JPH04144680A - コレステロール７α―ヒドロキシラーゼ遺伝子およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、５０４個のアミノ酸配列からなり分子量が５
７６３０±１０００である、コレステロールを基質とし
、還元型ＮＡＤＰと分子状酸素から７α−ヒドロキシコ
レステロールとＮＡＤＰと水分子を生成する反応を触媒
するヒト由来の純粋なコレステロール７α−ヒドロキシ
ラーゼ、および本酵素を構成するＤＮＡをクローニング
するために用いられる組換えＤＮＡ分子であって、咳組
換えＤＮＡ分子は、少なくともコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で
あって、かつ第１図で示されるポリペプチドをコードす
るＤＮＡ分子とハイブリダイズするＤＮＡ配列の縮重Ｄ
ＮＡ配列であってコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼポリペプチドをコードするものであることを特徴とす
るＤＮＡ断片、ｔｇＤＮＡ断片を保持してなる形質転換
された実質的に純粋で培養可能な微小細胞、該純粋で培
養可能な微小細胞により１ＤＮＡの遺伝情報を発現せし
めて得られるヒト由来の純粋なコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼポリペプチドの製造法に関する。

〈従来の技術〉 コレステロール７α−ヒドロキシラーゼは肝臓における
コレステロールから胆汁酸合成の最初のステップに関与
し、１モルのコレステロールを基質とし、１モルの還元
型ＮＡＤＰ　（ＮＡＤＰＨ＋Ｈ”）と１モルの分子状酸
素から１モルの７αヒドロキシコレステロールと１モル
のＮＡＤＰと１モルの水分子を生成する反応を触媒する
酵素で、従来から、酵素番号（Ｅ、Ｃ，Ｌ４．１４．１
３．１７としてＣｈｏｌｅｓｔｒｏｌ　７α−ｍｏｎｏ
ｏｘｙｇｅｎａｓｅ　（コレステロール７α−モノオキ
シゲナーゼ）〔系統名；　Ｃｈｏｌｅｓｔｒｏｌ、　　
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ：　ｏｘｙｇｅｎ　ｏｘｉｄｏｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ（７α−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｎｇ）
　、別名；　Ｃｈｏｌｅｓｔｒｏｌ　７　ｅｘ−ｈｙｄ
ｒｏｘｙｌａｓｅ）として、を椎動物の肝ミクロゾーム
画分に存在していることが知られ（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏ
ｃｈｅ＋＋、　、　２０．５６９−５７９（１９７１）
、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３７．３３４−３４
０（１９７３）　、さらに近年ラットの肝ミクロブーム
から精製されたチトクロームＰ４５０コレステロール７
α−ヒドロキノラーゼが得られ、５ＤＳ（ドブノル硫酸
ナトリウム）ポリアクリルアミドゲル電気泳動における
分子量が約５２０００で、そのＮ末端アミノ酸配列がＭ
ｅｔ−ＰｈｅＧｌｕ−Ｖａｌ　　（Ｉｌｅ）−３ｅｔ−
Ｌｅｕ−であると報告されている（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｓ、、２６２．　（１６）、ｐｐ７６４６−７６５０
（１９８７））　。

〈発明が解決しようとする問題点〉 上記した通り、本酵素はコレスレロール代謝における律
速酵素（Ｋｅｙ　Ｅｎｚｙｍｅ）であり、高コレスレロ
ール血症、胆汁酸代謝異常等に深く関与しており、これ
らの機能、症状の診断を論しる上で重要なものである。

しかしながら、本酵素は、分子レベルでの技術的知見は
十分でなく、また本酵素は肝ミクロゾームに局在してお
り、またその濃度が低く、特に重要な酵素であるにもか
かわらず口内変動する酵素であるため測定が非常に困難
であった。

本発明者らは、先に、ラット肝からポリ（Ａ）ＲＮＡを
調製し、ファージヘクターｃＤＮＡライブラリーを作製
し、このｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして５
０３個のアミノ酸からなり、分子量が５６８８０±１０
００からなるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼを
コードするＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を含むプラ
スミドをｐ７α−１１と命名した（ＦＥＢＳ　　Ｌｅ　
ｔ　ｔ。

２５７、ｐｐ９７−１００　（１９８９））。

さらに鋭意研究を行い、従来から何ら報告のない、ヒト
由来のコレステロール７α−ヒドロキシラーゼをコード
するＤＮＡ断片を得ることに成功し、従来のラット由来
のコレステロール７α−ヒドロキシラーゼペプチドとは
異なる新規なヒト由来の純粋なコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼペプチドであることを見出し、本発明を
完成した。かつこの遺伝子のＤＮＡ配列およびアミノ酸
配列の解析に当り、本発明のＤＮＡ配列から予想される
Ｎ末端アミノ酸配列とラット肝から得たプラスミドｐ７
α−１１のＤＮＡから配列から予想されるコレステステ
ロール７α−ヒドロキシラーゼのＮ末端アミノ酸配列で
あるＭｅｔ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｌｅｕ
−と異なり、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ
−Ｌｅｕであって、５０４個のアミノ酸からなる新規な
ペプチドであると判断され、さらにこの遺伝子ＤＮＡを
発現ベクターに組換え、例えばサル腎（ＣＯ３）細胞に
形質転換せしめて発現せしめて、５０４個のアミノ酸配
列からなる分子量が５７６３０±１０００である、コレ
ステロールを基質とし、還元型ＮＡＤＰと分子状酸素か
ら７α−ヒドロキシコレステロールとＮＡＤＰと水分子
を生成する反応を触媒するコレステロール７α−ヒドロ
キシラーゼの酵素活性から、本ＤＮＡ断片がヒト由来の
コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子配列を含
み、かつ発現されたポリペプチドがコレステロール７α
−ヒドロキシラーゼと認められ、コレステロール７α−
ヒドロキシラーゼの新規な遺伝子ＤＮＡを得た。この知
見に基づくコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝
子は、分子量が５７６３０±１０００からなり、コレス
テロールを基質とし、還元型ＮＡＤＰと分子状酸素から
７α−ヒドロキシコレステロールとＮＡＤＰと水分子を
生成する反応を触媒するコレステロール７α−ヒドロキ
シラーゼを構成するＤＮＡをクロニングするために用い
られる組換えＤＮＡ分子であって、該組換えＤＮＡ分子
は、少なくともコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、がっ第
１図で示されるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と
ハイブリダイズするＤＮＡ配列の縮重ＤＮＡ配列であっ
てコレステロール７α−ヒドロキシラーゼポリペプチド
をコードするものであればよいものである。また本酵素
の遺伝子を他の動物細胞や微生物に形質転換して本酵素
を生産せしめることにより、本酵素に対する抗体作製の
抗原物質として利用でき、さらに本酵素は７α−コレス
テロールの酵素的合成に利用でき、さらにまたＤＮＡ断
片の構造が決定されたことにより、本酵素のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ分子とハイブリダイズするＤＮＡ
配列遺伝子の定量、さらには本酵素のｍ−ＲＮＡの測定
を可能とした有用なものである。

