JPH02113892A - 均質な組換ヒトβ―インタ―ロイキン―１の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細胞を破壊して得られ
た可溶性フラクションを、単一クロマトグラフィー処理
で精製することによる均質形の組換ヒトβ−インターロ
イキン−１の製法に係る。

本発明は、ヒトβ−インターロイキン−Ｉをコード付け
る遺伝子を含有する複製可能な組換Ｄ！ｌ八分へ（バチ
ルス属菌における発現性を有する）、及び該組換ＤＮＡ
分子で形質転換されたバチルス属菌から選ばれる宿主微
生物にも係る。

さらに、本発明は、このようにして得られたヒトβ−イ
ンターロイキン−１を、ヒトの治療に用いる医薬組成物
の調製に使用することにも係る。

ヒトβ−インターロイキン−１（以下、βーｈｌＬー１
と表示する）は、免疫機能を調節するタンパク質の大グ
ループの１つであるリンホモノカイン系に属する分子量
約１７０００ドルトンのタンパク質である。

β−ｈｌＬ−　１　（単核球−マクロファージラインの
細胞によって主に産生される）は、■ーリンパ球の最も
重要な促進剤の１つと考えられており［Ｏｐｐｅｎ−ｈ
ｅｉｌｌＩＪ．　ｒＦｅｄ．　Ｐｒｏｃ，コ４１，　２
５７（１９１１１２月、Ｔ−ヘルパー及びＴ一細胞傷害
性リンパ球に対する作用により、抗原一認識段階中、免
疫応答の増幅に寄与する。

さらに、β−ｈｌ［、−１は、実際には免疫機能ではな
いが、宿主が病理状態の克服に利用する異質な保護機構
を導く多くの機能を果たす。

最後に、β−ｈ［Ｌ−　１は、細胞が傷害を受けた際の
修復機構の活性化に寄与し、線維芽細胞の生長を促進す
る。

このような多種の活性のため、特に関節炎及びエリテマ
トーデスの如き自己免疫疾患の治療及び創傷及び熱傷の
治癒を目的とするヒトの治療の分野でのｈｌＬ−　１の
使用がますます注目を集めている。

このためには、ヒトβ−インターロイキン−１を適切な
量でかつ高純度及び高い比活性を有する生成物として使
用できることが要求される。

ｈｌＬ−　１の調製について当分野で公知の方法は、た
とえば白血病患者から得た抹消面白血球又は単核球又は
白血病細胞を適当な条件下で培養し、得られた生成物を
一連のクロマトグラフィーによって精製することからな
るらのである。これに関連して、Ｔａｇａｗａら「ジャ
ーナル・オン・イミュノロノー（Ｊ．　Ｉａｍｕｎｏｌ
．）Ｊ　１２２，　２１１２−２１１．８（１９７９）
Ｌａｃｋｔｎａｎ　ｒフエデレーション泰ブロシーデイ
ングズ（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ）Ｊ　４２，　２６３９−２６４５（１９８３）：　
ＢｌｙｄｅｎらｒＪ．　　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊ　１１８
．　　１６３１１６３８（１９７７）を参照する。

しかしながら、公知の方法は、特に生産率が低い、及び
産生されたタンパク質を精製して均質なものとすること
が困難であるとの点で完全には満足できるものではない
。

α一及びβ−ヒトインターロイキン−１をコード付ける
遺伝子は、それぞれ、最近になってクローン化され、配
列決定されており［Ｍａｒｃｈら「ネーチ’ｒ−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）Ｊ　３１５．　６４１−６４７（１９８５）
；　ヨーロソバ特許公開第２００９８６号（１９８６年
１１月１２日公開）コ、これにより、高収率で該タンパ
ク質を製造する方法の開発が可能になった。

さらに詳述すれば、公知の方法によれば、該タンパク質
をコード付ける遺伝子を含有する組換ＤＮＡ分子によっ
て形質転換された大門菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）の菌株を培養し、つづいて発現された組換生成
物を分離、精製することによってヒトβ−インターロイ
キン−１が生成される。

しかしながら、これらの方法も、大腸菌の如き病原菌を
使用することに基づく不利益がある。

事実、エンドトキシンの如き不用な物質を生成すると共
に、この細菌は不溶性タンパク質として細胞内でヒトβ
−インターロイキン−１を発現する。

公知のように、これは、異質環境において高収率で発現
された異種タンパク質が不適当なら線状又は細菌内での
封入体の形成で明示される配置をとることによるもので
ある。従って、β−ｈｌＬ−１の回収及び精製には、宿
主細胞を破壊し、細胞物質及び封入体中にかなりの割合
で存在しつる汚染タンパク質から所望タンパク質を分離
することが必要である。

代表的には、封入体は、尿素及びグアニジン塩酸塩の如
き強力な変性剤によってのみ可溶性とされる。

これらの変性剤を使用する精製法は、２以上のクロマト
グラフィー法の組合せを特徴とするものであり、良好な
純度を育する組換β−インターロイキン−１を生成する
。しかしながら、理由は完全には明らかではないが、お
そらくタンパク質の異型性ら線群形成のため、精製され
たβ−ｈｌＬ−１の比活性レベルは約６Ｘ］０’単位（
ＩＪ）／ｍ９の値を越えない。

