ｍｂ。

水１２．５彫及びピリジンＩＩｕ 中の沃素５００　ｍＱ キャッグ形成：　ＴＥＡ　１２．５　ａｔ　、アセトニ
トリル７５計及び１−メチル− イミダゾール４　ｍｌ中の無水酢 酸１２．５ｆｆｉδ 洗浄工程　　：無水アセトニトリル １サイクルの各工程は次のように進行する：１、脱トリ
チル： ジクロルメタン中の６％−トリクロロ酢酸を、ジメトキ
７トリチル基金脱離するために２〜６分間担袴材料を通
してボンデ供給する。赤色の脱トリチル浴液を試料捕集
器中に取シかつ収ぶ測定のために使うことかできる。

２、洗浄： 痕跡蓋の酸をアセトニトリルで洗うことにより除去する
。

３、縮合： 活性化可能なヌクレオシド（ＤＭＴｒｄＴｐ”（ＮＲ２
゜Ｍｅ）　、　Ｒ−インデロビルノのうち縮合サイクル
１回当ｖ５０響を濃度５０１１Ｑ／ｍｅで貯蔵容器中へ
予め装入し、その容器から縮合サイクルの間にテトラゾ
ール溶液と混合して該単せ体を１分間でカラム中全ポン
プで通す。引続いて、反応性単友体を収率の改良に当り
８分間チューブ全弁してカラムｒボンデ循環させる。

４、洗浄： 過ｊｌｅｌＪｉｌで使用し友反応成分ｔアセトニトリル
で数分間洗浄することにより除去する。

５、酸化： 沃素溶液を２分間カラム中全ポンプ循環することにより
亜リン酸トリエステルの６価のリンが５１曲のリンに酸
化される。

３、洗浄： 酸化浴液上アセトニトリルで洗うことにより除去する。

Ｚキャップ形成（未反応ヒドロキフル基のマスキング）
： キャップ形成溶液を２分間担持材料中をポンプ供給する
。

８、洗浄： キャップ形成溶液を、アセトニトリルで洗うことにエフ
反応混合物から除去する。

ＳＡＭシンセサイザー中での合成サイクルの進行には約
２５分間を景する。

ｂ）セルロース−（ｄＴｚｏ　）及びセファロース（ｄ
Ｔ）２ｏの合成 セルロース及びセファロース材料ではａ）に挙げ友洗浄
工程を約２倍の時間に延長した（−般に２〜６分間を約
５分間にン。脱トリチル後に、アセトニトリルで洗浄す
る前にジクロルメタンによる付加的な洗浄工程が必要で
あり、これにエリ担持材料中に存在する痕跡蓋の酸金先
金に除去することができる（ジクロルメタンで２分間洗
浄）。

Ｃ）負荷密度 ＳＡＭ　１合成装置中で独々の担持材料を用いて（ｄＴ
２０）−オリゴヌクレオチドを製造すると次のよりに負
荷された： 保趨基（ＤＭＴｒ及びメトキンノの脱離後、オリゴヌク
レオチドは固相に残りかつ試桑及び有機溶剤の除去後に
酵素反応に使用するまで乾燥しかつ冷ＭＬ庫に保存した
。

ｄ）保繰基の脱離 ＤＭＴｒ保護基の脱離 合成する際に、ＤＭＴｒ基を塩化メチレン中の２％−ト
リクロロ酢酸會用いて２分間でもしくは塩化メチレン中
の６チージクロロ酢酸を用いて６分間で脱離する。生成
物音アフイニテイクロマトグラフイ処理せずに精製する
場合は、合成装置中で直ちにオリゴヌクレオチドの脱ト
リチルを行なう。アブイエティクロマトグラフィ精製後
では、オリゴヌクレオチドからのＤＭＴｒ保護基の脱１
１ｉは８０チー酢［’に用いて６０分間処理することに
より行なう。凍結乾燥後に水金２回添加し、かつ改めて
凍結乾燥する。ＤＭＴｒ基全エーテルで抽出しかつ生成
物を蒸発濃縮する。

ホスフェートのメトキシ基の脱離： メトキシ基の脱離は、チオフェノール／　ＴＥＡ／ジオ
キサン−１：２：２からの新しく自製した溶液で担体を
４５分間処理することにより行なう。引続いて液相全分
離しかつ担体をメタノール１ｒＩＬｔで６回及びジエチ
ルエーテル１勘で６回洗浄する。