く問題点を解決するための手段〉 本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、少な
くともコレステロールを基質とし、還元型ＮＡＤＰと分
子状酸素から７α−ヒドロキシコレステロールとＮＡＤ
Ｐと水分子を生成する反応ヲ触媒スるコレステロール７
α−ヒドロキシラーゼを構成するヒト由来の純粋なポリ
ペプチドに関し、また少なくともコレステロールを基質
とし、還元型ＮＡＤＰと分子状酸素から７α−ヒドロキ
シコレステロールとＮＡＤＰと水分子を生成する反応を
触媒するコレステロール７α−ヒドロキシラーゼを構成
するヒト由来の純粋なポリペプチドを本質的に発現する
ＤＮＡを含む組換えプラスミドによって形質転換された
エシェリヒア属またはＣＯ８細胞であることを特徴とす
る実質的に純粋で培養可能な微小細胞に関し、さらに少
なくともコレステロールを基質とし、還元型ＮＡＤＰと
分子状酸素から７α〜ヒドロキシコレステロールとＮＡ
ＤＰと水分子を生成する反応を触媒するコレステロール
７α−ヒドロキシラーゼを構成するヒト由来の純粋なポ
リペプチドを本質的に発現するＤＮＡが、第１図に示さ
れるアミノ酸配列のポリペプチドをコードすることを特
徴とするＤＮＡ断片に関し、さらにまた宿主にとって外
来性である当該ＤＮＡ断片を保持した実質的に純粋で培
養可能な微小細胞体を培地にて培養して該ＤＮＡの遺伝
情報を発現せしめ、該培養物から当該ポリペプチドを採
取することを特徴とする少なくともコレステロールを基
質とし、還元型ＮＡＤＰと分子状酸素から７α−ヒドロ
キシコレステロールとＮＡＤＰと水分子を生成する反応
を触媒するヒト由来の純粋なコレステロール７α−ヒド
ロキシラーゼポリペプチドの製造法である。

まず本発明におけるコレステロール７α−ヒドロキシラ
ーゼ遺伝子としては、例えばヒト肝から調製したｍＲＮ
Ａを用いてファージベクターに組み込んで得られるライ
ブラリーを用いて調製すればよく、例えば摘出したヒト
肝組織を粉末化したのちグアニジウム液を加えホモジエ
ナイズし、この懸濁液を１８．５ゲージの圧射針に数回
通して高分子ＤＮＡを分断し、これを塩化セシウム液上
に重層し、−夜遠心後、沈澱を水に溶解し、等量のフェ
ノール−クロロホルムで処理し、酢酸ナトリウムを加え
、さらにエタノールを加えて再沈澱させ、さらに遠心し
て全ＲＮＡを回収し、これを水に溶解し、６５℃で５分
加熱急冷し、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ含を緩衝液を
添加し、オリゴ（ｄ　Ｔ）−セルロースカラムにチャー
ジしてポリＡテールをもつＲＮＡのみを溶出して、ｐｏ
ｌｙ（Ａ”　）ＲＮＡを調製する。次いで、このポリ　
（Ａ）”　ＲＮＡをｄＮＴＰｓ　（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量混合物）とオリゴ（ｄＴ）
と逆転写酵素とを用いて第−鎖を合成し、ＲＮａｓｅＨ
およびＤＮＡポリメラーゼＩで第二鎖を合成し、さらに
ＥｃｏＲＩメチラーゼで遺伝子に内在しているＥＣ０Ｒ
Ｉサイトをメチル化し、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端となし、さらにこの両末端にＥＣ０ＲＩリンカ−を
付着させた後、制限酵素ＥＣ０ＲＩで消化し、これを電
気泳動によってサイズを分画するとともに過剰に加えた
リンカ−を除去後、さらにファージクローン クターに組み込んだｃＤＮＡライブラリーが調製するか
、適宜市販（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のヒト肝のλｇｔ
ｌｌ　　ｃＤＮＡライブラリーを用いてもよい。さらに
このようなライブラリーを用いて、例えばヒト肝組織か
ら調製したｍＲＮＡを用いてλｇｉｌｌヘクターに組み
込んで得たライブラリーを、コレステロール７α−ヒド
ロキシラーゼ遺伝子を参考として、このコレステロール
７αヒドロキシラーゼ遺伝子の断片や、または数十程度
の塩基を合成してプローブとして用いてスクリーニング
するか、前記のプラスミドｐ７α−１１のＥＣ０ＲＩ制
限酵素とＨｉｎｄｌ［［制限酵素によって生じる２、５
Ｋｂｐと１．ＩＫｂｐの混合のフラグメントをプローブ
として用いてスクリーニングしてもよい。スクリーニン
グにあたり、例えばλｇｔｌｌヘクターに組み込んで得
たライブラリーを、宿主菌（エシェリヒア・コリ）に感
染させ寒天培地上でプラーク・ハイブリダイゼイション
法を用い、溶菌せしめ、溶菌した培地表面にナイロン膜
を載せてファージを吸着せしめ、さらにフィルターをア
ルカリ処理してＤＮＡを変性し、中和した後８０℃で２
時間乾燥してＤＮＡを固定し、この膜をプレハイブリダ
イゼイション液（例えば５ｘＳＳＣ（１倍；１５０ｍＭ
　　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）　、５　
ＸＤｅｎｈａｒｔ液、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ
６，５）、０．１％ＳＤＳ　（ラウリル硫酸ナトリウム
）、２５０μｇ　／　ｍ　ｌ非相同性ＤＮＡ例えばサケ
精子ＤＮＡ、２０％ホルムアミド）中で３７℃、４時間
保温し、この液に５゛末端を３２ｐでラベルした上述の
如くのＤＮＡプローブを加え、３７℃、−夜ハイプリダ
イズさせ、その後該膜を室温で２×５ＳＣ１０，１％Ｓ
ＤＳ中で３回洗浄後同液で３７℃で１０分間洗浄し、通
風乾燥して、オートラジオダラムをとり、シグナルの出
た位置にあるプラークを回収し、再度プレートにまき、
プラークを純化して、目的とするコレステロール７α−
ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むファージクローンをスク
リニングする。さらにこのようにしてスクリーニングさ
れた純化ファージは、次いで宿主に感染させ、培地中で
一夜培養し、培養後遠心して上清を回収し、これにＤＮ
ａ　ｓ　ｅ　ＴおよびＲＮａ　ＳｅＡを加え、等量の２
０％ポリエチレングリコール、２．５ＭのＮａＣ１を加
え、氷冷し、遠心し、沈澱物をＳＭ　（０，ＩＭＮａＣ
＋／８ｍＭＭｇ５○ａ　／　５０　ｍ　Ｍ　）リスｐＨ
７，５１０，０１％ゼラチン水溶液）に懸濁し、等量の
クロロホルムを加えて遠心し、これに塩化セシウムを加
えて密度を１．６〜１．４に調整した水層を積層して遠
心し１’度１．５〜１．４の間のファージを含むハンド
を回収、さらにプロテアーゼ処理後フェノール抽出して
ＤＮＡを抽出し、この抽出したファージＤＮＡをＲＮａ
　ｓ　ｅＡを含む水溶液に溶解後制限酵素ＥｃｏＲＩで
部分消化して約”１．９Ｋｂｐのヒト由来のコレステロ
ール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子であるｍＲＮＡのｃ
ＤＮＡを得る。さらにこのＤＮＡ断片について、ノーザ
ンブロノトハイブリダイゼイション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
２７−６４３４−６４４３　　（１９８Ｂ））によりコ
レステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子のｍＲＮＡ
の長さを調べた結果、コレステロール７α−ヒドロキシ
ラーゼのｍＲＮＡの完全長は約２，９５Ｋｂｐの長さで
あることが判明した。この完全長のコレステロール７α
−ヒドロキシラーゼのｍＲＮＡのｃＤＮＡを得るに当り
、上記と同様に調製したヒト肝組織から調製したｍＲＮ
Ａを用いてλＺＡＰベクターに組み込んで得たλＺＡＰ
　　ｃＤＮＡライブラリーについてスクリーニングして
もよい、このようなスクリーニングにより、約２゜９Ｋ
ｂｐのＤＮＡ挿入断片を有するクローンを得る。次いで
このクローンについて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　　ｐ
ｈａｇｅｍｉｄにサブクローニングして制限酵素地図を
作成したもので、各クローンとも同一の制限酵素地図を
示したものであり、その中の１クローンをｐＨ７α−３
と命名し、第３図にｐＨ７α−３のＥＣ０ＲＩ消化部分
の制限酵素地図を示す。

