WO1988008453A1 - Method of obtaining polypeptides in cell-free translation system - Google Patents

Method of obtaining polypeptides in cell-free translation system Download PDF

Info

Publication number
WO1988008453A1
WO1988008453A1 PCT/SU1988/000078 SU8800078W WO8808453A1 WO 1988008453 A1 WO1988008453 A1 WO 1988008453A1 SU 8800078 W SU8800078 W SU 8800078W WO 8808453 A1 WO8808453 A1 WO 8808453A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
τρanslyatsii
synthesis
ατρ
sisτeme
cell
Prior art date
Application number
PCT/SU1988/000078
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
July Borisovich Alakhov
Vladimir Ivanovich Baranov
Sergei Jurievich Ovodov
Ljubov Anatolievna Ryabova
Alexandr Sergeevich Spirin
Original Assignee
Institut Belka Akademii Nauk Sssr
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Belka Akademii Nauk Sssr filed Critical Institut Belka Akademii Nauk Sssr
Priority to DE8888904712T priority Critical patent/DE3878821D1/de
Priority to JP63504206A priority patent/JPH07110236B2/ja
Priority to AT88904712T priority patent/ATE86306T1/de
Publication of WO1988008453A1 publication Critical patent/WO1988008453A1/ru
Priority to FI886002A priority patent/FI886002A/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • polypeptides are widely used in medicine as a biological regulator in biological processes.
  • immune polypeptides-activators are known, neurotransmitters and neurotransmitters, transmitters, polymeptides are shared.
  • the known use of the epidemics in agriculture is in the form of biostimulants, for example, the area of cultivation.
  • Polypeptides are also used in the bioelectronics industry, for example, in the form of a film with a pharmaceutical syringe.
  • the analysis of the target product for the radioactive label [ ⁇ ° h] - the method included in the policy, is carried out - 3 - me ⁇ d ⁇ m g ⁇ yacheg ⁇ ⁇ sazhdeniya ⁇ li ⁇ e ⁇ ida on ⁇ il ⁇ e b% ⁇ i ⁇ l ⁇ u ⁇ susn ⁇ y ⁇ isl ⁇ y, ⁇ liches ⁇ v ⁇ sin ⁇ ezi ⁇ vann ⁇ g ⁇ tselev ⁇ g ⁇ u ⁇ a for 60-90 minutes the s ⁇ s ⁇ avlyae ⁇ ⁇ 0.58 ⁇ m ⁇ l gl ⁇ bina on I ⁇ m ⁇ l ma ⁇ itsy.
  • the operating system is free of charge, only 1–2 hours.
  • Tight-free broadcast systems contain limited quantities of sources of energy ⁇ and ⁇ , an increase
  • the target product may also be an inhibition of the synthesis.
  • the basic task of the invention is to create such a invention.
  • ⁇ ⁇ aches ⁇ ve bes ⁇ le ⁇ chn ⁇ y sis ⁇ emy ⁇ anslyatsii in ⁇ edla- gaem ⁇ m s ⁇ s ⁇ be m ⁇ gu ⁇ Sy is ⁇ lz ⁇ vany ⁇ a ⁇ i ⁇ iches ⁇ ie or eu ⁇ a ⁇ i ⁇ iches ⁇ ie bes ⁇ le ⁇ chnye sis ⁇ emy ⁇ anslyatsii, s ⁇ de ⁇ 5-containing ⁇ a ⁇ end ⁇ gennye, and ⁇ a ⁇ e ⁇ z ⁇ gennye ⁇ i ⁇ dnye or is ⁇ us s ⁇ venn ⁇ sin ⁇ ezi ⁇ vannye m ⁇ .
  • the proposed method ensures that there is a synthesis of 20 in a free system of broadcasting with a constant speed for 40 hours or more.
  • the best-received product is made up of 200-300 copies of the drug for me.
  • the ballistic-free system of broadcasting is placed in a standard cell for ultrafiltration, equipped with a user-friendly membrane with a diameter suitable for the computer •. 10 places through the membrane of the target product. Further, the compartmentalized cells are heated in the oven before the required temperature. In the process of synthesis from a cell through a fully separable membrane, discharge from the system is carried out, including the products of decay and synthesis.
  • this system supplies the substance in the form of ⁇ , ⁇ , and amino acid to maintain their initial concentration from a separate outlet.
