JPH0198969A - レセプターの新規な結合測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本願発明は細胞に存在しである種の細胞外の物質（リガ
ンド（ｌｉｇａｎｄ）という）を特異的に認識し、これ
を刺激として細胞に応答をなさしめる構造体であるレセ
プター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ；若しくは受容体とも呼ばれ
る）の測定手段の一つである、結合測定法（Ｂｉｎｄｉ
ｎｇ　Ａｓ５ａｙ）に関する新規な方法に関するもので
ある。

この発明により可溶化レセプターとリガンドとの結合の
様相の研究、レセプターの精製等で用いられているレセ
プターの結合測定が、後述する従来法と比較して極めて
容易となるため、本願は産業上の利用価値の高いもので
ある。

〔従来の技術〕

上述したようにレセプターはホルモンや神経伝達物質等
の細胞外物質を特異的に認識し、それを刺激として細胞
内に情報伝達する物質であって、生体全体としての恒常
性を保つための情報伝達系における一構成要素である。

このためレセプターの研究は細胞の機能に対する基礎的
な研究上極めて重要なものである。また、レセプターの
異常は様々な疾患（例えばインシュリン抵抗性糖尿病、
重症筋無力症など）を引き起こすため、レセプターの研
究は医学的にも注目されている領域である。

従来可溶化されたレセプターを定量的に測定するのには
所謂「結合測定法」が広く用いられてきている。この測
定法はレセプターと該レセプターに特異的に結合する標
識されたりガントとを反応させ、レセプターに結合した
りガントと遊離しているリガンドとを分離し、レセプタ
ーに結合したりガントの標識を測定することによって、
レセプターの親和性や量などを測定する方法である。そ
してこの方法は血清中のレセプターや生体組織を可溶化
させた試料中のレセプターの定量において、ラジオイム
ノアッセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ）等
の免疫測定法と異なり、モノクローナル抗体を調製する
必要がない点に特長を有している。

この結合測定法においてその精度を左右するのは、レセ
プターと結合したリガンドと遊離しているリガンドとを
分離する作業である。そして従来は硫安沈澱法（Ｈｕｄ
ｇｉｎ、　Ｒ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
。

Ｃｈｅｍ、　２４９．５５３６−５５４３（１９７４）
）　、ポリエチレングリコール沈澱法（Ｔａｋｅｔａｎ
ｉ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６２．８６６８−８６７０１９８７））
　、リポソーム　（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）中でのレセプタ
ー再構成法（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ。

Ｗ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、　２５５．１１４４２−１１４４７（１９８０）　
）などが分離方法として用いられてきている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら硫安沈澱法とポリエチレングリコール沈澱
法では、レセプター結合リガンドと遊離リガンドとの間
に適当な溶解度の差がなければならないために、全ての
レセプターがこれらの方法で測定できる訳ではなく、あ
る限られたレセプターのみしか測定できないという難点
があった。

またリポソーム中へのレセプター再構成法は、可溶化さ
れたレセプター溶液中に存在する界面活性剤を除去し、
レセプターをリポソーム中に取り込ませることが容易で
ないために、操作全体が非常に煩雑になるという問題点
があった。

〔問題点を解決するための手段〕

本願発明者らは、以上のような問題を解決するために鋭
意研究してきた。その結果、 ■可溶化されたレセプターを含む試料を化学的に活性で
不溶性の基質に接触させてレセプターを該基質に固相化
（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）する。

■該しセプターと特異的に結合する標識されたりガント
を上記該基質に接触させる。

■該しセプターに結合しなかった遊離該リガンドを除去
する。

という方法を採ることにより、極めて容易にレセプター
結合リガンドと遊離リガンドとの分離が可能となり、従
来の問題点が大きく改善できることを見い出し、本願発
明を完成するに至った。

即ち、レセプターが固相（ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ）で
ある基質に固相化されているために、レセプターを含有
する試料とリガンドとを反応させた後に基質の表面を静
かに洗浄するという簡単な操作だけで、レセプター結合
リガンドと遊離リガンドをほぼ完全に分離することがで
きる点に、本願発明方法の従来方法に対する優位性があ
る。

