JPH0198483A - グルタチオン・パーオキシダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、グルタチオン・パーオキシダーゼのデオキシ
リボヌクレオチド配列の１３９塩基〜１４１塩基のＴＧ
ＡコドンのＴ（チミン）を中流域として−Ａｌａ−Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−のアミノ酸配列
をコードするパリンドローム構造（Ｐａ　Ｉ　ｉｎｄｒ
ｏｍｅ　；回文構造）ｌを構築し、必要に応じてその３
０塩基上流のＧ（グアニン）を中流域とするパリンドロ
ーム構造２を構築した遺伝子を含有した発現ベクターを
保持した微生物を、セレン含有培地にて培養し、次いで
培養物から発現されたグルタチオン・パーオキシダーゼ
を採取してなるグルタチオン・パーオキシダーゼの新規
な発現方法による製造法に関する。

〈従来の技術〉 グルタチオン・パーオキシダーゼは、グルタチオンを基
質として、２分子のグルタチオンと１分子の過酸化水素
から２分子のグルタチオン酸化物と２分子の水分子を生
成する反応を触媒する酵素であって、哺乳動物の肝臓、
心臓、肺や血液中に存在していることが知られ（Ｆｌｏ
ｈｅ、Ｌ、　ａｔ　ａｌ、ＦＥＢＳＬｅｔｔ、　ｄム１
３２−１３４（１９７３））、グルタチオンによる過酸
化脂質酸化物の２電子還元を触媒して生体内の過酸化物
処理に重要な役割を果している。

本グルタチオン・パーオキシダーゼは、セレンを含む蛋
白質で、セレンはその活性部位にセレノシスティン（Ｓ
ｅａ）の形で存在する。クローニングされたマウス由来
のグルタチオン・パーオキシダーゼ遺伝子から、通常は
停止コドンとして読み取られるデオキシリボヌクレオチ
ド配列（ＤＮＡ）ＴＧＡが、本酵素ではセレノシスティ
ン（Ｓｅｃ）をコードしているオパールコドンであるこ
とが知られている（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　５．１２
２１−１２２７．１９８６）。

〈発明が解決しようとする問題点〉 本発明者らは、マウス由来のグルタチオン・パーオキシ
ダーゼ遺伝子のセレノシスティン（ＳｅＣ）をコードし
ているＴＧＡを含んだ１７塩基を合成し、これをプロー
ブとして用いてマウス肝臓ｃ−ＤＮＡライブラリーをス
クリニングした。クローニングしたｃ−ＤＮＡを発現ベ
クターｐＵＣ１３に組み込み、エシェリヒア・コリーで
の発現を試みたが発現されなかった。

さらにヒト由来のグルタチオン・パーオキシダーゼ遺伝
子についても、ヒト肝臓ｃ−ＤＮＡライブラリーを用い
て、上記のクローニングしたマウス由来のグルタチオン
・パーオキシダーゼ遺伝子をプローブとして用いてスク
リニングし、同様に発現を試みたが発現されなかった。

〈問題点を解決するための手段〉 本発明者らは、グルタチオン・パーオキシダーゼ遺伝子
のＭ　ｅ　ｔ　（Ａ　Ｔ　Ｇ　ｉ以下Ａを１位塩基とし
て表現する）から１３９塩基〜１４１塩基のＴＧＡたる
オパールコドンのＴ（チミン；１３９位塩基）を中流域
とした塩基配列において−Ａｌａ−３ｏｒ−Ｌｅｕ−３
ｅｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−のアミノ酸配列をコードし、か
つ相補性を示してステムまたはループを形成するパリン
ドローム構造１を構築して、発現ベクターｐＵｃ１３に
組み込み、これを有するエシェリヒア・コリーを、セレ
ンを含有する培地で培養した結果、１３９塩基〜１４１
塩基のＴＧＡが何ら停止コ゛トンとして作用することな
く、グルタチオン・パーオキシダーゼの全アミノ酸配列
を発現し得ることを見出した。

さらに鋭意研究した結果、この１３９位塩基のオパール
コドンのＴから、その３０塩基上流のＧ（グアニン）を
中流域とする一３ｏｒ−１，ｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｅｕ−Ｌｓｕ−ＩＩｓ−Ｇｌｕ−の
アミノ酸配列をコードするパリンドローム構造２を構築
して、発現ベクターｐＵｃ１３に組み込み、セレンを含
有する培地で培養して、良好に発現し得ることを見出し
て、グルタチオン・パーオキシダーゼの新規な発現方法
を完成した。

本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので、グ
ルタチオン・パーオキシダーゼのデオキシリボヌクレオ
チド配列の１３９塩基〜１４１塩基のＴＧＡコドンのＴ
（チミン）を中流域として−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−
３ｅｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−のアミノ酸配列をコードする
パリンドローム構造１を構築した遺伝子を含有した発現
ベクターを保持した微生物を、セレン含有培地にて培養
し、次いで培養物から発現されたグルタチオン・パーオ
キシダーゼを採取することを特徴とするグルタチオン・
パーオキシダーゼの製造法である。

本発明におけるグルタチオン・パーオキシダーゼ（以下
、ＧＳＨＰｘという）遺伝子としては、例えばマウス肝
臓から抽出したｍ−ＲＮＡよりλｇｔｌｌベクターに組
み込んだライブラリーを作成し、マウスのＧＳＨＰｘ遺
伝子のセレノシスティンをコードしているＴＧＡを含ん
だ１７塩基（５’−ＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＡＣＣＡ
Ｃ−３′）を合成し、これをプローブとして用いてＣ−
ＤＮＡライブラリーをスクリニングしてＧ　Ｓ　ＨＰＸ
遺伝子の全構造遺伝子頭載を含む遺伝子を得るか、また
はヒト肝ｌ１１ｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーを用いて
、上記のクローニングしたマウス由来のＧＳＨＰｘ遺伝
子をプローブとして用いてスクリニングして得ることが
でき、さらにラビット、ヒト、ラントまたはウシ等の哺
乳動物由来の肝臓、心臓、肺や血液中Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘ
の遺伝子をも使用できるこのようにして得られるＧ　Ｓ
　ＨＰ　ｘ遺伝子は、少なくともＳｅｃを示す１３９塩
基〜１４１塩基のオパールコドンＴＧＡのＴを中流域と
するーＡＩａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−のアミノ酸配列を有するものであるが、このアミノ
酸配列の範囲におけるＴを中流域として何らパリンドロ
ーム構造を形成しているものではなく、またそのまま発
現ベクターに組換えてもオパールコドンＴＧＡが停止コ
ドンとして機能し、目的とするＧＳＨＰｘが得られない
ものであった。さらにこの＋３９塩Ｍ〜１４１塩基のオ
パールコドンＴＧＡのＴから３０塩基上流のＧ（Ｖａｌ
を示す第１コドン）を中流域とする一Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１
１ｅ−Ｇｌｕ−のアミノ酸配列をコードする遺伝子を有
する。