  • I ml of the free transduction system contains 0.6 nm 705 reactance, I mg of fraction with 100.0.6 mg ⁇ , 0.06 nm of protein, 5 mg is neglected, human placenta, at 0.1 micrograms of inhibitors of disease (apinotinin, leu).
  • I ml of the free transplantation system contains 0.5 ml of the extract from wheat breaths, 0.1 nm of the virus ⁇ , 64 mg of the disease, 2–10 mg of the syncrosis
  • the ballistic system of broadcasting is placed in the cell for ultrafiltration and transformed by synthesis at a temperature of 25 ° ⁇ . Broadcasting products, including product targets and decay products. There is a consumer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Figure imgf000003_0001
СП0С0Б ПΟЛУЧΕΗЙЯ ПΟЖШГЩЦΟΒ Β БΕСΚЛΕΤΟЧΗΟЙ СИСΤЖΕ ΤΡΑΗСЛЯЩИ
Οбласτь τеχниκи Ηасτοящее изοбρеτение οτнοсиτся κ мοлеκуляρнοй биοл гии и биοτеχнοлοгии, а именнο κ сποсοбам ποлучения ποли- πеπτидοв в бесκлеτοчнοй сисτеме τρансляции.
Ηазванные ποлиπеπτиды шиροκο исποльзуюτся в медицине в κачесτве биορегуляτοροв биοлοгичесκиχ προцессοв. Ηаπρи меρ, извесτны ποлиπеπτиды-аκτиваτορы иммуннοй сисτемы, π лиπеπτиды-нейροмедиаτορы и τρансмиττеρы, ποлиπеπτиды-ρегу ляτορы сοлевοгο οбмена и дρугие. Извесτнο πρименение ποли πеπτидοв в сельсκοм χοзяйсτве в κачесτве биοсτимуляτοροв, наπρимеρ гορмοны ροсτа. Пοлиπеπτиды πρименяюτся τаκже в биοэлеκτροниκе, наπρимеρ,в κачесτве πленοκ с ροдοπсинοм. Пρедшесτвугащий уροвень τеχниκи
Извесτны два меτοда προизвοдсτва ποлиπеπτидοв: χими чесκий синτез и меτοд геннοй инженеρии.
Μеτοд χимичесκοгο синτеза πшροκο исποльзуеτся πρи π мышленнοм προизвοдсτве ποлиπеπτидοв сρавниτельнο небοльшο длины (дο 15 аминοκислοτныχ οсτаτκοв) и лишь в исκлючиτе ныχ случаяχ для синτеза неκοτορыχ ποлиπеπτидοв бοльшей дл ны (25-30 аминοκислοτныχ οсτаτκοв). Пροизвοдсτвο ποлиπеπ- τидοв бοльшей длины с исποльзοванием эτοгο меτοда πρаκτи- чесκи недοсτуπнο. Эτο связанο с τем, чτο πρи исποльзοвани меτοда χимичесκοгο синτеза с увеличением ποлиπеπτиднοй це πи эκсποненциальнο снижаеτся выχοд целевοгο προρуκτа из-з ρацемизации аминοκислοτныχ οсτаτκοв, неποлнοτы удлинения ποлиπеπτиднοй цеπи, слοжнοсτей выбορа защиτныχ гρуππ и иχ удаления. Βсе эτο πρивοдиτ κ бοлыπим заτρуднениям πρи οчисτκе целевοгο προдуκτа и ρезκοму вοзρасτанию сτοимοсτи ποлиπеπτидοв πο меρе увеличения иχ длины.
Μеτοд геннοй инженеρйи для πρеπаρаτивнοй наρабοτκи ποлиπеπτидοв τаκже οгρаничен в πρименении. Эτο связанο сο слοжнοсτью выделения προρуκτа эκсπρесии τρансφορмиροван- ными κлеτκами, леτальнοсτью неκοτορыχ целевыχ προдуκτοв для κлеτκи-προдуценτа, элиминиροванием τρансφορмиροванныχ πлазмид из κлеτκи, προτеοлиτичесκοй дегρадацией προρуκτа эκсπρессии чужеροднοгο гена. Пοследнее οбсτοяτельсτвο вы- зываеτ οсοбые заτρуднения- πρи выделении мнοгиχ ποлиπеπτи- дοв, οсοбеннο ποлиπеπτидοв длинοй 15-70 аминοκислοτныχ οс - 2 - τаτκοв, κοτορые из-за οτсуτсτвия у ниχ κοмπаκτнοй сτρуκτу- ρы, легκο ποдвеρгаюτся дегρадации внуτρи- и внеκлеτοчными προτеазами. йз вышеизлοженнοгο следуеτ, чτο οπисанные меτοды προи
5 вοдсτва ποлиπеπτидοв πρаκτичесκи не πρименимы для ποлучени ποлиπеπτидοв с длинοй οτ 15 дο 70 аминοκислοτныχ οсτаτκοв. τοяэ.'вρемя извееτнο,чτο.вменнο'τаκую длину имеюτ мнοгие би лοгичесκи аκτивные ποлиπеπτиды, τаκие κаκ πеπτиды-аκτиваτο ρы иммуннοй сисτемы, πеπτиды-нейροмедиаτορы и τρансмиττеρ
10 πеπτиды-аκτиваτορы сοлевοгο οбмена.
Сушесτвуеτ еще οдин меτοд синτеза ποлиπеπτидοв, οснο- ванный на исποльзοвании бесκлеτοчнοй сисτемы τρансляции. насτοящее вρемя ρазρабοτан целый ρяд бесκлеτοчныχ сисτем τρансляции на οснοве κлеτοчныχ эκсτρаκτοв из ρазличныχ
15 προκаρиοτичесκиχ и эуκаρиοτичесκиχ ορганизмοв.
Τаκ, наπρимеρ, извесτен сποсοб ποлучения ποлиπеπτидο κοτορый сοсτοиτ в τοм, чτο в бесκлеτοчнοй сисτеме τρансля ции из заροдшпей πшеницы προвοдяτ синτез ποлиπеπτида глο- бИΗа κρθЛИΚа (Ρгοс . Η"а1; .Αсас_.5сϊ ϋ5Α Уο1.70 1 973 ϋЗΑ) .