以下に本願発明の好ましい態様を述べる。

レセプターを含む試料は生体組織より公知の細胞分画法
（例えば佐藤了　編、「細胞分画法」、岩波書店（１９
７２）を参照）によって膜画分を得、界面活性剤で可溶
化したものを用いる。試料が血清の場合はそのまま用い
れば良い。

レセプターを固相化する基質としては、その表面に遊離
エポキシ基を有するメタクリルアミド（ｍｅｔｈａｃｒ
ｙｌａｍｉｄｅ）、アリル−グリシジル−エーテル（ａ
ｌｌｙｌ−ｇｌｙｃｉｄｙｌ−ｅｔｈｅｒ）及びＮ−メ
チレン−ビス−メタクリルアミド（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｅ
ｎ−ｂｉｓ−ｍｅｔｈａｃｒｙＩａｍｉｄｅ）の共重合
体であるものが最適である。そして基質の形状はビーズ
状であり、直径が１〜ｌＯｍのものが本願方法の工程の
操作（反応を行なう容器に基質を１個づつ入れる操作、
固相と液相を分離する操作など）上、取扱いがしやすく
好ましい。これらの条件を満たすものとしてはオイパー
ギット＠　（Ｅｕｐｅｒｇｉ　ｔ）　ＣＢ−６２００（
ローム・ファルマ社製、直径約６画）として市販されて
いるものが最適である。

なおオイパーギット自身はこのように市販品であって、
蛋白質、酵素、ホルモン、抗体、アミノ酸、Ｉｉ類のよ
うな生体物質を同相化するのに用いられ、固定化酵素カ
ラム（Ｗｅｈｎｅｒｔ、　Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　７．
８２７−８３０（１９８５））、或はアフィニティカラ
ム（渡辺ら、医学と生物学。

監５７−６２（１９８４）　）として広く使用されてい
る。

しかしながらオイパーギットを固相化レセプターの結合
測定法においてレセプターを固相化する基質として使用
することは本願発明者らが初めて行なったことである。

リガンドの標識は通常ｌ２ｓＩを使用する。

以上のものを用いて概略以下のようにして測定を行なう
。

１）可溶化されたレセプターを含む試料溶液の入った試
験管にビーズを入れ、１６〜２０時間４°Ｃで放置して
レセプターをビーズ表面に固相化する。

２）次に試料溶液を捨て、０．１５ＭのＮａＣｌを含む
０．０１Ｍ、ｐＨ７，１の燐酸緩衝液（以下ＰＢＳトイ
ウ）にウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡという。シグマ
社製）を加えた溶液を添加して１６〜２０時間４°Ｃで
放置し、ビーズ表面の未反応のエポキシ基をＢＳＡでブ
ロックする。

３）ＢＳＡを含むＰＢＳを捨て、ビーズを１１５１で標
識されたリガンドを含むＰＢＳ　（ＢＳＡを含有する）
に入れる。別に標識リガンドと非標識リガンド（標識リ
ガンドの約１０００倍量）の両者を含む緩衝溶液にもビ
ーズを入れる。

どちらも３７°Ｃで１時間保持してリガンドをビーズに
固相化されたレセプターに結合させる。

４）界面活性剤を含むＰＢＳでビーズを静かに洗浄し、
ビーズの放射能を測定する。

５）標識リガンドのみと反応させたビーズのデータの値
（＝全結合）から、非標識リガンドと標識リガンドとに
反応させたデータの値（＝非特異的結合）を差し引いて
「特異的結合の値」とし、これをレセプターの定量や各
種分析に供する。

以下にトランスフェリン・レセプターの結合測定を実施
例として本願発明の実施態様を記載する。

〔実施例〕

八−跋料夏皿製 トランスフェリン・レセプターを含む試料としではヒト
胎盤刷子縁膜（ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｂｒ
ｕｓｈｂｏｒｄｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ；以下単に「膜
Ｊという）を可溶化したものを用いた。膜の原料である
ヒト胎盤は、正常妊娠の分娩後６０分以内に得られたも
のを用い、これからの膜の調製は高見ら（Ｔａｋａｍｉ
、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　
Ａｃｔａ、　８８４．３ｌ−３８（１９８６））の方法
に従って行った。膜の可溶化には１％のトリトンＸ−１
００■（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００；シグマ社製）を含
むＰＢＳを用いた。