上記のＧＳＨＰｘとして、例えばマウス由来のＧ　Ｓ　
ＨＰ　ｘ遺伝子を含んだＥｃｏＲｒ−ＥｃｏＲＩ約１０
００ｂｐの断片をλｇｔｌｌベクターのポジティブクロ
ーンからＥＣ０ＲＩの部分水解で切り出し、プラスミド
ｐＵＣ１１８にサブクローニングして得たプラスミドＩ
）ＭＧＳＨＰｘを用いて決定した塩基配列から予測され
ＧＳＨＰｘ遺伝子のＮ末端からの一部を例示すれば、 −八ＴＧ　　ＴＧＴ　　ＧＣＴ　　ＧＣＴ　　ＣＧＧＭ
ｅｔ　　Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　ＡｒｇＣＴＣ
ＴＣＣＧＣＧ　　　ＧＣＧ　　　ＧＣＡＬｅｕ　　Ｓｅ
ｒ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　ＡｌａＣＡ’Ｇ　　　ＴＣ
ＣＡＣＣＧＴＧ　　　ＴＡＴＧｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｖａｌ　　ＴｙｒＧＣＣＴＴＣＴＣＣＧＣＧ　　
ＣＧＣ Ａｌａ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　ＡｒｇＣＣ
Ｇ　　　ＣＴＧ　　　ＡＣＧ　　　ＧＧＣＧＧＧＰｒｏ
　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　ＧＩＹＧＡＧ　　
ＣＣＴ　　ＧＴＧ　　ＡＧＣＣＴＧＣｌｕ　　　Ｐｒｏ
　　　Ｖａｌ　　　Ｓｅｒ　　　ＬｅｕＧＧＣＴＣＣＣ
ＴＧ　　　ＣＧＧ　　　ＧＧＣＧｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｌ
ｅｕ　　Ａｒｇ　　ＧｌｙＡＡＧ　　　ＧＴＧ　　　Ｃ
ＴＧ　　　ＣＴＣＡＴＴＬｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　
　Ｌｇｕ　　１ｉｅＧＡＧ　　　ＡＡＴ　　　ＧＴＣＧ
ＣＧ　　　ＴＣＴＧｌｕ　　　Ａｓｎ　　　Ｖａｌ　　
　Ａｌａ　　　５ｅｒＣＴＣＴＧＡ　　　ＧＧＣＡＣＣ
ＡＣＧＬｅｕ　　　＊＊＊　　　Ｇｌｙ　　　Ｔｈｒ　
　　ＴｈｒＡＴＣＣＧＧ　　　ＧＡＣＴＡＣＡＣＣＩＩ
ｓ　　　Ａｒｇ　　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　　ＴｈｒＧ
ＡＧ　　　ＡＴＧ　　　ＡＡＣＧＡＴ　　　ＣＴＧＣ；
Ｉｕ　　Ｍｅｔ　　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　　ＬｅｕＣ
ＡＧ　　　ＡＡＧ　　　ＣＧＴ　　　ＣＴＧ　　　ＧＧ
Ａ−Ｇｌｎ　　　Ｌｙｓ　　　Ａｒｇ　　　Ｌｅｕ　　
Ｇｌｙ　−（式中、ＴＧＡはオパールコドンを示し、＊
＊＊はＳｅｃとして発現されるアミノ酸を示す）として
全構造遺伝子６０３ｂｐが挙げられ、第４図にその塩基
およびアミノ酸配列を挙げる。

このようなＧＳＨＰｘ遺伝子から本発明で使用するＧＳ
ＨＰｘの遺伝子配列の１３９塩基〜１４１塩基のオパー
ルコドンのＴ（チミン）を中流域とするパリンドローム
構造１を構築し、さらに好ましくはその３０塩基上流の
Ｇ（グアニン）を中流域とするパリンドローム構造２を
も構築した逍転子を得、これを有する発現ベクターを得
るには、以下の如くして常法の遺伝子操作手段によりな
し得る。

まず前記した手法によりＧＳＨＰｘの全構造遺伝子を含
む遺伝子を、マウス、ラビット、ヒト、ラットまたはウ
シ等の哺乳動物の組織等のｃ−ＤＮＡライブラリーから
クローニングする。このクローニングにおいて、例えば
マウス肝臓からの最長の断片（約９００ｂｐ）のクロー
ンを得、ＧＳ）Ｉ　Ｐ　ｘの全構造遺伝子を含む。

次いで、得られたクローンを、Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘの全構
造遺伝子またはその一部を含む遺伝子の制限酵素サイト
、例えば開始コドンの上流部位のＥｃ。

Ｒ１サイト、開始コドンから１６塩基下流のＳａＣ■サ
イト、全構造遺伝子の停止コドンから１２４塩基下流に
あるＨ　ａ　ｅ　［［サイト、さらにその下流にあるＥ
ｃｏＲＩサイト等を利用してＧ　Ｓ　ＨＰＸの構造遺伝
子を得るもので、好ましくはＳａｃ■およびＩｔ　ａ　
ｅ　Ｉ＋制限酵素サイトを利用するに制限酵素５ａｃ１
１および）［ａ　ｅ　Ｉ＋で該遺伝子を消化する。この
ようにして得られたフラグメント（フラグメントａとい
う）は、ＳＤ配列および開始コドンから１６塩基下流の
５ａｃＵサイトを欠くことから、５′末端にＸｂａ　ｌ
リンカ−を有するＳＤ配列を含む開始コドンから下流の
５ａｃＵサイトまでのフラグメント（フラグメントＣと
いう）５　’　−ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡ
ＴＧ３′−ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡｃＴＧＴＧＣ
ＴＧＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＣＧＣ−３’ＡＣＡＣＧＡＣ
ＧＡＧＣＣＧＡＧＡＧＧ−５’を合成する。

次いでこのフラグメントａおよびフラグメントＣを用い
て、例えばプラスミドｐＵｃ１３を制限酵素Ｘｂａ　Ｉ
およびＳｍａ　Ｉにて消化したＸｂａＩ切断サイトおよ
びフラッシュ末端切断サイトを有するプラスミドととも
に用いて、常法によりＳＤ配列およびＧ　Ｓ　［Ｉ　Ｐ
　ｘの全遺伝子を有するプラスミドを得（第１図に概要
を示す）、これをプラスミドｐ　Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘ　　
１と命名した。

このようなプラスミドｐＵｃ１３の他に、ｐＢＲ３２２
、ｐＢＲ３２５、ｐＡｃＹｃ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵ
ｃ１８、ｐＵｃ１９等のプラスミドがエシェリヒア属に
属するエシェリヒア・コリー（大腸菌）、例えばエシェ
リヒア・コリーＤＨ１、同１１Ｂ１０１．同Ｗ１３０４
、同Ｗ３１１０、同Ｃ６００株等を宿主微生物とする場
合に使用できる。またバチルス・ズブチルスを宿主微生
物とする場合にはｐＵＢｌｌｏ、ｐｃ１９４等のプラス
ミドが使用でき、さらにエシェリヒア・コリーとサツカ
ロマイセス・セレビシア等との２種以上の宿主微生物で
自律的に増殖可能なシャトルベクターを利用することも
でき、このようなベクターを用いる場合、前記と同様に
ベクターも制限酵素で切断消化して組換えに使用する。

さらにこのようにして得られたプラスミドを宿主微生物
に移入する方法としては、例えばカルシウムイオンの存
在下で組換えプラスミドの移入を行うか、コンピテント
セル法、ポリエチレングリ、コール法等の公知の方法を
用いて形質転換体を得ればよい。

次いで本発明のＧ　Ｓ　ＨＰ　ｘを得るための遺伝子を
得るに当たって、まず、前記の如くして得たＧＳ　ＨＰ
　ｘ遺伝子、例えば形質転換した宿主微生物から抽出し
たプラスミドｐＧｓＨＰｘ−１のＧＳＨＰ　ｘ遺伝子内
に存在する制限酵素サイトを利用して、少なくとも１３
０塩基〜１５０塩基付近を、目的とする１３９塩基〜１
４１塩基のＴＧＡコドンのＴを中流域とするパリンドロ
ーム構造１に改変するか、または少なくとも９５塩基〜
１５０塩基付近を、目的とする１３９塩基〜１４１塩基
（７）ＴＧＡコドンのＴを中流域とするパリンドローム
構造１およびその３０塩基上流のＧを中心とするパリン
ドローム構造２に改変する。