担体に結合し九オリゴチミジレートの化学合成の代りに
、担体に結合したオリゴヌクレオチド？混合塩基組成に
より合成することも可能である。

例　　２ 固定化（ｄＴ）２０オリゴヌクレオチドの＃素的５′−
ホスホリル化 例１からの（ＰＧ　３０００−　（ｄＴ２ｏ）１００β
Ｉ（約５００　ｐｍｏｔ、　５’−ＯＨ末端１ｎｍｏｔ
）にキナーゼ緩衝液（４００ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐ
Ｈ７−６，１００ｍＭ塩化マグネシウム、　１０　ｍＭ
ＤＴＴ　、　５０チーグリセリン）１μｌ、γ−３２Ｐ
−ＡＴＰ　ｌμ！並びに１００μＭ冷ＡＴＰ浴液１μｊ
。

Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌ”を加えかつ再
蒸留した水金装入して全谷力（１０μｌにする。反応混
合物ｔ−１５分間６７℃で恒温保持する。引続いて遊！
ｉＩ５′−ヒドロキシル基の定量的ホスホリル化に当Ｆ
）　１ｍＭ　ＡＴＰ　１μ１ｔｌ−添加し、史に６７℃
で１５分間反応させる。反応の終結は反応浴液１Ｄｐｌ
当？）　２５　Ｄ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　浴液１μｌの添加
により行なう。

反応パッチ： 次に、未結合の反応成分及び緩衝液全除去するために、
担体を１回当！００．Ｉ　Ｍ　＋、１ン酸水素二カリウ
ム溶液５００μノで５回洗浄する。洗浄効ｉｈチェレン
コフ測定により試験する。担体に残留し７’（残留放射
能量はこの方法で５ｘｉｏ５〜２−４　Ｘ　１０’　ｃ
ｐｍ　テあ谷。

３２ｐは半減期１４日間で壊変する。チェレンコフ測定
により１分間当りの壊変（ｃｐｍ　）全測定する。これ
は通常のシンチレーション計数器で行なう。放射能量８
Ｘ１０５〜２．４　Ｘ　１０’ｃｐｍにより、担持材料
に固定されたオリゴ９ヌクレオチド中の放射性ホスフェ
ートの−ｆｉｔ’に確定することができる。引続き、“
冷い”　ＡＴＰの添加により完全にホスホリル化ヒされ
るので、放射能量により、キナーゼ反応が行なわれ九の
かどうか、めるいは担体中のイロ」らかの汚染により又
は塩によりもしくはオリゴヌクレオチドの不純性により
妨害され友かどうかが明らかである。高い放射能量が有
利である。それというのもオリゴヌクレオチドを長時間
にわたって可視化することができるからである。担体／
オリゴヌクレオチドに対するキナーゼによる作用がすべ
ての他の醇素肚媒作用反応の前提である。

担体を多すに（５００μｙ〜１〜）に使用する場合、全
容ｔ４０μｌで作業し、初期のＡＴＰ濃度は１００μＭ
であり、１５分後には１０ｍＭＡＴＰ　浴液１μＡ！ヲ
加える。反応温度及び反応時間は同じである。

ＣＰＧ結合のオリゴチミジレートの代りに、ＣＰＧ　３
０００に結合した。混合塩基組成？有するオリデヌクレ
オチドｔ−酵素的にホスホツル什することもできる。

例　　３ ＤＮＡリガーゼによる固定化ＤＮＡフラグメントの酵素
的結合 例２からのＣＰ（）　３０００に共有結合した、５′末
端でホスホリル化されたオリゴチミジレートを初めに水
１５μぎ及びＤＮＡ　Ｕガーゼ／緩衝液（７６０ｍＭ　
）リス／塩酸−緩衝液、　ｐＨ７，６。

１Ｑ　ｍＭ塩化マグネシウム、　１　ｒｒｉＭＡＴＰ　
）　？ｈｔｌ中でオリゴアデニレート及び６′末端とし
てオリゴチミジレートを有する固定化されていない他の
オリゴ９ヌクレオチドと一緒に１００℃に６分１ｊＪｌ
加熱しかつ続いて室温に保冷することにニジ雑種形成す
る。１ｍＭ　ＡＴＰ　１μｌ及びＤＮＡリガーゼ２μｌ
ｋ加えかつ反応混合物を２０°Ｃで２〜２４時間恒１晶
保付する。