20 I мл бесκлеτοчнοй сисτемы τρансляции на ρибοсοмаχ сοдеρжиτ 0,5 мл эκсτρаκτа из заροдышей ншеницы, 0,125 нмο 95 мΡΗΚ глοбина κροлиκа, 8 мΜ κρеаτинφοеφаτа, 40 мκг κρеаτинφοсφοκиназы, 2-10 мκг ρибοнуκлеазнοгο ингибиτορа из πлаценτы челοвеκа, πο 0,1 мκг ингибиτοροв προτеаз (πеπ
25 сτаτина, χимοсτаτина, анτиπаина, леуπеπτина) в буφеρе 20 мΜ ΗΕΡΕз ρΗ 7,6, сοдеρжащем 80 мΜ Κ ацеτаτа, 3,0 мΜβ 2+ ацеτаτа, I мΜ ΑΤΡ, 20 мκΜοΤΡ, 2 мΜ диτиοτ- ρеиτа, 100 мκΚи [ з] -меτиοнина (сπециφичесκая аκτив- нοсτь 89 Κи/ммοл) , 19 οсτальныχ аминοκислοτ πο 20 мκΜ κаж
30 дοй.
Синτез ποлиπеπτида в 'бесκлеτοчнοй сисτеме τρансляции προвοдиτся πρи τемπеρаτуρе 25°С Β προцессе синτеза в сис τеме наκашшваюτся προдуκτы τρансляции, вκлючащие πвлевο προдуκτ и προдеκτы ρасπада в виде ΑΜΡ, ΟБΡ, πиρсφοсφаτа,
35 φοсφаτа, κρеаτина и дρугие, κοτορые являюτся ингибиτορами бесκлеτοчнοй сисτемы τρансляции. Β ρезульτаτе ингибиροва- ния синτез целевοгο προρуκτа πρеκρащаеτся чеρез 60-90 ми- нуτ. Αнализ целевοгο προдуκτа πο ρадиοаκτивнοй меτκе [^°з]- меτиοнина, вκлюченнοй в ποлиπеπτид, οсущесτвляюτ - 3 - меτοдοм гορячегο οсаждения ποлиπеπτида на φильτρе Ъ% τρиχ лορуκсуснοй κислοτοй, Κοличесτвο синτезиροваннοгο целевοг προρуκτа за 60-90 минуτ сοсτавляеτ < 0,58 πмοл глοбина на I πмοл маτρицы.
5 Ρассмοτρенный выше сποсοб ποлучения ποлиπеπτидοв явл еτся οдним из наибοлее эφφеκτивныχ из извесτныχ сποсοбοв , исποльзущиχ бесκлеτοчные сисτемы τρансляции. Οднаκο даже эτи сисτемы οбесπечиваюτ синτез лишь маκсимум οднοй-двуχ κοπий ποлиπеπτида на κοπию мΡΗΚ из-за малοй προдοлжиτель-
Ю нοсτи ρабοτы τаκοй бесκлеτοчнοй сисτемы, всегο 1-2 часа.
Οснοвные πρичины малοй προдοлжиτельнοсτи ρабοτы бесκ леτοчныχ сисτем τρансляции сοсτοяτ в следующем:
1. Бесκлеτοчные сисτемы τρансляции сοдеρжаτ οгρаниче нοе κοличесτвο исτοчниκοв энеρгии ΑΤΡ и οΤΡ, ποвышение
15 сοдеρжания κοτορыχ πρивοдиτ κ ингибиροванию сисτемы τρан- сляции.
2. Цρορуκτы ρасπада, οбρазущиеся πρи синτезе ποли- πеπτида в бесκлеτοчнοй сисτеме τρансляции ΑϋΡ, ΑΜΡ, сл>Ρ, φοсφаτы и πиροφοсφаτы являюτся ингибиτορами синτеза ποли-
20 πеπτидοв.
3. Целевοй προдуκτ τаκже мοжеτ быτь ингибиτοροм син- τеза.
Ρасκρыτие изοбρеτения Β οснοву изοбρеτения ποлοжена задача сοздаτь τаκοй
25 сποсοб ποлучения ποлиπеπτидοв в бесκлеτοчнοй сисτеме τρан- сляции, κοτορый ποзвοлял бы ποлучаτь целевοй προρуκτ в πρе πаρаτивныχ κοличесτваχ за счеτ увеличения προдοлжиτельнοс- τи ρабοτы бесκлеτοчнοй сисτемы синτеза ποлиπеπτидοв,
Эτа задача ρешаеτся τем, чτο πρедлагается τаκοй сπο-
30 сοб" ποлучения ποлиπеπτидοв в бесκлеτοчнοй сисτеме τρансля- ции на ρибοсοмаχ, сοдеρжащей в κачесτве субсτρаτοв ΑΤΡ, ΟΤ и аминοκислοτы, с οбρазοванием в сисτеме προдуκτοв τρансля- ции, вκлючающиχ целевοй προдуκτ, ΑΜΡ, СБΡ, πиροφοсφаτ и неορганичесκий φοсφаτ, в κοτοροм, сοгласнο изοбρеτению, в
35 προцессе τρансляции πο меρе ρасχοдοвания субсτρаτοв с οб- ρазοванием προдуκτοв из сисτемы вывοдяτ προдуκτы τρансляци вκлючающие ΑΜΡ.θϋΡ, πиροφοсφаτ, неορганичесκий φοсφаτ и целевοй προдуκτ, с οднοвρеменным ввοдοм в сисτему субсτρа- τοв в виде аминοκислοτ, ΑΤΡ и οΤΡ дο ποддеρжания иχ исχοд - 4 - нοй κοнценτρации.
Β κачесτве бесκлеτοчнοй сисτемы τρансляции в πρедла- гаемοм сποсοбе мοгуτ Сыь исποльзοваны προκаρиοτичесκие или эуκаρиοτичесκие бесκлеτοчные сисτемы τρансляции, сοдеρ 5 жащие κаκ эндοгенные, τаκ и эκзοгенные πρиροдные или исκус сτвеннο синτезиροванные мΡΗΚ. Β πρедлагаемοм сποсοбе иеποл зуюτ τе сοοτнοшения κοмποненτοв в ρеаκциοннοй смеси, иοнны и τемπеρаτуρные услοвия синτеза, κοτορые являюτся οπτималь ными для выбρаннοй бесκлеτοчнοй сисτемы τρансляции. Ю Пρедлагаемый меτοд синτеза ποлиπеπτидοв в бесκлеτοч- нοй сисτеме τρансляции лишен недοсτаτκοв меτοдοв χимичес- κοгο синτеаа и геннοй инженеρии и мοжеτ быτь исποльзοван для προизвοдсτва ποлиπеπτидοв любοй длины и аминοκислοτ- нοй ποследοваτельнοсτи. Эτο свοйсτвο οсοбеннο важнο для πο 15 лучения ποлиπеπτидοв длинοй 15-70 аминοκислστныχ οсτаτκοв, προмыπшеннοе προизвοдсτвο κοτορыχ дρугими меτοдами в нас- τοящее вρемя недοсτуπнο или являеτся κρайне дοροгοсτοйщим προцессοм.
