JPH10506015A

JPH10506015A - Ｇｌｕｔ−４小胞に由来するインスリン−依存性の膜アミノペプチターゼのクローニング

Info

Publication number: JPH10506015A
Application number: JP8511031A
Authority: JP
Inventors: ノウルズ，ウイリアム・ジエイ; グラルスキ，ドナ; レツツインガー，ジヨン・テイ; ヘイ，ウオーレス; ハート，ジヨン・テイ; クレアモント，ケビン・ビー
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 1998-06-16
Also published as: EP0782581A1; WO1996009317A1; AU3719195A; NZ294397A; AU709169B2; US5972680A; MX9702152A; EP0782581A4; US5968764A; CA2200354A1

Abstract

(57)【要約】インスリンを開裂するアミノペプチダーゼを、GLUT-4-含有小胞から精製し、そしてクローン化した。このペプチダーゼは、約165kDの測定質量を有するが、その脱グリコシル化状態では110kDである。これは図（配列番号１５および１６）のｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列に基づき、117,239ダルトンの予想質量を有する。これはアミノ酸配列Phe-Ala-Ala-Thr-Gln-Phe-Glu-Pro-Leu-Ala-Ala（配列番号１）およびIle-Leu-Gln-Asn-Gln-Ile-Gln-Gln-Gln-Thr-Arg-Thr-Asp-Glu-Gly-Xaa-Pro-Xaa-Met（配列番号２）を有するペプチドを含み、そして（配列番号１）と同定されたペプチドに対して生成された抗体に結合する。アミノペプチダーゼ活性のモジュレーターおよびそのようなモジュレーターの投与により、糖尿病を含むインスリン耐性症候群を処置する方法も特許請求する。

Description

【発明の詳細な説明】 GLUT-4小胞に由来するインスリン−依存性の膜アミノペプチダーゼのクローニング分野本出願は糖尿病の生化学に関し、そしてより詳細にはインスリンの調節に関与するアミノペプチダーゼに関する。背景脂肪細胞およびミオサイトは、インスリンの刺激に際して形質膜に融合する細胞内GLUT-4含有小胞を含む。生じる形質膜内のGLUT4上昇は、インスリン−刺激状態でグリコース輸送が10−20倍増加する原因である。GLUT4-含有小胞の細胞質から形質膜との融合への移動は、トランスローケーションと呼ばれる過程であるが、インスリン耐性およびインスリン非依存性糖尿病(NIDDM)の両方において、異常であると考えられている(B.Kahn,J.Clin.Invest.,89,1367-1374,(1992))。 GLUT4-含有小胞の形質膜への正常なインスリン-刺激トランスローケーションの分子機構、および同時に生じる影響を受けた細胞によるグルコース取り込みの増加は、今だに大部分が未知のままである。提案された機構には、GLUT4−含有小胞ドッキングおよび形質膜との融合の両方が含まれる。 GLUT4-含有小胞は、脂肪細胞中の全細胞内小胞群中でほんのわずかな画分にすぎない(Jamesら、J.Biol.Chem.,262,11817-11824,(1987))。これらのGLUT4小胞は、GLUT4の細胞質に向いたＣ−末端に対する抗体を用いた免疫アフィニティー法を使用して、低密度ミクロソーム画分から単離できる(Jamesら、J.Biol.Chem. ,262,11817-11824,(1987);Thoidis ら、J.Biol.Chem.,268,11619-11696(1993))。GLUT4-濃縮小胞は、小胞会合膜タンパク質(VAMP)(Cainら、J.Biol.Chem.,267,11681-11684(1992))を含む幾つかのシナプス小胞−様タンパク質、分泌キャリアー会合膜タンパク質(SCAMP)(Laurie ら、J.Biol.Chem.,268,19110-19117,(1993))、および初めに脳で同定されたある ras類似タンパク質（Rabタンパク質)(Cormontら、J.Biol.Chem.,268,19491-1949 7,(1993))を含むことが示された。現在では、NIDDMの薬理学的治療は、疾患の病態生理学的な異常性の鍵であるインスリン耐性を標的にできない。現存する治療は、１）食事および運動；２）スルホニルウレア、これはインスリン分泌を刺激する；３）α-グルコシダーゼインヒビター、これは複雑な炭化水素の酵素的消化を阻害し、そしてこれにより食後のグルコース吸収を遅らせる；４）メトホルミン、この機作は肝のインスリン感受性を向上させることを含むようである、そして５）インスリン注射である。インスリン耐性を標的とし、そしてインスリン感受性を向上させる治療薬は、上記に掲げた治療に優る重要な利点を有する。そのような治療薬が本発明の主題である。GLUT4小胞と会合するアミノペプチダーゼをモジュレートすることにより、インスリン感受性を増大させることが本発明の目的である。要約本発明は新規アミノペプチダーゼに関し、本明細書ではGTVapと命名するが、これはGLUT4-含有小胞の成分であり、そしてインスリン−シグナル伝達経路に関与している。また糖尿病を処置するために、このタンパク質の治療用モジュレーターの使用にも関する。本発明のさらなる観点を以下に論ずる。ペプチドシグナル伝達分子のダウンレギュレーションは、正常な恒常性を維持するために重要である。より詳細には、活性インスリンのダウンレギュレーションまたは除去は、非糖尿病の個体に低血糖症を生じる高インスリン症を予防するために重要である。現在のドグマは、すべての循環しているインスリンはインスリンレセプターに結合した後に分解され（インターナリゼーション）、そして最終的に予め特徴づけられているインスリン分解酵素(IDE)により細胞内でタンパク質溶解される。本明細書で提示したデータは、さらなるインスリン分解の機構が存在することを示し、すなわち脂肪細胞表面GTVapがインスリン分子からN-末端アミノ酸を除去し、そしてその生理学的活性を変化させることを示している。これはインスリンプロセッシングの正常な機構であるかもしれないが、肥満した個体中に存在する酵素活性の増加レベルまたは酵素活性が上昇した状態は、血漿インスリンが部分的に不活性化されている状態を起こす。これはインスリン耐性と肥満およびNI DDMとの関連を説明している。 GTVapがインスリンシグナル伝達経路で重要であり得る別の示唆は、GTVapがGL UT4タンパク質も含むインスリン−感受性組織中に主に見いだされるという事実である。肥満は、種々の臨床上の兆候、ならびにGTVapの増加を伴う体脂肪の増加が関連することが知られている。体脂肪およびGTVapの増加は、インスリンの外に他の重要な循環しているポリペプチドの不適切な不活性化または活性化を生じ得る。したがって、GTVapの薬理学的および遺伝的操作は、インスリン耐性、NIDDMおよび肥満を改善するために新たな治療用標的を構成する。本発明は、自然な状態でのGLUT4−含有小胞の成分であるタンパク質に関する。このタンパク質は、アミノペプチダーゼ活性を有し：グリコシル化の程度に応じて約165kD、155kDまたは120kDの分子量を、そして脱グリコシル化状態で約110 kDの分子量を有する。これはアミノ酸配列Phe-Ala-Ala-Thr-Gln-Phe-Glu-Pro-Le u-Ala-Ala（配列番号１）およびIle-Leu-Gln-Asn-Gln-Ile-Gln-Gln-Gln-Thr-Arg -Thr-Asp-Glu-Gly-Xaa-Pro-Xaa-Met（配列番号２）を含み、そして（配列番号１）と同定されたペプチドに対して産生された抗体と反応する。これはGTVap（配列番号１５および１６）の完全長の配列をコードするcDNAによりをコードされ、そしてそのアミノ酸配列はGTVapに関して予想された配列(配列番号１５および１６)と本質的に同一である。本発明はまた、このタンパク質のムテインにも関する。本発明はまた、GTVapの完全長配列をコードするcDNAおよび予想されるタンパク質配列（配列番号：１５および１６）にも関する。さらに本発明は、インスリン耐性症候群を処置する方法にも関し、この方法はインスリン耐性症候群を現している患者に、製薬学的に許容されるキャリアー中の有効量のGTVapモジュレーターを投与することを含んで成る。本発明の他の観点を、以下のさらに詳細な記述において論ずる。図面の説明本発明は以下の図面と関連して、以下の詳細な説明および用語解説から、より完全に理解されるだろう：図１は、GLUT4小胞の免疫アフィニティー精製を表すウエスタンブロットであり；図２は、免疫アフィニティー精製したGLUT4小胞のタンパク質染色であり；図３は、165kD(上線)および155kD(下線)GLUT4小胞タンパク質のトリプシン消化のHPLCプロフィールを表し；図４は、GLUT4小胞中に濃縮された165kDおよび155kDタンパク質を表すウエスタンブロットであり；図５は、N-グリコシダーゼFを用いた処理後の低密度ミクロソーム(LDM)165kD および155kDタンパク質のウエスタンブロットであり；図６は、GLUT4小胞中のアミノペプチダーゼ活性の定量的濃縮を表すグラフであり；図７は、ラット脂肪細胞膜画分中の165kD、155kDおよび120kDタンパク質のウエスタンブロットであり；図８は、ラット脂肪細胞膜画分中のGTVap酵素活性であり；図９は、GTVapの至適pHを表すグラフであり；図１０は、GTVapの温度安定性を表すグラフであり；図１１は、種々のイオンのGTVap活性に対する効果を表すグラフであり：Ｃｏ（黒色方形）；Ｚｎ（白色方形）；Ｍｇ（黒色ひし形）；Ｍｎ（白色ひし形）；Ｃａ（黒色三角）；図１２は、GTVap安定性のイオン濃縮のグラフであり：対照（白色ひし形）；２mM Ｍｇ（黒色三角）；0.02mM Ｍｎ（白色三角）；２mM Ｃａ（黒色丸）；１ μM Ｚｎ（黒色方形）；１μM Ｃｏ（白色方形）；0.2mM ＤＴＴ（黒色ひし形）；図１３は、種々のプロテアーゼインヒビターのGTVap活性に対する効果を表すグラフであり：フェナントロリン（黒色方形）；ＤＴＴ（白色方形）；ＬＬＰＡＣ（黒色ひし形）；ジピリジル（白色ひし形）；図１４は、種々のアミノペプチダーゼインヒビターのGTVap活性に対する効果を表すグラフでありベスタチン（黒色方形）；アクチノニン（白色方形）；ロイチオール（黒色ひし形）；アマスタチン（白色ひし形）；図１５ａは、WGA-精製GTVapの陰イオン交換クロマトグラフィー分離後のGTVap 活性のグラフであり；図１５ｂは、WGA-精製GTVapの陰イオン交換クロマトグラフィー分離後のGTVap -120、155および165のウエスタンブロットであり、図１６は、WGA-およびIDAC-精製GTVapの陰イオン交換酵素活性プロフィール後のGTVap活性のグラフであり:IDAC素通り（黒色ひし形）;IDAC結合(白色丸)；図１７は、インスリン刺激の前後における形質膜画分由来GTVapのウエスタンブロットであり；図１８、インスリン刺激の前後における形質膜中のGTVapの活性のグラフであり；図１９ａ、１９ｂおよび１９ｃは、それぞれGTVapを用いてインスリンを消化した0時間、3.5時間および22時間後の質量分析のグラフであり；図２０は、GTVapのcDNA配列およびこれらのcDNAから予想されるタンパク質配列（配列番号１５および１６）を表し；図２１は、GTVapおよびGLUT4の保持およびソーティングコンセンサス配列（配列番号２０）、逆保持およびソーティングコンセンサス配列（配列番号２１）、ならびにそれから派生したそれぞれのGTVap（ＮからＣ方向に（配列番号１７および１８）およびGLUT4（ＣからＮ方向に（配列番号１９））の各セグメントを表す。