反応バツテ： 表：　ＤＮＡリガーゼ反応 収率ｋ　ｉ）１＋１定するために、試料を採取しく懸濁
液２μｌ）、３０分間のアンモニア処理により担体から
分離しかつ凍結乾燥させる。引続いて、１０〜２０俤変
性ポリアクリルアミドｒル、０．４朋でｒ／ｌ／１！を
気泳動を行ない、オートラジオグラムの作成後生放物バ
ンド全切断しかつ０．５Ｍ酢酸アンモニワム、　１ｍＭ
　ＥＤＴＡ″″Ｃグル溶離して、チェレンコフ比収側定
により変換率を確定する。

ＣＰＧ結合した、５′末端ホスホリル化第１．＋　！”
チミジレートの代ジに、ＣＰＧ３０００に結合した、混
合塩基組成を有する５′末端ホスホリル化オリゴヌクレ
オチドｔＤＮＡリガーゼにより好適なオリゴ９ヌクレオ
チドと連結することもできる。

例　　４ 固定イヒＤＮＡ　７　ｔグメントとリボ末端會有するデ
オキ７オリゴヌクレオチドとのＲＮＡ　ｌ／ガーゼによ
る酵素的連結 使用するすべての緩衝液及び溶液全初めにオートクレー
ブにかけ、滅菌濾過する０ 例２からの固定化し′ｆｃ５′末端ホスホリル化工イコ
サチミジレート１００μｇに、６′−リポ末端を有する
デオキ７オリゴヌクレオチドを加えかつ凍結乾燥する。

引続いて１００μＭ　ＡＴＰ溶Ｑ１５＃、１０ｍＭスペ
ルミン４μＡ、１００ｍＭ塩化マグネシウム溶液４μ！
及びＩ　ＱＱｍＭＤＴＴ溶液４μｌｌｋ添加しかつ凍結
乾燥させる。

５　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　２μｌ及びＤＭＳＯ３
μｌ’を加え、短時間振盪させ、その佐４０チポリエチ
レングリコール溶液１０μｌ並びにＲＮＡ　Ｉ）ガーゼ
５μｌを装填する。反応混合物を室温で４″８時間恒は
保書する。

反応バッチ： 実施した反応： 反応後に、担体を１回当ジ５００μｌ　ＯＴｇ（ｉ　Ｑ
　ｍＭ　）リス／塩酸−緩衝液、　ｐＨ７，５。

２．５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）で６回洗浄し、試料を採取
し、アンモ１ア処理によｐ担体から分離しかつ１０〜２
０多のポリアクリルアミドデルでｒルミ気泳動にＬり分
離する。例６のＤＮＡ　ｌ／ガーゼ反応法と同様にして
デル溶離後の収率をチェレンコフ比軟測定にエフ測定す
る。

初めのＲＮＡ　１，１ガ一ゼ反応後に他のＲＮＡ　１７
ガ一ゼ反応？ｆ−Ｔｈ施する場合、初めにヒドロキシル
末端を有するＤＮＡ末端の定汝的ホスホリル化？行なわ
なけれはならない。このために、ＲＮＡリガーゼ反応か
らの試楽紮除去するために担体？！？フェノール化すべ
きであるニ ーフェノ−＃　５００μｌの添加、６０秒間混合、１分
間遠心分離、フェノール相の除去；−フェノール／クロ
ロホルムー１：１５００μｌｏ添加、６０秒間混合、１
分間遠心分離。

