JPH01503119A - 無細胞翻訳系においてポリペプチドを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 無細胞翻訳系においてポリペプチドを製造する方法従来技術 本発明は、分子生物学および生物工学に関し、またより詳細には、無細胞翻訳系 （ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）においてポリ ペプチドを製造する方法に関する。

該ポリペプチドは、生物学的プロセス（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｃ−ｅｓ ｓｅｓ　）の調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）として医薬において広く使用さ れている。従来技術においては、例えば免疫系を活性化するポリペプチド、ポリ ペプチド神経伝達因子および伝達物質（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｎｅｕｒｏ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ）　、塩代謝のポリペ プチド調節因子（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）等力（知 られている。ポリペプチドはまた農業においても、生物学的刺激剤（ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａｌ　ｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）　、例えば成長ホルモンとして使用されて いる。ポリペプチドはまた生物電子工学においても、例えばロドプシン膜（ｒｏ ｄｏｓｐｉｎ　ｆｉｌｍｓ）として使用されている。

技術の状態 従来技術においては、二つのポリペプチド製造方法、すなわち化学的合成法およ び遺伝子工学的方法が知られている。

化学的合成法は、比較的小さい長さく１５個のアミノ酸基までの）のポリペプチ ドの工業的製造において広く使用されており、例外的にまれには、２５〜３０個 のアミノ酸基を有するポリペプチドが合成されている。さらに長いポリペプチド はこの方法では実用的に製造することができない、なぜならば最終生産物の収量 が、アミノ酸基のラセミ化、ポリペプチド鎖の不完全伸長（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔ ｅ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）ならびに保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｇｒｏｕｐ ｓ　）の選択の困難さおよび保護基の除去のために、ポリペプチド鎖の長さの増 加につれて指数関数的に減少するからである。これらのファクターは総て、最終 生産物の精製の際に大いなる困難さをもたらし、またポリペプチドの長さの増大 につれてポリペプチドの製造費用を極端に増大せしめる。

ポリペプチドの準備合成（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）の遺 伝子工学的方法（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）に もまた、実用においである限界がある。これらの限界は、形質転換細胞による発 現生産物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の分離の困難さ、すなわ ちある最終生産物が生産細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｎｔ　ｃｅｌｌ）上で産生ずると いう避けられない効果および外来遺伝子（ｆｏｒｅｉｇｎ　ｇｅｎｅ）の発現生 産物の蛋白質加水分解減成（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｃｌｅｇｒａｄａ−ｔｉ ｏｎ）と関連がある。後者の事情が、多くのポリペプチド、特に１５〜７０個の アミノ酸基を有するポリペプチドの分離に特別なむずかしさを課し、ポリペプチ ドは、該ポリペプチド中に密な立体構造がないために、細胞内および細胞間プロ テアーゼによって容易に減成されてしまう。

当然の結果として、ポリペプチドの上記製造方法は、１５〜７０個のアミノ酸基 を有するポリペプチドの製造には、実際的に適用できないということになるが、 やはり、免疫系を活性化するペプチド、ペプチド神経伝達因子および伝達物質な らびにまた塩代謝を活性化するペプチドのような多くの生物活性ポリペプチドは 、１５〜７０個のアミノ酸基を有している。

ポリペプチドを合成するさらに別の方法が知られている。この方法は無細胞系を 使用することに基づいている。現時点では、種々の無細胞翻訳系が、種々の原核 生物および真核生物からの細胞抽出物（ｃｅｌｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ）に基づい て開発されている。

従来技術においては、例えば、小麦胚芽の無細胞翻訳系において、うさぎグロビ ン　ポリペプチド（ｒａｂｂｉｔ　ｇｌｏｂｉｎ　ｐｏｌｙ−ｐｔｉｄｅ）を合 成することからなるポリペプチドの製造方法が知られている（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ 、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ｖｏｌ、７０，１９７３　ＬＩＳ＾）。

リポソームの無細胞翻訳系１−１は、緩衝液−に°の酢酸塩（Ｋ’　ａｃｅｔａ ｔｅ）　８０　ｍＭ、Ｍｇ　”　Ｈの酢酸塩３．０　ｍＭ　（３，Ｏｍｕｇ　２ ”ｅｅｔａｔｅ）　、＾ＴＰ　１　ｍＭ、にＴＰ　２０１１Ｍ、ジチオトレイト （ｄｉ−ｔｈｉｏｔｒｅｉｔｅ）　２　ｓＭ、１００　ｕｃｉ　（コ５Ｓ）−メ チオニン（比活性、８９Ｃｉ／　ｍｓ＋ｏｌ　）および残り１９種のアミノ酸の それぞれ２０　、Ｍを含んでいるＨＥＰＥＳ　２０　Ｊ、ｐＨ７，６−中に、小 麦胚芽抽出物０．５　ｍｌ、うさぎグロビン（ｒａｂｂｉｔ　ｇｌｏｂｉｎ）の ９８　ｓＲＮ＾０．１２５ｎｍｏｌ、クレアチンリンｆｌｉ　８　ｍＭ、クレア チンホスホキナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ）　４０ 　Ｈｇ、ヒト胎盤のりボヌクレアーゼ　インヒビター２〜１０１ｇ、各プロテア ーゼ　インヒビター（ペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）　、キモスタチン（ ｅｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）、アンチパイン（ａｎｔｉｐａｉｎ）　、ロイペプチ ン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）　）０．１目を含んでいる。