Ｂ、　　　　トランスフェリンｄｉｆｅｒｒｉｃ　ｔｒ
ａｎｓｆｅｒリガンドである鉄飽和トランスフェリンの
調製は角尾ら（Ｔｓｕｎｏｏ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｓｕｓｓ
ｍａｎ、　Ｈ，Ｈ，、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５８．４１１８−４１２
２（１９８３））の方法に従って行なった。

Ｃ０トランスフェリンの１２５１による　−鉄飽和トラ
ンスフェリン（以下、単に「トランスフェリン」という
）のｌ２ｓＩによる標識はヨードビーズ＠（ピアス社製
）を用いた。即ち１００μｇのトランスフェリンを０．
５Ｍ、　　ｐＨ７，０の燐酸緩衝液２００μ℃に溶かし
、これを［１２５１コＮａ溶液（アマジャム社製）に加
え、更にヨードビーズを２〜３個加えた。室温で２０分
間反応させた後、反応液をセファデックスＧ−２５０（
ファルマシア社製；０．１％のオボアルブミンを含むＰ
ＢＳで予め平衡化しておいたもの）でゲルろ過して、遊
離の１２５１を除いた。

た膜蛋白質と［”Ｑ］　Ｎａ溶液とヨードビーズを室温
で２０分間反応させた。反応液をセファデックスＧ−２
５（１％のトリトｙＸ−１００を含むＰＢＳ　テ予め平
衡化しておいたもの）でゲル濾過して遊離の１２５Ｉを
除いた。

本明細書において以下に記載されたデータは、全て二重
系（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で行なって得られた２つの値
の平均値である。また、＋２５１で標識された鉄飽和ト
ランスフェリンを「＋２ＳＩ）ランスフェリン」と記す
。

本実施例で用いるオイパーギットＣＢ−６２００ビーズ
の可溶化膜蛋白質固相化能を知るために、Ｄ。

に従って標識された様々な濃度のＩ２５１＝可溶化膜蛋
白質を含む１％のトリトンＸ−１００含有ＰＢＳ　４０
０μｌにオイパーギットＣＢ−６２００ビーズ１個を入
れ、４°Ｃで１６時間固相化した。溶液を捨て、ビーズ
を０．１％のツイーン−２０■（Ｔｗｅｅｎ−２０；シ
グマ社製）を含むＰＢＳＩＴｎｌでビーズを２回静かに
洗浄した後、ビーズの放射線量を測定した。結果はＨ０
試験結果の第１図に示す。

Ｆ、　　　ヒトランスフェ１ン・レセプ　−の　へ皿定 ａ）　　１０　Ｘ　７５ｍｍの使い捨てガラス製試験管
に４００μｌの可溶化膜蛋白質溶液を入れ、オイパーギ
フトＣＢ−６２００のビーズを１個加えて、４°Ｃで１
６〜２０時間反応させて可溶化膜蛋白質をビーズ表面に
固相化した。

ｂ）　ビーズを残して可溶化膜蛋白質溶液を捨て、１％
のＢＳＡを含む４００μｌのＰＢＳを加え、４℃で１６
〜２０時間反応させてビーズ表面の未反応の活性エポキ
シ基をブロックした。

Ｃ）　ビーズを残してＢＳＡ溶液を捨て、４００μ！の
＋ｚｓ■−トランスフェリン溶液を加え、３７°Ｃで１
時間反応させた。該＋２５１−トランスフエリン溶液は
１％のＢＳＡを含むＰＢＳである。

これとは別に、ＩＺＳＩ）ランスフェリンとこれの１０
００倍量の非標識トランスフェリンを含む１％のＢＳＡ
含有ＰＢＳ溶液４００＃ｆを用いて、上と同じ条件でビ
ーズと反応させた。