例えば、抽出した＝亥プラスミドにおけるＧＳＨＰｘ遺
伝子内に転子するＢａｎｌ１サイトを利用してＢａｎｌ
１制限酵素およびＧＳＨＰｘ遺伝子の開始コドン上流の
Ｈｉｎｄｎ［サイトを利用してＨ１ｎｄｌｌ＋制限酵素
を作用せしめて、少なくとも開始コドン部分からＢａｎ
ＩＩサイトを含むフラグメント（フラグメントｅ）を得
る。また工亥ブラスミドにおけるＧＳＨＰｘ遺伝子内に
存在するｐｓｔ＋サイトを利用してＰｓｔｌ制限酵素お
よびＧＳＨＰｘ遺伝子の開始コドン上流の）（ｉｎｄｌ
Ｉ［サイトを利用してＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ制限酵素を作用
せしめて、少なくとも開始コドン部分からｐｓｔｌサイ
トを含むフラグメントを切断除去した開裂したプラスミ
ド（フラグメントｄ）を得る。このフラグメントθおよ
びフラグメントｄは、ＧＳＨＰｘ遺伝子に比較して、少
なくともＢａｎ１１サイト〜ＰｓｔＩサイト間の塩基部
分を欠くものであるから、さらにこのフラグメントを別
途に合成する。このＢａｎＩＩサイト〜ｐｓｔｌサイト
間の塩基部分は、上記した少なくとも１３０塩基〜１５
０塩基付近または少なくとも９５塩基〜１５０塩基付近
を含むもので、１３９塩基〜１４１塩基のＴＧＡコドン
のＴを中流域とするパリンドローム構造１または、この
パリンドローム構造ｌと１３９塩基〜１４１塩基のＴＧ
ＡコドンのＴの３０塩基上流のＧを中流域とするパリン
ドローム構造２とを改変するものである。まず１３９塩
基〜１４１塩基のＴＧＡコドンのＴを中流域とするパリ
ンドローム構造１を含むフラグメント（フラグメントｆ
）は、少なくとも−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅｅ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−のアミノ酸配列をコードするＴＧＡコ
ドンのＴを中流域とするパリンドローム構造を構築する
ものであればよい。例えば、−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｃ−Ｇｌｙ−−ＧＣＧ−ＴＣＴ−ＣＴＣ−工ＧＡ
−ＧＧＣ−ｈｒ− ＣＣ− にて示されるコドンを、 −Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅｅ−Ｇｌｙ−−ＧＣＧ
−ＴＣＣ−ＣＴＣ−工ＧＡ−ＧＧＧ−ｈｒ− ＣＣ− のアミノ酸配列をコードする改変した塩基配列が挙げら
れ、この内５　’　−Ｇ−ＴＣＣ−ＣＴＣ−工ＧＡ−Ｇ
ＧＧ−ＡＣ−３’にて例示されるＴＧＡのＴを中流域と
しての周囲針１５塩基についてアミノ酸配列が変化しな
いようにパリンドローム構造を構築すればよい。さらに
このよにして構築したパリンドローム構造１を有するフ
ラグメントｒは、例えば、５　’　−ＡＡＴＧＴＣＧＣ
ＧＴＣＣＣＴＣＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＡＴＣ−３’
にて示される３０塩基の合成オリゴヌクレオチド配列（
オリゴヌクレオチド■）として使用することが簡便であ
る。また１３９位塩基のＴＧＡコドンのＴから３０塩基
上流のＧを中流域とする一Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇ
ｌｕ−のアミノ酸配列をコードするパリンドローム構造
２を構築するに当たっては、例えば 一Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−−ＴＣＣ
−ＣＴＧ−ＣＧＧ−ＧＧＣ−ＡＡＧ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ−ＧＴＧ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−
ＡＴＴ−ＧＡＧ−にて示されるコドンを、 一Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−−Ｔ　
ＣＣ−ＣＴ　Ａ　−ＣＧ　Ａ　−Ｇ　Ｇ　Ａ　−Ａ、　
Ａ　Ａ　−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ
−ＧＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＡＴＡ−ＧＡＧ−の如くア
ミノ酸配列が変化しないようにパリンドローム構造を構
築すればよい。さらにこのようにして構築したパリンド
ローム構造２に対応するフラグメントとしては、例えば
５　’　−ＣＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＣＴＣ
ＣＴＣＡＴＡＧＡＧ−３′の２９塩基の合成オリゴヌク
レオチド配列（オリゴヌクレオチド■）として使用する
ことが簡便である。なお、本発明のパリンドローム構造
１のみを改変するに当たっては、上記のパリンドローム
構造２のように改変される前の塩基配列である合成オリ
ゴヌクレオチドを用いることから、例えば５　’　−Ｃ
ＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＴ
ＧＡＧ−３’の２９塩基の合成オリゴヌクレオチド配列
（オリゴヌクレオチド■）として使用することが簡便で
ある。

さらに前記したＢａｎｎサイト〜Ｐｓｔｌサイト間の塩
基部分を補完する目的として、例えば、オリゴヌクレオ
チド■の下流塩基部分としての５’　−ＣＧＧＧＡＣＴ
ＡＣＡＣＣＣ；ＡＧＡＴＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＣＡ−３
’の２９塩基からなるオリゴヌクレオチド■、さらに上
記のオリゴヌクレオチド■またはオリゴヌクレオチド■
、とオリゴヌクレオチド■およびオリゴヌクレオチド■
に相補するオリゴヌクレオチドとして、３　’　−ＣＣ
ＧＡＧＧＧＡＣＧＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＧ
ＴＡＡＣＴＣＴＴＡＣＡＧＣＧＣ−５’の４２塩基から
なる改変されていないオリゴヌクレオチド■、または３
　’　−ＣＣＧＡＧＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡ
ＣＡＧＧＡＧＴＡＴＣ：ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＧＣ−５’
の４２塩基からなる改変したオリゴヌクレオチド■、３
　’　−Ａｃ；ＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＡ
ＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＡＣＴＴＧＣＴＡ
Ｇ−５’の４６塩基からなるオリゴヌクレオチド■の各
合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。

以上の合成オリゴヌクレオチド５本を使用するもので、
本発明のパリンドローム構造ｌのみを構築するには、オ
リゴヌクレオチド■、オリゴヌクレオチド■、オリゴヌ
クレオチド■、オリゴヌクレオチド■およびオリゴヌク
レオチド■を使用すればよく、またパリンドローム構造
１およびパリンドローム構造２を構築する場合にはオリ
ゴヌクレオチド■、オリゴヌクレオチド■、オリゴヌク
レオチド■、オリゴヌクレオチド■およびオリゴヌクレ
オチド■を使用すればよい。

これらのオリゴヌクレオチドを使用することにより、例
えば、マウスＧＳＨＰｘにおけるパリンドローム構造１
のみを構築するには、 ５　’　−ＣＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＡＧＧ３′−ＣＣ
ＧＡＧＧＧＡＣＧＣ′ｃＣＣＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴ
ＣＡＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＣＧＣＡＣＧＡＣＧＡＧＴＡ
ＡＣＴＣＴＴＡＣＡＧＣＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＡＧＧＧ
ＡＣＣＡＣＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＴＣＧ
ＴＧＣＴＡＧＣＧＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡ
ＡＣＧＧＣＣＣＴＧＡ、ＴＧＴＧＧＣＴＣＴＡＣＴＴＧ
ＣＡＴＣＴＧＣＡ−３’ ＴＡＧ−５’ にて示される二本鎖ＤＮＡ部分が構築される。またマウ
スＧＳＨＰｘにおけるパリンドローム構造ｌおよびパリ
ンドローム構造２を構築する場合には、 ５　’　−ＣＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＡＡＡＧ３　’　−
ＣＣＧＡＧＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣ
ＴＣＡＴＡＧＡＧＡＡＴＧＴＣＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴ
ＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＧＣＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＡＧＧ
ＧＡＣＣＡＣＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧ
ＧＴＧＣＴＡＧＣＧＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＧＡＴＧ
ＡＡＣＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＡＣＴＴＧ
ＣＡＴＣＴＧＣＡ−３’ ＴＡＧ−５’ にて示される二本ｔｌＷ　Ｄ　Ｎ　Ａ部分が構築される
。