英国特許第２，１８６，５８０号は、遺伝子工学による
処理を行った大腸菌の細胞から産生された組換ヒトα−
インターロイキン−Ｉの可溶性フラクションを、５ｅｐ
ｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００でのゲル濾過及びＤＥＡＥセ
ルロースでのクロマトグラフィーとの組合せによって精
製する方法を開示している。

この方法では、比活性０．４−　Ｉ　Ｘ　１０’Ｕ／ｘ
ｇ（Ｊ　ンバク質）を有するα−ｈｌＬ−１が収率（生
物活性として測定）５０％で得られる。

しかしながら、この方法では、エンドトキシン（その存
在は、ヒトの治療を目的とする物質では好ましくない）
を完全に除去することはできない。

形質転換大腸菌細胞を使用するこの方法は、α−ＩＬ−
１の一部のみが可溶形で発現されるとの事実によって制
限される。

従って、本発明の目的は、エンドトキシンを含有せず、
かつ従来法よりも良好な比活性を有する均質なヒトβ−
インターロイキン−１を高収率で得ることができる簡単
かつ経済的に有利な方法を開発することにある。

本発明によれば、この目的は、バチルス属菌から選ばれ
る遺伝子工学による処理を行った微生物を使用する未知
の方法によって達成される。

事実、これら微生物は、エンドトキシンを産生すること
なく、完全に可溶形のヒトβ−インターロイキン−１を
発現でき、これにより、単一工程クロマトグラフィー処
理により精製を行って均質なものとすることができ、比
活性少なくとも１×１０”Ｕｌｏ（タンパク質）を有す
る所望タンパク質を収率的７０％で得ることができる。

このように、本発明の目的は、適切な条件下で成育させ
た遺伝子工学処理バチルス属菌の細胞を破壊することに
よって得られたタンパク質を含有する可溶性フラクショ
ンを、単一クロマトグラフィー工程で精製することから
なる、組換ヒトβ−インターロイキン−１をエンドトキ
シンを含有せずかつ少なくと６１０’Ｕ１０（タンパク
質）の比活性を有する均質タンパク質として製造する方
法にある。

本発明の他の目的は、バチルス属菌における発現性を有
する複製可能なクローニングベクターをヒトβ−インタ
ーロイキン−１をコード付ける遺伝子に結合させること
によって調製された組換ＤＮＡ分子、及び該組換ＤＮＡ
分子によって形質転換されたバチルス属菌から選ばれる
微生物にある。

本発明の他の目的は、このようにして得られた組換ヒト
β−インターロイキン−１をヒトの治療に用いる医薬組
成物の調製に使用すること、及びこれにより得られた組
成物にある。

本発明のさらに他の目的は、以下の記載及び実施例から
明らかになるであろう。

特に、本発明による方法は、ａ）ヒトβ−インターロイ
キン−１をコード付ける遺伝子を含有する組換ＤＮＡ分
子によって形質転換させたバチルス属の宿主微生物を適
切な培地で培養し、ｂ）宿主細胞を破壊した後、遠心分
離によって、不溶性細胞フラクションから可溶性フラク
ションを分離し、Ｃ）該可溶性フラクションから、溶離
剤として２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ２　ｐＨ７，５緩衝
液を使用するイオン交換クロマトグラフィーによる単一
工程で均質な組換ヒトβ−インターロイキン−１に精製
することからなる。

本発明の方法によって生成された組換ヒトβインターロ
イキン−１は、第１図に示すアミノ酸配列によって特徴
づけられる。

本発明の方法によれば、たとえばアメリカン・タイプ・
カルチャー・センターの如き保存機関に寄託された利用
可能な枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）
、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓａｍｙ！ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・
セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、バチル
ス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）又は
バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒＩＩｌｏｐｈｉｌｕｓ）の菌株
を、工程ａ）における宿主微生物として使用できる。

本発明の目的に関しては、バチルス属菌のクロニングベ
クターをβ−ｈｌＬ−１をコード付ける遺伝子に結合さ
せることによって得られた組換ＤＮ八へ子を用いて形質
転換させた枯草菌の５Ｍ５Ｉ　１８菌株（ｌｅｕ、　ｐ
ｙｒ、　Ｄｌ、、　ｎｐｒ−、ｓｐｒつを使用すること
が好ましい。本発明の目的に適するクローニングベクタ
ーは、当分野で一般的に使用されるバチルス属菌のプラ
スミドから選択される。

好ましくは、枯草菌における良好な安定性によって特徴
づけられ、異種タンパク質の有効な発現を誘発できるプ
ラスミドｐＳＭ２１４（ＡＴＣＣ６７３２０）を使用す
る。このプラスミドは、カナマイシン、アンピシリン及
びクロラムフェニコールに対する耐性をそれぞれコード
付けるＫｍ、　Ｂｌａ及びＣａｔ遺伝子の枯草菌及び大
腸菌での複製を可能にするｐｕＢｌｌｏ及びｐＢＲ３２
２の多官能性複製開始点、Ｂｌａ及びＣａｔ遺伝子の配
列を含むジシストロニック（ｄｉｃｙｓｔｒｏｎｉｃ）
メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ人）の転写を指図する強
力な合成プロモーター及びＣａｔ遺伝子の下流に位置す
る大腸菌のランダファージのＬＯターミネータ−を含有
する。