有機相の除去； −インアミルアルコール／クロロホルム−１：２５　５
００μｌの添加、６０秒間混合。

１分間遠心分離、有機相の除去、短時間蒸発。

次いで改めてＴ　４−　＆　！Ｊヌクレオチドキナーゼ
によりホスホリル化することによジ、担体の放射能は再
度１〜２Ｘ　１０６ｃｐｍ−ＣＩ＞ｌ）かつ５′末端は
ホスホリル化ヒされている。引続いて実施したＲＮＡ　
！ｊガーゼによる他の一本鎖結合により、固定されたオ
リゴマーとしてオリがヌクレオチド（ｄＴ）２０Ｐ及び
ｄＴ２ｏ（ｄＮ）４ｅＡｐｋ　官有する担体試料１００
例では次の反応が行なわれる：べ く 例　　５ 固定化オリゴヌクレオチドｋ　ＤＮＡポリメラーゼ（フ
レノウフラグメントノにエフ複製一般に使用可能なプラ
イマーオリがヌクレオチド（ｄＡ）１ｏ〜１８ヲ再蒸留
水１６μ！及びニックトランスレー７ヨン緩衝液（５０
０ｍＭ　トリス／塩酸−緩Ｉｊｉ［、ｐＨ７，２、１０
０ｍＭ硫酸マグネ７クム＋　１　ｍＭ　ＤＴＴ　、　５
００　ｐｉ　／　ｐｉｇ　ＥＳＡ　）　３μｌ中で例１
からの固定化エイコサチミジレートで雑鴇形成する。そ
のために、１００°Ｃに６分間加熱しかつ注意深く室温
に冷却させる。

１［１ｍＭデオキヌクレオシドトリホスフエート５　μ
ｉ　（その都度２．５　ｍＭ　ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ
　、　ｄＣ’ＴＰ及びｄＴ’Ｉ’Ｐ　ｋ含む）及びα−
３”Ｐ　−ｄＡＴＰ　３μｌ並ひにＤＮＡポリメラーゼ
のフレノウフラグメント６μｊの添加後、担体に固定さ
せたオリゴヌクレオチドの複製を開始する。

反応バツチ： 行なわγした反応： ａノ　（ｄＡハロ２０　Ｄ　ｐｍｏｌｌ　ｋクレノウボ
リメラーゼ２μの存在において例４からのＣＰＧ　３０
００−　ｄＴ２０−　ｒＡ（ｄＡ２Ｔ、、）に雑種形成
して伸長する。

その反応の結果の測定は１回当り５００μｌのＴＥ　（
１０ｍＭ　）リス／　ＨＣｌ−緩衝液、　０．２５ｍＭ
ＥＤＴＡ　、　ｐ）１８．０　）で５回洗浄し穴径でチ
ェレンコフ比軟測定にエフ行なう： ｈａｓσの相体Ｃｃｐｍ）　：　４１４０　Ｄ複製後の
担体（ｃｐｍ）　：　２４３８５０変性後の担体（ｃｐ
ｍ）：　５２５７０変性後の上澄み（ｃｐｍ、）　：　
１８４３３０ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーとして
、例５　ａＪからの変性後の上澄みからのオリゴアデノ
７ン生成物約１ｎｍｏｔ（０，Ｄ、　０．２５）及びク
レノウ〆リメラーゼ１５μｌ’ａ−例５　ａ）と同様に
して使用する。

複製結果はグル電気泳動にエフ測定する。２つの試料Ａ
及びＢｉ測測定る： Ａ：担体試料のアンモニア処理後のバンド結果：均一な
配列約１４　ｍａｒ〜３０　ｍａｒ２０　ｍｏｒ及び３
　Ｑ　ｍｅｒは強力なバンド勿示すＢ：担体変性後のバ
ンド（上澄みのみン結果：均一な配列約１４　ｍｅｒ〜
３０　ｍａｒ例　　６ 担体力・らオリゴヌクレオチド二本鎖全切断するための
制限酵素の使用 例５からのフレノウ反応後のＣＰＧ　３０００−ｄＴ２
ｏ−ｒＡ（ｄＡ、Ｔ〕）ｆ使用する。

バッチを全谷亀２０μｌで実施する。例５がらの担体試
料約２５μ９　（ＤＮＡ　／ポリメジーゼ反応からのバ
ッチの”／ａ）に水１６μ／ｌ−加え、低塩（Ｌｏｗ−
ｑａｌｔ　）制限エンドヌクレアーゼ緩衝液（１０ｍＭ
　？リス／塩酸緩衝液、　Ｐ）（７，５。

１０ｍＭ塩化マグネシウム、　ｉ　ｍＭ　ＤＴＴ　）　
２　Ｉｌｌ及びＥｃｏＲＩ　２μｌを添加する。このバ
ッチｔ６７゛Ｃで１時間恒記保持する。

反応バッチ： 切断の結果は、試料を担体から切断しかつキナーゼ処理
した後で試料を分けて、Ｉｆ）Ｌ／電気泳岬にエフ試験
する。第１試料分は熱変性し、第２試料分は直ちにアン
モニア処理により切断する（固定化配列並ひに雑種形成
により結合し次起動に貧有する）。切断したオリゴヌク
レオチドからセファデックスＧ５０−カラム（パスツー
ルピペット）を介して溶離剤として再蒸留水。