ｄ）　　”５Ｉ−）ランスフェリン溶液を捨て、０．１
％のツイーン−２０を含むＰＢＳ　１−でビーズを２回
静かに洗浄した後、ビーズの放射線量を測定した。

ｅ）ｌｔ５■−トランスフェリンのみと反応させたビー
ズのデータの値（＝全結合）から、非標識トランスフェ
リンとＩＺＳＩ）ランスフェリンとに反応させたデータ
の値（＝非特異的結合）を差し引いて特異的結合の値と
した。後述するＨ０試験結果の第２図及び第４図に記さ
れたデータは全てこの特異的結合の値である。

Ｇ　　　　′庁の悄 各蛋白質の濃度の測定はＢＳＡ溶液を標準としてローリ
−法（Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

月じ工２６５−２７５　（１９５１））若しくは５ＯＳ
−ローリ−法（Ｗａｎｇ＋　Ｃ，Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６３　４１４−４
１７　（１９７５）　）によった。

且−試験結果 以上の試験の結果を第１図〜第４図に示す。

第１図は固相化に用いた可溶化膜蛋白質の量と実際に１
個のビーズに固相化された可溶化膜蛋白質の量の関係を
示すグラフ（両対数）である。固相化に用いられた可溶
化膜蛋白質濃度が１８０　ｕ　ｇ／ｍｌから４　、５ｍ
ｇ／−の範囲ではグラフは直線であるとみなすことがで
き、少なくともこの濃度領域では固相化に用いた可溶化
膜蛋白質の量と実際にビーズに固相化された可溶化膜蛋
白質の量は正の相関関係にあり、かつオイバーギットＣ
Ｂ−６２００ビーズの可溶化膜蛋白質の固相化能は飽和
していないことを示している。

第２図はビーズに固相化する際に用いる可溶化膜蛋白質
の量を変化させ、これに一定濃度の１２５１−トランス
フェリンを反応させたときのｌ　Ｚ５Ｉ−トランスフェ
リ−ンの結合量の関係を示すグラフである。Ｆ、ａ）の
可溶化膜蛋白質のビーズへの固相化は４°Ｃで１６時間
行ない、Ｆ、ｃ）のリガンド溶液は全量４００μ！に１
．３３μｇの１２５■〜トランスフエリンを含むものを
用いた。この図から、ビーズへの固相化に用いた可溶化
膜蛋白質の量と結合１２５１）ランスフェリン量は正の
相関関係にあり、測定される放射線量は可溶化膜蛋白質
の量の指標となることが示される。

第３図は一定量の＋２Ｊ　　）ランスフェリンと一定量
の固相化された可溶化膜蛋白質との結合反応に際して、
非標識トランスフェリン（・−・）、オボアルプミン（
０−○）、またはヒト血清アルブミン（△−Δ）を阻害
剤としてその量を増加させつつ競合反応させたときの結
合＋２Ｊ　　）ランスフェリンを示すグラフである（阻
害剤を加えない時の結合＋ｚｓ４　　）ランスフェリン
量をコントロールとする）。Ｆ、ａ）において固相化に
用いた膜蛋白質の量は３．５ｍｇ／ｍｌで全量は４００
μｌであり、４°Ｃで１６時間かけて固相化した。Ｆ、
ｃ）のリガンド溶液は全量４００μ！に１３．３μｇの
１２５１　　）ランスフェリンを含むものを用いた。こ
の図からインヒビターが非標識トランスフェリンの場合
は、横軸が２、即ちインヒビターが標識トランスフェリ
ンの１００倍存在すると約９０％も結合が阻害されるこ
とが読み取れる。ところがインヒビターがオボアルブミ
ンやヒト血清アルブミンの場合は、横軸が３或は４、即
ちインヒビターが標識トランスフェリンの１０００倍或
は１００００倍存在していても結合の阻害は最大約２０
％程度に過ぎないことが示されている。