このプラスミドから制限酵素１：ｃｏＲＩ及びｔｌｉｎ
ｄｔｌｌによってＢｌａ遺伝子を除去し、つづいて該部
位に異種遺伝子を挿入することによって、単一プロモー
ターの存在によって転写が確実に行われる組換ＤＮＡ分
子（クロラムフェニコールの存在下で選別される）を作
成できる。

本発明によれば、異種遺伝子はβ−ｈｌＬ−１をコード
付けるものである。

この遺伝子は、Ａｕｒｏｎらの開示（ＴＮａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　８１．７９０？−７９１１（１９
８４）］及びＭａｒｃｈらの開示［「ネーチ＋−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）Ｊ　１５．６４１．−６４６（１９８４）］
の如く、β−ｈｌＬ−Ｉのフロデューサ細胞から抽出さ
れた完全ＤＮＡからｃＤＮＡとして得られる。

特に、β−ＩＬ−］をコード付ける５ｏ４ｂｐ（塩基対
）Ｓａｕ３Ａフラグメント（Ｍａｒｃｈらによって開示
されている）を有するプラスミドｐＵＣ８−β−ｈｌＬ
−１から、制限酵素ＨｐａＵ及びＰｓｔ　Ｉでの消化に
よって、該タンパク質の最初のアミノ酸１１個をコード
付ける５′末末端列を持たないβ−ｈｌＬ−１遺伝子を
含む６００ｂｐフラグメントを単離する。

ついで、Ｈｐａ　Ｕでの切断によってＤＮＡから除去さ
れた１１個のアミノ酸をコード付ける３６ｂｐオリゴヌ
クレオチドを合成する。

メチオニン（ｎｅｔ）をコード付け、すべてのタンパク
質の翻訳を開始するために必須であるＡＴＧトリブレッ
ト及びＥｃｏＲＩでの切断によって生じた配列をオリゴ
ヌクレオチドの５′末端部に配置する。

本発明によれば、オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ＤｌｉＡ
リガーゼの存在下、リゲーンヨン混合物中で６００ｂｐ
ＤＮＡフラグメントに結合させる。

得られたＤＮＡフラグメント（６４０ｂｐである）をゲ
ル電気泳動で分離し、ついで制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰ
ｓｔＩで消化したｐｓＡ＋２１４ベクターに挿入する。

リゲーション混合物中、Ｔ４　ｆ）ＮＡリガーゼの存在
下、１４℃において一夜反応を行う。ついで、リゲーシ
ョン混合物を使用して、Ｃｏｎｔｎｅｎｔｅ及びＤｕｂ
ｎａｕ法ＩＪＭｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、Ｊ　１
６７、２５８（１，９７９月によってコンピテントとし
た枯草菌細胞５Ｍ５１１８を形質転換させる。

このようにして形質転換させた細胞を、クロラムフェニ
コールを添加して選択性とした好適な培地で選別する。

組換プラスミドを陽性クローンの１つから単離し、該プ
ラスミドは電気泳動分析及び配列決定において予測した
特性を示す。

このプラスミド（ｐｓＭ２６１と称する）を枯草菌５Ｍ
８１１．８（ｐｓＭ２６１）としてアメリカン・タイプ
・カルチャー・センターに苓託しており、１９８８年７
月１９日付で受託番号Ａ丁ＣＣ６７７４３か付されてい
る。

本発明によれば、ｐｓＭ２６１で形質転換させた枯草菌
５Ｍ５１１８の細胞を、クロラムフェニコールの存在下
、ウシ浸出ブロス（ＤＩＰＣＯ）の如き好適な培地にお
いて細胞内に挿入された遺伝子の発現を達成するｊこ必
要な温度及び期間で培養する。

ついで、破壊した枯草菌ＳＭＳＬ１８（ｐｓＭ２８１励
）ら全タンパク質を抽出し、ヒトβ−インターロイキン
−１を分離、精製する。

細胞の破壊に当たっては、たとえば化学的処理、リゾチ
ームによる酵素分解、ガラスポール等による物理的処理
等、又は好ましくは音波処理の如き各種の方法を利用で
きる。

実際には、本発明の方法に従い、遠沈による培養基から
の分離後、細胞を適当な緩衝液で繰返し洗浄し、１８０
００ｐｓｉでフレンチ・プレス（ＦｒｅｎｃｈＰｒｅｓ
ｓ）を２回以上繰返し通過させることによって破壊する
。

ついで、得られたホモジネートを３８００Ｏｒｐｍで３
０分間遠心分離して、不溶性細胞物質（従来法によれば
、形質転換大腸菌細胞によって発現されたβ−ｈｉＬ−
１の大部分を含有する）からＯＪ溶性フラクションを分
離する。