このようなオリゴヌクレオチドについて、上記したアミ
ノ酸をコードするパリンドローム構造ｌおよびパリンド
ローム構造２を示す塩基配列であればよく、その他の部
分の塩基については本発明の０３　ＨＰ　ｘの活性を有
する限り公知の遺伝子操作手段による塩基またはアミノ
酸を改変せしめてもよいものであり、さらに上記のマウ
ス由来のＧＳＨＰｘの場合以外のラビット、ヒト、ラッ
トまたはウシ由来ＧＳＨＰｘにおいても、ＧＳＨＰ　ｘ
のＤＮＡ配列の１３９塩基〜１４１塩基のＴＧＡコドン
のＴを中流域として−ＡＩａ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｃ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−のアミノ酸配列をコードするパリン
ドローム構造ｌを、同様に構築して使用すればよいもの
である。

さらに本発明のパリンドローム構造ｌを含有する発現ベ
クターを構築するに当たり、第２図にその概要を示すも
ので、上記の如くして得られたフラグメントｄ、フラグ
メントｅ１オリゴヌクレオチド■、オリゴヌクレオチド
■、オリゴヌクレオチド■、オリゴヌクレオチド■およ
びオリゴヌクレオチド■を使用して連結し、プラスミド
ｐＧＳＨＰｘ−２と命名した発現ベクターが得られる。

またパリンドローム構造１およびパリンドローム構造２
を含有する発現べ々ターを構築する場合には、第３図に
その概要を示すもので、フラグメントｄ１フラグメント
ｅ３オリゴヌクレオチド■、オリゴヌクレオチド■、オ
リゴヌクレオチド■、オリゴヌクレオチド■およびオリ
ゴヌクレオチド■を使用して連結し、プラスミドｐＧＳ
ＨＰｘ−３と命名した発現ベクターが得られる。

このプラスミドｐＧＳＨＰｘ−２はＧＳＨＰｘのＤＮＡ
配列の１３９塩基〜１４１塩基のＴＧＡコドンのＴを中
流域とする１つのパリンドローム構造１を形成した遺伝
子を含有し、またプラスミドｐ　Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘ　−
３はＧ　Ｓ　ＨＰ　ｘのＤＮＡ配列の１３９塩基〜１４
１塩基のＴＧＡコドンのＴを中流域とするパリンドロー
ム構造１と１３９塩基〜１４１塩基のＴＧＡコドンのＴ
の３０塩基上流のＧを中流域とするパリンドローム構造
２の２つのパリンドローム構造を形成した遺伝子を含有
するものである。

次いでこれらのプラスミドｐＧｓＨＰｘ−’ｌまたはプ
ラスミドｐ　Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘ　−３は、前記した宿主
微生物、例えばエシェリヒア属に属する微生物に形質転
換せしめればよい。

さらにこのようにして得られた形質転換体である微生物
は、目的とするＧ　Ｓ　ＨＰ　ｘを発現せしめるために
培養するが、培養の形態は液体培養で行えばよく、工業
的には深部通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の
栄養源としては、微生物の培養に通常使用されるものが
広く使用でき、微生物の同化可能な炭素源、例えばグル
コース、シュクロース、糖蜜、グルセリン、スターチ加
水分解物等が使用され、窒素源としては利用可能な窒素
化合物であればよく、例えばコーン・スチープ・リカー
、大豆粉、カゼイン加水分解物、ペプトン、種々の肉エ
キス、酵母エキス、硫安、塩化アンモニウム等が使用さ
れ、その他、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグ
ネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、銅等とのリン酸塩、塩
化塩、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩等との水溶性塩を添加し
てもよく、さらにセレンを培地中に０．０５〜１０μＭ
程度添加する。

培養温度は、微生物が生育し、ＧＳＨＰｘを生産する範
囲で適宜変更できるが、エシェリヒア属に属する微生物
の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間
は、条件によって多少異なるが、Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘが最
高収量に達する時間を見計らって適当な時期に培養を収
量すればよく、通常は１２〜７２時間程度である。

次いで培養後、ＧＳＨＰｘは、菌体を含む培養液そのま
まを採取して分離、精製すればよい、ＧＳ　ＨＰ　ｘが
菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過また
は遠心分離等の手段にて菌体を回収し、次いでこの菌体
をボールミルや超音波による機械的破砕方法やりゾチー
ム等の酵素的破砕方法で破砕し、必要に応じてキレート
剤や界面活性剤を添加してＧＳＨＰｘを可溶化して分離
採取する。このようにして得られたＧ　Ｓ　ＨＰ　ｘ含
有溶液を例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫酸ナトリウ
ム等での塩析処理、メタノールやエタノール、アセトン
等の親水性有ａ溶媒での分別沈澱等の手段を適宜選択し
、組み合わせて行い沈澱せしめる。さらにこのＧＳＨＰ
ｘを含有する沈澱物は、必要に応じて精製すればよく、
例えばこの沈澱物を水または緩衝液に溶解し、透析膜に
て透析して、より低分子量の不純物を除去してもよく、
また吸着剤やゲル濾過剤等によるイオン交換クロマトグ
ラフィー、吸着クロマトグラフィー、やゲル濾過により
精製してもよく、精製ＧＳＨＰｘは凍結乾燥して保存す
ればよい。

このようにしてプラスミドｐＧＳＨＰｘ　　２およびプ
ラスミドｐＧＳＨＰｘ−３を保持した微生物の培養物か
ら得られたＧ　Ｓ　ＨＰ　ｘ含有物は、その１０μｍ溶
液を、Ｏ，１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　、
０．２ｍＭ還元型ＮＡＤＰ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２
ｍＭのグルタチオン、１単位のグルタチオン・リダクタ
ーゼを含有する反応液０．９８ｍ１に混合し、ｉｏμｌ
　（最終濃度７０、ｃ＋Ｍ）の過酸化ブタノール（Ｂｕ
ＯＯＨ）を添加し、３７℃で還元型ＮＡＤＰの酸化によ
る減少量を３４０ｎｍの波長にて吸光度測定した結果、
目的とするＧ　Ｓ　ＨＰ　ｘ活性を発現したもので、Ｇ
ＳＨＰｘが産生されたことを確認した。

なお本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基、その
他に関する略号は、それらの当該分野における慣用略号
に基づくもので、また全てのアミノ酸はＬ体を示す。

〈実施例〉 以下に本発明の参考例および実施例を挙げて具体的に説
明するが、本発明は何らこれにより限定されるものでは
ない。

シ・人′トクトＵ マウスＧＳＨＰ、遺伝子のクローニング参考例１ マウス肝臓ポリ（Ａ）”　ＲＮＡ調整 （ｉ）マウスの肝１１１０ｇを液体チッ素中で粉沫にし
、４０ｍ１の６Ｍグアニジンインチオシアネート中でホ
モジナイズしたのち、１８．５ゲージの太さの注射針を
通してＤＮＡを切断し粘度を下げた。ホモジネートを３
分の１容の５．７Ｍ塩化セシウム、０．１ＭＥＤＴＡｐ
８７．５のクツション上に１漕し、３５，０００ｒｐｍ
２５℃で一夜遠心した。遠心後、沈澱を少量のエタノー
ルで洸浄し、過剰の塩化セシウムを除いたのち、水１ｍ
ｌに溶解し、等量のクロロホルム−フェノールを加え、
１０．ＯＯＯｒｐｍ５分の遠心で水増を分取した。１０
分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２倍容のエタノール
を加えて遠心し、沈澱を集め、減圧乾燥した。この機に
して粗ＲＮＡを得た。