次いで、他のベクターのＸｈｏｌサイト、ＥＣｏＲＩサ
イトにライゲイジョンしてサブクローニングしてもよく
、このようにして他のベクターの制限酵素サイトにコレ
ステロール７α−ヒドロキシラーゼのｃＤＮＡを含むｐ
Ｈ７α−３のＤＮＡを挿入したベクターを得る。なおこ
のようなサブクローニングにおいて、適宜な制限酵素サ
イトを有するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＡｃＹｃ１８４、ｐＵｃ１２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９等のエシェリヒア属に属する微生物を宿主とするプラ
スミドを選択してもよく、その他バチルス・ズブチリス
を宿主とするプラスミドｐｕＢ１１０、ｐｃ１９４等を
用いてもよい、さらにこのコレステロール７α−ヒドロ
キシラーゼｃＤＮＡを含むｐＨ７α−３のＤＮＡを挿入
したベクターが、目的とするコレステロ−Ｊし７α−ヒ
ドロキシラーゼの活性を発現することの確認のために、
適宜有効な発現ベクターを構築すればよい。このような
発現ベクターを構築するにあたり、宿主微生物としてエ
シェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）　ｒｓに属する
エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ　：大腸＠）、例えばエシェリヒア・コリＤＨＩ、
同ＨＢ１０１、同ＭＶ１１８４、同ＭＶ１３０４、同Ｗ
３１１０、同Ｃ６００株等に適する発現プラスミド、例
えばプラスミドｐｌＮ！、ｐＴＮＩＩ［等を使用しても
よく、またバチルス・ズブチルスを宿主微生物とする場
合には、例えばプラスミドｐＴＵＢ２１Ｂ、ｐＴＵ８２
８５等の発現用プラスミドが使用でき、またサツカロマ
イセス・セレビシア等の酵母を宿主とする例えばプラス
ミドｐＡＭ８２等の発現用ベクターを使用してもよく、
さらにＳＶ４０ウィルスの後期ブロモターで外来遺伝子
を発現させるウィルスベクター例えばプラスミドｐＳＶ
Ｌ　（ファルマシア社製）やプラスミドｐＳＶ２−ｄｈ
ｆ　ｒ　（ＢＲＬ社）を使用してなる動物細胞、例えば
サル腎（ＣＯ３）細胞やチャイニーズハムスターオバリ
ー（ＣＨＯ）細胞、さらにまたＣＨＯ−ｄｈｆｒ（葉酸
還元酵素欠ｔＭ）株細胞等を宿主として構築し、このよ
うにして調製したベクターを宿主生物に移入する方法と
しては、例えばリン酸カルシウム法やエレクトロポレー
ション法によってＣＯ３細胞やＣＨＯ細胞等に直接上記
の如くして得られたプラスミドベクターの移入を行うか
、その他公知の宿主生物に移入する方法であるコンピテ
ントセル法、ポリエチレングリコール法を用いて形質転
換した純粋で培養可能な微小細胞を得ればよい、またこ
のようなベクターを用いる場合、前記と同様にベクター
を制限酵素で切断消化し、挿入すべきコレステロール７
αヒドロキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のサイトと
ライゲイジョンできるように、適宜いず゛れかのサイト
を付加または削除するかして常法により調製し、組換え
に使用すればよい６例えば、上記のベクターをコンピテ
ント化した宿主、例えばエシェリヒア・コリＸＬＩ　　
Ｂｌｕｅに形質転換し、さらにコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼ遺伝子を同様にして回収し、その遺伝子
の塩基配列を確認する。この形質転換体をエシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｘ　Ｌ　
Ｉ　　Ｂ　１　ｕ　ｅ　−ｐ　Ｈ７α−３（工業技術院
微生物工業技術研究所に「徽工研菌寄第１１６５２号、
ＦＥＲＭ−Ｐ　ｌ　１６５２）と命名し、そのベクター
をｐＨ７α−３と命名した。

さらに発現ベクターを構築するにあたり、目的とするコ
レステロール７α−ヒドロキシラーゼの活性を発現する
ことの確認のためにＣＯ３細胞やＣＨＯ細胞による発現
を行うに、例えばコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼＤＮＡを含む挿入したベクターｐＨ７α−３をＸｈｏ
　Ｉ制限酵素で消化、切断してコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼＤＮＡを含むＤＮＡ断片１．９Ｋｂｐを
得、次いでプラスミドｐ　ＳＶＬのＸｈｏｌ制限酵素サ
イトに挿入して組換えプラスミド（プラスミドｐＨＸ−
６と命名した）を得、このプラスミドｐＨＸ−６をＣＯ
Ｓ細胞やＣＨＯ細胞に転換せしめて純粋で培養可能な微
小細胞となし、このような微小細胞は、常法によるＣＨ
Ｏ細胞等動物細胞の組織培養の手段を使用して培養すれ
ばよく、例えばＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞の組織培養の培
地、例えば、ダルベツコ変法イーグルＭＥＭ培地＋ｌＯ
％牛脂児血清を含有する培養器、簡便にはシャーレに、
形質転換体を１０’個／ｃｍ”程度播種して、２〜６日
間、３０〜３７℃にて培養した後、その培養上清を回収
して目的とするコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
の活性を確認し、ヒト由来のコレステロール７α−ヒド
ロキシラーゼポリペプチドが発現されたことを確認し、
さらに適宜公知酵素の回収、精製手段を利用して、目的
とするコレステロール７α−ヒドロキシラーゼポリペプ
チドを回収すればよい、このようにして得られた実質的
にヒト由来のコレステロール７α−ヒドロキシラーゼポ
リペプチド含有溶液は、例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫安
や硫酸ナトリウム等での塩析処理、メタノールやエタノ
ール、アセトン等の親水性有機溶媒での分別沈澱等の手
段を適宜選択し、組み合わせて行い沈澱せしめ、さらに
このコレステロール７α−ヒドロキシラーゼポリペプチ
ドを含有する沈澱物を、必要に応じて精製すればよく、
例えばこの沈澱物を水または緩衝液に溶解し、透析膜に
て透析して、より低分子量の不純物を除去してもよ（、
また吸着側やゲル濾過剤等によるイオン交換クロマトグ
ラフィー、吸着クロマトグラフィー、やゲル濾過により
精製してもよ（、実質的にヒト由来の純粋なコレステロ
ール７α−ヒドロキシラーゼとして得るもので、これは
必要に応して凍結乾燥して保存すればよい。