ついで、上澄液を分析して、ＢＩＯ−ＲＡＤ　ミクロ法
によって全タンパク質の量を測定する（約６．２１９／
村）。

さらＩこ、可溶性フラクション及び不溶性フラクション
の両者について、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上
での電気泳動の後、クマンー・ブルー［ＨａＩＩｌｅｓ
　Ｂ、　Ｄ、及びＲｉｃｋｗｏｏｄ　Ｄ、編ｒゲル・エ
レクトロホレシス・才ブ・プロテインズ：ア・プラクテ
ィカル・アプローチ（Ｇｅ１．　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓｉｓ　ｏｒＰｒｏｔｅｉｎｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｊｓ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ
ｓ社］での染色及びニトロセルロースへの転移後におけ
るイミュノブロツティングによってテストを行う。

得られた結果は、可溶性フラクションにのみ分子１ｉ１
７０（１０ドルトンを有しかつ特異的に抗β〜ＩＬ−１
抗体と反応しうるタンパク質が存在することを示す。

本発明によれば、上述の如くして得られた可溶性フラク
ショ〉・からイオン交換クロマトグラフィーによって組
換β−ｈＪＬ−１をＩ製する。

好ましくは、２ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ｌ　ｐＨ７，５
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムを使用す
る。

ついで、平衡化に使用したものと同じ緩衝液を使用し、
流ｍ２５ｘ（１／時間でカラムからタンパク質を溶出し
、溶出液の吸光度を連続して２８Ｄｎｍでモニターする
。

溶出されたタンパク質を含有するフラクションを集め、
Ｌａｅｍｌｌｌｌｉによって開示されたように［ｒＮａ
ｔｕｒｅＪ　２７７、６８０−６８５（１９７０）コ、
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）上でのゲル電気泳動によってテストする。

β−ｈｌＬ−１を含有するフラクション（単一の狭いバ
ンドを示す）を合わせ、膜上で濾過してａ縮し、タンパ
ク資金（１２，５ｘｇ／：４Ｑを有する溶液を生成する
。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ上における単一の狭いバンド及びＩＩ
ＰＬｃ上におけるシングルビークの存在によってβ−ｈ
！Ｌ−１の純粋性を確認する。

本発明の方法に従って精製したβ−ｈｌＬ−１の生物活
性を比活性１　ｘ　ｌＯ’Ｕ／ａｙ（タンパク質）を存
する標準β−ｈｌＬ−１を使用するテス）・法ｆＫａｙ
ｅらｒＪｌｍｍｕｎｏｌ、　Ｊ　１３．１３３９−１３
４５（１，９８４）コで測定する。

第７図に示すように、β−ＩＬ−１は標準物質より６５
−１０倍高い生物活性を示す。

ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって測定し
た均質なβ−ｈｌＬ−１の分子量は約１７０００ドルト
ンである。

精製した生成物の比活性はｔ　ｘ　ｉｏ’Ｕ／ｌ？（タ
ンパク質）である。

従って、本発明の方法によって得られた均質なヒトβ−
インターロイキン−Ｉは、シングルビーク形として単離
されたものであり、２−メルカプトエタノールの存在下
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動にお
いて唯一の狭いバンドを生ずることによって特徴づけら
れる。

このようにして得られた均質なβ−ｈｌＬ−１は、たと
えば病原体に対する宿主の防御を改善するように、患者
の免疫系を促進する医薬として、又はワクチンにおける
アジュバントとして使用される。

他の臨床上の用途としては、自己免疫疾患の治療及び組
織が傷害を受けた際の修復機構の活性化がある。

得られたヒトβ−インターロイキン−１は、これらの臨
床上の用途を目的としてヒトに投与される。

投与は従来法（筋肉内、静脈内及び皮下注射）によって
行われる。

当然ながら、必要な用量は、病状、治療期間及び投与方
法に応じて変化する。

使用前に凍結乾燥されたβ−ｈｌＬ−１を滅菌水に再溶
解することによって医薬品としての剤形とされる。

さらに、当業者にとって公知の如く、医薬組成物中に安
定化緩衝剤及び静菌剤及び他の一般的な添加剤を配合す
ることもできる。

次に添付図面について説明する。

第１図は、枯草菌においてクローン化され、発現された
遺伝子のヌクレオチド配列から推定されたβ−ｈ！Ｌ−
１の配列を示す図である。図中、アンダーラインしたメ
チオニンは、天然β−ＩＬ−１の配列の一部を構成しな
い唯一のアミノ酸である。

第２図は、枯草菌においてβ−ｈｌＬ−１をクローニン
グする方法を示すダイアグラムである。図中、Ｅ＝　Ｅ
ｃｏＲｒ　、　８＝　ＢａｍＨＩ　、ＩＡ＝旧ｒ＋ｄｌ
ｌｒ、Ｐ＝プロモーターである。

第３図Ａは、枯草菌の細胞から抽出した全タンパク質を
単Ｍし、クマシー・ブルーで染色した１２．５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を示す写真である。Ｉ　：５
Ｍ５１１８；　２　：ＳＭＳＩ１８（ｐｓＭ２１４）；
　３分子量基準物、　４　：５Ｍ５１１８（２６１）。

第３図Ｂは、枯草菌から抽出され、Ｉ２，５％ポリアク
リルアミドゲル上で分離された全タンパク質のイミュノ
プロットを示す写真である。１：５Ｍ５ｉｌｌ！；　　
２　：５Ｍ５ｌ１８（＋）８Ｍ２１．４）：　　３　：
３ＭＳ１１８（ｐｓＭ２６１）。矢印はβ−ＩＬ−１の
位置を示す。