アスタリスクは、通常ではないＣからＮ方向に書かれている配列を示す。Xaaはアミノ酸を表し；X¹aaはPro、GluまたはAspを表し；そして X²aaはArgまたはLysを表す。詳細な説明ラット脂肪細胞由来のGLUT4-含有LDM小胞は、免疫アフィニティー法により精製され、そしてそれらのタンパク質組成がGLUT4を欠いているLDM小胞と比較された。仮定は、GLUT4小胞タンパク質が小胞のインスリン-誘導トランスローケーションに関与しているということであり、これはそれらが存在する細胞内区分からの移動、形質膜とのドッキングそして融合、そしてインスリンシグナル伝達の終了時の形質膜の再取り込み、またはエンドサイトーシスを含む。本精製法は、約 160kDの分子量をもつ独特な幾つかのタンパク質の同定を行った。 GLUT4−含有小胞に独特であると同定された２つのタンパク質は、それぞれ約1 65kDおよび155kDの分子量を有する。最初のN-末端シークエンシングの試みでは、それぞれのN-末端がブロックされていることを示した。165kDおよび155kDの両タンパク質の消化、続いてペプチド断片のミクロボアHPLC分離では、消化物のHP LC-UVプロフィールが大変良く似ていることから、これらのタンパク質が緊密に関連していることを示した。１つのペプチド配列は、妊娠に関連している血漿アミノペプチダーゼの断片であると言われた、これまでに報告されている15アミノ酸ペプチドと100％の相同性を有した。残りのペプチド配列はいずれも、胎盤または他の既知のアミノペプチダーゼといかなる相同性もない。種々の合成および天然のアミノペプチダーゼ基質を用いた実験では、脂肪細胞中の165kD、155kDおよび120kDタンパク質がアミノペプチダーゼであり、そしてそれらは小麦胚芽レクチンアフィニティー樹脂に結合することからグリコシル化されていることが示された。165kDおよび155kD物質は、N-グリコシダーゼFを使用して脱グリコシル化でき、そして110kDのタンパク質を生じる。120kD物質は、抗体が165kD形と反応し、そして155kD形も120kDアミノペプチダーゼと反応するので、165kDおよび155kDアミノペプチダーゼと関連している。以下の内容において、GLUT4-含有小胞由来の各アミノペプチダーゼを、グルコース輸送体小胞アミノペプチダーゼ（Glucose Transporter Vesicle aminopeptidase:GTVap）と呼び、kDでの分子量を名前に付け加える。１つのGTVap 165kDのペプチド配列は、胎盤由来の既知の妊娠-関連アミノペプチダーゼと100％の相同性を有するが、２つのアミノペプチダーゼは有意に異なる特性を有し、そしてより大きなアミノペプチダーゼ一族の構成員であると予想される。GTVap酵素活性および免疫反応性もまた、ラット筋肉、ヒト脂肪および脂肪細胞系3T3-L1に見いだされた。高レベルの免疫反応性を脾臓中に見いだすことができ、他の組織では少量である。自然状態ではGLUT4-含有小胞の成分である、単離され、そして精製されたアミノペプチダーゼに関して、アミノペプチダーゼ活性、分子量、特定のアミノ酸配列および［配列番号１］と同定されたペプチドに対して産生されたその抗体との反応性を上記にまとめた。このタンパク質は、糖尿病の処置に有用性を有し得るモジュレーターの同定に有用である。タンパク質はさらに、それが中性pHで最適活性を有し；その合成アミノ酸p-ニトロアニリド基質に対する比活性が：ロイシン＞＞プロリン、アラニン＞バリン、グリシンであり；その合成アミノ酸ナフチルアミド基質に対する比活性がロイシン＞リシン＞アルギニン＞メチオニン＞アラニン＞フェニルアラニンであり；その活性は二価イオンCo、Zn、Mg、MnおよびCaによりモジュレートされ；不活性化の最低温度が40℃から50℃の間であり；その活性はCaイオンにより安定化され；その活性はフェナントロリン、ジピリジル、ロイチオール、アマスタチン、アクチノニンおよびベスタチンにより減少し；そしてそれぞれ約165kD、155 kDおよび120kDの分子量を有する少なくとも３つのグリコシル化状態を有すると特性決定された。これらの特性は以下の実験の章で見いだされる。第二の観点では、本発明はGTVapの精製法およびそれらのグリコシル化種の分離法に関し、以下の工程：（ａ）GTVapを少なくとも１つの供給源から抽出し：（ｂ）生成したGTVap抽出物をレクチンアフィニティー樹脂と接触させてグリコシル化GTVapを吸着させ；（ｃ）グリコシル化GTVapをレクチンアフィニティー樹脂から溶出し；（ｄ）レクチンアフィニティー樹脂からの溶出物を、樹脂とGTVa pに同時に相互作用する金属イオンを含むキレート化クロマトグラフィー樹脂と接触させ；（ｅ）非結合物質をキレート化クロマトグラフィー樹脂から回収し；（ｆ）結合物質をキレート化クロマトグラフィー樹脂から溶出し；（ｇ）キレート化クロマトグラフィー樹脂からの非結合および溶出したGTVap−含有画分を、陰イオン交換樹脂に別個に接触させ；（ｈ）結合したGTVap種を陰イオン交換樹脂から溶出し；そして（ｉ）陰イオン交換樹脂から分離したGTVap種を検出する、工程を含んで成る。特許請求するGTVapの精製法およびそれらのグリコシル化種の分離法において、少なくとも１つの生物的供給源からGTVapを抽出する工程は、好ましくは少なくとも１つの金属イオン安定化剤および界面活性剤の混合物を使用して行う。以下の実験の章に示すように、酵素の活性は時間および安定化剤の不在で減少する。今回、好ましくは２mM濃度のカルシウムイオンが、タンパク質の活性を安定化するために役立つ可能性のある多くの金属イオンの中の1つとして役立つことが見いだされた。種々の異なる界面活性剤を使用でき、Triton X-100のような非-イオン性界面活性剤が好ましい。GTVap抽出物をレクチンアフィニティー樹脂と接触させてグリコシル化GTVapを吸着させる工程は、グリコシル化タンパク質を吸着する能力について当業者には既知の市販されている多数の任意のレクチンを使用して行われる。これらにはコンカナバリンＡ、小麦胚芽、カタツムリ (Helix)、レンズ豆クリナリス、カブトガニ(Limulus)レクチンが含まれる。小麦胚芽レクチンを本発明に使用するが、他のものも使用できる。グリコシル化GT Vapのレクチンアフィニティー樹脂からの溶出は、レクチン−炭化水素結合を破壊するための任意の種々の手法を使用して行われる。例として競合する炭化水素リガンドの使用、およびｐＨ条件の変化が含まれる。キレート化クロマトグラフィー工程は、レクチンアフィニティー樹脂からの溶出物を、樹脂とGTVapに同時に相互作用する金属イオンを含んで成るキレート化クロマトグラフィー樹脂と接触させることにより行う。多数の適当な市販のキレート化クロマトグラフィー樹脂がある。これらの樹脂は典型的には、精製されるタンパク質または糖タンパク質と相互作用できる金属イオンを持っている。本発明では、亜鉛がGTVapおよび使用するイミノジ酢酸樹脂と相互反応できるので、亜鉛を金属イオンとして使用することが好ましい。結合した物質のキレート化クロマトグラフィー樹脂からの溶出は、典型的にはＥＤＴＡのようなキレート化剤を加えることにより、またはｐＨを変化させることにより行う。好ましくは本質的な酵素活性を変化させない条件が採用される。キレート化クロマトグラフィー樹脂から非結合および溶出したGTVap-含有画分を、別個に陰イオン交換樹脂と接触させる工程は、当業者には周知の活性な官能基を有するリガンドを含有する多数の種々の支持体を使用することにより行える。本発明のこの工程は好ましくは、高速液体クロマトグラフィー法を使用した時、高分離能および優れた流速を有するResourceQのような樹脂を使用する。結合したGTVap種の陰イオン交換樹脂からの溶出は、塩勾配の増加を使用して行うか、または緩衝液ｐＨを変化させることにより行う。陰イオン交換樹脂から分離したGTVap種の検出は、酵素活性を測定することにより行う。GTVap活性は、アミノ酸p-ニトロアニリドまたはβ-ナフチルアミド誘導体ならびにインスリンのような天然のタンパク質基質を含む、任意の多数の基質を使用して検出できる。他の基質もまた使用できる。この方法は酵素の精製に有用であり、これは次にそのさらなる特性決定ならびに酵素に対する抗体の精製、および酵素活性のモジュレーターの同定に有用である。第三の観点では、本発明はGTVap活性のモジュレーターの同定法に関し、これは以下の：（ａ）アッセイできる酵素活性の量を有するGTVapまたはGTVap-含有物質を提供し；（ｂ）GTVapまたはGTVap-含有物質を試験基質とインキューベーションして、GTVap活性をモジュレートする能力についてアッセイし;(c)GTVap基質を加え；（ｄ）GTVap活性を時間の関数として監視し；そして（ｅ）試験基質のGTVapに対するモジュレーター活性を測定する、工程を含んで成る。 GTVap活性のモジュレーターを同定する方法に関して、アッセイできる酵素活性量を有するGTVapまたはGTVap-含有物質を提供する工程には、限定するわけではないが脂肪組織、骨格筋組織、心筋、脾臓組織、これらの物質に由来する細胞系または当業者に周知の方法を使用して作成された組換え源を含む生物組織の使用が関与する。そのような組織は典型的には、ヒトまたは齧歯類起源であるが、 GTVapはまた他の種に由来するものでもよい。好ましくはヒト起源の酵素が使用される。組換え源は、例えばGTVapをコードする遺伝子を、挿入遺伝子を転写できる原核または真核細胞系に挿入し、酵素的に活性なGTVap分子の発現を生じる。そのような手法は当業者には周知である。GTVapまたはGTVap-含有物質を、GTVap活性をモジュレートする能力についてアッセイされる試験基質とインキューベーションする工程では、可能な試験基質には既知のアミノペプチダーゼインヒビターの類似体、ならびにこれまでに活性が知られていない合成および天然に存在する試験基質を含む。GTVap基質を加える工程には、典型的にはロイシンp-ニトロアニリドのような合成のアミノペプチダーゼ基質、あるいは特定の酵素によりN-末端アミノ酸を除去できた合成または天然に存在するポリペプチド基質の使用を含む。適当なポリペプチドの２例は、インスリンおよび合成インスリンである。時間の関数としてGTVap活性を監視する工程は、一般的に基質の消失または基質に対する酵素活性生成物の出現を監視することにより行われる。これは典型的には、分光光度的またはクロマトグラフィー的手段で行われるが、個々の場合に応じた目的について広範な種々の技術を通して行われた。該試験基質のGTVapに対するモジュラトリー効果の測定工程は、試験基質の存在または不在下で、GTVap基質の開裂速度を比較することにより行われる。第４の観点では、本発明は実質的に純粋なGTVapまたはその断片を使用して生成されたGTVapに特異的な抗体に関する。 GTVapに特異的な抗体は、以下のように生成できる。GTVapに対するポリクローナル抗血清は、完全なGTVapまたはその断片を、ウサギ、マウス、ヤギおよびヒツジのような種々の任意の宿主動物に注射することにより生成する。そのような宿主動物中で生成した抗体は、自然にはポリクローナルであり、特異的抗体の場合には、当業者に周知な方法により部分的に精製できる。さらにモノクローナル抗体は、免疫適合性脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合により、モノクローナル免疫グロブリンを本質的に精製するハイブリッド細胞系を調製することにより生成できる。この技法の現状では、そのような動物にはマウスおよびラットが含まれる。抗体は生物物質中のGTVapの検出および定量に使用されるだろう。さらにそのような抗体は、当業者には周知の免疫アフィニティー法を使用して、GTVapの精製に使用できる。