本発明の目的とするヒト由来のコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼポリペプチドのＤＮＡにコードされたＮ
末端アミノ酸配列は、すでに公知のラット由来のＭｅｔ
−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−１１，ｅＳｅｒ−Ｌｅｕ−で表され
る配列とは異なりＭｅｔ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−３
ｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣ末端側アミノ酸配列が−Ｔ
ｙｒＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕの配列を
含む５０４個のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子で、新規な遺伝子であることが明らかで
、この遺伝子ＤＮＡにおいて５末端側たるＡＴＣ，（Ｍ
ｅ　ｔ）の上流コドンがアミノ酸をコードするコドンで
あればいずれでもよく、さらにその５゛末端側にアミノ
酸をコードするコドンを１個以上有してもよいが、好ま
しくはＡＴＧであって、さらに適宜なシグナルペプチド
に対応するポリデオキシリボ核酸に組換えてもよく、ま
た３′末端側たるＴＴＧ　（Ｌ　ｅ　ｕ）の下流コドン
は翻訳停止コドン例えばＴＧＡまたはアミノ酸、ペプチ
ドをコードするコドンであればいずれでもよく、さらに
その３゛末端側にアミノ酸、ペプチドをコードするコド
ンを１個以上有する場合にはこのコドンの３′末端側に
さらに翻訳停止コドン、例えばＴＧＡを有することが好
ましい。

この新規なコレステロール７α−ヒドロキシラーゼを構
成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードしたＤＮＡ
を発現させることにより、分泌されたポリペプチドで、
分子量５７６３０±１０００からなる、コレステロール
を基質とし、還元型ＮＡＤＰと分子状酸素から７α−ヒ
ドロキシコレスレロールとＮＡＤＰと水分子を生成する
反応を触媒スるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
である５０４個のアミノ酸配列を有するポリペプチドで
あって、ラット由来のコレステロール７αヒドロキシラ
ーゼのアミノ酸配列と８２％の相同性を示すにすぎない
。

また上記のＣｏＳ細胞を用いる代わりに宿主として微生
物を用いて適宜な発現用ヘクターを用いて形質転換体を
得てもよく、このような微生物形質転換体を用いてコレ
ステロール７α−ヒドロキシラーゼを得るに、例えばエ
シェリヒア属に属する微生物に形質転換せしめればよく
、このようにして得られた形質転換体である微生物は、
目的とするコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ活性
現せしめるために培養するが、培養の形態は液体培養で
行えばよく、工業的には深部通気攪拌培養を行うのが有
利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常
使用されるものが広く使用でき、微生物の同化可能な炭
素源、例えばグルコース、シュクロース、糖蜜、グリセ
リン、スターチ加水分解物等が使用され、窒素源として
は利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコーン・
スチープ・リカー、大豆粉、カゼイン加水分解物、ペプ
トン、種々の肉エキス、酵母エキス、硫安、塩化アンモ
ニウム等が使用され、その他、ナトリウム、カリウム、
カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、銅等
とのリン酸塩、塩化塩、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩等との
水溶性塩を添加してもよい、培養温度は、微生物が生育
し、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼを生産する
範囲で適宜変更できるが、エシェリヒア属に属する微生
物の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である、培養時
間は、条件によって多少異なるが、コレステロール７α
−ヒドロキシラーゼが最高収量に達する時間を見計らっ
て適当な時期に培養を収量すればよく、通常は１２〜７
２時間程度である。

次いで培養後、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
は、菌体を含む培養液そのままを採取して分離、精製す
ればよい、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼは、
場合により菌体内に存在する場合には、得られた培養物
を濾過または遠心分離等の手段にて菌体を回収し、次い
でこの菌体をボールミルや超音波による機械的破砕方法
やりゾチーム等の酵素的破砕方法で破砕し、必要に応し
てキレート剤や界面活性剤を添加してコレステロール７
α−ヒドロキシラーゼを可溶化して分離採取し、前述の
分離、精製手段を適宜選択組み合わせて分離、精製すれ
ばよい。

このようにして得られたコレステロール７αヒドロキシ
ラーゼの活性は、ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　　ＢＩＯＣＨ
ＥＭＩＳＴＲＹ　　１５８，２２８−２３２　（１９８
６）に記載のコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの
改良測定法に基いて測定した結果、目的とするコレステ
ロール７α−ヒドロキシラーゼ活性を発現したもので、
新規なヒト由来のコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼが産生されたことを確認した。

なお本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基、その
他に関する略号は、それらの当該分野における慣用略号
に基づくもので、また全てのアミノ酸はＬ体を示す。

以下に本発明の参考例および実施例を挙げて具体的に説
明するが、本発明は何らこれにより限定されるものでは
ない。

〈実施例１〉 摘出されたヒト肝組織２ｇを液体チソ素中で粉末にし、
４０．、／の６Ｍグアニジンイソチオシアネート中でホ
モジナイズしたのち、１８，５ゲージの太さの注射針を
通して高分子ＤＮＡを切断し粘度を下げた。ホモジネー
トを３分の１容の５．７Ｍ塩化セシウム、０．１ＭＥＤ
ＴＡ　（ｐ　Ｈ７，５）の溶液上に重層し、３５．ＯＯ
Ｏｒｐｍ　、　２５℃で１８時間遠心した。

遠心後、沈澱物を水３−Ｉ−に溶解し、等量のフェノー
ル・クロロホルムで処理し、水層を別の試験管に取り、
１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍容の
エタノールを加えて遠心し、沈殿物を集め、減圧乾燥し
、粗ＲＮＡ２００■を得た。

この沈澱物を１．５−の水に溶解後、６５℃で５分間保
温し、急冷して１　、５　ｎｌの４０５Ｍ　）リス−塩
酸（ｐ　Ｈ７，６）　　、　１．ＯＭＮ　ａ　　ＣＩ　
　、　２ｍＭＥＤＴＡ、０゜２χＳＤＳを加えた。この
溶液全量を２０＋ｗＭ　）リス−塩酸　（ｐＨ７，６）
　　、０．５ＭＮａＣ１、１ｓＭ　　ＥＤＴＡおよび０
．１χＳＤＳで平衡化した７５−ｇのオリゴ（ｄＴ）−
セルロース（ファルマシア社製）カラムに吸着させた。

ＩＯＪの同じ溶液で洗浄した後、５Ｊの２０ｍＭ　ｌ−
リス−塩酸（ｐＨ７，６）　、Ｏ，１ＭＮ　ａ　Ｃ１，
１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１χＳＤＳ溶液でポリ　（Ａ
）ＲＮＡ以外のＲＮＡを溶出させた０次に１０ｍＭ　）
リス−塩酸（ｐＨ７，５）　、ｌ＊Ｍ　ＥＤＴＡ、０．
０５χＳＤＳの溶液でポリ　（Ａ）”ＲＮＡを溶出させ
、始めに溶出してくるＩＪを分画した。これに１０分の
１容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍容のエタノー
ルを加え、−２０℃で一晩放置し、１５，０ＯＯｒｐｌ
、３０分の遠心で沈澱を集め、減圧乾燥した。