第４図は、枯草菌の粗製抽出物中に存在する全タンパク
！（１）及びＤＥＡＥセルロース上でのイオン交換クロ
マトグラフィー後に得られた各フラクション中に存在す
る全タンパク質のポリアクリルアミドゲル上の挙動を示
す写真である。（２）：ワラクシジン８：（３）＋フラ
クション１０；　（４）：フラクション１２：　（５）
：フラクション１４：（６）フラクション１６：（７）
ニフラクション１８：（８）フラクション２０゜（９）
：フラクション２２；　（１０）：フラクション２４；
（＋１）：フラクション２６：　（１２）フラクション
２８゜第５図は、β−メルカプトエタノールの存在下（
２）及び不存在下（１）における精製β−ＩＬ−１の電
気泳動を示す写真である。（３）；標準β−ＩＬ−１、
（ＳＣＩ、Ａ％’ｏ）。

第６図は、ＤＥＡＥセルロースで精製したβ−ＩＬｌの
ＨＰＬＣによるクロマトグラムを示すチ畢−トである（
技術上の詳細については後述の実施例２参照）。

第７図は、精製β−Ｉ　Ｌ　−１（−０−）泣び標準β
−ＩＬ−１（−・−）の添加後におけるＤＩＯ細胞によ
る標識チミジンの取込みを示すグラフである。

次に、本発明を説明するためにいくつかの実施例を例示
するが、これら実施例は本発明を限定するものではない
。

実施例１ 発現 ａ）組換プラスミドｐｓＭ２６１の作成プラスミドｐｓ
Ｍ２１４　１１１９を、５０ｄ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣ（！
ｐＨ７，５，１０ｄ　Ｍｇ（Ｊ！２．５０ｄ　ＮａＣ（
ｌ及びＥｃｏＲｒ及びＰｓｔ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ）　Ｉ　Ｕを含有する溶液２０μｍ２中、３７℃、
１時間で消化した。ついで、６５℃に１０分間維持して
酵素を不活性化させた。

プラスミドｐＵＣ８−β−ＩＬ−１１０μｇを、上記溶
液１．００μ＆中、Ｈｐａ’ｆｌ及びＰｓｔｌ　　ＩＯ
Ｕを使用し、３７℃、１時間で消化した。同様に、６５
℃に１０分間維持して酵素を不活性化させた。

ついで、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動及び溶
出［Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔｆメソツズ・イン・
エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）Ｊ　６５゜４９９−５６０（１９８０月に
よって、消化混合物から、β−ＩＬ−１をコード付ける
遺伝子を有する６００ｂｐ１’ｌｐａ　ＩＩ　−Ｐｓｔ
　Ｉフラグメントを分離した。

ついで、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＤＮＡ合成機Ｓｙｓｔｅｍ　
Ｏｎｅ　ｐｌｕｓを使用して、β−ＩＬ−！の最初のア
ミノ酸１１個（Ｈｐａ　ＩＩでの切断によってＤＮＡか
ら除去されたもの）をコード付ける３ｓｂｐオリゴヌク
レオチドを合成した。

ＡＴＧメチオニントリブレブト及び制限酵素ＥｃｏＲＩ
での切断によって生じた配列を、配列５′　＾＾丁ＴＣ
ＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＡＡ
ＣＴＧＣＡＣＧＣＴＣ３’３’　　ＧＡＡ丁＾ＣＣＧＴ
ＧＧＡＣＡＴＧＣＴＡＧＴＧＡＣ丁ＴＧＡＣＧＴＧＣＧ
ＡＧＧＣ５’を有するオリゴヌクレオチドの５′末端部
に配置させた。

ついで、合成オリゴヌクレオチド０．５μ９を、６６ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ！　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍｇ
ＣＱ、、１０ｄジチオトレイトール（ＤＴＴ）、Ｉ　ｍ
Ｍ　ＡＴＰ及びＴ４　Ｄｌｒ＾リガーゼ０、ＩＵを含有
する溶液５０μＱ中、６００ｂｐ　Ｈｐａ［−Ｐｓｔ　
Ｉフラグメント２００μ７と接合させた。

反応を１４℃で１４時間行い、ついで６５℃に１０分間
維持して酵素を不活性化させた。

反応混合物をポリアクリルアミドゲルに負荷し、前述の
如くして、６４０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＰｓｌＩ　　Ｄ
Ｎ＾フラグメントを分離、溶出した。

溶出後、該フラグメント１．００ｎｇをＴＥ（１０ｄ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＱｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）２０
μｒｌ中に懸濁させた。

ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌで消化したｐｓＭ２１４１１０
０ｎを含有する溶液２峠を、Ｅｃｏｌ？　ｆ　−Ｐｓｔ
　ｒ　　ＤＮＡフラグメント５ｈｇを含有する溶液（６
６ｄ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ（ｌ　ｐＨ１，５，１０ｍｂｌ
　ＭｇＣＬ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、　　Ｉ　ｍＭ　ＡＴＰ
）５０μ＆に添加し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ０．ＩＵの
存在下、１４℃、１８時間でリガーゼ処理した。