以上から本発明の方法で測定しているものはトランスフ
ェリンと特異的に結合する物質であることが知れる。

第４図Ａは一定量の固相化された可溶化膜蛋白質に対し
てリガンド溶液の濃度を変化させたときの１′■−トラ
ンスフェリンの結合を示したグラフである。Ｆ、ａ）に
おいて固相化に用いた可溶化膜蛋白質の量は３．５ｍｇ
／ｇｉで全量は４００ｕ１．であり、４°Ｃで１６時間
かけて固相化した。Ｆ、ｃ）のりガント溶液は全量４０
０ｕｆｆｉに０〜７６４０ｇの１Ｚｓｒ　　）ランスフ
ェリンを含むものを用いた。このグラフの形状はあるレ
セプターとそれに対する特異的なリガンドとの組合せで
見い出される典型的な直角双曲線である。

そこで第４図Ａのデータを元にしてスキャチャード・プ
ロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ　Ｐｌｏｔ；　５ｃａｔｃ
ｈａｒｄ、　Ｄ、。

Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　５１．
６６０（１９４９）　、小用紀ｔ１１編著、「脳のレセ
プター、　ｐｐ、３３−３６、世界保険通信社（１９８
６）　）を描いたのが第４図Ｂである。

なお、スキャチャード・プロットにおいては、横軸は結
合リガンドの量であり、縦軸は［レセプター結合リガン
ド濃度］／［遊離リガンド濃度］である。直線の傾きは
見かけの解離定数をＫｄとしたとき一１／Ｋｄに相当し
、Ｘ切片は最大リガンド結合量を表わす。

故に第４図Ｂのグラフから１２ｓＩ　　）ランスフェリ
ンの可溶化膜蛋白質に対する見かけの解離定数Ｋｄは１
．８　Ｘｌ０−’　Ｍ、１２５（）ランスフェリンの最
大結合量は０．５ｎｇ／ビーズであることが示される。

角尾ら（Ｔｓｕｎｏｏ、■、ａｎｄ　Ｓｕｓｓｍａｎ、
　Ｈ，ＨｌＪ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２５８　４１１８−４１２２（１９８３
））によれば可溶化ヒト胎盤刷子縁膜と１２５１　　）
ランスフェリンの解離定数はｐＨ７，４で２．４　Ｘｌ
０−９Ｍ、クラウスナーら（Ｋｌａｕｓｎｅｒ、　Ｒ，
Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、ξ＋０．２２６３−２２６６（１
９８３））によればに５６２細胞と１２５ｒ−トランス
フェリンの解離定数はｐＨ７，２で１．９　Ｘｌ０−９
Ｍと報告されていることから、本願発明の方法による解
離定数の値はこれらの値に極めて近いものであり、本願
方法の信頼性を物語るものであるといえよう。

また、第１図のグラフに基づいて求められた固相化に用
いた可溶化膜蛋白質の量と実際にビーズに固相化された
可溶化膜蛋白質の量の関係式により、固相化に用いた可
溶化膜蛋白質の量（＝３．５■／−）からビーズに固相
化された可溶化膜蛋白質量が計算できる（＝０．８μｇ
／ビーズ）ので、上述の１２Ｊ　　）ランスフェリンの
１ビーズ当たりの最大レセプター結合量＝０．５ｎｇと
いうデータから、１μｇの可溶化膜蛋白質に結合する＋
２Ｊ　　）ランスフェリンの最大量は０．６ｎｇである
ことが算出される。角尾ら（Ｔｓｕｎｏｏ、　ｏ、　ａ
ｎｄ　Ｓｕｓｓｍａｎ、　Ｈ，）１．＋Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、、　２５８　４１１８−４１２２（１９
８３））の報告によれば可溶化ヒト胎盤刷子縁膜１μｇ
当たりの１２５１　　）ランスフェリンの最大結合量は
０．７ｎｇであるから、この点から言っても本願発明の
方法による測定法は信頼に値するものであることが示さ
れるのである。

以上本明細書においては実施例はレセプターとしてトラ
ンスフェリン・レセプターを用いたもののみを記載した
が、本発明はこれに限定されるものでは決してなく、そ
の他のレセプターであっても本願記述の方法に準じて基
質に固相化することにより、レセプターと結合したりガ
ントと遊離リガンドとを分離する作業が容易になり、結
合測定を簡便に行なうことができるものが数多く存在す
るであろうことは当業者において容易に予測できよう。