この様にしてポリ　（Ａ）”ＲＮＡ２００μｇを得た。

〈実施例２〉 実施例１で得たポリ（Ａ）’ＲＮＡを２μｇ／μｌにな
るように水に溶解し、その２．５μｌをマイクロチュー
ブに移し、６５℃で５分間加熱し、急冷した後に、これ
に５０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ８，３）　、　１０−
−ＭｇＣ１ｇ　　、　１４０ｍＭ　　ＫＣＩ、Ｉｆ）＋
Ｍジチオスレイトールおよび２ＪＭのｄＮＴＰｓ　　（
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量混合
物）、５μｇのオリゴ（ｄＴ）（ファルマンア社製）と
１．５単位の逆転写酵素（宝酒造社製）を加え、全量を
２０ｔｔｌとし、４２℃で１時間反応させた。その反応
液に８０５Ｍ　トリス−塩＃（ｐＨ７，５）　、２００
■Ｍ　ＫＣＩ、１０＊ＭＭｇ　ＣＩｇ　、２５μ”、、
ＩＢＳＡにＲＮａｓｓ）（（宝酒造社製）６０単位およ
びＤＮＡポリポリーゼＩ　（ベーリンガーマンハイム社
製）５単位を加えて総量を１５０μｌにし、１２℃で１
時間反応させたのち、２２℃で１時間反応させた。２０
μｉの０．２５Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａと１０μｌの１０χ
ＳＤＳを加えて反応を停止した後、等量のフェノール−
クロロホルムを加え、１０．０００ｒｐｔｍ、５分間遠
心し、水層を分取した。それに等量の４Ｍ酢酸アンモニ
ウムと２倍のエタノールを加え、１５．０ＯＯｒｐｍ　
、１５分間遠心し、沈澱物を集め減圧乾燥した。沈澱物
に１００ｍＭ　　ｌ−リス−塩＃（ｐＨ８，０）　、１
０ｍＭＥＤＴＡ、８０μＭＳ−アデノシルメチオニン、
１００　ｐｇ　４Ｚ　Ｂ　Ｓ　Ａおよび２単位のＥｃｏ
ＲＩメチレース（ブロメガハイオテンク社製）を加え、
１０μｌとし、３７℃でｒ時間反応させた０反応後、反
応液に４０μｌの水を加え、等量のフェノール−クロロ
ホルムで処理し、遠心により分取した水層に、等量の４
Ｍ酢酸アンモニウムと２倍のエタノールを加え、−７０
℃で１５分間放置した。

１５．０ＯＯｒｐ−１１５分間遠心後の沈澱物に６７５
Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ８，８）　、６．７ｗＭ　Ｍｇ
ＣＩ□、１６．６曽Ｈ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ　２
−メルカプトエタノール、６．７８Ｍ　ＥＤＴＡ、　０
．１６７χＢＳＡ、各７５０μＭ　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（
宝酒造社製）４単位加え、全量を１２μｌとし、３７℃
で１時間反応させた０等量のフェノール−クロロホルム
液で処理し、エタノール沈澱し、遠心によって沈澱物を
回収し、減圧乾燥した。１μｇのＥｃｏＲＩリンカ−に
５０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐ　Ｈ７，６）　、１０ｍＭ
Ｍ　ｇ　Ｃ１ｔ、１０曽Ｈジチオスレイトール、０．１
ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭＡＴ
Ｐおよび３単位のＴ４ポリヌクレオチドカイネース（宝
酒造社製）を加え、全量を１０μｌとし、３７℃で３０
分間反応させた。これを７４ＤＮＡポリメラーゼ処理後
のサンプルに全量加え、６０単位のＴ４リガーゼ（ファ
ルマシア社製）を加え、１４℃で一晩反応させた。この
反応液にｌｏｏｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　、５０＋＋Ｍ　ト
リス−塩酸（ｐＨ７，５）　、１０鴎ＭＭｇＣＩ２．７
−Ｍ　２−メルカプトエタノール、１００　μｇ々ＢＳ
Ａおよび２５０単位のＥｃｏＲＩを加え、全量４０μｌ
にて、３７℃で２時間反応させた。この反応液を１χ低
融点アガロースゲルにて分画し、６００−２０００ベー
スのＤＮＡを含むゲルを回収した。６５℃で１０分間保
温し、ゲルを融解した後、等量のフェノールを加え、１
０分間氷冷後、１５．ＯＯＯｒｐｍ　、４℃で１０分間
遠心した。水層に等量のフェノールを加え操作を繰り返
し、水層をクロロホルムで２回処理し、１０分の１容の
訪酢酸ナトリウムおよび２．５倍容のエタノールを加え
、−７０℃に放置した。　１５．ＯＯＯｒｐｍ　、１５
分間遠心した後、沈澱を７５χエタノールで２回洗浄し
、減圧乾燥した。それにラムダファージベクターλｇｔ
ｌｌ　　（ストラドジーン社製）アームを１μｇ加え、
ライゲーションキ・７ト（宝酒造社製）を用いて、２６
℃で１０分間反応させた。反応後のサンプルはインビト
ロパッケージングキット　（ストラドジーン社製）を用
いて反応させた。得られたλファージをエシェリヒア・
コリＹ１０８９　　（ストラドジーン社製）に感染させ
、総数を調べたところ、５Ｘ１０’ｐｆｕ　（ｐｌａｑ
ｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ　）よりなっていた。

また上記のライブラリーの代わりに、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
社製のヒト肝由来遺伝子を含むラムダファージベクター
λｇｔｌｌ　　ｃＤＮＡライブラリーを用いた。

〈実施例３〉 実施例１におけるラムダファージベクターλｇｔｌｌの
代わりに、ラムダファージベクターλＺＡＰを用いて、
同様に行い、λＺＡＰライブラリーを調製した。