酵素を不活性化した後、全すゲーシタン混合物を使用し
て、Ｃｏｎｔｅｎｔｅ及びＤｕｂｎａｕによって開示さ
れた方法［ＴＭｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　Ｊ　
１６７、２５１−２５８（１９７９）］でココンビテン
とした枯草菌ＳＭＳｌ１ｇ（Ｉｅｕ。

ｐｙｒ、　ＤＩ、　ｎｐｒ”、　ａｐｒ−）を形質転換
させた。

クロラムフェニコール５μｙ／ｘりを含有するＶＹ培地
（Ｙｅａｌ　Ｉｎｒｕｓｉｏｎ　Ｂｒｏｔｈ：　Ｄ［Ｆ
ＣＯ）上、３７℃、１８時間で培養して、形質転換体を
選別した。

期待したバイブリドプラスミドを有する形質転換クロー
ンを、Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ及びＴａ１ｔによって開示さ
れたプラスミドＤＮＡの急速抽出法（ＪＲｅｃｏｍｂ３
ｎａｎｔＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：　Ａｎ　ｆｎ
ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＪ　ｐ、５０−５１゜＾ｄｄｉｓ
ｏｎ　−１ｒｅｓｌｅｙ出版社）により同定した。

各種クローンのプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＰｓｔｌにより、酵素を販売する会社（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ）の推奨する条件下で消化し、０．８％ア
ガロースゲルによって分析した〔Ｍａｎｉａｔｉｓらｒ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌＪＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ｔ（ａｒｂｏｒ　（１９ｇ２）］。

酵素によって切断の後、６４０ｂｐ及び７（１００ｂｐ
の２つのフラグメントを生じたプラスミドの１つを９８
Ｍ２６１と名付け、さらに検討した。

β−ＩＬ−１遺伝子の５′末端領域の正確な配ダリを確
認するため、アルカリホスファターゼによる処理の後、
ＥｃｏＲ１部位の露出した５′末端で６４０ｂｌ）フラ
グメントをマークし、配列決定したＥＭａｘａＩｌｌ及
びＧｉｌｂｅｒｔｒＭｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙＪ（１９８０）］。

配列の分析の結果、期待した遺伝子構造であることが確
認された。

ｂ）枯草菌ＳＭＳ１１ｇ（ｐｓＭ２６ｆ）におけるβ−
ＩＬ−１の発現の証明 クロラムフェニコール５μｇ／　ｘ（ｌを含有するｖＹ
培地中、３７℃で１６時間生育させたＳＭＳｉｌｇ（９
８Ｍ２６１）の菌体培養物１ｎ（ｌから、下記の方法に
よって全タンパク質を抽出した。すなわち、細胞をＥｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機において１分間遠沈し、等容
量の３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｆ　ｐＨ７，６，５ｈＭ
　ＮａＣＩＪで洗浄し、リゾチームＩｘｇ／ｘ（ｌを含
有するＳＥＴ緩衝液（２０％ショ糖、３０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆＪ　ｐｌ（７，６、ｌ　ｍＭＥＤＴＡ）１０
０μｒｌ中に懸濁化させた。

溶菌処理を３７℃において１５分間行った。ついで、１
２５ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ！　ｐＨ６，８，３％ＳＤＳ
、　　３％β−メルカプトエタノール及び２０％グリセ
リンを含有する緩衝液１５０μぐを添加し、混合物をＩ
　Ｑ　Ｇ　’Ｃで５分間インキュベートした。染料（０
，２５％ブロムフェノール・ブルー、４０％ショ糖）２
μａを添加した後、その２０μＣを１５％ポリアクリル
アミドゲル上に負荷した。２ＱＩｌ＋Ａで３時間電気泳
動させた後、クマシー・ブルーで染色することによって
タンパク質バンドを発色させると共に、並行してニトロ
セルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ
　５ｃｈｕｌｌ　４５ｐｘ）に移動させ、ペルオキシダ
ーゼ（Ｍｉｌｅｓ）と複合させたウサギ抗β−ＩＬ−１
抗体及びヤギ抗−ウサギー抗体抗体と処理した。

クマシー・ブルーで染色した後、分子１ｉ１７０００を
育するタンパク質の存在を明確に示した。該タンパク質
は枯草菌５Ｍ５１１８及び３ＭＳ１１８（ｐｓＭ２１４
）の抽出物では存在しない（第３図Ａ）。このタンパク
質は抗β−ＩＬ−１抗体と特異的に反応する（第３図Ｂ
）。さらに、クマシー・ブルーで染色した同じゲル上で
行った密度計測分析では、枯草菌ＳＭＳＩ１８（１）Ｓ
Ｍ２６１．）によって生成されたβ−ＩＬ−１の量が全
タンパク質の６％に相当することを示していた。