例えば、血清蛋白質ではＬ　Ｄ　Ｌ　（ｌｏｗ　ｄｅｎ
ｓｉｔｙ　１ｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；低密度リボ蛋白質
）、アシアロａｉ白ｓ、セルロプラスミン、ヘモグロビ
ン−ハプトグロビン複合体、フェリチン、ヘモベキシン
とこれらのレセプター、ホルモン及び成長因子ではイン
シュリン、ソマトメジン、ｌ”　ＣＦ　（ｅｐｉｄｅｒ
ｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：上皮細胞成長因
子）、ＰＤＧＦ　（ｐｌｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　
ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；血小板由来成長因子）　
、Ｔ　Ｇ　Ｆ　（ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔ
ｏｒ；腫瘍成長因子）とこれらのレセプター、神経伝達
物質ではアセチルコリン、Ｇ　Ａ　Ｂ　Ａ　（７−ａｍ
ｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ）　、サブスタンスＰ、
エンケファリンとこれらのレセプターなどへの応用が考
えられる。またレセプターを固相化する基質の形状につ
いても実施例ではビーズ状のもののみを記載したが、本
発明の効果は他の形状でも期待できるものであることは
言うまでもなく、本願発明に包含されるものである。

〔発明の効果〕

以上の説明から示されるように可溶化されたレセプター
を固相基質に固相化させる工程を特徴とする本願発明の
方法は、従来の結合測定法のネックであったレセプター
と結合したリガンドと遊離しているリガンドとを分離す
る作業を非常に容易かつ信頬性の高いものにする。そし
て更に本願方法を用いることにより、レセプター結合リ
ガンドと遊離リガンドとの間に適当な溶解度の差がなか
ったために、これまで結合測定を行なうことができなか
った系であってもこれを簡便に実施することができるよ
うになる。

【図面の簡単な説明】

第１図は固相化に用いた可溶化膜蛋白質の量と実際に１
個のビーズに固相化された可溶化膜蛋白質の量の関係を
示すグラフ（両対数）である。第２図はビーズに固相化
させる可溶化膜蛋白質の量を変化させ、これに一定濃度
の１２５１　　）ランスフェリンを反応させたときの１
２５１　　）ランスフェリンの結合量の関係を示すグラ
フである。第３図は一定量の１２５■−トランスフェリ
ンと一定量の固相化された膜蛋白質との結合反応に際し
て、非標識トランスフェリン（・−・）、オポアルプミ
ン（Ｏ−○）、またはヒト血清アルブミン（△−Δ）を
インヒビター（阻害剤）としてその量を増加させつつ競
合反応させたときの結合１２ｓｒ　　）ランスフェリン
を示すグラフである。第４図Ａは一定量の固相化された
可溶化膜蛋白質に対してリガンド溶液の濃度を変化させ
たときの１２５１）ランスフェリンの結合を示したグラ
フである。第４図Ｂは第４図Ａのデータを元にしてスキ
ャチャード・プロットしたものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、可溶化されたレセプターを含む試料を、不溶性の基
   質に接触させてレセプターを該基質に固相化し、該レセ
   プターと特異的に結合する標識されたリガンドを上記該
   基質に接触させ、該レセプターと結合しなかった遊離該
   リガンドを除去し、該基質上の該レセプターに結合した
   該リガンドの標識を測定することを特徴とする、レセプ
   ターの結合測定方法。２、レセプターがトランスフェリ
   ン・レセプターでありかつ、リガンドがトランスフェリ
   ンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   レセプターの結合測定方法。 ３、基質がメタクリルアミド、アリル−グリシジル−エ
   ーテル及びＮ−メチレン−ビス−メタクリルアミドの共
   重合体であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載のレセプターの結合測定方法。 ４、基質の形状が直径１乃至１０ｍｍの球状であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のレセプターの
   結合測定方法。 ５、標識が１２５Ｉであることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載のレセプターの結合測定方法。