〈実施例４〉 実施例２のラムダファージへクターλｇｔｌｌライブラ
リーについて、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
のｃＤＮＡを選択するために、ＦＥＢＳ　　　Ｌｅｔｃ
、、　　２５７．　９７−１００　　（１９８９）記載
のプラスミドｐ７α−１１を用いてスクリーニングを行
った。即ち作製したｃ　ＤＮＡライブラリー約２Ｘ１０
’クローンをエシェリヒア・コリエシェリヒア・コリＹ
１０８９を指示面として、１．５χＬＢ寒天培地（１１
につき、バクトドリプトン１０ｇ２バクトイ−ストエキ
ストラクト５ｇ、ＮａＮａＣ１１Ｏ上にひらき、ＬＢプ
レート上の溶菌したプラークをナイロン膜上に移し、膜
を０゜５ＭＮａＯＨ１１，５ＭＮ　ａ　Ｃ１で５分、３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）で５分処理した後、８
０℃減圧下で２時間乾燥した。次にこの膜をビニール袋
にいれ、５倍濃度ＳＳＣ（１倍：　１５０５Ｍ　Ｎ　ａ
　Ｃ１，１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５倍デンハル
ト液（１倍：　０．０２χフイコール、０．０２χポリ
ビニルピロリドン、０．０２χＢＳＡ）、５０醜−リン
酸ナトリウム（ｐ　Ｈ６，５）　、０．１χＳＤＳ　（
ラウルル硫酸ナトリウム）　、２５０μｇ意サケ精子Ｄ
ＮＡ、２０χホルムアミド１０　　中で、３７℃、４時
間保温した。液を除いてから、５′端を３ｚＰでラベル
した約２゜５ｋｂｐおよび１．１ｋｂｐのＤＮＡ挿入断
片プローブ（１０”　ｃｐｍ／μｇ　；プラスミドｐ７
α１１をＥｃｏＲ１制限酵素および）［１ｎｄｌ（［制
限酵素にて完全消化して２．５ｋｂｐおよび１゜１ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を得、これを用いた）を２０ｎｇ上液に
加え、３７℃で一晩ハイブリダイズさせた。その後膜を
２倍５ＳＣ１０，１χＳＤＳで室温で３回、３７℃で１
０分洗浄し、通風乾燥して一晩オートラジオダラムを行
った。シグナルの出た位置の培地をくり抜き、ＳＭ液（
０，ＩＭＮ　ａ　Ｃｌ　、８ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　
、５０ｗＭ　）リス−塩酸（ｐ　Ｈ７，５）、０．０１
χゼラチン）ＩＪに懸濁し、希釈してＬＢプレートにひ
らき直し、同じプローブでスクリーニングを繰り返し、
プラークを純化して、２０クローンを得た。さらにこの
クローンをエシェリヒア・コリエシェリヒア・コリＹＸ
ＬＩ−Ｂｌｕｅに感染させ、ＬＢ寒天培地プレー）（１
３ｃｗＸ９ｃ―）２枚にひらいた。１枚につき１５Ｊの
ＳＭ液を加えて、ファージをＳＭに浸潤させ、試験管に
上層寒天とともに移し、８．ＯＯＯｒｐｍ、１０分間遠
心した。上滑に６０単位のＤＮａｓｅ！（宝酒造社製）
および１００　ｔｔｇのＲＮａｓｅＡ（シグマ社製）を
加え、３７℃で３０分間保温した。これに等量の２０χ
ポリエチレングリコール、２．５ＭＮ　ａ　ＣＩを加え
、１時間水冷した後、１５．ＯＯＯｒｐｍ　、２０分遠
心し、沈澱物を得た。この沈澱物をｏ、５−１−のＳＭ
液に懸濁し、等量のクロロホルムを加えて処理し、遠心
後の水層に密度が１．１５になるように塩化セシウムを
加えた０次いでそれを密度が１．６　（２％Ｚ）、１．
５（３％Ｌ）　、１．　４　（３Ｊ）になるように塩化
セシウムを加えたＳＭの溶液上に重層し、３０，０ＯＯ
ｒｐ■、３時間遠心した。遠心後、密度１．５と１．４
の間に表れるファージを含むバンドを分取し、トリス−
塩酸（ｐＨ７，５）に溶解し、４０．ＯＯＯｒｐｍ　、
１時間遠心によって沈殿物を得り、沈殿物を、２０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５ＸＳＤＳ、５０μｇ／％Ｊｌプロテア
ーゼＫ（シグマ社製）で、６５℃、１時間処理した。こ
の反応液に等量のフェノールを加え、遠心後の水層を等
量のフェノール−クロロホルムで処理し、再度遠心後の
水層をクロロホルムで処理し、水層に１０分の１容の３
ｈ酢酸ナトリウムと２．５倍容のエタノールを加え一７
０℃に１５分放置した。　１５．ＯＯＯｒｐｍ　、１５
分の遠心にて回収した沈澱物を７５χエタノールで２回
洗浄し、減圧乾燥した＊　５１’　ｇ　／５ｐＪＬ　Ｒ
Ｎ　ａ　ｓ　ｅ　Ａを含む水５０μｌに沈澱を溶かし、
１０μｊをＨ１ｌ衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、１０４．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９８２））中においてＥｃ
ｏＲＩ消化して挿入断片を調べると、約２．９ｋｂｐの
最長の断片を有する、コレステロール７α−ヒドロキシ
ラーセ遺伝子クローンが得られ、消化後に得られた約２
．９ｋｂｐの挿入断片を低融点アガロースゲル電気泳動
により回収した０次いでこれらのクローンについて、ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　　ｐｈａｇｅｍｉｄに変換して
制限酵素地図を作成した。得られた３クローンとも同一
の間隙酵素地図を示したものであり、その中の１クロー
ンをｐＨ７α−３と命名し、このクローンを保持して形
質転換されたエシェリヒア・コリＸＬＩ−Ｂｌｕｅをエ
シェリヒア・コリ（［！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｔ）　Ｘ　Ｌ　１−　Ｂ　ｌ　ｕ　ｅｐＨ７α−３（工
業技術院微生物工業技術研究所に［徽工研菌寄第１１６
５２号、ＦＥＲＭ−Ｐ１１６５２）と命名し、寄託し、
さらにｐＨ７α−３のＸｈｏｌ−ＸｈｏＩ断片の制限酵
素地図を第４図に示す。

〈実施例５〉 さらにこのｐＨ７α−３クローンを用いて、Ｘｈｏｌで
完全消化した後、５０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ８，０
）中にバクテリアアルカリホスファターゼ（東洋紡績社
製）を０．５単位加え、６５℃で１時間反応させた（以
下ＢＡＰ処理と略す）０反応液をフェノール−クロロホ
ルム液で２回処理した後、水層に１０分の１容針酢酸ナ
トリウムおよび２倍容のエタノールを加え、遠心してベ
クターを回収した。ゲルから回収した挿入断片とＸｈｏ
Ｉ消化したベクターｐｓＶＬ　（ファルマシア社製）を
、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結さ
せ、プラスミドｐＨＸ−６と命名した。

１００Ｊの！培地（１１につきハクトドリプトン２０ｇ
、バクトイ−ストエキストラクト５ｇ、Ｍｇ５Ｏｓ　１
４ｇ　、Ｉ）　Ｈ７，６）で培養した対数増殖期のエシ
ェリヒア・コリＸＬＩ　　Ｂｌｕｅ　　（ストラジーン
社から購入）を集菌し、４ｏ、Ｊｌの水冷した３０ｍＭ
酢酸カリウム、１０（１ｗＭ　ＲｂＣ１、ｌｏｍＭｃａ
ｃｌ、、５抛ＭＭｎＣ＋、および１５χグリセリン（ｐ
Ｈ５，８）で懸濁した後、０℃で５分間放置後遠心集菌
し、さらに４９．Ｌの１〇−阿ＭｏＰＳＷｋ衝液（ドー
タイ社製）、７５ｍＭＣａＣＩｇ、１０５ＭＲｈＣｌお
よび１５χグリセリン（ｐ　Ｈ６，５）に懸濁し０℃で
１５分間放置してコンピテント細胞とした。

このエシェリヒア・コリ懸濁液２００μｌに、上記のラ
イゲーションしたプラスミドｐ７Ｘ−６ＤＮＡ溶液２０
μｌを加え、０℃で３０分間保温した、４２℃、９０秒
間熱処理し、ＬＢ培地８００．ｕｆを加え、３７℃、６
０分間保温した。これを、アンピシリン５０ｐｇ　／、
Ｊ　、　０．０２χＸ−ｇａｌ　（５−ブロモ４−クロ
ロ−３−インドリル−β−ガラクシド）および５０ｇＭ
ＩＰＴＯ（イソプロピル−β−０−チオガラクトピラノ
シド）を含んだＬＢ寒天培地にまき、３７℃、−晩培養
して形質転換体を得た。形質転換した単一の白コロニー
を５０ｇｇ　／、ｊ！チアンシリンを含む２ＪのＬＢ培
地で一晩培養し、遠心により集菌した。