第５の観点では、本発明はアミノ末端が短縮化されたタンパク質およびペプチドの調製法に関し、これはタンパク質またはペプチドをGTVapとインキューベーションする工程を含んで成る。短縮化タンパク質およびペプチドの調製法に関して、この工程は主題のタンパク質をGTVap活性を増強する条件下でインキューベーションすることにより行われ、すなわち中性ｐＨおよびGTVap活性の安定化を増大させるイオンの存在での条件下で行われる。短縮化された生成物を反応から、任意の分離法により単離する。短縮化される物質はインスリンまたはGTVapにより開裂できるアミノ酸末端を持つ任意のポリペプチドである。短縮化ペプチドおよびタンパク質の調製法は、新規の薬学的に活性なポリペプチドを誘導するために使用される。第６の観点では、本発明は生物学的材料中のGTVapを測定する方法に関し、これは以下の工程を含んで成る：ａ）生物学的材料の検体を、最適に免疫反応性エピトープを暴露するように調製し；（ｂ）この検体またはその抽出物をGTVap特異的抗体とインキューベーションし；（ｃ）非結合抗体を検体から除去し；そして（ｄ）検体中のGTVapに結合した抗体を定量する。生物学的材料中のGTVapを測定するための方法に関して、生物学的材料の検体を、最適に免疫反応性エピトープを暴露するように調製する工程は、緩衝液で洗浄することにより、あるいは自然なタンパク質配置中に埋もれているエピトープを暴露させる、よりカオトロピック条件下で処理することにより行う。そのようなカオトロピック試薬には、アセトン−またはアルコール−含有溶液、ＳＤＳおよび他の同様な特性を持つ変性剤が含まれる。これらの調製法は、天然または変性したGTVapの検出を可能にする。検体またはその抽出物をGTVap特異抗体とインキューベーションする工程は、通常の様式で行われ、そして好ましくは本発明の GTVap１抗体を使用する。GTVap−特異的抗体は、フルオロホア、ビオチン、放射性同位体またはアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素で直接標識できる。検体中のGTVapに結合した抗体の定量は、前述の標識を同定すことにより行う。あるいは結合した抗体は、それ自体が標識され、そして第一抗体に特異的に結合し、そしてこれが次にGTVapに結合する第二抗体を使用して検出できる。第７の観点では、本発明はGTVapのセグメントをコードする核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブに関する。 GTVapのセグメントをコードする核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの例は、以下の物質であり、これは図Ｉに述べるGTVap中で同定されるアミノ酸配列と関連して以下に示す：ペプチド：対応する“センス”オリゴヌクレオチド：対応する“アンチセンス”オリゴヌクレオチド：ペプチド：対応する“センス”オリゴヌクレオチド：対応する“アンチセンス”オリゴヌクレオチド：上記のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、個々の塩基については標準的な１文字の表示法を使用し、そして文字Ｎは縮重の位置を表す。ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＩ（インシン）であり；ＲはＡまたはＧであり；ＹはＣまたはＴであり；ＭはＡまたはＣであり；ＫはＧまたはＴであり；ＳはＣまたはＧであり；ＷはＡまたはＴであり；ＨはＡ、ＣまたはＴであり；ＢはＣ、ＧまたはＴであり；ＶはＡ、ＣまたはＧであり；そしてＤはＡ、ＧまたはＴである。上記オリゴヌクレオチドの断片および当業者には周知のさらなるヌクレオチド置換は、さらなる例を構成する。これらのオリゴヌクレオチドは、生物源中のGTVapをコードする核酸を決定するために使用できる。第８の観点では、本発明は生物学的検体中のGTVapセグメントをコードする核酸配列を決定する方法に関し、以下の工程を含んで成る：（ａ）核酸物質の分析用に生物学的検体を調製し；（ｂ）この生物学的検体の核酸物質を、GTVapのセグメントをコードする核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブとインキューベーションし；（ｃ）非結合オリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを核酸物質から除去し；そして（ｄ）GTVapのセグメントをコードする核酸配列に結合したオリゴヌクレオチドを決定する。生物学的検体中のGTVapのセグメントをコードする核酸配列を決定する方法に関して、核酸物質の分析用の生物学的検体を調製する工程は、界面活性中またはアルカリ性媒質での溶解、またはカオトロピック試薬の使用を通して行われる。これに続いてＤＮＡまたはＲＮＡをアフィニティークロマトグラフィーにより（これはｍＲＮＡに有用であり、ｍＲＮＡを精製するためにはオリゴ-dTを使用する）、あるいはCsCl勾配中での遠心により（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方に有用である）、あるいはプロテアーゼ（タンパク質を破壊する）および特別なヌクレアーゼ（望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡを破壊する）を使用して混入物質の破壊することにより精製する。この物質を膜に直接添加でき、ゲル電気泳動で分離でき、あるいは電気泳動前に制限消化によりさらに分析できる。最終物質は、核酸を結合できる膜に固定化する。この生物学的検体に由来する核酸物質を、GTVapのセグメントをコードする核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとインキューベーションし、非結合オリゴヌクレオチドプローブを核酸物質から除去し、そしてGTVapセグメントをコードする核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドプローブを決定する工程は、当業者に周知な方法で行われる。第９の観点では、本発明はGTVapをコードする核酸配列に関する。より詳細には、本発明は配列番号１５および１６に表すアミノ酸配列を有するGTVapをコードする核酸から本質的に成る精製された核酸、またはストリンジェントな条件下でその相補体とハイブリダイズでき、かつGTVapをコードする核酸に関する。これらを図２０に表す。幾つかのＤＮＡクローンは、他のクローンには無い一連のヌクレオチドAGCを含み、生成した予想される特定のタンパク質中にＧＬＮを生じることに注目すべきである；これを図２０のボックス中、および挿入の有無のみが異なり、あとは同一である配列番号１５（これは挿入を含む）および配列番号１６（挿入は含まない）と同定される配列中に表す。この核酸配列は、当業者に周知な方法を使用して、生物起源からGTVapをコードする核酸配列を同定または精製するために使用できる。この核酸配列の領域に由来するか、またはこの配列またはその相補体とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを、生物源中に存在するこの配列中の突然変異を同定するために使用できる。この核酸をまた、ヘテロロガスなプロモーターを有するベクター中に挿入し、そしてこれを細胞中に挿入することにより組換えタンパク質を発現させることができる。組換えタンパク質は完全長のGTVapであるか、またはそのムテインであってよい。好適な発現系は、細胞の均質な集団であり、各々がGTVapをコードするクローン化核酸を有するか、または図２０（配列番号１５および１６）に表すアミノ酸配列を有するそのムテインであるか、またはストリンジェントな条件下でその相補体とハイブリダイズでき、そしてGTVapをコードする核酸である。好適な細胞は、GTVapタンパク質を安定に発現する哺乳類細胞であるが、原核および他の真核細胞も使用できる。GTVapを生成する方法は、上記定義のようなGTVapをコードするクローン化核酸を保有する細胞を培地中で培養して、GTVapを発現する細胞群を形成し、そして細胞から、または培養培地からGTVapを精製する工程を含んで成る。GTVapは上記の方法または当業者に周知の他の方法を使用して精製できる。組換えGTVap は、研究用または治療的目的のために、酵素的に活性なアミノペプチダーゼの供給源として使用できる。第１０の観点では、本発明はタンパク質の保持配列をコードし、そして以下のアミノ酸残基：-X¹aa-Xaa-(X¹aa)₃-(Xaa)_2-3-Tyr-Glu-(Xaa)_1-3-Ser-(Xaa)_0-1-X² aa-(Xaa)_0-4-Leu-Leu（配列番号２０）を含んで成る第一ポリペプチド、および第一の逆であり以下のアミノ酸残基の配列；-Leu-Leu-(Xaa)_0-4-X²aa-(Xaa)_0-1- Ser-(Xaa)_1-3-Glu-Tyr-(Xaa)_2-3-(X¹aa)₃-Xaa-X¹aa（配列番号２１★）を含んで成る第二ポリペプチド、ここでXaaは任意のアミノ酸残基を表し、X¹aaはPro、Gl uまたはAspを表し、そしてX²aaはArgまたはLysを表す、ならびにそのムテインから成る群から選択されるポリペプチドに関する。第２１図は、これらのGTVapおよびGLUT4-保持およびソーティングコンセンサス配列を表す。そのようなポリペプチドの特別な例は、保持配列がHis Pro Leu Glu Pro Asp Glu Val Glu Tyr Glu Pro Arg Gly Ser Arg Leu Leu（配列番号１７）；His Glu Met Asp Glu Asp Glu Glu Asp Tyr Glu Ser Ser Ala Lys Le u Leu（配列番号１８）；またはLeu Leu Glu Gln Glu Val Lys Pro Ser Thr Glu Leu Glu Tyr Leu Gly Pro Asp Glu Asn Glu（配列番号１９）のものである。配列番号２０により表される保持配列は、配列番号１７および１８としてGTVap中に見いだされる、配列番号２１により表されるのは、配列番号１９としてGLUT4 中に見いだされる。これらのポリペプチド（配列番号１７−２１）は、当業者に周知の化学的手段により合成できるか、または組換え手段により発現でき、細胞内トラフィッキングのモジュレーターの同定に有用な試薬として役立つだろう。そのソーティングがインスリンにより調節されるGTVap以外のタンパク質のインスリン感受性保持配列の同定法は、タンパク質のアミノ酸配列を決定し、その配列を配列番号２０または２１のポリペプチドのアミノ酸配列と比較し、そしてポリペプチド（配列番号２０または２１）のアミノ酸配列を含む、またはそれに相同的な部分のアミノ酸の配列を同定することを含んで成る。いったんそのような保持配列がそのような他のタンパク質中で同定されれば、これらのタンパク質はGLUT4およびGTVapの様式でソートする物質として関連し、そしてこのようにインスリンにより調節される。本発明はまた、第二タンパク質のインスリン感受性保持配列に結合する細胞内ソーティングタンパク質またはその活性断片を同定する方法に関する。この方法は、１）ソーティングタンパク質と保持配列との間の結合を可能とする条件下で、細胞内ソーティングタンパク質を保持配列とをインキューベーションし、そして２）特異的に結合したソーティングタンパク質を同定することを含んで成る。そのような方法には、保持配列の固定化、続いて細胞内ソーティングタンパク質を含有する細胞抽出物の添加を含む。非特異的に結合したタンパク質は除去され、次に細胞内ソーティングタンパク質が溶離され、そして分析される。別の方法は、“２−ハイブリッド” 系でおとりとしての保持配列の発現、そしてこの配列に特異的に相互作用するタンパク質をコードするＤＮＡを同定するための、ライブラリーのスクリーニングを含む。