（ｉｆ＞この沈澱を１．５ｍｌの水に溶解後、６５℃で
５分間保温し、急冷して１．５ｍｌの４０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７，６）、１．０ＭＮａＣ１，２ｍ　Ｍ　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ、０．２％ＳＤＳを加えた。この溶液全１
を２０　ｍ　Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ７，６）、０．５
ＭＮａＣ＋、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳで平衡
化した７５ｍｇのオリゴ（ｄＴ）　−セルロース（ファ
ルマシア社製）カラムに吸着させた。１０ｍ１の同じ溶
液で洗浄したのち、５ｍｌの２０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７，６）０．ＩＭＮａＣ］　、１ｍＭＥＤＴＡ及び０
．１％ＳＤＳ溶液でポリ（Ａ）”ＲＮＡ以外のＲＮＡを
溶出させた。次に１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５＞
１ｍＭＥＤＴＡ及び０．０５％ＳＤｓの溶液でポリ＜Ａ
＞”ＲＮＡを溶出させ、始めに溶出してくる１ｍｌを分
画１−な、これに１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム及
び２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃で一晩放宣
し、１５．ＯＯＯｒｐｍ、３０分の遠心で沈澱を集め、
減圧乾燥した。この棟にしてポリ（Ａ）”　ＲＮＡを得
た。

参考例２ ＣＤＮＡ合成とクローニング （ｉ）参考例１で得たポリ（Ａ）”　ＲＮＡを１μｇ／
μｍになるように水に溶解し、その５μｍをマイクロチ
ューブに移し、６５°Ｃで５分間加熱し、急冷したのち
に、これに２０μｍの５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，
３＞、１０ｍＭＭｇＣＩ２．１４０ｍＭＫＣｌ、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール及び２　ｍ　ＭのｄＮＴＰｓ　（
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等１混合物
）、５μｇのベクターブライマーＤＮＡ（ファルマシア
社製）と１．５単位の逆転写酵素（宝酒造社製）を加え
、４２°Ｃ１時間反応させた。その反応液に８０ｍＭト
リス−塩酸ｐＨ７，５，２００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭ
ｇＣＩ２．２５μｇ／ｍ１ＢｓＡにＲＮａｓｅＨ（宝酒
造社製）６０単位及びＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリン
ガーマンハイム社製）５単位を加えて１ｆｆｉ量を１５
０μｌにし、１２℃で１時間反応させたのち、２２℃で
１時間反応させた。

２０μｍの０．２５ＭＥＤＴＡと１０μＩの１０％ＳＤ
Ｓ及び大！菌のｔＲＮＡを１μｇ加え、等量のフェノー
ル−クロロホルムを加え、１０．ＯＱＱｒｐｍＳ分間遠
心し、水増を分取した。それに等量の４Ｍ酢酸アンモニ
ウムと２倍のエタノールを加え、１５．ＯＯＯｒｐｍ１
５分遠心し、沈澱全遠心減圧乾燥した。再びエタノール
沈澱を繰り返し、２００μｍの７５％エタノールで２回
洗浄後、減圧乾燥した。沈澱に１００ｍＭトリス−塩Ｍ
（ｐＨ８，０）１０ｍＭＥＤＴＡ、８０μＭＳ−アデノ
シンメチオニン、１００μｇ　／　ｍ　ｌ　ＢＳＡ、お
よびＥｃｏＲＩメチレース（プロメガバイオチック社′
ＩＡ）を加え、１０μｌとし、３７℃で１時間反応させ
た。反応後４０μｍの水を反応液に加え、等量のクロロ
ホルム−フェノールで処理し、遠心により分取した水層
に等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと２倍のエタノールを加
え、−７０°Ｃで１５分間放ヱした。１５．ＯＯＯｒｐ
ｍ１５分遠心後の沈澱物に６７ｍＭトリス−塩酸、（ｐ
Ｈ８，８）、６．７ｍＭＭｇＣＩ２．１６．６ｍＭ　（
ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍＭ２−メルカプトエタノール
、６，７μＭＥＤＴＡ、０．０１６７％ＢＳＡ、各７５
０μＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びＴ
　４　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（宝酒造社製〉４ｓ位加
え、全量を１２μｌとし、３７℃で１時間反応させた０
等量のクロロホルム−フェノールで処理し、エタノール
沈澱し、遠心によって回収し、沈澱を減圧乾燥した。１
ｎｇのＥｃｏＲＩリンカ−に５０ｍＭトリス−塩１Ｍｐ
Ｈ７゜６．１０ｍＭＭｇＣ］ｚ　、１０ｍＭジチオスレ
イトール、０．１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭＥＤＴ
Ａ、１　ｍ　Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐ及び３単位のＴ４ポリヌク
レオチドカイネース（宝酒造社製）を加え、全１を１０
μｍとし、３７℃で３０分間反応させた。

これを７４ＤＮＡポリメラーゼ処理後のサンプルに全量
加え、６０単位のＴ４ライゲース〈ファルマシア社）を
加え、１４℃で一晩反応させた。この反応液に１００ｍ
ＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，５，１０ｍ
ＭＭｇＣＩ２．７ｍＭ２−メルカプトエタノール及び１
００μｇ　／　ｍ　ＩＢＳＡ及び２５０単位のＥｃｏＲ
Ｉを加え、全量４０μｌにて、３７℃で２時間反応させ
た。この反応液を１％低融点アガロースゲルにて分画し
、６００−２０００塩基のＤＮ−Ａを含むゲルを回収し
た。６５℃で１０分保温し、ゲルを融解したのち、等量
のフェノールを加え、１０分の水冷ののち、１５．ＯＯ
Ｏｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。水層に等量のフェ
ノールを加え操作を繰り返し、再々度フェノールで処理
したのち、水層をクロロホルムで処理し、１０分の１容
の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５容のエタノールを加え
、−７０°Ｃに放置した。

（ｉｉＨ５，ＯＯＯｒｐｍ、１５分の遠心ののち、沈澱
を７５％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥した。それ
にラムダファージベクターλｇｔｌｌアーム（ストラテ
ジーン社製）を１μｇ加え、ライゲーションキット（宝
酒造社製）を用いて、２６℃で１０分反応させた。反応
後のサンプルは１ｎ−ｖｉｔｒｏパッケージングキット
（スロラテジーン社製）を用いて反応させた。得られた
ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｙｌ　０８８に感染させ
、総数を調べたところ、７．０ＸＩＯ’　ｐｆｕよりな
っていた。