Цρедлагаемый сποсοб οбесπечиваеτ синτез ποлиπеπτидοв 20 в бесκлеτοчнοй сисτеме τρансляции с ποсτοяннοй сκοροсτью в τечение 40 часοв и бοлее. Κοличесτвο ποлученнοгο целевο гο προдуκτа сοсτавляеτ πρи эτοм 200-300 κοπий ποлиπеπτида на κοπиго мΡΗΚ. С I лиτρа ρеаκциοннοй смеси πρи исποльзοва- нии πρедлагаемοгο сποсοба удаеτся ποлучаτь дο 100 мг целе- 25 вοгο προдуκτа за 50-100 часοв ρабοτы сисτемы. Эτο οτκρы- . ваеτ вοзмοжнοсτи для προмышленнοгο προизвοдсτва ποлиπеπτи- дοв.
Κρаτκοе οπисание чеρτежей Β дальнейшем изοбρеτёние ποясняеτся πρимеρами выποлне 30 ния сο ссылκами на πρилагаемые чеρτежи, на κοτορыχ: φиг.1,2,3,4 изοбρажаюτ гρаφиκ зависимοсτи κοличесτва синτезиρуемοгο ποлиπеπτида на единицу мΡΗΚ οτ вρемени син τеза; φиг.5 πρедсτавляеτ сοбοй φοτοгρаφиюδБδ -мοчевина-πο 35 аκρиламиднοгο геля, на κοτοροм ποκазанο ρасπρеделение ποлу ченныχ ποлиπеπτидοв в сοοτвеτсτвин с иχ мοлеκуляρным весο
Лучший ваρианτ οсущесτвления изοбρеτения Сποсοб ποлучения ποлиπеπτидοв в бесκлеτοчнοй сисτеме - 5 - τρансляции προсτ в τеχнοлοгичесκοм исποлнении и οсущесτв- ляеτся следующим οбρазοм.
Бесκлеτοчную сисτему τρансляции из προκаρиοτ или из эуκаρиοτ, сοдеρжащую ρибοсοмы, φаκτορы τρансляции, аминο-
5 аπил τΡΗΚ, мΡΗΚ, субсτρаτы ρеаκции, вκлючая ΑΤΡ, οΤΡ, ами нοκислοτы, гοτοвяτ извесτными меτοдами.
Бесκлеτοчную сисτему τρансляции ποмещаюτ в сτандаρτ- ную ячейκу для ульτρаφильτρации, снабженную ποлуπροницае- мοй мембρанοй с диамеτροм πορ, дοсτаτοчным для προницае- •. 10 мοсτи чеρез мембρану целевοгο προдуκτа. Далее сοдеρжимοе ячейκи нагρеваюτ в τеρмοсτаτе дο τρебуемοй τемπеρаτуρы. Β προцессе синτеза из ячейκи чеρез ποлуπροницаемуго мембρану προизвοдяτ οτκачивание из сисτемы προ?уκτοв τρан слящи, вκлючая προдуκτы ρасπада и синτезиροванный целе-
15 вοй προρуκτ. Οднοвρеменнο с эτим в сисτему ποдагоτ субсτρа τы в виде ΑΤΡ, οΤΡ и аминοκислοτ для ποддеρжания иχ исχοд нοй κοнценτρации из οτдельнοгο ρезеρвуаρа.
Дзιя дальнейшегο выделения и οчисτκи целевοгο προдуκ- τа ρасτвορ, οτκачиваемый из сисτемы, ποдаюτ на κοлοнκу с
20 иммунοаφφинным сορбенτοм, на κοτοροм προисχοдиτ селеκτив- ная адсορбция целевοгο προдуκτа. Пο οκοнчании синτеза це- левοй προдуκτ смываюτ с κοлοнκи с иммунным сορбенτοм, 'οбе сοливаюτ.
Цρимеρ I.
25 I мл бесκлеτοчнοй сисτемы τρансляции сοдеρжиτ 0,6 нм 705 ρибοсοм Ε.сοϋ , I мг φρаκции з 100,0.6 мг τΡΗΚ, 0,06 нмοл мΡΗΚ белκа οбοлοчκи φагамзг , 5 мκг πиρуваτ κи- назы, 2-10 мκг ρибοнуκлеазнοгο ингибиτορа из πлаценτы че- лοвеκа, πο 0,1 мκг ингибиτοροв προτеаз (аπροτинина, леу-
30 πеπτина, χимοсτаτина), в буφеρе : 20 мΜ τгϊв нσϊ ρΗ 7,4, 100 мΜ ЛΗ4С1 , 10 мΜ ΜеС12, I мΜ ΑΤΡ, 0,2 мΜ СΤΡ, 5 мΜ φοсφοенοлπиρуваτа, 25 мκΜ |_3н] -лейцина (сπециφи- чесκая аκτивнοсτь 52 Κи/ммοл) и πο 25 мκΜ οсτальныχ 19 аминοκислοτ.
35 Бесκлеτοчную сисτему τρансляции ποмещаюτ в ячейκу для ульτρаφильτρации и προвοдяτ синτез ποлиπеπτида πρи τемπеρаτуρе 37°С. Οτбορ προ^уκτοв τρансляции, вκлючающиχ целевοй προдоκτ и προдуκτы ρасπада, οсущесτвляюτ чеρез ποл προницаемую мембρану с οднοвρеменнοй ποдачей в ρеаκциοн- - 6 - ную смесь субсτρаτοв в виде ΑΤΡ, οΤΡ и аминοκислοτ в τе- чение 20 часοв. Β ρезульτаτе ποлучаюτ белοκ οбοлοчκи φа- га Μз2. .,
Β τечение всегο вρемени синτез целевοгο προдуκτа προи