ｐ）１８’を用いて脱塩する。先金容重で溶離し７′ｃ
試料勿凍結乾燥しかつ溶液中のオリゴヌクレオチドに関
して記載した方法によりホスホリル化する。切断結果全
試験するにはポリアクリルアミドゲル全使用する。

すべてが使用しｆＣ３０ｍａｒよりも思い生成物が得ら
れる。制限酵素の妨害は認められない。

例　　７ ＤＮＡフラグメント’ｉ　ＤＮＡリガーゼ七用いて膨潤
性担体に結合しているオリゴヌクレオチドに連結 反応バツチ： 記載した収率は放射性標識した、担体のオリゴヌクレオ
チドの変換率に関してである。

使用しｆｃ６釉の担持材料はＴ４−ＰＮ−キナーゼによ
る処理及びＤＮＡ　ｌｊガーゼ反応の際に比奴すること
ができる。しかしながら両方の膨潤件担体は、使用し友
反応成分（使用した放射性標識したＡＴＰを洗出する際
に明瞭に見える）から分離するのに非常に困難であった
。長い洗浄工程後でもｒルミ気泳動の際に非共有結合の
放射性ホスフェート分が存在していた。

ＤＮＡ　’）ガーゼ反応の際に、３種の担体で収率上比
較することができ几・しかしＣＰＧ　３０００を使った
化学合成は良好であるので、ＣＰＧ３０００での所望の
連結生成物（ｄＴ）、ｓ。の収率は明らかに良好である
。

セルロース製の濾板は化学合成の際に、担持材料の機械
的負荷により新しいヒドロキシル基が発生して短い連鎖
長の配列が形成さ肛るという問題を有する。これはトリ
チル色の増強により認められる。

最も間踊なのはセファロースＣＬでの化学合成である。

担体が著しく膨潤性であるので、反応工程の間の洗浄工
程を著しく長時間にわたって行なわなけれはならない。

合成の自動イと′に実施するのは非常に困難である。更
に、セルロースの場合と同様にトリチル色の増強が聴め
られ、それ故、最終生成物が著しく強く生じていても、
この場合にも相同の生瓜物列が生じる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核酸化学で常用の保護基を有していてもよい核酸又
   は核酸フラグメント１個又は数個が固定している不溶性
   で非膨潤性の多孔性重合体より成る、核酸又は核酸フラ
   グメントを固相で酵素的に又は化学的及び酵素的に反応
   させるための担体において、重合体の孔が基本的に一定
   の大きさ１４００〜１００００Åを有することを特徴と
   する核酸又は核酸フラグメントを固相で酵素的に又は化
   学的及び酵素的に反応させるための担体。 ２、血合体が主にＳｉ原子及び酸素原子より構成されて
   いる請求項１記載の担体。 ３、重合体が２５００Åを上廻り５０００Åまでの規定
   された孔径を有するガラスである請求項２記載の方法。 ４、保護基を有していてもよい核酸フラグメントが重合
   体に共有的に固定されている請求項１から３までのいず
   れか１項記載の担体。 ５、保護基を有していてもよい核酸フラグメントがアミ
   ノプロピルシリルスペーサー： ▲数式、化学式、表等があります▼を介して重合体に固
   定され ている請求項４記載の担体。 ６、保護基を有していてもよい核酸フラグメントを不溶
   性で非膨潤性の多孔性通合体に固定し、この固定化核酸
   フラグメントを他の核酸フラグメントで伸長し、かつ最
   後に生成核酸を不溶性重合体から分離してもよく、この
   ようにして、核酸を酵素的に又は化学的及び酵素的に固
   相合成する方法において、重合体としてその孔が基本的
   に規定された大きさ１４００〜１００００Å又であるも
   のを使用することを特徴とする核酸の固相合成法。 ７、重合体として、２５００Åよりも大きくかつ５００
   ０Åまでの規定された孔径を有するガラスを使用する請
   求項６記載の方法。