参考例　３ ＧＳＨＰｘ遺伝子のスクリーニング ｉ）作製したマウス肝員ライブラリーを、大腸菌Ｙ１０
８８を指示菌として、１．５％ＬＢ寒天培坤（１１につ
き、バクトドリプトン１０ｇ、バクトイ−ストエキスト
ラクト５ｇ、ＮａＣＩ　Ｌｏｇ）上にひらき、プラーク
ハイブリダイゼーション法を用いて、ＧＳＨＰｘ遺伝子
のクローンのｉＨ択を行った。ＬＢプレート上に溶菌し
たプラークをナイロン膜上に移してから、膜を０．５Ｍ
　　ＮａＯＨ１１，５ＭＮａＣ＋で５分、３Ｍ酢酸ナト
リウム（ＰＨ５，５＞で５分処理したのち、８０℃減圧
下で２時間乾燥した０次にこの膜をビニール袋にいれ、
１０ｍ１の３倍濃度５ＳＣ（１倍：１５０ｍＭＮａＣｌ
、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）で洗浄したのち、この
膜を１０ｍ１の６倍濃度５ＳＣ１０，０５％ピロリン酸
ナトリウム、５倍濃度デンハルト液（０，０２％フィコ
ール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％Ｂ
ＳＡ）、０．１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｔバクテリ
ア破砕ＤＮＡ液に浸し、３７℃で一夜放置した。液を除
いてから、５°端を３２ｐでラベルした合成オリゴヌク
レオチド＜１０’ｃｐｍ／μｇ）　５１　’ｒｃＴＣＴ
ＣＴＧＡＧＧＣＡＣＣＡＣ３°　（この合成オリゴヌク
レオチドはマウスＧＳＨＰｘのセレノシスティンをコー
ドしている領域をふくむアミノ酸部分（Ｓｅｒ、Ｌｅｕ
、Ｓｅｃ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒをコードする塩基配列である
。）を含む６倍５ＳＣ１０，０５％ピロリン酸ナトリウ
ム、５倍デンハルト液、２０βｇ／ｍ　Ｉ’ｔＲＮＡ液
中で３７℃−晩ハイブリダイズさせた。その後６倍５Ｓ
Ｃ１０，０５％ピロリン酸ナトリウムで室温３回洗浄し
たのち、さらに４０℃で１５分洗浄し、乾燥し、オート
ラジオグラフィーを行った。シグナルの出た位置にある
培地をくり抜き、希釈液で希釈し、プレートにひらき直
し、同じ１０−ブでスクリーニングを繰り返した結果、
ＩＫｂの挿入断片をもつマウスクローンを得た。

ｉｉ＞得たラムダ−ファージを宿主菌に感染させ、ＬＢ
培地１０ｍ１中で一晩振どう培養した。８゜０００ｒｐ
ｍ、１０分遠心後上清に、６０単位のＤＮａｓｅＩ（宝
酒造社製）及び、１００μｇＲＮａｓｅＡ（ベーリンガ
ーマンハイム社製）を加え、３７℃で３０分間保温しな
、これに等量の２０％ポリエチレングリコール、２．５
ＭＮａＣｌを加え、１時間氷冷したのち、１５．ＯＯＯ
ｒｐｍ、２０分遠心し、沈澱を得た。この沈澱を、０゜
１Ｍ　　ＮａＣ］、８ｍＭ　　ＭｇＳＯ４，５０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ７，５＞及び０．０２％ゼラチン０．
５ｍｌに溶き、等量のフェノールを加えて処理し、遠心
後の水層をクロロホルム−フェノールを加えて処理し、
１０分の１容の酢酸ナトリウム及び２倍容のエタノール
を加え一７０℃に１５分放置した。１５．ＯＯＯｒｐｍ
、１５分の遠心にて回収した沈澱を、７５％エタノール
で２回洗浄し、減圧乾燥した。５μｇ／ｍｌ　　ＲＮａ
ｓｅＡを含む水５０μｌに沈澱を溶かし、１０μｌをＥ
ｃ　ｏＲＩで部分消化してＩＫｂのＥｃｏＲＩ断片を得
た。

１ｉｉ）Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ消化後に得られた約ＩＫｂの
挿入断片を低融点アガロースゲルから回収した。ベクタ
ーｐＵｃ１１８をＥｃｏＲＩで完全消化したのち、５０
　ｍ　Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ８，０＞中でバクテリア
アルカリホスファターゼ（東洋紡社製）を０．５単位加
え、６５℃で１時間反応させた。

クロロホルム−フェノール液で処理したのち、水層に１
０分の１容３Ｍ酢酸ナトリウム及び２倍容のエタノール
を加え、遠心してベクターを回収した。ゲルから回収し
た挿入断片とＥｃｏＲＩ消化したベクターをライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて連結させた。

ｉｖ）１００ｍｌのす培地（１１につきバクトドリプト
ン２０ｇ、バクトイ−ストエキストラクト５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ４，ｐＨ７，６）で培養した、対数増殖期の大腸菌Ｄ
ＨＩ　（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６β−１５５７（１
９８３）１を集菌し、４０ｍ１の氷冷しな３０ｍＭ酢酸
カリウム、１００ｍＭＲｂＣ１，１０ｍＭＣａＣ］２．
５０　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｎ　Ｃ１２及び１５％グリセリン（
ｐＨ５，８）で懸濁したのち、０℃で５分間放置後遠心
集菌し、さらに４ｍ１の１０ｍＭＭＯＰＳＭｍ液（ドー
タイ社製）、７５　ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ＋　２．１０ｍＭ
ＲｂＣ＋及び１５％グリセリン（ｐＨ６，５）に懸濁し
、０℃で１５分間放置してコンピテント細胞とした。

■）この大腸菌懸濁液２００μｌに（ｉｆｆ）で調製し
たＤＮＡ溶液２０μｍを加え、０℃で３０分間放置した
。４２℃９０秒間熱処理し、ＬＢ培地８００μｍを加え
、３７℃６０分間保温した。この３０μＩをアンピシリ
ン５０μｇ／ｍｌを含んだＬＢ寒天プレートにまき、−
晩培養して形貢転換体を得た。

ｖｉ）（ｖ）で形質転換した単一のコロニーを２ｍｌの
ＬＢ培地で一晩培養し、遠心により集菌した。

これに１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ社製）を含む５
０ｍＭトリス−塩酸＜ｐＨ８，０）、５０ｍＭＥＤＴＡ
　（ｐＨ８，０）　、１５％ショ糖を０゜６ｍｌ加え、
３７℃で１５分反応させたのち、１０％ＳＤＳを１２μ
ｌ加え混ぜ合わせた後、５Ｍ酢酸カリウムを６０μｍ加
え、０℃で３０分間放置した。１０．ＯＯＯｒｐｍ、１
５分遠心し、上清に等量のクロロホルム−フェノールを
加えて処理し、水層をエーテルで２回処理してから、２
倍容のエタノールを加え、−７０℃で１５分間放１した
。１５．ＯＯＯｒｐｍ、１５分遠心して沈澱を回収し、
７５％エタノールで２回洗浄後、減圧乾燥した。沈澱を
５μｇ／ｍ１ＲＮａｓｅを含む水に溶き、ＥｃｏＲＩで
消什して、挿入断片を含むクローンをｉＭ別した。

ｖｉｉ）４０　ｍ　ｌの２倍ＹＴ培地（１１につきバク
トドリブトン１６ｇ、バクトイ−ストエキストラフ）Ｌ
ｏｇ、ＮａＣ１１５ｇ）で培養した、対数増殖期の大腸
菌ＭＶ１３０４（宝酒造より購入）を集菌し、２０ｍ１
の水冷した５０ｍＭＣａＣｌ２に懸濁したのち、０℃で
２０分間放置した。遠心集菌し、４ｍｌの５０ｍＭＣａ
Ｃｌ２に懸濁し、コンピテント細胞とした。この懸濁液
２００μｍに（ｖｊ）で確認できた形質転換体から分離
したプラスミドＤＮＡ液を２μｍ加え、１時ｆＳｉＯ℃
で放置後、４２℃９０秒間熱処理し、２倍ＹＴ培坤８０
０μｍを加え、３７℃で６０分間保温した。

この３０μｌを５０μｓ／ｍ＋アンピシリン、０゜０２
％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−ガラクトシド）及び５０μＶ　Ｉ　ＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）を含
む２倍ＹＴ培坤にまき、−晩培養して形質転換体を得た
。

参考例４ マウスＧＳＨＰ、遺伝子の塩基配列決定形質転換した白
いコロニーより一本ｉｆｆ　Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、Ｍ１
３ファージを用いたジデオキシ法（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ
２１４．１２０５−１２１０　（１９８１））を用いて
決定した。確認されたＧＳＨＰ、を含むプラスミドをｐ
Ｍ−ＧＳＨＰｘと命名した。