5 χοдиτ с ποеτοяннοй сκοροсτью. Зависимοсτь κοличесτва ποлуч мοгο белκа οбοлοчκи на единицу мΡΗΚ οτ вρемени синτеза πρе сτавлена на φиг.Ι. Пο οси абцисс οτлοженο вρемя синτеза в часаχ, а πο ΌСИ ορдинаτ οτлοженο κοличесτвο οбρазующегοся προдеκτа в πмοл на единицу мΡΗΚ в πмοл.
Ю Β ρезульτаτе за вρемя ρабοτы бесκлеτοчнοϊ сисτемы τρа сляции из Ε.сοϋбылο ποлученο 6000 πмοл белκа οбοлοчκи, чτο- сοсτавилο ΙΟΟπмοл целевοгο προдуκτа на I πмοл мΡΗΚ οбοлοчκи φага Μз2. Ιϊρимеρ 2.
15 Пοлучаюτ κальциτοнин πο меτοдиκе, οπисаннοй в πρимеρе за исκлючением τοгο, "чτο вмесτο мΡΗΚ белκа οбοлοчκи φага Μз2 исποльзуюτ 0,06 нмοл мΡΗΚ κальциτοнина. Β ρезульτаτе ποлучаюτ πеπτид κальциτοнин. Β τечение всегο вρемени син- τез целевοгο προдуκτа προисχοдиτ с ποсτοяннοй сκοροсτью.
20 Зависимοсτь κοличесτва ποлучаемοгο κальциτοнина на единицу мΡΗΚ οτ вρемени синτеза πρедсτавлена на φиг.2. Β ρезульτаτ за вρемя ρабοτы бесκлеτοчнοй сисτемы τρансляции изΕ.сοϋ былο ποлученο 18000 πмοл κальциτοнина, чτο сοсτавляеτ 300 πмοл целевοгο προдуκτа на I πмοл мΡΗΚ κальциτοнина.
25 Цρимеρ 3.
I мл бесκлеτοчнοй сисτемы τρансляции сοдеρжиτ 0,5 мл эκсτρаκτа из заροдышей πшеницы, 0,1 нмοл мΡΗΚ виρуса ΒΜν, 64 мκг κρеаτинφοсφοκиназы, 2-10 мκг ρибοнуκлеазнοгο инги- биτορа из πлаценτы чзлοвеκа, πο 0,1 мκг ингибиτοροв προτеа
30 (аπροτинина, πеπсτаτина, леуπеπτина) в буφеρе : 40 ι/Μ ΗΕΡΕЗ ρΗ 7,6, 112 мΜ Κ* ацеτаτа, 1,9 мΜ Μе 2+ ацеτаτа, 0,25 мΜ сπеρмидина, 6 мΜ диτиοτρеиτа, 1,5$ глицеρина, 2 */Μ ΑΤΡ, 50 мκΜ СΤΡ, 8 ιДО κρеаτинφοсφаτа, 25 мκΜ [%] лейцина (сπециφичесκая аκτивнοсτь 50 Κи/ммοль) и πο 25 мκ
35 οсτальныχ 19 аминοκислοτ.
Бесκлеτοчную сисτему τρансляции ποмещаюτ в ячейκу дл ульτρаφильτρации и προвοдяτ синτез ποлиπеπτидοв πρи τемπе ρаτуρе 25°С. Οτбορ προдуκτοв τρансляции, вκлючащиχ целев προдуκτ и προдуκτы ρасπада.οсущесτвляюτ чеρез ποлуπροница
Figure imgf000009_0001
- 7 - мую мембρану с οднοвρемеκнοй ποдачей субсτρаτοв в вцде Α σΤΡ и аминοκислοτ в τечение 20 часοв. Β ρезульτаτе ποлу чаюτ белοκ οбοлοчκи виρуса ΒΜ ν . Β τечение всегο вρемен синτез целевοгο προдуκτа προисχοдиτ с ποсτοяннοй сκοροсτь Зависимοсτь κοжчесτва ποлучаемοгο белκа οбοлοчκи виρуса Βмν на единиιзу мΡΗΚ οτ вρемени синτеза πρедсτавлена на φиг.З. Β ρезульτаτе, за вρемя ρабοτы бесκлеτοчнοй сисτемы τρансляιщи из заροдышей πшеницы былο ποлученο 10000 πмοл белκа οбοлοчκи виρуса Ε ν , чτο сοсτавилο 100 πмοл целе вοгο προдуκτа на I πмοл мΡΗΚ бе&κаοбοлοчκи виρуса ΕΜν . Пρимеρ 4.
Пοлучаюτ κальциτοшш πο меτοдиκе, οπисаннοй в πρиме- ρе 3, за исκлючением τοгο, чτο вмесτο мΡΗΚ белκа οбοлοчκи виρуса ΕΜν исποльзуюτ 0,1 нмοл мΡΗΚ κальциτοшша. Β ρе зульτаτе ποлучаюτ πеπτид κальциτοнин. Β τечение всегο вρе мени синτез целевοгο προдуκτа προисχοдиτ с ποсτοяннοй сκο ροсτью. Гρаφиκ зависимοсτи κοличесτва ποлучаемοгο κалыщ- τοнина на единицу мΡΗΚ κальциτοнина οτ вρемени синτеза πρедсτавлена на φиг.4. Β ρезульτаτе за вρемя синτеза в бе κлеτοчнοй сисτеме τρансляции из заροдышей πшеницы былο πο лученο 15000 πмοл κальциτοнина, чτο сοсτавилο 150 πмοл це левοгο προдуκτа на I πмοл мΡΗΚ κальциτοнина.
Элеκτροφορеτичесκий анализ ποлученныχ ποлиπеπτидοв (πρимеρы 1-4) πρедсτавлен на φиг.5. Οκρашивание ποжπеπτи дοв в геле προвοдяτ Οοοтаззϊе ЪгШΙаη-Ь Ыие С-250 Α - сτандаρτный набορ ποлиπеπτидοв (Αтегзϊιат) Β - κοммеρчесκий κальциτοнин (Заϊтοη саΙсϊ-ЬοηΙηе, Зϊёт С - белοκ οбοлοчκи виρуса вмν (πρимеρ 3) ; Б - κальциτοнин:(πρимеρ 4) нижняя ποлοса - κальциτοнин с мοлеκуляρным весοм 3400; веρχняя ποлοса - πρимесь димеρ нοй φορмы κальциτοнина; Ε - белοκ οбοлοчκи φага Μ$2 (πρимеρ I) ; ρ - κальциτοнин (πρимеρ 2).
Из πρедсτавленнοй φοτοгρаφии виднο, чτο ποлучаемые ποлиπеπτиды имеюτ мοлеκуляρный вес, сοοτвеτсτвующий иχ πρ ροдным аналοгам.
Пροмышленная πρименимοсτь Пοлучаемые πο πρедлагаемο у сποсοбу ποлиπеπτиды мοιу исποльзοваτься в медицине , οβльсκοм χοзяйсτве , биοэлеκτρο ниκе.