菌体溶解物を６５００ｒｐＩＩｌで１０分間遠心分離す
ることによって得られた不溶性細胞フラクションはβ−
ＩＬ−１を含有していないことを示していた。

従って、該タンパク質は完全な可溶形で発現されている
。

実施例２ 組換ヒトβ−インターロイキン−１の精製枯草菌５Ｍ５
１１ｇ（ｐＳＭ２６１）の培養培地１りから遠心分離に
よって湿った菌体４ｇを集めた。

これら菌体を実施例１に記載の如くして洗浄し、Ｆｇ！
壊した。

このようにして得られたホモジネートを、３０ｒｖａｌ
ｌ遠心分離機において、３８００Ｏｒｐｍで３０分間遠
心分離し、上澄液（２９ｘ□を回収した。

ＢＩＱ−ＲＡＤ　ミクロ法によって行った全タンパク質
の測定では、タンパク質含量は６．２ｘ９／’ｘ（ｌで
あった。

ライフ、該上澄液２ｈｔ（ｌを、予め２０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ。

ｐＨ７、５緩衝液で平衡化した１、６Ｘ３５ｃｉ　ＤＥ
ＡＥセルロース（ＤＥ−５２Ｖｈａｔ＋ａａｎ）カラム
に負荷した。

前記と同じ緩衝液を流量２５１７時間で使用して、タン
パク質をカラムから溶出した。

溶出液の吸光度を２８０ｎｍで連続的にモニターしなが
ら溶出を行った。

溶出されたタンパク質を含有するフラクションを集め、
５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動法によってテストしたｆ
ＬａｅｍｍｌｉｒＮａｔｕｒｅＪ　２２７．６８０−６
８５（１９７０）］（第４図）。

β−ｈｌＬ−１を含有するもの（フラクション１４Ｊ９
）（単一の狭いバンドを示した）を合せて、タンパク質
含量約８０μ７／峠を有する溶液６５１を生成した。

ついで、ＹＭ　−１０１１ｉ（１０１１ｉ（Ａ上での濾
過によって該溶液を濃縮し、タンパク質２．５１９／ス
ｅを含有する溶液２１シを生成した（収率７０％）。

このようにして得られたβ−ｈｌＬ−１の純粋性を、β
−メルカプトエタノール減力剤（ｒｅｄｕｃｅｒ）の浮
性下（第５図の２）及び不存在下（第５図の１）におけ
る１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での電
気泳動によって確認した。

ゲルをクマシー・ブルーで染色したところ、サンプルが
唯１つの種類のタンパク質で構成されていることを示し
た。

β−ＩＬ−１サンプルの純粋性をさらに確認するため、
タンパク質溶液５ｕＱを４．６Ｘ　２５０＋ｎｍ　ＡＬ
ＴＥＸ［ＪＬ丁ＲＡＳＩＬ−ＯＤＳタイプのカラム（ｃ
ａｔ、　Ｎｏ、　２５６−２５Ｂｅｃｋｍａ、ｎ）に負
荷し、Ｂｅｃｋｍａｎ　−）ＩＰＬＣクロマトグラフモ
デルｌｌ０Ｂを使用し、０．１％ＴＦＡＯリフルオル酢
酸）水溶液から８０％ＣＨ３ＣＮ（アセトニトリル）中
にＴＦＡｏ、１％を含む溶液までのグラデイエンドによ
ってクロマトグラフィー処理した［Ｄｅｗｈｉｒｓｔ　
Ｆ、Ｅ、らｒＪ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．　Ｊ　１３５．
２５６２−２５６８（１９８５）］。

第６図に示されるように、β−ｆＬ−１サンプルは保持
時間４３．６８３分でシングルピークとして溶出された
。

このβ−ＩＬ−１サンプルの生物活性を、Ｋａｙｅらに
よって開示されたテスト法［ｒＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙＪｔ見、　１３３９−１３４５＜１９８４月で測定
した。特に、融解シタハカリノＤ１０細胞を、２５＋ｎ
Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　５０ｔｔ９／ｘ（１ゲンタマイシン
、２ｄＬ−グルタミン、１０％非相補性（ｕｎｃｏｍｐ
ｌｅｍｅｎｔｅｄ）ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ。

５ｔｅｒｉｌｅ　Ｓｙｓｔｅｍ）及び６　Ｘ　１０−’
Ｍ　２−メルカプトエタノールを含存すルＲＰＭＩ−１
６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中において、平底のＣ１ｕｓ
ｔｅｒ′ａプレートミクロデイツノ５　（Ｃｏｓｔａｒ
）に分配した（２ＸｌＯ’／デイツシユ）。

同じ培地で希釈した標準ＩＬ−１又はサンプルの各挿置
を各デイツシュに３個１組として添加した。

さらにＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）を最終濃度２．５
μ２／１ｇで添加した。各デイツシュの最終容量は０．
２１Ｑであった。

３７℃で４８時間インキュベートした（湿潤状態、５％
Ｃ０７）。増殖を測定するため、各デイツシュ当たりａ
、５ｔｔ　ｃｒのトリチウム標識チミジン（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ、比活性２Ｃｉ／ミリモル）を添加し、これらを
さらに１６−１．８時間インキュベートシた。

各デイツシュからマルチプル細胞回収装置（Ｓｋａｔｒ
ｏｎ）によって菌体を集めた後、増殖した細胞によって
取込まれた放射能を液体シンチレーションによって評価
した。