そのようなタンパク質は、細胞内ソーティングタンパク質であろう。この物質は保持配列と組み合わせて、それらの相互作用を破壊する化合物の同定を可能にするだろう。前述に記載に従い、少なくとも１つのGLUT4およびGTVapの細胞内ソーティングを変化させることができる化合物を同定する方法は：ａ）試験化合物の存在および不在中で、ソーティングタンパク質と保持配列との間の結合を可能とする条件下で、細胞内ソーティングタンパク質またはその活性断片を、配列番号２０または２１のポリペプチド保持配列とインキューベーションし；ｂ）ソーティングタンパク質および保持配列の特異的結合複合体を定量し；そしてｃ）試験化合物の存在および不在中での複合体形成の程度を比較することを含んで成る。そのような化合物はインスリン耐性症候群を処置するために有用であろう。インスリン耐性症候群を処置する方法は、糖尿病、肥満、グルコース耐性欠陥、高インスリン症のような症状、ならびに限定するわけではないがＸ症候群、高脂血症および高血圧症のような高インスリン症に付随する他の症状の処置に関する。投与量および投与時間は、例えば（特別なモジュレーターに応じて）、経口的、経皮的または鼻内に、あるいは注射可能な状態で、皮下に、筋肉内に、または静脈内に、あるいは他の適当な手段により、血中グルコースレベル、血漿グルコースレベル、ヘモグロビンＡ_lcのようなグリコシル化タンパク質のような代用マーカーおよびインスリンレベルの低下を治療目的とする標準的な処方に従い、そしてインスリン模擬活性またはインスリン強化活性を有するだろう。特許請求する方法は単独で、またはインスリン耐性および関連する症候群の他の治療法と組み合わせて使用できる。材料および方法以下の用語一覧、供給元、装置等は、以下に与える実験操作を理解および再現する際に読者を補助する目的で提供する。略号および説明：胞膜画分：ＰＭ（形質膜）、ＨＤＭ（高密度ミクロソーム）およびＬＤＭ（低密度ミクロソーム）は、それらの本来の密度および遠心中の沈降挙動、ならびにこれらの膜が類型化される特定酵素の濃縮により定められる。 GTVapはグルコース輸送体小胞アミノペプチダーゼ(Glucose Transporter Vesi cle aminopeptidase)を表す。 GTVap１は、種々のGTVap状態と反応するペプチドPhe-Ala-Ala-Thr-Gln-Phe-Gl u-Pro-Leu-Ala-Ala-[Cys]（配列番号８）から産生されたウサギポリクローナル抗体を言う。 KRBH緩衝液は、120mM NaCl、4mM KH₂PO₄、1mM CaCl₂、10mM NaHCO₃および30mM HEPESであり、そして7.4のpHを有する。 RACEはcDNA 末端の迅速な増幅(Rapid Amplification of cDNA Ends)である。 TBS(Tris緩衝化塩溶液)は、10mM Tris、150mM NaCl、0.01％チメロサール、pH8.0である。 TBS-TWは、0.05％ Tween-20を含有するTBSである。 TES(Tris-EDTA-シュクロース)緩衝液は、20mM Tris、1mM EDTA、250mMシュクロース、pH7.5である。 SDS-PAGEは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動である。試薬：アクチノニンは、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社（Sigma Chemical Co.,)から得た。アマスタチンは、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。 ω-アミノヘキシルSepharose 4Bは、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。 AmpliTaq DNA ポリメラーゼは、コネティカット州、ノルウォークのパーキンエルマー(Perkin Elmer)から得た。ベンズアミジンは、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。ベスタチンは、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。 BSA（ウシ血清アルブミン−第Ｖ画分）は、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。コラゲナーゼは、ニュージャージー州、フリーホールドのウォーシントン(Wor thington)から得た。クーマシーブルー G-250およびSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)は、カリフォルニア州、ヘリキュルスのバオラッド(BioRad)から得た。サイトカラシンＢは、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。 DFP(ジイソプロピルフルオロホスフェート)は、ウィスコンシン州、ミルウォーキーのアルドリッチ(Aldrich)から得た。 EDTAはエチレンジアミン四酢酸であり、そしてモンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。エクスパンドDNA熱安定性DNAポリメラーゼは、インディアナ州、インディアナポリスのベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)から得た。 HEPESはN-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)であり、そしてモンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。 IAVマトリックス、Immobilon(AV)膜は、マサチューセッツ州、ミルフォードのミリポア社(Millipore Corp)から得た。 IDACはイミノジ酢酸キレート化樹脂を表し、イリノイ州、ロックフォードのピアス(Pierce)から得た。インスリン（ブタ）は、インディアナ州、インディアナポリスのイーライリリー(Eli Lilly)から得た。ロイペプチンは、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。 L-ロイシンチオールは、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。 Marathon RACEキットは、カリフォルニア州、パロアルトのクローンテック(C lontech)から得た。オリゴヌクレオチドは、テキサス州、ミッドランドのミッドランドサーティファイドリージェント社（Midland Certified Reagent Company）から得た。ペプスタチンＡは、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。 PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド)は、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。 Problot膜は、カリフォルニア州、フォスター市のアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)から得た。 PVDF膜は、ポリビニリデンジフルオリドであり、マサチューセッツ州、ベッドフォードのミリポア社。ラット心臓RACE Ready cDNA(7383-1)は、カリフォルニア州、パロアルトのクローンテックから得た。ラット骨格筋cDNAライブラリー(RL3003b)は、カリフォルニア州、パロアルトのクローンテックから得た。ラット骨格筋polyA⁺RNAは、カリフォルニア州、パロアルトのクローンテックから得た。 Resource Q 陰イオン交換樹脂は、直径15μmの固いポリスチレン／ジビニルベンゼンビーズ上に四級アンモニウム基を含み、そしてニュージャージー州、ピスカタウェイのファルマシア(Pharmacia)から得た。レトロサーム熱安定性RNAおよびDNA依存性DNAポリメラーゼは、ウィスコンシン州、マジソンのエピセントレテクノロジーズ(Epicentre Technologies)から得た。 Sequenaseキットは、オハイオ州、クリーブランドの合衆国バイオケミカル(Un ited States Biochemical)から得た。シナピン酸（3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシ桂皮酸)は、ウィスコンシン州、ミルウォーキーのアルドリッチから得た。 sMBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル) は、イリノイ州、ロックフォードのピアスから得た。ストレプトアビジンは、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのジメッド社(Zymed Corp.)から購入した。 Supelcosil LC-18-DB、3μm、2.1X250mmカラムは、ペンシルバニア州、ベレホントのスペルコ社(Supelco Corp.)から得た。 TEA(トリエチルアミン)は、イリノイ州、ロックフォードのピアスから得た。 3’RACEキットは、カリフォルニア州、パロアルトのクローンテックから得た。 TEA(トリフルオロ酢酸)は、カリフォルニア州、フォスター市のアプライドバイオシステムズから得た。チメロサールは、チオール第二水銀サリチル酸エチルナトリウムであり、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から市販されている。 Trisはトリスヒドロキシアミノメタンを表す。 Triton X-100は、モンタナ州、セントルイスのシグマ化学社から得た。トリプシン（改良シークエンシング級、ブタ）は、ウィスコンシン州、マジソンのプロメガ(Promega)から得た。 WGAは小麦胚芽レクチン-Sepharose 6MBを表し、これはニュージャージー州、ピスカタウェイのファルマシア(Pharmacia)から得た。放射標識材料およびシンチレーション流体 ¹²⁵Ｉ-プロテインＡ（２−10μCi/μg）を、ウエスタンブロット分析に使用した。すべての同位体およびシンチレーション流体(Aquasol)は、マサチューセッツ州、ボストンのニューイングランドヌクレアー(New England Nuclear) 、またはイリノイ州、アーリントンハイツのアマシャム社(Amersham Corporati on)からであった。ペプチド合成の一般法ラットGLUT4配列のCOOH-末端15アミノ酸残基(495-509;[Cys]-Lys-Pro-Ser-Thr -Glu-Leu-Glu-Tyr-Leu-Gly-Pro-Asp-Glu-Asn-Asp（配列番号９）)およびその断片（Lys-Pro-Ser-Thr-Glu-Leu-Glu-[Cys]（配列番号１０）；Thr-Glu-Leu-Glu-T yr-Leu-[Cys]（配列番号１１）；[Cys]-Gly-Pro-Asp-Glu-Asn-Asp（配列番号１２）；GTVapペプチド(Phe-Ala-Ala-Thr-Gln-Phe-Glu-Pro-Leu-Ala-Ala-[Cys]（配列番号８）)を含むすべてのペプチド、およびインスリン−誘導ペプチドは、固相法を使用して、KnowlesおよびMarchesiの米国特許第5,225,354号明細書にすでに記載の430Aペプチド合成機で合成した。すべてのペプチドは、-NH₂または-C OOH末端で、配列中で[Cys]と確認されるシステイン残基を用いて合成し、そして ω-アミノヘキシルSepharose 4Bまたはインスリン-誘導ペプチドのタンパク質溶解活性を監視するためにフルオロホアに結合させた。