Claims

Figure imgf000010_0001
- 8 - ΦΟΡΜУΙΑ ЙЗΟБΡΕΤΕΗЙЯ Сποсοб ποлучения ποлиπеπτидοв в бесκлеτοчнοй сисτеме τρансляции на ρибοсοмаχ, сοдеρжащей в κачесτве субсτρаτοв ΑΤΡ, ΟΤΡ и аминοκислοτы,с οбρазοванием в сисτеме προдуκ- τοв τρансляции, вκлючагощиχ целевοй προдуκτ, ΑΜΡ,ΟБΡ, ΠИ- ροφοсφаτ и неορганичесκий φοсφаτ, χаρаκτеρизующийся τем, чτο в προцессе τρансляции πο меρе ρасχοдοвания субсτρаτοв с οбρазοванием προдуκτοв из сисτемы вывοдяτ προдеκτы τρан сляции, вκлючаκщие ΑΜΡ, ΟБΡ, πиροφοсφаτ, неορганичесκий φοсφаτ и целевοй προдуκτ, с οднοвρеменным ввοдοм в сисτему субсτρаτοв в виде аминοκислοτ, ΑΤΡ и ΟΤΡ дο ποддеρжания иχ исχοднοй κοнценτρации.
PCT/SU1988/000078 1987-04-29 1988-04-14 Method of obtaining polypeptides in cell-free translation system WO1988008453A1 (en)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE8888904712T DE3878821D1 (de) 1987-04-29 1988-04-14 Verfahren zur herstellung von polypeptiden in zellfreien translationssystemen.
JP63504206A JPH07110236B2 (ja) 1987-04-29 1988-04-14 無細胞翻訳系においてポリペプチドを製造する方法
AT88904712T ATE86306T1 (de) 1987-04-29 1988-04-14 Verfahren zur herstellung von polypeptiden in zellfreien translationssystemen.
FI886002A FI886002A (fi) 1987-04-29 1988-12-28 Foerfarande foer framstaellning av polypeptider i ett cellfritt translationssystem.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU4239148/31 1987-04-29
SU874239148A SU1441787A1 (ru) 1987-04-29 1987-04-29 Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1988008453A1 true WO1988008453A1 (en) 1988-11-03

Family

ID=21301977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/SU1988/000078 WO1988008453A1 (en) 1987-04-29 1988-04-14 Method of obtaining polypeptides in cell-free translation system

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0312617B1 (ru)
JP (1) JPH07110236B2 (ru)
AT (1) ATE86306T1 (ru)
DE (1) DE3878821D1 (ru)
FI (1) FI886002A (ru)
HU (1) HUT54420A (ru)
SU (2) SU1441787A1 (ru)
WO (1) WO1988008453A1 (ru)

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991002074A1 (en) * 1989-07-31 1991-02-21 Institut Belka Akademii Nauk Sssr Method for obtaining polypeptides in a cell-free translation system
WO1991002075A1 (fr) * 1989-07-31 1991-02-21 Institut Belka Akademii Nauk Sssr Procede d'obtention de polypeptides dans un systeme de translation exempt de cellules
WO1991002076A1 (fr) * 1989-07-31 1991-02-21 Institut Belka Akademii Nauk Sssr Procede d'obtention de polypeptides dans un systeme exempt de cellules
EP0646648A1 (en) * 1993-10-04 1995-04-05 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing polypeptide
US5556769A (en) * 1992-09-24 1996-09-17 Wu; Ying Coupled replication-translation methods and kits for protein synthesis
WO1999020749A1 (en) 1997-10-20 1999-04-29 Medical Research Council Method to screen phage display libraries with different ligands
WO2003035679A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Medical Research Council Molecules
WO2008063933A2 (en) 2006-11-10 2008-05-29 Massachusetts Institute Of Technology Pak modulators
US7459290B1 (en) 2004-03-30 2008-12-02 Iowa State University Research Foundation, Inc. Methods of using functional 30S subunits
US7615344B2 (en) 2003-05-22 2009-11-10 Riken Process for producing extract for cell-free protein synthesis and cell extract produced thereby
EP2116618A1 (en) 2008-05-09 2009-11-11 Agency for Science, Technology And Research Diagnosis and treatment of Kawasaki disease
EP2364999A2 (en) 2001-06-28 2011-09-14 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
EP2371390A2 (en) 2004-10-08 2011-10-05 Domantis Limited Antagonists and methods of use therefor
EP2420251A2 (en) 2004-11-10 2012-02-22 Domantis Limited Ligands that enhance endogenous compounds
US8226976B2 (en) 2007-11-05 2012-07-24 Riken Method of using cell-free protein synthesis to produce a membrane protein
EP2481424A1 (en) 2005-03-19 2012-08-01 Medical Research Council Improvements in or relating to treatment and prevention of hepatitis C viral infections
EP2559704A1 (en) 2007-02-08 2013-02-20 Domantis Limited Antibody single variable domains against serum albumin
US8445232B2 (en) 2004-11-17 2013-05-21 Riken Cell-free system for synthesis of proteins derived from cultured mammalian cells
US8603774B2 (en) 2002-11-28 2013-12-10 National Food Research Institute Extract of E. coli cells having mutation in ribosomal protein S12, and method for producing protein in cell-free system using the extract
US8664355B2 (en) 2004-11-19 2014-03-04 Riken Cell-free protein synthesis method with the use of linear template DNA and cell extract therefor
EP2865754A1 (en) 1999-06-14 2015-04-29 BP Corporation North America Inc. Synthetic ligation reassembly in directed evolution
WO2020159445A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Agency For Science, Technology And Research Cnx/erp57 inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer
US11618777B2 (en) 2015-07-31 2023-04-04 Shigeyuki Yokoyama Method of manufacturing membrane protein and utilization thereof