ポリペプチドは、無細胞翻訳系において、２５℃の温度で合成された。最終生産 物および無細胞翻訳系のインヒビターである分解生産物（＾ＨＰ、ＣＤＰ、ピロ リン酸塩、リン酸塩、クレアチン、その他）を含んでいる翻訳生産物が、合成中 に該系内に蓄積される。該インヒビターの作用の結果として、最終生産物の合成 は６０〜９０分で終わる。ポリペプチドに含まれている〔３ＳＳ）−メチオニン マーカー（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　Ｉ＋ａｒｋｅｒ）による最終生産物の分析は 、５パーセント　トリクロロ酢酸を使用して、フィルター上で、ポリペプチドの 熱沈澱法（ｈｏｔ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉ。

ｎ）によって行われる。６０〜９０分の間に合成された最終生産物の量は、＜０ ．５８マトリツクス１ビコモＪし当たりのグロビンのピコモルである。

ポリペプチドの上記製造方法は、無細胞翻訳系を利用する最も有効な既知方法の うちの一つである。しかしながら、これらの系でさえ、かかる無細胞系の短時間 の仕事（１〜２時間）のために、−ＲＮＡのｌコピー当たりポリペプチド１コピ ーまたは最大２コピーだけを与え得るにすぎない。

無細胞翻訳系のこのような短時間仕事の主な理由は次の通りである。

１、無細胞翻訳系は、限られた量のエネルギー源＾ＴＰおよびＧＴＰを含んでい るが、翻訳系においてそれらの濃度が増大すると銀系が阻害される。

２、無細胞翻訳系におけるポリペプチドの合成中に形成される減成生産物−＾Ｄ Ｐ、＾ＭＰ、　ＧＤＰ、リン酸塩およびピロリン酸塩−は、ポリペプチド合成の インヒビターである。

３、最終生産物もまた、合成を阻害し得る。

発明の開示 本発明の目的は、無細胞翻訳系においてポリペプチドを製造する方法であって、 ポリペプチド合成の無細胞系の仕事の延長を図った上で量産的に最終生産物を得 る方法を提供することである。

本目的は、＾ＴＰ、Ｇ丁Ｐおよびアミノ酸を基質として含んでいるリポソームの 無細胞翻訳系において、最終生産物、＾ＨＰ、　ＧＤＰ、ピロリン酸塩および無 機リン酸塩を含んでいる翻訳生産物を生成するポリペプチドの製造方法において 、本発明により、八ＨＰ、ＣＤＰ、ピロリン酸塩、無機リン酸塩および最終生産 物を含んでいる翻訳生産物を、前記系がら取り出し、それと同時にアミノ酸、＾ ＴＰおよびＧＴＰの形態の基質をそれらの初期濃度を維持するために前記系へ送 り出すポリペプチドの製造方法を提供することによって達成された。

内因性および外因性の天然または人工のｓＲＮ＾を含んでいる原核ならびに真核 の無細胞翻訳系が、本発明による無細胞翻訳系として使用される。提案した方法 における、反応混合物中の成分比率、イオンおよび温度の合成条件は、選ばれた 無細胞翻訳系のために最適である。

無細胞翻訳系においてポリペプチドを合成する提案方法は、それとは違って化学 的合成および遺伝子工学的方法の場合に固有のどのような欠点も有しない、この 提案方法は、任意の長さを有しかつアミノ酸の任意の配列を有するポリペプチド の製造のなめに使用され得る。この特徴は、１５〜７０個のアミノ酸基に等しい 長さを有するポリペプチドの製造のために特に重要である。既知方法によるかか るポリペプチドの製造は非常に費用がかかるかまたは実行不可能のいずれかであ る。

提案方法によれば、無細胞翻訳系において、４０時間以上の間、一定の速度でポ リペプチドを合成することが確保される。

かくして製造された最終生産物の量は、ａＲＮ＾１コピー当たりポリペプチド２ ００〜３００コピーである０本発明による反応混合物１リツトルは、５０〜１０ ０時間の間に最終生産物を１００　ｍｇまで与える。これは、ポリペプチドの工 業的製造のための条件を提供する。