このペプチドをスルフィドリル−特異的フルオレセイン結合体を用いて標識した。この手法で、２倍モル過剰のフルオレセイン-5-マレイミド(ジメチル-ホルムアミド、40mg/ml中)をペプチド(10mg/ml)(100mM リン酸ナトリウム、5mM EDTA、pH7.1)中に加え、そして室温で20時間インキューベーションした。生成したペプチド−フルオレセイン結合体を、HPLCクロマトグラフィーにより、KnowlesおよびMarchesiの米国特許第5,2 25,354号明細書に記載したように精製した。装置： 477aタンパク質シークエンサー、120Aアミノ酸分析機および430Aペプチド合成機は、カリフォルニア州、フォスター市のアプライドバイオシステムズからのものだった。 ¹²⁵Ｉは、ワラック(Wallac)(LKB)1272 Clinigammaカウンターで測定した。 155kDおよび165kDタンパク質のトリプシン消化のHPLCデータの獲得および分析は、Nelson Thurbochrome System（パーキン-エルマーネルソン、ノルウォーク、コネティカット州）で行った。合成ペプチドおよびインスリン断片の質量分析用のマススペクトロメトリーは、飽和シナピン酸、0.1％TFA、50％アセトニトリルをマトリックスとして使用して、フライトマススペクトロメーターのKratos Maldi ３レーザー脱着-時間(LD- TOF-MS)を使用して行った。タンパク質測定のための一般方法タンパク質の定量は、製造元（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）により記載されたようにビシンコニン酸法(bicinchoninic acid method:BCA)を使用して測定した。抗−ペプチド抗体の免疫アフニティー精製 GLUT4およびGTVap抗-ペプチド抗体は、GLUT4小胞の精製のためにウエスタンブロットで使用する前に、またはGLUT4小胞の精製のために、免疫アフィニティー吸着により精製した。このために、１つのシステインを含有するペプチド免疫原を、以下の方法に記載されているようにSepharoseにカップリングさせた。ω-アミノヘキシルSepharose 4B樹脂を50mM Na₂PO₄、10mM EDTA、pH7.0で洗浄した。樹脂を50％スラリーに懸濁し、そしてsMBS(2μmoles/ml 樹脂)を加えた。周辺温度で10分後、誘導化された樹脂を50mM Na₂PO₄、10mM EDTA、pH7.0で洗浄し、そして50％スラリーに再懸濁した。システイン−含有ペプチドを加え(１−２mgペプチド／ml)、そして周辺温度で一晩反応させた。生成したペプチド−樹脂結合物を、使用前に0.1M 酢酸そして次に50mM Na₂PO₄、10mM EDTA、pH7.0で洗浄した。免疫アフニティー精製のために、個々のペプチドに対するポリクローナル抗血清を100mM Na₂HPO₄、150mM NaCl、pH7.5で1:1に希釈し、そして対応するペプチド樹脂に添加した。上記緩衝液で簡単に洗浄した後、結合したアフニティー−精製抗体を0.1M 酢酸で溶離し、そして1.0M Tris塩基でpH8.0に直ぐに調整した。精製した抗体を、0.5％アジ化ナトリウムを含有する0.1M ホウ酸ナトリウムpH8. 0に対して透析し、そしてその中で保存した。ウエスタンブロット分析ウエスタンブロット分析前に、タンパク質をSDS-PAGEゲルで電気泳動し(Laemm li,Nature,277,680-685,1970)、そしてPVDFまたはProblot膜に、Tobinら、PNAS,76 ,4350-4354,1979の方法により移した。GLUT4およびGTVapのウェスタンブロット分析のために、上記のように免疫アフニティー−精製したウサギ抗−GLUT4抗体を、1:5000希釈(1μg/5ml)で使用した;GTVapアフニティー精製抗体を1:1000(1 μg/ml)で使用した。第一抗体を検出するために、プロテインＡ¹²⁵Ｉ(1μCi/ml) およびヤギ抗-ウサギアルカリホスファターゼ(1:10,000;プロメガ)を連続的に使用した。免疫反応性バンドは、発色したアルカリホスファターゼ反応生成物および／または¹²⁵Ｉ−プロテインＡのオートラジオグラフィーにより同定し、そして¹²⁵Ｉ−プロテインＡカウントをLKB1272Clinigammaカウンターにより定量した。実験および結果：GLUT4 特異的抗体の生成 GLUT4ウサギポリクローナル抗体は、ラット-GLUT4配列のCOOH-末端15アミノ酸残基に対応する合成ペプチド、すなわち残基495-509、[Cys]-Lys-Pro-Ser-Thr-G lu-Leu-Glu-Tyr-Leu-Gly-Pro-Asp-Glu-Asn-Asp（配列番号９）を使用して産生した。GLUT4に対する抗体特異性は、ポリクローナル抗血清を、ω-アミノヘキシル Sepharose 4Bにヘテロ二官能性試薬sMBSを使用して共有的に結合した３つのペプチド(Lys-Pro-Ser-Thr-Glu-Leu-Glu-[Cys]（配列番号１０）；Thr-Glu-Leu-Glu- Tyr-Leu-[Cys]（配列番号１１）；[Cys]-Gly-Pro-Asp-Glu-Asn-Asp（配列番号１２）に吸着させることにより強化した。非吸着GLUT4特異的抗体を、495-509ペプチドカラム、そして次にプロテイン-Ａ Sepharoseで精製した。生成した高度に精製され、かつ特異的GLUT4抗体を1:5000希釈(１μgタンパク質/５ml希釈物)でウエスタンブロッティングに使用した。ラット脂肪細胞の調製および単離 125gのスプラージ-ダウレイ(Sprague-Dawley)ラットに由来する精巣上体脂肪パッドを取り出し、そして即座に1％BSA、2.5mM グルコースおよび200nM アデノシンを含有するKRBH緩衝液に入れた。脂肪を細かく刻み、コラゲナーゼを3mg/ml で加え、そして混合物を37℃で45分間、撹拌しながらインキューベーションした。解離した脂肪細胞を250ミクロンのナイロンスクリーンを通して濾過し、そして1％BSAおよび200nM アデノシンを含有するKRBHを用いて３回洗浄した（穏やかな遠心を使用した）。ラット脂肪細胞の分画膜画分ＰＭ、ＨＤＭおよびＬＤＭは、一般的にSimpsonら、Biochimica et Bio physica Acta,763,393-407(1983)に従い調製した。単離した脂肪細胞を冷却した Wheaton 55ml テフロンペステルホモジナイザー中で10ストローク、均質化した。脂肪層を10,000Xg遠心後に取り出し、そして残存物質を再度均質化した。ＰＭ画分を16,000Xgでペレット化し、そして上清を再遠心してさらにＰＭを取り出した。このＰＭを再懸濁し、そして再度均質化し、そして次に96,000Xgで1.12Mシュクロースクッションを通して超遠心により、ＤＮＡおよびミトコンドリアオルガネラから精製した。ＰＭをシュクロースクッションの相内から回収した。ＨＤＭを最初の上清から48,000Xgでペレット化し、そして生成した上清を再度遠心して残存するＨＤＭを取り出した。ＬＤＭはＨＤＭ上清から1.12Mシュクロースクッションで、212,000Xgの遠心により回収した。このＬＤＭをシュクロース相内から回収し、そしてこの工程をさらなる試験管からプールしたＬＤＭで３回繰り返してＬＤＭを濃縮し、いかなる混入細胞質タンパク質をも除去した。GLUT4 小胞の免疫精製上記のように調製した精製GLUT4特異的抗体を、NHS-ビオチンを使用して50mM NaHCO₃、pH8.2中で室温にて30分間、ビオチン化した。20mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0に対して透析した後、活性ビオチン化抗体は、アミノヘキシル-Sepharose CL -4Bに上記のように共有結合した[Cys]-Lys-Pro-Ser-Thr-Glu-Leu-Glu-Tyr-Leu-G ly-Pro-Asp-Glu-Asn-Asp（列番号９）でアフィニティー精製することにより回収した。 Immobilon アフィニティー膜(IAV、1cm²)を、室温で６時間、そして次に４℃ で一晩、0.5M KH₂PO₄、pH7.5中の500μgのストレプトアビジンで飽和させた。残存する部位を0.44Mのグルタミン酸でキャップし（６時間、室温）、そして膜を洗浄した。上記記載のビオチン化抗-GLUT4抗体(50μg/cm²)を1 00mM ホウ酸、150mM NaCl、1mM EDTA、pH7.5に加え、そして接触を室温で６時間維持した。生成した抗体−誘導化IAVマトリックスを３回(20分/洗浄)、TBS、0.1 ％ Tween-20中で洗浄し、そして次にTESに移した。対照IAVマトリックスをストレプトアビジンを用いて調製し、そしてグルタミン酸でキャップした。ＬＤＭをGLUT4または対照IAVマトリックスに加えた。典型的には2.4ラットからのＬＤＭのものを、それぞれ1cm²のマトリックスに加え、そして４℃で一晩、 150mM NaClを含有するTES中でインキューベーションし、そして続いて３回、同じ緩衝液中で洗浄した。非結合小胞を、212,000xgで遠心することにより回収した。結合した小胞タンパク質は、マトリックスから10mM Tris-HCl、pH7.4中の1. 0％ SDS、または20mM Tris、1mM EDTA、pH7.4中の0.1％ Triton X-100で溶出した。GLUT4小胞タンパク質を液体Ｎ₂中で凍結し、そしてさらに使用するまで-80 ℃で保存した。タンパク質を分析するために、等容量の精製GLUT4小胞および対照を、回収した非結合ＬＤＭ小胞の等容量タンパク質添加と一緒に凍結し、そして4-20％ SDS -PAGEゲルに添加し、PVDF膜に移し、そしてクーマシーブルー R-250で染色した。約165kDの分子量を有するタンパク質を、GLUT4小胞に対して特異的であると特徴付け、そして部分的から完全に非結合画分から消費した。図１はウエスタンブロットオートラジオグラフィーにより定性的に、GLUT4抗体−誘導化IAVマトリックスを使用した免疫アフィニティー吸着が、GLUT4抗体を欠いたIAVマトリックスと比較してGLUT4小胞の有意な濃縮を生じることを表す。¹²⁵ＩプロテインＡの定量では、免疫アフィニティー −精製小胞中にGLUT4の８倍濃縮を示した。この免疫アフィニティー−精製GLUT4 小胞タンパク質を、0.1％ Triton X-100または低濃度SDS(＜1％)で可溶化でき、そして共有結合ストレプトアビジンに付いた抗体を遊離し、全ＬＤＭ画分よりは一層単純化されたタンパク質組成を生じる。図２はSDS-PAGE後のGLUT4小胞−会合タンパク質のクーマシーブルー染色が、G LUT4小胞に独自に会合し、そしてGLUT4抗体を欠いているIAVマトリックス上に吸着するタンパク質中には見いだされない、165kDおよび155kDタンパク質を明らかにする。165kdおよび155kDタンパク質の両方が、GLUT4 IAVマトリックスとの吸着後にＬＤＭから消費されるが、対照マトリックス上の吸着後では消費されない。165kd および155kDタンパク質の精製および配列分析 GLUT4小胞タンパク質を、20cmの7-15％アクリルアミド、SDS-PAGEゲルで電気泳動的に分離し、そしてProblot膜に移した。165kdおよび155kDタンパク質は、クーマシーブルー染色により同定された。Problot膜からNH₂末端方向でのシークエンシングの最初の試みでは、NH₂-末端がブロックされたことを示した。続く実験では、165kdおよび155kDタンパク質を分離し、そして上記のように同定し、そして次にトリプシン(30:1;基質/酵素)を用いてFernandezら、Analyt.Biochem.,2 01 ,255-264(1992)に従い消化した。