参考例５ ラビットＧＳＨＰｘ遺伝子のクローニングｉ）ラビット
肝朦１０ｇより前述の方法に従ってポリ（Ａ）”　ＲＮ
Ａを調製し、ｃＤＮＡを合成した。

できなｃＤＮＡライブラリーは、５．０ＸＩＯ’ｐｆｕ
であった。

ｉｉ）先にクローニングしたマウス遺伝子を、制限ｒ４
素ＰｓｔＩ及びＨａｅＩ［［（Ｊ［洋紡社製）で切断し
て得た３３０塩基のフラグメントをマルチプライムイク
ステンション法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３２．
６−１３．１９８３＞に従って３２Ｐでラベルしプロー
ブとした。

１ｉｉ）スクリーニング及び塩基配列決定は前述の方法
に従った。最終的にマウスの遺伝子とヌクレオチドで８
７．１％、アミノ酸で７８．９％の相同性をもつ７７０
塩基のＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片は、マウ
ス同様内部にセレノシスティンをコードしているＴＧＡ
配列を有していて、ＴＧＡの周辺１００塩基についてマ
ウスとの相同性は、ヌクレオチドで、９６％であった。

このクローンをｐＲ−ＧＳＨＰｘと命名した。ただし、
このクローンはＮ末端が１９塩基欠けたクローンだった
。

参考例６ ヒトＧ　Ｓ　）（Ｐ　ｘ遺伝子のクローニングｉ）ヒト
肝ＩＡｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー（クローンチック社
、東洋紡より購入）２．０ＸＩＯ’　ｐｆｕをひらき、
ｐＲ−ＧＳＨＰｘのＮ末ｎ４ｊｐ！２６０塩基のＥｃｏ
ＲＩ断片をプローブにしてスクリーニングを行った。ス
クリーニングの方法は前述のとうりである。

ｉｉ）スクリーニングの結果、１０株のクローンが得ら
れた。その中で最も長い挿入断片を有するクローンにつ
いて、ｐＵｃ１１９ベクターにサブクローニングし、そ
の中で約ＩＫｂの挿入断片をもつクローン、ｐ　Ｈ−Ｇ
　Ｓ　ＨＰ　ｘ　１の塩基配列を決定した。その結果、
マウス及びラビットとヌクレオチド及びアミノ酸配列で
高い相同性をもち、内部にセレノシスティンをコードす
るＴＧＡｌ？列を有している遺伝子断片が得られた。ま
た、ＴＧＡ周辺の１００塩基については、マウス及びラ
ビットと特に高い相同性を示していた。

実施例１ マウスＧＳＨＰｘ遺伝子の発現 ｉ）参考例４で得られたマウスＧＳＨＰｘ遺伝子の塩基
配列をもとにして、大腸菌の発現ベクターでありｌａｃ
のプロモーターをもつｐＵｃ１３（ファルマシア社製）
のＳｍａＩ、ＸｂａＩサイトを用い、マウスＧＳＨＰｘ
遺伝子の大腸菌での発現を試みた。このベクター１μｇ
をまずＳｍａ　Ｉ切断用緩衝液（Ｍａｎ　ｉ　ａｔ　ｉ
　ｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｐｐ１
０４、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ（１９８
２））を用いて６単位のＳｍａＩ（ＪＫ洋紡社製）を加
え全量を１０μｍとして、３７℃２時間保温切断し、等
量のクロロホルム−フェノールで処理後水層を分取した
。２倍容のエタノールを加えて一７０℃１５分放１した
のち、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分）によりＤＮ
Ａを集め減圧乾燥した。ＭＷ衝液（前述Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら、文献記載）を用いて、２０単位のＸｂａＩ（東洋
紡社製）を加え全量を１０μｌとして、３７°Ｃ２時間
保温切断した。１Ｍトリス−塩！（ｐＨ８，０＞を５μ
Ｉ加えたのち、０．５単位のバクテリアアルカリフォス
ファターゼで６５℃１時間処理した０等量のクロロホル
ム−フェノールで２回処理したのち、エタノール沈澱で
ＤＮＡを回収し、減圧乾燥したくフラグメントｂ）、こ
れとは別にマウスＧＳＨＰＸ遺伝子を含むｐ　Ｍ　−Ｇ
　Ｓ　ＨＰ　ｘ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１　μｇを前述のＭ緩衝
液を用い５単位のＨａｅｎ＜宝酒造社製）と６本位の５
ａｃＩＩ（東洋紡社製）を加え全１を１０μｌとし、３
７℃２時間保温切断した。

０．７％低触点アガロース電気泳動により、約７００塩
基対のＤＮＡ断片を抽出精製乾燥したくフラグメントａ
）。さらに５宇側にＸｂａＩの粘着末端をもち、ＳＤ針
列（ＧＡＧＧ）とマウスＧＳＨＰｘの開始コドンから５
ａｃｎ粘着末端をもった万言ｚの２本のオリゴヌクレオ
チドを、ベックマンシステム１を用いて合成した。

■５°ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＧＴ
ＧＣＴＧＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＣＧＣ３″ ｎ５’　ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＡＣＧＣＡＡ
ＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＧＧ　　３’これらの合成オリゴ
ヌクレオチド各１μ＋（１μｇ）に１０倍濃度のリンカ
−カイネースバッファー（０，７Ｍトリス−塩酸（ｐＨ
７，６）　、０゜１ＭＭｇＣＩ、５０ｍＭジチオスレイ
トール）５μｌ、５０ｍＭＡＴＰ１μ！、ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造社製）１μＩ〈１０単位）を加え
、３７℃で１時間、８５℃で２０分保温後徐冷したくフ
ラグメントＣ）０以上の様にして詞製したフラグメント
ａ、ｂ全量を水８８μｍに溶解しフラグメントＣ溶液１
μｍ、１０倍濃度ライゲーション緩衝液１０μｌとＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、３５０ｕ／μｌ）ｌμｌ
を加え、４℃で一時放置した。フェノール処理後、エタ
ノール沈澱でＤＮＡを回収乾燥し２０μｌのＴＥ（１０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥＤＴＡ）で
溶解した。参考例　３　（ｉｖ）に記述したのと同様の
方法でコンピテント化した大腸菌Ｄ８１２００μＩに、
上で溶解したＤＮＡ液を加え０’Ｃ３０分間放１後、４
２℃で′９０秒置き、ＬＢ培地８００μｍを加え、３７
℃６０分間保温した。

この１００μｍを、アンピシリン５０μｇ　／　ｍ　＋
を含んだＬＢ寒天培地にまき、３７℃−晩培養して形質
転換体を得た。この様にして得られたクローンをｐＧＳ
ＨＰｘ−１と命名した。（第１図）ｉｉ）上で得たｐＧ
ＳＨＰｘ−ＩＤＮＡ１μｇをＭｌｆｌ衝液を用いて１０
単位のＨｉｎｄＩ［（宝酒造社製）と、１５単位のＰｓ
ｔＩ（東洋紡社製）で３７℃２時間消化した。消化後０
７％低融点アガロース電気泳動を行い、大きい方の断片
（フラグメントｄ）を抽出し、２回のフェノール処理に
より精製した後、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。