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4124132A1 (de) * 1990-08-07 1992-02-13 Bendzko Peter Verfahren zur herstellung von peptiden und polypeptiden in einem zellfreien translationssystem
RU2169154C2 (ru) 1999-03-25 2001-06-20 Институт белка РАН Способ получения полипептидов в бесклеточной системе
DE10011209A1 (de) 2000-03-08 2001-09-13 Roche Diagnostics Gmbh Matrix-Reaktor und Verfahren zur Herstellung von Produkten in diesem Reaktor
JP4061043B2 (ja) 2000-12-28 2008-03-12 株式会社ポストゲノム研究所 ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系によるペプチド等の製造方法
DE10137792A1 (de) 2001-08-06 2003-02-27 Erdmann Volker Verfahren zur Genexpression
DE50312184D1 (de) 2002-03-01 2010-01-14 Volker A Erdmann Streptavidin-bindungspeptid
WO2005075660A1 (ja) * 2004-02-03 2005-08-18 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha 改良された無細胞タンパク質合成用組成物
DE102004032460B3 (de) * 2004-06-30 2005-08-18 Rina-Netzwerk Rna Technologien Gmbh Verfahren zur präparativen in vitro Proteinbiosynthese
JP2008029204A (ja) * 2004-11-12 2008-02-14 Cellfree Sciences Co Ltd 無細胞タンパク質合成方法
EP4001415A4 (en) 2019-07-19 2023-09-27 Taiyo Nippon Sanso Corporation PROTEIN PRODUCTION METHOD AND CELL-FREE PROTEIN SYNTHESIS KIT
RU199182U1 (ru) * 2019-12-10 2020-08-19 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук (ИБ РАН) Устройство для синтеза белков в бесклеточной системе

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0152483A1 (en) * 1983-08-22 1985-08-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing peptide

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5748958A (en) * 1980-09-08 1982-03-20 Nippon Chemiphar Co Ltd Cyclohexanecarboxylic acid esters and their acid addition salts
JPH0636746B2 (ja) * 1985-08-24 1994-05-18 味の素株式会社 Ｌ―グルタミン酸の製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0152483A1 (en) * 1983-08-22 1985-08-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing peptide

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biopolimery i Kletka, Vol. 4, Nr. 3, May-June 1988, (Naukova Dumka, Kiev), A.P. POTAPOV et al. "Sravniteloe Izuchenie Matrichnoi Aktivnosti Polya (U) i Polya (dT) v Besckletochnykh Beloksintezi-Ruyuschikh Sistemakh iz Escherichia Coli i Zarodyshei Pshenitsy" see pages 133-138 *
European Journal of Biochemistry, Vol. 93, Nr. 1, January 1979, (published by Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York), WARWICK BOTTOMLEY et al. "Cell-Free Transcription and Translation of Total Spinach Chloroplast DNA" see pages 31-39 *
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 82, Nr. 15, August 1985 (Washington) K.E. ROGERS et al. "Olfactory Neuronspecific Protein is Translated from a Large Poly (A)+ mRNA, see pages 5218-5222 *
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 82, Nr. 6, March 1985 (Washington) M. CLELIA GANOZA et al. "Isolation and Point of Action of a Factor from Escherichia Coli Reguired to Reconstruct Translation", see pages 1648-1652 *
See also references of EP0312617A4 *