生成したペプチド生成物をSupelcosil LC-18 -DB、3μm、2.1X250mmカラムで、３時間で70％アセトニトリル中の0.1％TFAから 0.1％ TFA直線勾配を使用して分離した。溶出液を215nmで監視し、そして選択したピークを、ガス相がオンライン120AアナライザーおよびPE Nel son Turbochromeソフトウェアで操作されるABI 477aタンパク質シークエンサーを使用してシークエンシングに供した。図３はトリプシン処理断片のHPLC分離を表し、そして２つのタンパク質間に有意な類似性を示している。中程度の疎水性および強いUV吸収の選択したペプチドをシークエンシングした。得られた配列を、表１に示す。両ペプチドは165kdおよび155kD状態からシークエンシングされ、そして同一であり、これら２つのタンパク質間の類似性をさらに証明している。GLUT4 小胞タンパク質165kDaのアミノペプチダーゼとしての同定得られた第一配列は、GenBank、EMBL、NucleicおよびGeneSeqを含むＤＮＡデータベース、ならびにタンパク質データベースPIR、PatchXおよびSwissProtを調査するために使用した。１つのペプチドが、GeneSeqデータベース中の胎盤起源の血清アミノペプチダーゼのトリプシン処理断片と100％の相同性を有することが判明した。表１を参照にされたい。断片#１の下線残基は、高力価ウサギポリクローナル抗血清を生成するために使用した。断片#２の下線残基は、既に同定された胎盤ロイシンアミノペプチダーゼ(PLAP )と100％の相同性を有した。 ★GTVap-165およびGTVap-155残基中の両方に見いだされる同じ配列を表す下の場合の文字中の残基には完全な信頼性がないので、請求の範囲ではXaaで表す。ペプチド Phe-Ala-Ala-Thr-Gln-Phe-Glu-Pro-Leu-Ala-Ala-[Cys]（配列番号８）は、上記のように連続的にアフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体を生成するために使用した。これらの抗体をGTVap1と呼び、そしてウエスタンブロット分析のために1:500希釈で使用した。図４は、ウエスタンブロット分析において、アフィニティー精製したGTVap1抗体が、GLUT4小胞上の165kDおよび155kDタンパク質に特異的であり、そしてその２つよりも豊富ではない120kDタンパク質とも反応することを示している。対照と比較して、ウエスタンブロットによる測定のように、精製したGLUT4小胞は有意に免疫反応性165kDおよび155kDタンパク質を濃縮する。¹²⁵ＩプロテインＡの定量では、免疫アフィニティー−精製した小胞で18倍の165kDおよび155kDタンパク質の濃縮が示された。オリゴサッカライド側鎖除去後の165kDおよび155kDタンパク質の同一性を示すために、ＬＤＭをN-グリコシダーゼＦで処理した。精製したＬＤＭを0.5％ SDS で可溶化し、そして次に25mM Hepes、10mM EDTA、1.7％β-オクチルグルコシド、pH 7.5で緩衝化した後、試料あたり1単位のN-グリコシダーゼＦ(PNGase F)で、37℃にて12または24時間消化した。対照（グリコシダーゼを欠く試料）を、各条件でインキューベーションした。図５は、ＬＤＭのN-グリコシダーゼＦを用いた処理で、165kDおよび155kD免疫反応性タンパク質の両方が110kDの１つの免疫反応性タンパク質に転換されることを示している。したがって、両方の形態はグリコシル化165kDおよび155kD形態のオリゴサッカライド側鎖の数および／または長さに差異が存在する、タンパク質レベルでは同一のものらしい。165kD および155kDタンパク質は、既に同定されたアミノペプチダーゼと配列相同性を有し、そしてGLUT4小胞はアミノペプチダーゼ活性を濃縮する表１に示したように、断片#2のペプチド配列は既に報告された胎盤起源の血漿アミノペプチダーゼ(Tsujimotoら、欧州特許出願公開第535 241号号明細書)と10 0％の相同性を有した。合成基質ロイシンp-ニトロアニリドは、アミノペプチダーゼ活性がGLUT4小胞と同時に精製されることを確かめるために使用した。免疫アフィニティー精製したGLUT4小胞、または対照IAV膜に非特異的に結合した小胞を、20mM Tris、0.1％ Triton X-100、pH7.5で抽出した。２つのマトリックスから等容量の抽出物を、 1.6mM leu-p-ニトロアニリドを使用してアミノペプチダーゼ活性についてアッセイした。図６に示す結果は、GLUT4小胞が対照IAVマトリックスのアミノペプチダーゼ活性よりも5倍多い活性を含むことを示す。したがって、アミノペプチダーゼ活性はGLUT4小胞を一緒に精製する。本出願を通して、グルコース輸送体小胞アミノペプチダーゼまたはGTVapは、G LUT4小胞に会合したアミノペプチダーゼを命名するために使用する。ＰＭおよびＨＤＭ膜中のGTVapの同定図７に示すようにGTVapはまた、GTVap1抗体を使用するウエスタンブロット分析によりＰＭおよびＨＤＭ画分にも見いだされる。GTVap-165およびGTVap-155はＨＤＭおよびＬＤＭ中で優勢な状態であるが、ＰＭ中ではこれらのGTVapはより少ない。ＰＭ、ＬＤＭおよびＨＤＭ膜からのGTVapの一般的抽出法およびアッセイ法 GTVapは、低濃度の界面活性剤を使用してＬＤＭ、ＨＤＭおよびＰＭ膜区分から最大（＞95％）に抽出できる。特に示さない限り、GTVapをGLUT4小胞、ＬＤＭ、ＨＤＭおよびＰＭから20mM Tris、pH7.5中の0.1％ Triton X-100を使用して４ ℃にて15分間可溶化した。不溶性物質を20,000Xgで20分間遠心することによりペレット化し、そして捨てた。酵素抽出物(10-20μgタンパク質)を、1.6mM ロイシンp-ニトロアニリド(20mM Tris-HCl、0.1％ Triton X-100、pH7.5、250μl容量中)を使用して37℃でアッセイした。p-ニトロアニリド生成物のＵＶ吸収を405nm で測定し、そしてp-ニトロアニリド標準と比較することにより定量した。結果は特記しない限り37℃でμgタンパク質/時間あたりに生成されたp-ニトロアニリドのピコモルで表す。あるいは結果は、タンパク質が低くすぎて測定できない場合は（例えばカラム画分）405nmでのOD変化として表すか、または相対比を作成した。図８に示すように、ＰＭ、ＬＤＭおよびＨＤＭはGTVap活性を含む。 GLUT4小胞は初めにアミノペプチダーゼ活性を有することが示されたが、165kD および155kDタンパク質が真にアミノペプチダーゼであるかどうかを確認する必要があった。精製したGLUT4またはＬＤＭから得られるタンパク質の量には限界があるで、ＨＤＭ由来の酵素を特性決定し、そして精製する必要があった。GTVap 酵素活性の特性決定種々のアミノ酸p-ニトロアニリド基質に対するGTVapの相対反応性を特徴付けるために、ＨＤＭ抽出物を上記のように調製し、そして1.6mM濃度の各基質と上記のようにインキューベーションした。表２に示すように、GTVapの合成アミノ酸p-ニトロアニリド基質に対する相対活性は、ロイシン＞＞プロリン、アラニン＞バリン、グリシンである。種々のアミノ酸β-ナフチルアミド基質に対するGTVapの相対反応性を特徴付けるために、GLUT4小胞抽出物を上記のように調製し、そして200μM濃度の各基質と上記のようにインキューベーションした。表２Ａに示すように、GTVapの合成アミノ酸β-ナフチルアミド基質に対する相対活性は、ロイシン＞リシン＞アルギニン＞メチオニン＞アラニン＞フェニル基アラニンである。 GTVap活性の至適pHを決定するために、ＨＤＭ抽出物を上記のように調製し、そして100mM Tris塩基、0.1％ Triton X-100(これはすでに示したpH値にHClで調整した)で１：９に希釈した。15分間のインキューベーション後、ロイシンp-ニトロアニリド基質を加え、そして酵素活性を上記のように測定した。図９に示した結果は、酵素が広い中性の至適pHを有することを示している。 GTVapの温度安定性を測定するために、ＨＤＭ抽出物を上記のように酵素分析する前に、種々の温度で20分間インキューベーションした。図１０に示す結果は、20から40℃の間で活性が25％、温度依存的に不活性化することを示す。さらに 40℃から50℃の間で大きな活性低下があり、20℃のインキューベーションと比較して75％の阻害を生じる。既知のアミノペプチダーゼには構造の最適な安定化および最大酵素活性に結合イオンが必要である。GTVapに関するイオン要求性を探索するために、ＨＤＭのT riton x-100抽出物を種々のイオンと共に37℃で15分間インキューベーションした後、leu-p-ニトロアニリド基質を加えた。図１１に示す結果により、特定のイオンが酵素活性を活性化および阻害できることを実証する。これはまた酵素が二価カチオン添加無しで有意な活性（最大活性のおよそ55％）を有することも証明している。亜鉛、コバルトおよびマンガンは、マイクロモル濃度で最適に活性化し、そしてミリモル濃度で阻害する。カルシウムおよびマグネシウムも部分的には活性化するが、高マイクロモルからミリモルのイオン濃度でである。リチウムおよびカリウムイオンは、1μMと10mMの間で酵素活性に効果がない。 GTVapの初期の調査中に、Triton X-100抽出物は４℃では時間経過により酵素活性を失うことが証明された。特別なイオンを加えることにより酵素活性を安定化させる試みは、すでに酵素を活性化することを示した。ＨＤＭの日常的な抽出の直後に、抽出物は、イオンまたはDTTを既に酵素活性を強化すると示された濃度で含有する20mM Tris-HCl、pH7.5で希釈された。４℃で種々の時間の後、アリコートを取り出し、そしてGTVap活性を測定した。図１２に示す結果は、カルシウムが時間依存的不活性化に対して酵素活性を安定化することを示している。すでに活性を増加させると示された亜鉛、コバルトおよびマンガンは、酵素を安定化しない。多数のプロテアーゼインヒビターを、GTVapに対するそれらの阻害効果を調査するために研究した。酵素測定法は上記に示したが、leu-p-ニトロアニリド基質を加える15分前に、種々の濃度のインヒビターをＨＤＭ酵素抽出物に加えた点は異なった。データは100％の活性の有するインヒビター無しの対照との比較で与える。以下のインヒビター（試験した最大濃度は、カッコ内に示す）は、ロイシン-p-ニトロアニリド基質を使用してGTVap活性に対して効果が無かった：ジイソプロピルフルオロホスフェート(5mM)、PMSF(1mM)、ベンズアミジン(10mM)、ロイペプチン(5mM)、EDTA(5m M)。２つの亜鉛錯化物、フェナントロリンおよびジピリジルは、図１３に示すように＞0.2mMで＞98％の阻害物質であることが判明した。 Leu-Leu-Phe-クロロメチルケトン(LLPAC)はカルパインの既知のインヒビターであるが、1mMのGTVap IC₅₀を有する。ジチオスレイトール(DTT)は５mMで30％の阻害を有するが、0.2mMで酵素活性を20％増加させる。既に同定された多数のアミノペプチダーゼインヒビターを、GTVapについて試験した。最も効果的なインヒビターは２μMのIC₅₀を有するロイチオールであった。図１４に示すように、アマスタチンは0.35mMのIC₅₀を有し、そしてベスタチンおよびアクチノニンは＞１mMのIC₅₀を有した。ＨＤＭ由来のGTVap-165、155および120の精製 GTVap酵素に関する精製法は、酵素の比較的早い、時間に依存する不活性化に基づき構成した。精製スキームは２つのアフィニティー精製(WGAおよびIDAC)、続いて陰イオン交換クロマトグラフィー分離を使用する。カルシウムイオンは可能であればいつでも最適な安定性を維持するために使用した。 