同様にｐＧＳＨＰｘ−ＩＤＮＡ１μｇを、■緩衝液を用
いて、１０単位のＨｉｎｄＩ［（宝酒造社製）と、８単
位のＢａｎＩ［（東洋紡製）で３７℃で２時間消化し、
前述の方法でＧＳＨＰｘ遺伝子の５宇側を含む最も短い
断片（フラグメントｅ）を抽出精製した。マウスＧＳＨ
Ｐｘの発現のために、４７番目のアミノ酸であるセレノ
システィンをコードしているＴＧＡの周囲１５塩基につ
いてアミノ酸配列が変化しない機に１７２塩基目のＴを
Ｃに、１８１塩基目のＣをＧに変え、Ｔを頂点にパリン
ドローム構造を構築し得る配列 ＊＊　　　　　　　＊＊＊ ５’　　　ＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＡＣ３’＊＊＊
　　　↓　＊　＊ ＣＧ ＡｌａＳｅｒＬｅｕＳｅｃＧ］ｙＴｈｒまたＴＧＡの３
０塩基上流にあるＧを頂点に周囲３１塩基について同機
に、アミノ酸配列を変化しないように、７カ所の塩基を
変えてパリンドローム４遺を構築し得る配列 ★　＊　　　　＊＊　　　　　　＊　　　　＊＊　　　
　　　＊　　　　　　＊５’　ＴＣＣＣＴＧＣＧＧＧＧ
ＣＡＡＧＧＴＧＣＡＡＡＴ ＳｅｒＬｅｕＡｒｇＧｌｙＬｙｓＶａｌＬ＊　　　　＊
＊＊　　　　＊　　　　水　　　＊　＊ＴＧＣＴＣＡＴ
ＴＧＡＧＡ　　３゜ ↓ ＣＡ ｅｕＬｅｕＩ　１ｅＧｌｕ の以上の２つの配列を含む全長９２塩基について、以下
の様な７種型のオリゴヌクレオチドを、ベックマン社シ
ステム１を用いて合成した。

■−５’　ＣＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧ
ＣＴＣＡＴＴＧＡＧ３’　−（２９＞■−５’　ＣＣＣ
ＴＡＣＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＧＡ
Ｇ３°−＜２９＞■−５’　ＡＡＴＧＴＣＧＣＧＴＣＣ
ＣＴＣＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＡＴＣ３’−＜３０）
■−５’　ＣＧＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＡ
ＣＧＡＴＣＴＧＣＡ３’−（２９）■−５’　ＣＣＧＡ
ＧＧＧＡＣＧＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＧＴＡ
ＡＣＴＣＴＴＡＣＡＧＣＧＣ３°−（４２） ■−５°ＣＣＧＡＧＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡ
ＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＧＣＧＣ３″−（
４２） ■−５’　ＡＧＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＡ
ＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＡＣＴＴＧＣＴＡ
Ｇ３’−（４６） ＴＧＡ周辺のパリンドロームだけを含む合成オリゴヌク
レオチド（■、■、■、■、■）各１μｍ（１μｇ）に
１０倍濃度のリンカ−カイネースバッファー（０，７Ｍ
トリス−塩酸（ｐＨ７，６＞、０．１ＭＭｇＣｌ、５０
ｍＭジチオスレイトール）５μｌ、５０ｍＭＡＴＰ１μ
１．水３１μ１．ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社
製）１μｍ（１０４を位）を加え、３７℃で１時間、８
５℃で１０分保温後徐冷した。この反応液２５μｌに１
０倍のライゲーションバッファー１０μ＋、水６４μ１
．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｍを加え、４°Ｃで一時放置
した。その後フェノール−クロロホルム処理し、水層を
分取し、エーテル処理によりフェノールを除いた。先に
調製したフラグメントｄ。

ｅを、それぞれ水９０μｍで溶解した。各フラグメント
溶液４４μｍと合成りＮＡＩμＩ、１０倍濃度ライゲー
ションバッファー１０μ１．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μ１
（３５０単位、宝酒造社製）を混合し、４℃−嗜放ゴし
た。フェノール処理、エタノール沈澱後、前述した様に
大、膓菌ＤＨＩを形質転換した。この様にして得られた
クローンを、ｐＧＳＨＰｘ　　２と命名した。（第２図
）次に全く同様の操作で、合成オリゴヌクレオチド■、
■、■、■、■を結合したＤＮＡ溶液とフラグメントｄ
、ｅ溶液を混合結合したのち、大腸菌ＤＨＩを形質転換
しな、このようにして得たクローンを、ｐＧＳＨＰｘ−
３と命名した。（第３図）ｉｉｉ＞これらのプラスミド
（ｐＧＳＨＰｘ−１、ｐＧＳＨＰｘ−２、ｐＧＳＨＰｘ
−３）を保持する大腸菌ＤＨＩを、セレン１μＭ含有Ｌ
Ｂ培序で３７℃−時培養後集菌、ソニケーション処理し
た。

この処理液１０　μ＋を０．９８ｍ１の０．１Ｍトリス
−塩酸（ｐＨ８，０＞、０．５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＧ
ＳＨ１１単位グルタチオンリダクターゼと混合し、１０
μｍ　（最終濃度７０μＭ）のｔ−Ｂ　ｕ　ＯＯＨを加
え、３７℃でＮＡＤＰＨの酸化を吸光度３４０ｎｍにて
測定した。その結果、ｐＧＳＨＰｘ−１では、ＧＳＨＰ
ｘの活性がみられなかったのに対して、ｐＧＳＨＰｘ−
２及びｐＧＳＨＰｘ−３では活性がみられた。

発明の効果 本発明は本来大腸菌では終始コドンとして蛋白の１訳が
停止するＴＧＡコドンを有効にセレノシスティンとして
翻訳する方法をもたらしめるものでありセレノシスティ
ンをコードするＴＧＡ配列を有する遺伝子を大腸菌内で
効率的に発現させつるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＧＳＨＰｘ−１プラスミドの作製法を示す模
式図、第２図はｐＧＳＨＰｘ　　２プラスミドの作製法
を示す模式図、第３図はｐＧＳＨＰｘ−３１ラスミドの
作製法を示す模式図、第４図はマウスＧＳＨＰｘ遺伝子
ＤＮＡの塩基配列および得られる翻訳生成物のアミノ酸
配列を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルタチオン・パーオキシダーゼのデオキシリボ
   ヌクレオチド配列の１３９塩基〜１４１塩基のＴＧＡコ
   ドンのＴ（チミン）を中流域として−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
   Ｌｅｕ−Ｓｅｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−のアミノ酸配列をコ
   ードするパリンドローム構造１を構築した遺伝子を含有
   した発現ベクターを保持した微生物を、セレン含有培地
   にて培養し、次いで培養物から発現されたグルタチオン
   ・パーオキシダーゼを採取することを特徴とするグルタ
   チオン・パーオキシダーゼの製造法。
2. （２）グルタチオン・パーオキシダーゼのデオキシリボ
   ヌクレオチド配列において、１３９塩基〜１４１塩基の
   ＴＧＡコドンのＴを中流域とするパリンドローム構造１
   および１３９塩基〜１４１塩基のＴＧＡコドンのＴの３
   ０塩基上流のＧ（グアニン）を中流域とするパリンドロ
   ーム構造２を構築した遺伝子を含有した発現ベクターで
   ある特許請求の範囲第１項記載のグルタチオン・パーオ
   キシダーゼの製造法。
3. （３）パリンドローム構造２が、−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ
   ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌ
   ｅ−Ｇｌｕ−のアミノ酸配列をコードするＴＧＡコドン
   のＴの３０塩基上流のＧを中流域とするパリンドローム
   構造である特許請求の範囲第１項記載のグルタチオン・
   パーオキシダーゼの製造法。
4. （４）グルタチオン・パーオキシダーゼのデオキシリボ
   ヌクレオチド配列が、マウス、ラビット、ヒト、ラット
   またはウシ由来のグルタチオン・パーオキシダーゼのデ
   オキシリボヌクレオチド配列である特許請求の範囲第１
   項記載のグルタチオン・パーオキシダーゼの製造法。