図面の説明 本発明を、添付図面と関連してさらに説明する。

第１．２．３および４図は、ｍＲＮ＾１単位当たりの合成ポリペプチド量の合成 時間に対する依存性をグラフにより示す。

第５図は、得られたポリペプチドのそれらの分子量に従った分配を示している５ ＯＳ−尿素ポリアクリルアミドゲルの写真である。

発明の実施態様の好ましい変形 無細胞翻訳系におけるポリペプチド製造方法は簡単であり、次のようにして実現 され得る。

リボゾーム、翻訳ファクター、アミノアシル（ａｍｉｎｏａｃｙｌ　）ｔＲＮ＾ 、ＭＲＮＡ、ならびに＾ＴＰ、　ＣＴＰおよびアミノ酸を含む反応基質を含有し ている原核生物または真植生物の無細胞翻訳系が既知方法によって製造される。

前記無細胞翻訳系は、最終生産物を通過させるのに充分な孔を有する半透膜を備 えた限外濾過のための標準セル内に置かれる０次いで、セル内容物はサーモスタ ットで所望温度まで加熱される。

合成の間に、分解生産物および合成された最終生産物を含んでいる翻訳生産物は 半透膜を通して系から取り出される。同時に、＾ＴＰ、　（：ＴＰおよびアミノ 酸の形態の基質が、それらの初期濃度を維持するために、（別の貯蔵槽から）系 内に供給される。

最終生産物のその後の単離および精製のために、系から取り出された溶液は、最 終生産物に対して親和性を有する免疫吸着剤の充填されたカラム内に供給される ０合成の終了後、最終生産物はカラムから溶出され、脱塩される。

実施例１ 無細胞翻訳系１１は、次の緩衝液、即ちトリス塩酸２０　ｍＭ、ｐＨ７，４、Ｎ ）１．ＣＩ　１００　ｍＭ、　ＭｇＣ１ｚ　１０　ＩＩＮ、　＾ＴＰ　１　ａＭ 、ＣＴＰ　Ｏ，２ｍＭ、ホスホエノールピルビン酸エステル（ｐｈｏｓｐｈｏｅ ｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ）５−１〔３Ｈ〕−ロイシン（比活性、５２　Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅ）　２５１Ｈおよび残り１９種のアミノ酸それぞれ２５　、Ｍを含む緩 衝液中に、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の７０　Ｓリポソーム０．６　ｎｍｏｌｅ、 分画Ｓ　１００（ｂｒａｅｔｉｏｎ　Ｓ　１００）　１　ｗｉｇ、ｔＲＮ＾０． ６　ｍｇ、ファージ（ｐｈａｇｕｅ　）ＭＳ２細胞蛋白質の−ＲＮ＾０．０６　 ｎｍｏｌｅ、ピルビン酸キナーゼ５シロ、ヒト胎盤からのりボヌクレアーゼ　イ ンヒビター　２〜１０■ならびにプロテアーゼ　インヒビター（アプロチニン、 ロイペプチン、キモスタチン）　０．１　ｕｇを含んでいる。

前記無細胞翻訳系を限外−過のためのセル内に置き、３７℃の温度でポリペプチ ドを合成する。最終生産物および分解生産物を含んでいる翻訳生産物を、＾ＴＰ 、　ＧＴＰおよびアミノ酸の形態の基質混合物を２０時間の間反応系へ同時に送 り出しながら、半透膜を通して系から取り出す、その結果として、ファージＮＳ ２細胞の蛋白質が得られる。

全合成期間の間、最終生産物は一定速度で合成される。　ＪＮ＾１単位当たりの 得られた蛋白質の量は、合成時間に依存する。

その依存性は第１図に示されている０合成時間は、横座標軸にプロットされてお り、一方合成生産物の量は、ｍＲＮ＾１単位当たりのピコモル数で、縦座標軸に プロットされている。

その結果として、細胞蛋白質６０００ピコモルが、大腸菌からの無細胞翻訳系の 仕事の時間の間に得られ、これは、ファージＮＳ２細胞のｍＲＮ＾１ピコモル当 たり最終生産物１００ピコモルである。

実施例２ 実施例１に記載した方法によってカルシトニンを製造する。

但し、ファージＮＳ２細胞蛋白質のＭＲＮＡの代わりにカルシトニン−ＲＮ＾０ ．０６　ｎｍｏｌｅを使用する。ペプチド　カルシトニンが合成によって得られ る。全合成期間の間、合成速度は一定のままである。　ｍＲＮ＾１単位当たりの 合成カルシトニンの量の合成時間に対する依存性が第２図に示されている。カル シトニン１８０００ピコモルが大腸菌からの無細胞翻訳系の仕事の間に製造され る。これは、カルシトニン＋ｓＲＮ＾１ピコモル当たり最終生産物３００ピコモ ルである。