1mg/ml濃度に精製されたＨＤＭを、20mM Tris-HCl、0.1％ Triton X-100(2mM CaCl₂、150μM PMSF、1mM DFP、1mM ベンズアミジン、2μM ロイペプチンおよび 1μM ペプスタチンＡを含有)で可溶化した。この抽出物は全アミノペプチダーゼ活性の96％およびＨＤＭ画分の全タンパク質の77％を可溶化することが判明した。非可溶化膜を20分間、48,000Xgでペレット化し、そして捨てた。可溶化抽出物を小麦胚芽凝集素(WGA)-Seph aroseと共に浴でインキューベーションした。特に1mlの包装された小麦胚芽レクチン-Sepharose 6MB樹脂(WGAと呼ぶ)を、10mgのＨＤＭのタンパク質に加え、そして４℃で一晩回転させた。樹脂をCaCl₂無しの上記緩衝液で洗浄し、そして5.0 mlの0.5M N-アセチルグルコサミンで溶出した。全アミノペプチダーゼ活性の約9 3％が結合し、そして0.5M N-アセチルグルコサミンを使用してWGAカラムから溶出できた。このWGA精製画分を直接、陰イオン交換Resource Qカラムに添加した。典型的には、全WGA精製画分を４℃で1mlのResource Q陰イオン交換樹脂カラムに添加した。20mM Tris、0.1％ Triton X-100、pH7.8中で0−0.5M NaClの直線勾配を４℃で溶出に使用した。全画分をアミノペプチダーゼ活性についてアッセイし、そしてGTVap1抗体に対するウエスタンブロット反応性をアッセイした。図１５ａおよび１５ｂに示すように、このイオン交換法は120kD免疫反応タンパク質をGTVap-155およびGTVap-165kd状態から分離した。GTVap1抗体を使用する、120k Dタンパク質およびGTVap-155kDおよびGTVap-165kDタンパク質同定のResource Q ウエスタンブロットプロフィールは、アミノペプチダーゼ活性との優れた相関を示す。Resource Qカラムからの鋭い初期の溶出ピークはGTVap-120であり、後に溶出する広いピークは初めにGTVap-155であり、接近してGTVap-165が続いた。あるいはWGA精製画分はまた、亜鉛を予め添加したイミノジ酢酸カラムに直接添加することができた。特にWGA精製画分は、製造元の推薦に従い10mM ZnSO₄(20 mM Tris、0.1％Triton X-100、pH7.5中)を前以て添加した0.5mlのイミノジ酢酸キレート化(IDAC)カラムを直ぐに通過した。WGA溶出液の添加後、カラムを10カラム容量の20mM Tris、0.1％ Triton X-100、pH7.5で洗浄した。次にカラムを10 mM EDTAを含む20mM Tris、0. 1％ Triton X-100、pH7.5で溶出した。約93％のアミノペプチダーゼ活性がIDAC に結合し、そして10mM EDTAで溶出できた。 IDAC素通りおよびIDAC結合画分を、1mlのResource Q陰イオン交換樹脂で上記のように別個にクロマトグラフィーを行った。図１６に示す結果は、亜鉛−添加 IDACカラムがすべてのGTVap-120を結合するが、ほとんどのGTVap-155およびGTVa p-165は通過することを示している。この観察はこれら画分のウエスタンブロット分析により確証される（データは示さず）。亜鉛への結合にはタンパク質のヒスチジン残基と結合した亜鉛イオンとの配位が関与するらしいので、さらにグリコシル化された重いGTVapは固定化された亜鉛への結合が立体的に妨害されるのかもしれない。亜鉛カラムに結合しないGTVap-155およびGTVap-165の画分は、GT Vap-120と二量体化し、そして亜鉛と直接反応しないかもしれない。他のアミノペプチダーゼに関するこれまでの生物物理学的研究は、これらの酵素が二量体で存在できることを示唆している。まとめると、GTVap-120、GTVap-155およびGTVap-165は酵素的に活性であり、そしてすべてがGTVap1抗体と反応し、そして上記の精製スキームにより濃縮され、そして分離できる。GTVap はインスリンに反応して形質膜に転移する GLUT4はインスリンの刺激で、細胞内の小胞区分から形質膜に転移することが知られている。GTVapもまた転移するのかどうかを決定するために、上記のように調製したラット精巣上体脂肪パッドから解離した脂肪細胞をインスリンで刺激した。インスリン(10nM)を、37℃で20分間維持した新たに調製した脂肪細胞に加えた。脂肪細胞を次にTES緩衝液で洗浄した。インスリン刺激および対照脂肪細胞を、亜細胞区分に分画し、そしてGTVap酵素およびタンパク質（ウエスタンブロット）を前述のように分析した。図１７はウエスタンブロット反応性の増加により証明されるように、 GTVapがインスリン刺激に反応して形質膜に転移することを示している。図１８は、GTVap酵素活性がインスリン刺激後に形質膜で29％増加することを示す。インスリンおよび合成ペプチド基質のGTVap開裂ＨＤＭ(1.8mg/ml)を、37℃で120μg/mlのブタインスリンと50mM ホウ酸ナトリウム、pH7.5(すでにGTVapに対して阻害効果をもたないと示された以下のプロテアーゼインヒビターを含有)中でインキューベーションした：2mM ベンズアミジン、2μM ロイペプチン、1μM ペプスタチン、1mM DFPおよび150μM PMSF。反応は種々のインキューベーション時間後に、ＨＤＭを除去するためにアリコートを 200,000Xg遠心して停止させた。インスリン生成物はマススペクトロメトリーにより検出するか、または始めに0.25ml/分の流速で2.1X15cmのベックマン(Beckma n)Spherisorb C18カラムで、４時間に27％から31％アセトニトリル(TEAでpHを3 に調整したTFA中)への勾配でクロマトグラフィーを行い、その後マススペクトロメトリー分析により検出した。この方法を使用して、完全な、およびTriton X-100抽出ＨＤＭは、インスリンに対するアミノペプチダーゼ活性を有することが示された。図１９ａ、ｂおよびｃに示すように、マススペクトロメトリー分析ではインスリンのＢ−サブユニットのN-末端残基フェニルアラニンおよびバリンが完全なインスリン分子から連続して除去されたことを示した。GTVap をコードする核酸配列の同定１組の２つの縮退オリゴヌクレオチドプールを得、その１つはペプチドの初めの７つのアミノ酸をコードし、そしてもう１つは最後の７アミノ酸の逆相補鎖をコードした。これらのオリゴヌクレオチドプールは、3’RACEキットを使用してラット骨格筋polyA⁺RNAから生成したラット骨格筋cDNAについて、Ampli Taq DNA ポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行うために、あるいは逆転写、続いてポリメラーゼ連鎖反応をラット骨格筋polyA⁺RNAについてレトロサームDNAポリメラーゼを使用して行うために使用した。これらの反応から、このオリゴヌクレオチドを基本としたペプチドをコードする明白なＤＮＡ配列の短い領域を得た。³²Ｐで標識したこれらの明白な核酸をプローブとして使用して、ラムダgt11ラット骨格筋cDNAライブラリーをスクリーニングし、そしてGTVapをコードする25個のクローンを同定した。5.3、10.1および12.1と同定されたこれらの中の３つは、クローン5.3および10.1が両方ともイントロンを含んでいたので、クローン12.1の配列に基づいた最終配列を用いて配列決定された。クローン12 .1の5'および3'末端付近の核酸配列に基づき、Marathon RACEキットを使用して3 'および5'RACEを行うために、さらなるオリゴヌクレオチドプローブを設計した。７つの反応生成物が３’末端で同定され、KC44およびKC45と同定されたその中の２つを配列決定して、図２０(配列番号１５および１６)に記載のcDNAの３’末端を得た。２つの反応生成物が５’Marathon RACE反応により同定され、そしてクローン334について完全な配列が、そしてクローン331について部分的な配列が得られた。クローン334の５'末端付近の核酸配列に基づき、そして最初の５'Mar athon RACE反応からのRACE生成物を鋳型として使用して、さらに５’Marathon R ACE反応を行った。これによりさらに７つのクローンを得、クローン２、３および５と同定したそのなかの３つクローンを配列決定した。これらの配列を合わせて、図２０（配列番号１５および１６）の全核酸配列を作成する。テキサス州ヒューストンのLARKシークエンシングテクノロジーズ(Lark Sequencing Technologies)により配列決定されたクローン334を除いて、すべてのクローンのシークエンシングはシークエナーゼを使用して行った。配列はAssemblyign(ラボラトリーリサーチプロダクツ:Laborat ory Research Products、イートスマンコダック社:Eastman Kodak Company、ニューヘブン、コネティカット州)、およびWisconsin Package(ジェネティックコンピューターグループ:Genetics Computer Group、マジソン、ウィスコンシン州 )を使用して集成した。開始コドンは、翻訳を開始できる核酸配列中の最初のATGを使用して同定した[ Kozak、J.Cell Biol .,108,229-241(1989)]。成熟タンパク質のより長い形態（配列番号１５）は1026アミノ酸を含み、そして117239と予想される分子量を有する。この核酸配列は、受け入れ番号R47032およびH08895を含む幾つかの未同定発現配列タグと高度な類似性を表す。ラットの門歯の未分類組織から単離されたR470 32は、GTVapと90ヌクレオチドにわたって同一であり、次に両端が逆である。これはGTVapの非スプライスまたはスプライス状態のいずれかをコードするようである。ヒト脳から単離されたH08895は、382ヌクレオチドにわたって（この発現された配列タグの完全長）GTVapと88.5％同一である。これはH08895がヒトGTVap の一部をコードするようである。予想されるタンパク質はラットアミノペプチダーゼNと32.5％同一であり、そして他のアミノペプチダーゼとは＞20％の同一性を表す。このタンパク質同一性のレベルは、1000ヌクレオチドより多くにわたって50％−60％の核酸同一性に相当する。インスリン−感受性保持配列のコンセンサス配列の同定 GTVapおよびGLUT4はGLUT4小胞に見いだされ、そして形質膜への同時転移により証明されるようにインスリンに反応するので、両タンパク質が共通の構造的モチーフ（保持配列）を共有すると予想される。これらのタンパク質にこのような特性を付与する構造的モチーフは、インスリン−感受性の様式で転移する他のタンパク質について見られるようである。インスリン−感受性保持配列を同定する試みにおいて、GTVapの予想されるタンパク質配列がGLUT4の細胞質ドメインのタンパク質配列と、Wisconsin Package コンピュータープログラム（ジェネティックスコンピューターグループ、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して比較された。有意な相同性が、GTVapの細胞質ドメイン２つの隣接するセグメント（配列番号１７および１８）中、およびGLUT4の逆（Ｃ−Ｎへ読む）細胞質ドメイン（配列番号１９）で明らかであった。このコンセンサス配列は、配列番号２０および２１として同定された配列により表されている。本発明の他の態様は、ここに開示されたこの明細書または実験の考察から当業者には明らかであろう。明細書および実施例は例示と考えられるだけであり、本発明の真の範囲および精神は以下の請求の範囲に示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＥＤ (72)発明者レツツインガー，ジヨン・テイアメリカ合衆国コネチカツト州06516ウエストヘブン・アイビーストリート90 (72)発明者ヘイ，ウオーレスアメリカ合衆国コネチカツト州06443マデイソン・レイスヒルロード85 (72)発明者ハート，ジヨン・テイアメリカ合衆国コネチカツト州06492ウオーリングフオード・ウツドランドドライブ 47 (72)発明者クレアモント，ケビン・ビーアメリカ合衆国コネチカツト州06410チエシヤー・マーウインサークル80