これにｌａｇＡＪリゾチーム（ングマ社製）を含む５０
１ＩＭトリスー塩ｆｌｌ　（ｐ　Ｈ８，０）　、５０ｍ
ＭＥＤＴＡ（ｐ　Ｈ８、０）　、１５Ｘ　ンｇ糖ヲ０．
６−ｅｊｍｘ、３７℃で１５分反応させた後、１０χＳ
ＤＳを１２μｌを加え混ぜ合わせた後、５Ｍ酢酸カリウ
ムを６０μｌ加え、０℃で３０分間放置した。１５．Ｏ
ＯＯｒｐｍ　＋　ｌ　Ｑ分間遠心し、上清に等量のフェ
ノール−クロロホルムを加えて処理し、水層をエーテル
で２回処理してから、２倍容のエタノールを加え、−７
０℃で１５分間放置した。　１５．ＯＯＯｒｐｍ　、１
５分間遠心して沈澱物を回収し、７５χエタノールで２
回洗浄後、減圧乾燥した。沈澱物を５μｇ　／Ｊ　ＲＮ
　ａ　ｓｅＡを含む水に溶き、Ｘｈｏｌで消化して、挿
入断片を含むクローンを選別した。このクローンを含む
単一コロニーを５０ｇｇノーのアンピシリンを含むＬＢ
培地６ｗＪ−にて３７℃で一晩培養後、その５Ｊを５０
０　ＪのＬＢ液に植菌し、３７℃で培養した、対数増殖
期の菌液に２０ｕｇ’Ｊのクロラムフェニコールを加え
、さらに−晩培養した。６．ＯＯＯｒｐｍ、１０分の遠
心により集菌し、１５ｕの８χノｇ糖、１０χ　トリト
ンＸ、２５＋ｓＭＥＤＴＡ、５０ＩＩＩ１１トリス−塩
酸（ｐ　Ｈ８，０）および０．２５Ｍ　　トリス−塩＃
（ｐＨ８，０）に溶解した１０彎ｇ／％ｉのリゾチーム
１．５Ｊを加え、加熱により溶菌させた。　１４．ＯＯ
Ｏｒｐｍ　、３０分の遠心後の上清に、等量のフェノー
ル−クロロホルムを加えて処理し、水層に１０分の１容
の３ｉ酢酸ナトリウムと２倍容のエタノールを加えて、
７０℃で１５分放置した。３．０ＯＱｒｐａ、１５分の
遠心にて回収した沈澱物に、２１〜乙のトリス−塩酸（
ｐ　Ｈ７，４）を加えて溶解し、２０ｇの塩化セシウム
およびｉｏｍｇ／、Ｊ−のエチジウムブロマイドＩＪを
加え、５０．ＯＯＯｒｐｍ　、４℃にて一晩遠心した。

遠心後間環状プラスミドＤＮＡを分取し、エチジウムブ
ロマイドを除くために等量のブタノールを加え遠心し、
さらに水層を２回ブタノールを加えて処理した。そのサ
ンプルを０．２ＭＮ　ａ　Ｃ１を含んだトリス−塩ｆｉ
　（ｐ　Ｈ７，４）で洗浄したＣＬ４Ｂセファロースゲ
ル（ファルマシア社製）にてゲル濾過し不純物を除いた
後、２倍容のエタノールを加えて、−７０℃で１５分間
放置した。３．００Ｏｒｐｍ、３０分間遠心し、沈澱物
を７５χエタノールで２回洗浄後、乾燥し、濃度を１μ
ｇ／μｌになるように調整した。得られたプラスミドか
ら、全領域にわたって塩基配列を決定するに当たり、こ
の遺伝子内を各制限酵素で消化し、各プラスミドｐＢ１
ｕｅｓｃｒｉｐｔと連結し、エシェリヒア・コリＸＬ−
Ｂｌｕｅを宿主菌として常法により形質転換した。挿入
の確認された単一クローンを５０ｕｇ／Ｊ’アンピシリ
ンと０．０１χチアミンを含む２倍ＹＴ培地（１１につ
き、バタトトリブトン１６ｇ１バクトイ−ストエキスト
ラクト１０ｇ　、　Ｎａ　Ｃｌ　５ｇ）１０Ｊに植菌し
、３７℃で１時間培養してからヘルパーフｙ−ジＭ１３
ＫＯ７（宝酒造社製）を６×１０・ｐｆｕ感染させ、−
晩培養した。　１０．００Ｏｒｐｍ　、　１０分間遠心
後の上清に、５分の１容のＰＥＧ−ＮａＣ１溶液（２０
χポリエチレングリコール６０００．２．５ＭＮａＣ１
）を加え、室温に１５分間放置した。　１５．０００ｒ
ｐ＋ｓ　、１０分間の遠心後の沈殿物に、５μｇ　／ｓ
ｌ　ＲＮａ　ｓ　ｅＡを含む水を加えて溶解し、室温に
１５分間放置した後、等量のフェノールで処理した。遠
心後の水層をフェノール−クロロホルムで処理し、水層
に１０分の１容の３−酢酸ナトリウムおよび２倍容のエ
タノールを加え一７０℃に１５分間放置した。１５．Ｏ
ＯＯｒｐｍ　、１５分間遠心後の沈殿物を７５χエタノ
ールで２回洗浄し、減圧乾燥した。このようにして得た
ＤＮＡを、Ｅｘｏｌｉ／Ｍｕｎｇ　−ｂｅａｎ　　ｎｕ
ｃｌｅａｓｅ　　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　　ｓｙｓｔｅｍ（
タカラ社製：Ｇｅｎｅ、２８，３５１−３５９　（１９
８４）　）および５ｅｑｕｅｎｓｅ　　Ｋｉｔ　　（Ｕ
ｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　ｃ
ａ　１社製）を用いて、コレステロール７α−ヒドロキ
シラーゼをコードする領域付近の塩基配列の決定を行い
、第１図にそのアミノ酸配列を示し、第２図にそのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を示す。

この結果から、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
遺伝子は１５１２塩基からなり、５０４残基のアミノ酸
をコードする遺伝子であり、開始コドンＭｅｔをコード
するＡＴＧからはじまり、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｈｒ−３ｅｒ−ＬｅＵ−をコードする５°　−ＡＴＧ　
　ＡＴＧ　　ＡＣＣＡＣＡ　　ＴＣＴ　　ＴＴＣ，−３
’　の塩基配列を有し、かつＣ末端側アミノ酸配列が−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕをコ
ードする５′−ＴＡＴ　　ＡＡＡ　　ＴＴＣＡＡＧ　　
ＣＡＴ−ＴＴＧ−３°の塩基配列を有し、ＴＧＡの終止
コドンからなる塩基配列を有するヒト由来のコレステロ
ール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子であるポリペプチド
をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片でであることが
確認された。

またこのようにして得られたコレステロール７α−ヒド
ロキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡの配列表を次に示す。

Ｎ　　　ロ　　　ψ　　　ロ　　　！　　　　Ｎ　　　
ロ　　　ψ　　　クロ　　　の　　　ｃｌｌ　　　　＋
Ｆ　　　　■　　　＋Ｐ　　　■　　　の　　　（１）
−ロコ　−ク　（り　ロコ　＜ψ　←ψ　←Φ　←偽　
ローフ　　←Φ　←Φ　ｌ＋Φ　＜−＋　　＜＞　　＜
−←ｊ＜η　く−（１＋、Ｊ　　（Ｊ＋ｉ　　ｌ＋−ク
ロ　＜、ｕ　　１．Ｊ−←偽　ロく　Ｑクロー　←−く
Φ　ＣＪＷ　　＜ム　ロー　ＱΦ　ロコ　Ｃ＜＜　　＜
１＋＜−ロく　く←　＜２　　＜−←−ω〈実施例６〉 上記のコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子を
挿入したベクターが目的とするコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼ活性を発現することの確認のために、動
物細胞で発現させるベクターを構築した。

まずコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含
むクローンｐＨ７α−３をＸｈｏｌ−Ｘｈｏｌ断片（１
，９Ｋｂｐ）を５ｉｅｎｃｅ、２旦、１２５８−１２６
１　　（１９８６）に従い、プラスミドｐＳＶＬ発現ヘ
クターに組換えた。この組換えに当り、まずクローンｐ
Ｈ７α−３のＤＮＡｌ０μｇをＨ１ｌ衝液（前述）中に
おいて１５単位のＸｈｏ　Ｉで３７℃、２時間消化して
切断した０反応液を、フェノール−クロロホルム処理し
、エタノール洗浄後のＤＮＡに各々５ａ＋ＭのｄＡＴＰ
、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む５抛阿トリス塩
酸（＋）Ｈ７，２）　、１０ｍＭＭｇ５Ｏ，，０，１＋
ｉＭジチオスレイトール、５０μｇ／ＢＳＡおよび１０
単位のフレノウフラグメント（東洋紡績社製）を加え、
室温で１時間反応させた。その反応液を、１％低融点ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、約２．２ＫｂｐのＤＮＡ
断片を抽出精製乾燥した。