実施例３ 無細胞翻訳系１１は、次の組成：　ＨＥＰＥＳ　４０　Ｊ、ｐＨ７，６酢酸カリ ウム（に″ａｃｅｔａｔｅ）　１１２　ｍＭ、酢酸マグネシウム（Ｍｇ’ａｃｅ ｔａｔｅ）　１．９　ｍＭ、スペルミジン０．２５　ｍＭ、ジチオトレイドロー Ｈ、グリセリン１．５パーセント、＾ＴＰ　２　ｍＭ、ＧＴＰ　５０．１４、ク レアチンリン酸８　ｍＭ、〔３Ｈ〕−ロイシン（比活性、５０　Ｃｉ／ｍｍｏｌ ｅ）２５　ｕＭおよび残り１９種のアミノ酸それぞれ２５　、ｓを有するＩｆ衝 液中に、小麦胚芽抽出物０．５　ｍｌ、　ＢＭＶのＭＲＮＡ　Ｏ，１ｎｍｏｌｅ 、クレアチンホスホキナーゼ６４μｇ、ヒト胎盤からのりボヌクレアーゼ　イン ヒビター２〜１０しｇならびにプロテアーゼ　インヒビター（アプロチニン、ペ プスタチン、ロイペプチン）のそれぞれ０．１１ｇを含んでいる。

前記無細胞翻訳系を限外濾過のためのセル内に置き、２５℃の温度でポリペプチ ドを合成する。最終生産物および減成生産物（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｐｒｏ ｄｕｃｔｓ）を含んでいる翻訳生産物を、＾ＴＰ、ＣＴＰおよびアミノ酸の形態 の基質を２０時間の間系内へ同時的に送り出しながら半透膜を通して取り出す、 得られた生産物はＢＮＶウィルス細胞の蛋白質である。系の全仕事時間の間、合 成速度は同じままである。　ｍＲＮ＾１単位当たりの合成蛋白質の量の合成時間 に対する依存性は第３図に示されている。　ＢＭＷウィルス細胞の蛋白質１００ ００ピコモルが無細胞翻訳系の仕事時間の間に製造され、これはＢＭＷウィルス 細胞の−ＲＮ＾１ピコモル当たり最終生産物１００ピコモルである。

実施例４ 実施例３記載の方法によってカルシトニンを製造する。但し、ＢＭＷウィルス細 胞のｍＲＮ＾蛋白質の代わりにカルシトニンｍＲＮ＾０．Ｉ　ｎ＋５ｏｌｅを使 用する。その結果として、ポリペプチドカルシトニンが製造される。翻訳系の全 仕事時間の間、最終生産物は一定速度で合成される。カルシトニンの−ＲＮ＾１ 単位当たりの合成されたカルシトニン量の合成時間に対する依存性を示すグラフ が第４図に示されている。カルシトニン１５０００ピコモルが小麦胚芽の無細胞 翻訳系において合成され、これはカルシトニンのｍＲＮ＾１ピコモル当たり最終 生産物１５０ピコモルである。

合成したポリペプチド（実施例１〜４）の電気泳動分析が第５図に示されている 。ポリペプチドは、ジオマシー　ブリリアント　ブルー（Ｃｅｏｍａｓｓｉｅ　 ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ）　Ｇ−２５０によりゲル内で染色される。

Ａ−ポリペプチドの標準セット〔アマ−ジャム（＾−ｅｒｓｈａ蒙）〕Ｂ−市販 力ルシトニン〔サルモン（Ｓａｌｍｏｎ）カルシトニン、シグマ（Ｓｉｇｍａ） 　） Ｃ−カルシトニン＝（実施例４）下方帯−分子量３４００のカルシトニン；上方 帯−カルシトニンの二量体形Ｅ−ファージＭＳ２細胞の蛋白質（実施例１）Ｆ− カルシトニン（実施例２） 写真は、合成したポリペプチドがそれらの天然類似体に対応する分子量を持って いることを示している。

産業上の利用可能性 本発明に従って製造されたポリペプチドは、医薬、農業およびバイオエレクトロ ニクスにおいて使用することができる。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＡＴＰ、ＧＴＰおよびアミノ酸を基質として含むリボソームの無細胞翻訳系にお いて、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ピロリン酸塩および無機リン酸塩を含む翻訳生産物の形 成を伴うポリペプチドの製造方法において、ＡＴＰおよびＧＴＰの形態で翻訳過 程の間に消費される前記基質を、それらの濃度を初期レベルに維持するために、 前記系に送り出しながら、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ピロリン酸塩、無機リン酸塩および 最終生産物を含む翻訳生産物を前記系から取り出すことを特徴とするポリペプチ ドの製造方法。