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）天然状態でGLUT4−含有小胞の成分であり；（ｂ）アミノペプチダーゼ活性を有し；（ｃ）脱グリコシル化状態で約110kDの分子量を有し；（ｄ）アミノ酸配列Phe-Ala-Ala-Thr-Gln-Phe-Glu-Pro-Leu-Ala-Ala(配列番号１ )およびIle-Leu-Gln-Asn-Gln-Ile-Gln-Gln-Gln-Thr-Arg-Thr-Asp-Glu-Gly-Xaa-P ro-Xaa-Met（配列番号２）を含んで成り；そして（ｅ）（配列番号１）と同定されたペプチドに対して生成された抗体と反応するタンパク質、およびそのムテイン。２．さらに（配列番号１５および１６）に示すｃＤＮＡ配列によりコードされ、かつGTVapの予想タンパク質配列（配列番号１５および１６）と本質的に同一であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。３．さらに、（ａ）中性ｐＨで至適活性を有し；（ｂ）合成アミノ酸 -p- ニトロアニリド基質に対する比活性が：ロイシン＞＞プロリン、アラニン＞バリン、グリシンであり；（ｃ）その活性がＣｏ、Ｚｎ、Ｍｇ、ＭｎおよびＣａの二価イオンによりモジュレートされ、（ｄ）不活性化の最低温度が40℃から50℃の間であり；（ｅ）その活性がＣａイオンにより安定化され；（ｆ）その活性がフェナントロリン、ジピリジル、ロイチオール、アマスタチン、アクチノニンおよびベスタチンにより減少し；（ｇ）それぞれ約165kD、155kDおよび120kDの分子量を有する少なくとも３つのグリコシル化状態を有する、ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のタンパク質。４．さらに合成アミノ酸β-ナフチルアミド基質に対する比活性が：ロイシン＞リシン＞アルギニン＞メチオニン＞アラニン＞フェニルアラニンであることを特徴とする、請求の範囲第３項に記載のタンパク質。５．GTVapを精製し、そしてそのグリコシル化種を分離する方法であって、（ａ）該GTVapを少なくとも１つの供給源から抽出し：（ｂ）該GTVap抽出物をレクチンアフィニティー樹脂と接触させてグリコシル化G TVapを吸着させ；（ｃ）グリコシル化GTVapを該レクチンアフィニティー樹脂から溶出し；（ｄ）該レクチンアフィニティー樹脂からの溶出物を、樹脂およびGTVapと同時に作用する金属イオンを含んで成るキレート化クロマトグラフィー樹脂と接触させ；（ｅ）非結合物質を該キレート化クロマトグラフィー樹脂から回収し；（ｆ）結合した物質を該キレート化クロマトグラフィー樹脂から溶出し；（ｇ）該キレート化クロマトグラフィー樹脂からの非結合および溶出したGTVap- 含有画分を、別個に陰イオン交換樹脂と接触させ；（ｈ）結合したGTVap種を該陰イオン交換樹脂から溶出し；そして（ｉ）該陰イオン交換樹脂から分離したGTVap種を検出する、工程を含んで成る上記方法。６．GTVapの抽出工程が、少なくとも１つの金属イオン安定化剤および界面活性剤の混合物を使用して行なわれる、請求の範囲第５項に記載の方法。７．安定化剤がカルシウムイオンである、請求の範囲第６項に記載の方法。８．上記レクチンアフィニティー樹脂からの溶出物をキレート化クロマトグラフィー樹脂と接触させる上記工程において、上記金属イオンとして亜鉛が採用される、請求の範囲第５項に記載の方法。９．上記キレート化クロマトグラフィー樹脂からの非結合および溶出したGTVap- 含有画分を、別個に陰イオン交換樹脂と接触させる上記工程において、該陰イオン交換樹脂が四級アンモニウム基を含む、請求の範囲第５項に記載の方法。１０．GTVap活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）アッセイできる量の酵素活性を有するGTVapまたはGTVap-含有物質を提供し；（ｂ）上記GTVapまたはGTVap-含有物質を、GTVap活性をモジュレートする能力についてアッセイする試験基質と共にインキューベーションし；（ｃ）GTVap基質を添加し；（ｄ）GTVap活性を時間の関数として監視し；そして（ｅ）該試験基質のGTVapに対するモジュラトリー効果を測定する、工程を含んで成る、上記方法。１１．アッセイできる量の酵素活性を有する上記GTVapまたはGTVap-含有物質が、脂肪組織、骨格筋組織、心筋、これらの組織に由来する細胞系から、または組換え源から得られる、請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．GTVap基質を加える上記工程において、ロイシンパラニトロアニリドまたはポリペプチド基質が採用される、請求の範囲第１０項に記載の方法。１３．実質的に純粋なGTVapまたはその断片を使用して生成されたGTVapに特異的な抗体。１４．生物学的材料中のGTVapを測定する方法であって、（ａ）生物学的材料の検体を、免疫反応性エピトープを最適に暴露するように調製し、（ｂ）該検体またはその抽出物をGTVap特異的抗体と共にインキューベーションし；（ｃ）非結合抗体を該検体から除去し；そして（ｄ）該検体中のGTVapに結合した抗体を定量する、工程を含んで成る、上記方法。１５．上記インキューベーション工程において、上記GTVap特異的抗体がGTVap1 抗体である、請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．GTVapのセグメントをコードする核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ。１７．上記オリゴヌクレオチドが、以下の配列：およびその断片を有するオリゴヌクレオチドから成る群から選択され、ここでＮはＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＩ（インシン）であり；ＲはＡまたはＧであり；ＹはＣまたはＴであり；ＭはＡまたはＣであり；ＫはＧまたはＴであり；ＳはＣまたはＧであり；ＷはＡまたはＴであり；ＨはＡ、ＣまたはＴであり；ＢはＣ、ＧまたはＴであり；ＶはＡ、ＣまたはＧであり；そしてＤはＡ、ＧまたはＴである、請求の範囲第１６項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。１８．生物学的検体中にGTVapのセグメントをコードする核酸配列を決定する方法であって：（ａ）核酸物質の分析のための生物学的検体を調製し；（ｂ）該生物学的検体の核酸物質を、GTVapのセグメントをコードする核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと共にインキューベーションし；（ｃ）非結合オリゴヌクレオチドプローブを該核酸物質から除去し；（ｄ）GTVapのセグメントをコードする核酸配列に結合したオリゴヌクレオチドプローブを決定する、工程を含んで成る上記方法。１９．図２０に表すアミノ酸配列（配列番号１５および１６）を有するGTVapをコードする核酸、またはストリンジェント条件下でその相補体とハイブリダイズでき、かつGTVapをコードする核酸から本質的に成る、精製された核酸。２０．上記の精製された核酸がベクター中に存在する、請求の範囲第１９項に記載の精製された核酸。２１．上記の精製された核酸が細胞中に存在する、請求の範囲第１９項に記載の精製された核酸。２２．上記核酸がヘテロロガスなプロモーターの転写制御下にある、請求の範囲第１９項に記載の精製された核酸。２３．上記の各細胞が、図２０に表すアミノ酸配列（配列番号１５および１６）を有するGTVapをコードするクローン化核酸、またはストリンジェント条件下でその相補体とハイブリダイズでき、かつGTVapをコードする核酸を含んで成る、細胞の均質な集団。２４．各細胞が哺乳類細胞である、請求の範囲第２３項に記載の細胞の均質な集団。２５．請求の範囲第２３項に記載の細胞を培地中で培養して、GTVapを発現する細胞集団を形成し、そしてGTVapを該細胞または該培養培地から精製する工程を含んで成る、GTVapの生成法。２６．タンパク質の保持配列をコードし、そして以下のアミノ酸残基の配列： -X¹aa-Xaa-(X¹aa)₃-(Xaa)_2-3-Tyr-Glu-(Xaa)_1-3-Ser-(Xaa)_0-1-X²aa-(Xaa)_0-4-L eu-Leu（配列番号２０）を含んで成る第一ポリペプチド、および以下のアミノ酸残基の配列：-Leu-Leu-(Xaa)_0-4-X²aa-(Xaa)_0-1-Ser-(Xaa)_1-3-Glu-Tyr-(Xaa)_2- ₃ -(X¹aa)₃-Xaa-X¹aa（配列番号２１★）を含んで成る第二ポリペプチド、ここで Xaaは任意のアミノ酸残基を表し、X¹aaはPro、GluまたはAspを表し、そしてX²aa はArgまたはLysを表す、ならびにそのムテインから成る群から選択されるポリペプチド。２７．上記保持配列が、His Pro Leu Glu Pro Asp Glu Val Glu Tyr Glu Pro Ar g Gly Ser Arg Leu Leu（配列番号１７）；His Glu Met Asp Glu Asp Glu Glu A sp Tyr Glu Ser Ser Ala Lys Leu Leu（配列番号１８）；又はLeu Leu Glu Gln Glu Val Lys Pro Ser Thr Glu Leu Glu Tyr Le u Gly Pro Asp Glu Asn Asp（配列番号１９）である、請求の範囲第２６項に記載のポリペプチド。２８．ソーティングがインスリンにより制御されるGTVap以外のタンパク質のインスリン感受性保持配列の同定法であって、該タンパク質のアミノ酸配列を決定し、該配列を請求の範囲第２６項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と比較し、そして該ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、またはそれに相同的な該タンパク質のアミノ酸配列を同定することを含んで成る、上記方法。２９．第二タンパク質のインスリン感受性保持配列に結合する細胞内ソーティングタンパク質またはその活性断片を同定する方法であって：ａ）該細胞内ソーティングタンパク質を該保持配列と、該ソーティングタンパク質と該保持配列との間の結合が可能な条件下でインキューベーションし、そしてｂ）特異的に結合したソーティングタンパク質を同定する、ことを含んで成る、上記方法。３０．少なくとも１つのGLUT4およびGTVapの細胞内ソーティングを変化させることができる化合物を同定する方法であって、ａ）細胞内ソーティングタンパク質またはその活性断片を、請求の範囲Ａのポリペプチド保持配列と、該ソーティングタンパク質と該保持配列との間の結合が可能な条件下で、試験化合物の存在または不在下でインキューベーションし；ｂ）該ソーティングタンパク質と該保持配列の特異的結合複合体を定量し；そしてｃ）試験化合物の存在および不在下での複合体形成の程度を比較する、ことを含んで成る上記方法。３１．インスリン耐性症候群を現している患者に、薬学的に許容できるキャリアー内の有効量のGTVapモジュレーターを投与することを含んで成る、インスリン耐性症候群を処置する方法。