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991002075A1 (fr) * 1989-07-31 1991-02-21 Institut Belka Akademii Nauk Sssr Procede d'obtention de polypeptides dans un systeme de translation exempt de cellules
WO1991002076A1 (fr) * 1989-07-31 1991-02-21 Institut Belka Akademii Nauk Sssr Procede d'obtention de polypeptides dans un systeme exempt de cellules
WO1991002074A1 (en) * 1989-07-31 1991-02-21 Institut Belka Akademii Nauk Sssr Method for obtaining polypeptides in a cell-free translation system
US5556769A (en) * 1992-09-24 1996-09-17 Wu; Ying Coupled replication-translation methods and kits for protein synthesis
EP0646648A1 (en) * 1993-10-04 1995-04-05 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing polypeptide
US5643744A (en) * 1993-10-04 1997-07-01 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing polypeptide
EP2230335A2 (en) 1997-10-20 2010-09-22 Domantis Limited Method to screen phage display libraries with different ligands
WO1999020749A1 (en) 1997-10-20 1999-04-29 Medical Research Council Method to screen phage display libraries with different ligands
US6696245B2 (en) 1997-10-20 2004-02-24 Domantis Limited Methods for selecting functional polypeptides
EP2308973A1 (en) 1997-10-20 2011-04-13 Domantis Limited Method to screen phage display libraries with different ligands
EP2865754A1 (en) 1999-06-14 2015-04-29 BP Corporation North America Inc. Synthetic ligation reassembly in directed evolution
EP2364999A2 (en) 2001-06-28 2011-09-14 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
WO2003035679A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Medical Research Council Molecules
US8603774B2 (en) 2002-11-28 2013-12-10 National Food Research Institute Extract of E. coli cells having mutation in ribosomal protein S12, and method for producing protein in cell-free system using the extract
US7615344B2 (en) 2003-05-22 2009-11-10 Riken Process for producing extract for cell-free protein synthesis and cell extract produced thereby
US7459290B1 (en) 2004-03-30 2008-12-02 Iowa State University Research Foundation, Inc. Methods of using functional 30S subunits
EP2371390A2 (en) 2004-10-08 2011-10-05 Domantis Limited Antagonists and methods of use therefor
EP2420251A2 (en) 2004-11-10 2012-02-22 Domantis Limited Ligands that enhance endogenous compounds
US8445232B2 (en) 2004-11-17 2013-05-21 Riken Cell-free system for synthesis of proteins derived from cultured mammalian cells
US8664355B2 (en) 2004-11-19 2014-03-04 Riken Cell-free protein synthesis method with the use of linear template DNA and cell extract therefor
EP2481424A1 (en) 2005-03-19 2012-08-01 Medical Research Council Improvements in or relating to treatment and prevention of hepatitis C viral infections
WO2008063933A2 (en) 2006-11-10 2008-05-29 Massachusetts Institute Of Technology Pak modulators
EP2559704A1 (en) 2007-02-08 2013-02-20 Domantis Limited Antibody single variable domains against serum albumin
EP2559702A1 (en) 2007-02-08 2013-02-20 Domantis Limited Antibody single variable domains against serum albumin
EP2559703A1 (en) 2007-02-08 2013-02-20 Domantis Limited Antibody single variable domains against serum albumin
US8226976B2 (en) 2007-11-05 2012-07-24 Riken Method of using cell-free protein synthesis to produce a membrane protein
EP2116618A1 (en) 2008-05-09 2009-11-11 Agency for Science, Technology And Research Diagnosis and treatment of Kawasaki disease
US11618777B2 (en) 2015-07-31 2023-04-04 Shigeyuki Yokoyama Method of manufacturing membrane protein and utilization thereof
WO2020159445A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Agency For Science, Technology And Research Cnx/erp57 inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
JPH07110236B2 (ja) 1995-11-29
FI886002A (fi) 1988-12-28
HUT54420A (en) 1991-02-28
SU1441787A1 (ru) 1990-09-23
DE3878821D1 (de) 1993-04-08
SU1618761A1 (ru) 1991-01-07
EP0312617A1 (de) 1989-04-26
EP0312617A4 (de) 1990-07-03
JPH01503119A (ja) 1989-10-26
ATE86306T1 (de) 1993-03-15
EP0312617B1 (de) 1993-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1988008453A1 (en) Method of obtaining polypeptides in cell-free translation system
Wisseman Jr et al. Mode of action of chloramphenicol I: action of chloramphenicol on assimilation of ammonia and on synthesis of proteins and nucleic acids in Escherichia coli
Reed From lipoic acid to multi-enzyme complexes.
SU1329604A3 (ru) Способ получени конъюгированного соединени ,специфичного по отношению к клеткам меланомы
EP0593757A4 (en) PROCESS FOR OBTAINING POLYPEPTIDES IN A CELL-FREE SYSTEM.
CN107501405B (zh) 一种细胞自噬抑制多肽
JPH09509311A (ja) 単離ｐ２７タンパク質及びそれをコードする核酸分子
WO1990007003A1 (en) Method for preparative expression of genes in a cell-free system of conjugated transcription/translation
EP0172577A1 (en) A superoxide dismutase, its production and pharmaceutical compositions containing it
CN116554331B (zh) 一种抗人cd15工程抗体及应用
Cormont et al. Rab4 is phosphorylated by the insulin‐activated extracellular‐signal‐regulated kinase ERK1
CN114621327B (zh) GLP-1、GIP和Gcg多重受体激动蛋白质
SU871721A3 (ru) Способ получени биологически активного вещества,обладающего способностью усиливать секрецию инсулина и улучшать глюкозную толерантность
Johal et al. Crystalline ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase-oxygenase from spinach
GANOZA et al. Stimulation of peptidyltransferase reactions by a soluble protein
WO1991002075A1 (fr) Procede d&#39;obtention de polypeptides dans un systeme de translation exempt de cellules
Franzl et al. Bacterial enzyme preparations oxidizing inositol and their inhibition by colchicine
Wang et al. Geometric isomers of covalently labeled mitochondrial F1-adenosinetriphosphatase with different properties
Smit et al. Activation of the genome of alfalfa mosaic virus is enhanced by the presence of the coat protein on all three genome parts
US20080194540A1 (en) Use of a Tricyclic Antidepressant Drug For Promoting Endocytosis
Stanbury et al. Preparation and properties of thyroid cell membranes
Mukerjee et al. Transfer RNA species in tumors of different growth rates
WO1996009832A1 (fr) Hybride d&#39;adn-arn et preparation d&#39;adn, procedes d&#39;obtention dudit hybride et de ladite preparation a partir de laitance d&#39;esturgeon, et compose pharmaceutique a base dudit hybride d&#39;adn-arn
US2554242A (en) Process for preparing pure autolytic tuberculin
CN115521360A (zh) 特异性结合Sestrin2蛋白的多肽及其在消化道癌治疗中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BG FI HU JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1988904712

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 886002

Country of ref document: FI

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1988904712

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1988904712

Country of ref document: EP