またこれとは別に、プラスミドｐＳＶＬ　（ファルマシ
ア社製）ＤＮＡ３．ｃｏｇを、Ｓｍａ　ＴＩＮ衝液（１
０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７，５）　、７義ＭＭｇＣ
１２，２０ａ＋ＭＫ　Ｃｌ　、　７ｍＭ　２−メルカプ
トエタノールを加え、３０℃で２時間反応させた。反応
後、ＢＡＰ処理（前述）し、約１．９ＫｂｐのＤＮＡ断
片とライゲイジョンキットを用いて連結した。これをエ
レコトロボレーシ３ン法でＣＯＳ　７細胞にトランスフ
ェクトする。

〈実施例７〉 ＣＯＳ細胞によるコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼの発現を確認した。

２５ｍＭ　）リス−塩酸（１）　Ｈ　７．　　４）　、
１３７ｍＭ　ＮａＣ　　ｌ　　、　　５ｍＭ　　Ｋ　Ｃ
　　Ｉ　　、　　０．７ｓＭ　　Ｃ　　ａ　　Ｃ　　Ｉ
　　ｔ　　−　　０．５＋ＩＭ　　Ｍｇｃｌ，および０
．６ｓＭ　Ｎ　ａ　ｚ　Ｈ　Ｐ　Ｏ　ａからなる緩衝液
（以下、ＴＢＳと略称する）１７５μｆｆｉニ、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン（ファルマシア社製）４−ｇと上記の
ライゲイジョンしたＤＮＡＩＯμｇを加えた。このＤＥ
ＡＥ−デキストラン／ＤＮＡ混合液を、１０χウシ胎児
血清を含むＩ）−ＭＥＭ培地（ジブコ社製）で培養され
たＣＯＳ７細胞（ＩＸＩＯ８個）に加えて、常法による
エレコトロボレーション法でＣＯＳ７細胞にトランスフ
ェクトした。

次いで同一培養液を使用して、５％ＣＯ□濃度、３７℃
で細胞培養した。この培養物についてコレステロール７
α−ヒドロキシラーゼ活性の測定をおこなった。

活性測定に当り、トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞は
、ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ−４５０還元酵素と基質
のコレステロールを細胞中に有していることから、コレ
ステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子が発現されれ
ば、７α−ヒドロキシコレステロールが生産物として細
胞内に蓄積されると予想され、そこで、トランスフェク
トしたＣＯＳ７細胞を０時間、６時間、１２時間、２４
時間、３６時間、４８時間培養した細胞を集め、Ｏｇ　
ｉ　ｓ　ｈ　ｉｍａらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．、２６２．７６４６−７６５０．　　１９８７）に従
い、７α−ヒドロキシコレステロールの量全測定した。

かつ前記したコレステロール７αヒドロキシラーゼに対
する抗血清を用いたウェスタンブロッティング法にて免
疫反応性を確認した。その結果、７α−ヒドロキシコレ
ステロールは、１２時間後に検出することができ、その
後増加して、４８時間後では０　、　　７　ｎ　ｍｏｌ
ｅ／ｍｇ蛋白の量までに達した。またｐＳＶＬベクター
のみをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞では、全く７
αヒドロキシコレステロールを検出できながっ゛た。

さらにウェスタンブロッティングの結果、抗体に反応す
る蛋白質は、７α〜ヒドロキシコレステロールの蓄積量
に平行して増加することが確認され、コレステロール７
α−ヒドロキシラーゼが産生されたことをｆｌ認し、こ
れを精製して、分子量が分子量が５７６３０±１０００
で、コレステロールを基質とし、還元型ＮＡＤＰと分子
状酸素がら７α−ヒドロキシコレステロールとＮＡＤＰ
と水分子を生成する反応を触媒するコレステロール７α
−ヒドロキシラーゼを得た。

〈発明の効果〉 本発明のＤＮＡおよび形質転換体を用いることによって
、分子量が５７６３０±１ｏｏｏからなる、コレステロ
ールを基質とし、還元型ＮＡＤＰと分子状酸素から７α
−ヒドロキシコレステロールとＮＡＤＰと水分子を生成
する反応を触媒するコレステロール７α−ヒドロキシラ
ーゼを効率よく製造することが可能となった。また本発
明によって新規なコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼのアミノ酸配列を明らかとすると共に、単離した。更
にそのコレステロール７α−ヒドロキシラーゼを構成す
るＤＮＡをクローニングするために用いられる組換えＤ
ＮＡ分子であって、該組換えＤＮＡ分子は、少なくとも
コレステロール７α−ヒドロキシラーゼポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列であって、かつ第１図で示される
ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子とハイブリダイズ
するＤＮＡ配列の縮重ＤＮＡ配列であってコレステロー
ル７α−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするコ
レステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子が明らかと
なり、有用なコレステロール７α−ヒドロキシラーゼを
純化して提供できるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼのアミノ酸配列、第２図はコレステロール７α−ヒド
ロキシラーゼのＤＮＡ塩基配列、第３図はコレステロー
ル７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ消化
断片の制限酵素地図を示し、第４図はコレステロール７
α−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むＸｈｏｌ−ＸｈｏＩ
消化断片の制限酵素地図を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくともコレステロールを基質とし、還元型Ｎ
   ＡＤＰと分子状酸素から７α−ヒドロキシコレステロー
   ルとＮＡＤＰと水分子を生成する反応を触媒するコレス
   テロール７α−ヒドロキシラーゼを構成するヒト由来の
   純粋なポリペプチド。
2. （２）少なくともコレステロールを基質とし、還元型Ｎ
   ＡＤＰと分子状酸素から７α−ヒドロキシコレステロー
   ルとＮＡＤＰと水分子を生成する反応を触媒するコレス
   テロール７α−ヒドロキシラーゼを構成するヒト由来の
   純粋なポリペプチドを本質的に発現するＤＮＡを含む組
   換えプラスミドによって形質転換されたエシェリヒア属
   またはＣＯＳ細胞であることを特徴とする実質的に純粋
   で培養可能な微小細胞。
3. （３）少なくともコレステロールを基質とし、還元型Ｎ
   ＡＤＰと分子状酸素から７α−ヒドロキシコレステロー
   ルとＮＡＤＰと水分子を生成する反応を触媒するコレス
   テロール７α−ヒドロキシラーゼを構成するヒト由来の
   純粋なポリペプチドを本質的に発現するＤＮＡが、第１
   図に示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードする
   ことを特徴とするＤＮＡ断片。
4. （４）ＤＡＮ断片が、第２図で示される塩基配列の全部
   または部分である請求項第３項記載のＤＮＡ断片。
5. （５）宿主にとって外来性である請求項第２項記載のＤ
   ＮＡ断片を保持した実質的に純粋で培養可能な微小細胞
   体を培地にて培養して該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ
   、該培養物から当該ポリペプチドを採取することを特徴
   とする少なくともコレステロールを基質とし、還元型Ｎ
   ＡＤＰと分子状酸素から７α−ヒドロキシコレステロー
   ルとＮＡＤＰと水分子を生成する反応を触媒するヒト由
   来の純粋なコレステロール７α−ヒドロキシラーゼポリ
   ペプチドの製造法。