第７図に示すように、ＤＩＯ菌体によって取込まれた標
識チミジンの最大量は、精製したβ−１１゜１１０ｐｇ
を添加した場合に見られ、この濃度は標準β−ＩＬ−１
（ＳＣＬＡｖＯＸ比活性１０７Ｕ／Ｒｙを有する）につ
いて要求されるものの１．１５ないしｌ／１０である。

第１表は、相対収率及び精製ファクターと共に、使用し
た精製スキームを示す。

第　　１　　表 菌体２当たりの　　比活性　ｉｌ！算の収率注タンへす
質のＩｔ　（ｕ）　　　（Ｕｎｉ４２−（駕）抽出物　
　　　　４５　　　　　２ＸＩＯ＠ＤＥＡＥｔラム　　
　　　　　　１．１１６　　　　　　　　　　　　１Ｘ
ＩＯ”　　　　　　　　７０精製７Ｔタター 注：収率は、ポリアクリルアミドゲルの密度測定分析に
よって測定されたタンパク！調製物の濃度に基いて評価
されたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法によって生成された組換ヒトβ−
インターロイキン−１のアミノ酸配列を示す図、第２図
は枯草菌においてβ−ＩＬ−１をクローニングする方法
を示すダイアグラム、第３図は枯草菌から抽出した全タ
ンパク質の１２，５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を示す（Ａ）と共に、枯草菌から抽出され、１２．５％
ポリアクリルアミドゲル上で分離された全タンパク質の
イミュノプロットを示す（Ｂ）写真、第４図は枯草菌の
粗製抽出物中に存在する全タンパク質及びＤＥＡＥセル
ロース上でのイオン交換クロマトグラフィー後に得られ
た各フラクション中に存在する全タンパク質のポリアク
リルアミドゲル上の挙動を示す写真、第５図はβ−メル
カプトエタノールの存在下及び不存在下における精製β
−ＩＬ−１の電気泳動を示す写真、第６図はＤＥＡＥセ
ルロースで精製したβ−ＩＬ−１のＨＰＬＣによるクロ
マトグラムを示すチャート、第７図は精製β−ＩＬ−１
及び標準β−ＩＬ−１の添加後におけるＤＩＯ細胞によ
る標識チミジンの取込みを示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　エンドトキシンを含有せず、比活性少なくとも１−
   １０＾８Ｕ／ｍｇ（タンパク質）を有する均質な組換ヒ
   トβ−インターロイキン−１の製法において、 ａ）ヒトβ−インターロイキン−１をコード付ける遺伝
   子を含有する組換ＤＮＡ分子によって形質転換させたバ
   チルス属の宿主微生物を適切な培地で培養し、 ｂ）宿主細胞を破壊した後、遠心分離によって、不溶性
   細胞フラクションから可溶性フラクションを分離し、 ｃ）該可溶性フラクションから、イオン交換クロマトグ
   ラフィーによる単一工程で均質な組換ヒトβ−インター
   ロイキン−１に精製する、ことを特徴とする、均質な組
   換ヒトβ−インターロイキン−１の製法。 ２　請求項１記載の製法において、前記宿主微生物が枯
   草菌である、均質な組換ヒトβ−インターロイキン−１
   の製法。 ３　請求項１記載の製法において、前記組換えＤＮＡ分
   子が、バチルス属菌における発現性を有する複製可能な
   クローニングベクターをヒトβ−インターロイキン−１
   をコード付ける遺伝子に結合させることによって調製さ
   れたものである、均質な組換ヒトβ−インターロイキン
   −１の製法。 ４　請求項３記載の製法において、前記クローニングベ
   クターが枯草菌において複製可能なプラスミドである、
   均質な組換ヒトβ−インターロイキン−１の製法。 ５　請求項４記載の製法において、前記プラスミドがｐ
   ＳＭ２１４　ＡＴＣＣ　６７３２０である、均質な組換
   ヒトβ−インターロイキン−１の製法。 ６　枯草菌における発現性を有する複製可能な組換ＤＮ
   Ａ分子（ｐＳＭ２６１）（ＡＴＣＣ　６７７４３）。 ７　請求項１記載の製法において、前記工程ａ）で使用
   する培地がウシ浸出ブロスであり、培養をクロラムフェ
   ニコールの存在下、温度２５ないし４０℃で行う、均質
   な組換ヒトβ−インターロイキン−１の製法。 ８　請求項１記載の製法において、前記工程ｂ）におけ
   る細胞の破壊を、フレンチ・プレスによる１８０００ｐ
   ｓｉでの物理的処理によって行う、均質な組換ヒトβ−
   インターロイキン−１の製法。 ９　請求項１記載の製法において、前記工程ｃ）におけ
   るイオン交換クロマトグラフィーを、ＤＥＡＥセルロー
   スカラムを使用し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．
   ５緩衝液によって溶出して行う、均質な組換ヒトβ−イ
   ンターロイキン−１の製法。 １０　請求項１−９記載の製法に従って得られた組換ヒ
   トβ−インターロイキン−１を疾患の治療及び予防に使
   用する、組換ヒトβ−インターロイキン−１の使用法。 １１　請求項１−９記載の製法に従って得られた組換ヒ
   トβ−インターロイキン−１を治療上有効な量で含有し
   てなる、医薬組成物。