JPH0141160B2

JPH0141160B2 -

Info

Publication number: JPH0141160B2
Application number: JP61134799A
Authority: JP
Inventors: Junichi Tamura; Hiroaki Takagi
Original assignee: Higeta Shoyu Co Ltd
Current assignee: Higeta Shoyu Co Ltd
Priority date: 1986-06-12
Filing date: 1986-06-12
Publication date: 1989-09-04
Also published as: DE3704419A1; US4837313A; FR2600080A1; GB8702620D0; JPS62294093A; GB2191497B; FR2600080B1; GB2191497A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は懸濁微細物の凝集にきわめて有用な凝
集活性物質PF―102及びその塩に関するものであ
る。従来、凝集活性を有する物質としては塩化第二
鉄等の無機物からポリアクリルアミド系凝集剤の
如き高分子合成品迄、その使用目的に応じ各種の
凝集剤が知られている。しかし、これらの凝集剤
は各々各種の欠点を有している。例えばポリアク
リルアミド系凝集剤の場合、アクリルアミドモノ
マーは強い毒性があることから、その製造プロセ
ス上安全性に問題があるばかりでなく、凝集剤製
品へのモノマーの混入も皆無でないこと等安全性
に不安があり、また塩化第二鉄等を活性汚泥の凝
集剤として使用した場合、出来た汚泥を処理する
際に凝集剤の故に肥料としての利用性も制限さ
れ、燃焼処理にも有害であり、更に廃棄に際して
も残留公害の問題がある。またポリアクリル酸ソ
ーダはアニオン性凝集剤であるためにその適応範
囲は狭く、例えば微生物の凝集などには使用出来
ない欠点がある。また天燃高分子凝集剤としてキトサン、グアー
ガム、アルギン酸ソーダ、CMC等が知られてい
るが、これら天然高分子凝集剤は、毒性や廃棄公
害等の問題はないものの、凝集能が低いという欠
点がある。一方、凝集剤の需要は年々増大しており、適用
範囲の広いもの、特に、被凝集物に対する適用範
囲ばかりでなく、凝集反応を起させる条件、即ち
温度・PH・妨害物質の存在等に対して適用範囲が
広く、且つ安全性や廃棄公害等に問題がない凝集
剤が強く要望されている。先に、本発明者らは、上記の条件に適合する凝
集活性物質を得るため、各種微生物を検策した結
果、和歌山県の腐植層から分離した不完全菌―
１菌が培養濾液に凝集活性物質を蓄積することを
見出し、この物質が従来全く知られていない新規
物質であることを確認し、この物質に凝集活性物
質PF―101と命名し、先の発明をなすに至つた。（特公昭56―12639）しかしながら、この凝集活性物質PF―101（以
下、PF―101という）は、培養液にエタノールを
加え沈澱した画分を熱水に溶かし、セフアロース
6Bに吸着させ、マレート・バツフアーで溶出し
て得たもので、精製法が複雑で、しかも、収率も
非常に悪く、その上種々溶媒に対する溶解性が悪
く、その取扱いは極めて不便なものであつた。本発明者は、培養液からの凝集活性物質の精製
法を鋭意研究した結果、培養液に塩類を添加する
等のことにより凝集活性物質を析出させることが
出来ることを見い出し発明を完成するに至つた。本方法により簡便でしかも非常に収率よく凝集
活性物質を得ることが出来るようになつた。しか
も、塩類添加等により析出させたものは常温で酸
水溶液に溶解する物質に変化していることを知つ
た。また、この酸水溶液溶解性の析出物について
精製をくりかえし、ほぼ純品と認められる物質に
ついて理化学的性質を詳細に検討したところ、
PF―101とはかなり異なつており、新規物質と認
めるに到り、この物質をPF―102と命名した。本発明はPF―102及びその塩に関するものであ
る。本発明のPF―102はほとんどすべての酸水溶液
に溶解し塩酸を形成する。PF―102を単離するこ
とは可能であるが、水溶液に難溶である為、取扱
いがきわめて困難となるので、理化学的性質のう
ち、凝集活性、凝集活性PH範囲、凝集活性温度範
囲、紫外吸収スペクトル、呈色反応の測定には
PF―102の塩酸塩を用いた。本発明のPF―102は次の理化学的性質を有して
いる。 (1) 凝集活性；きわめて微量で懸濁微細物を凝集
する。 (2) 凝集活性PH範囲；PH２〜９で安定に凝集活性
を示す。 (3) 凝集活性温度範囲；０〜100℃で凝集活性が
認められる。 (4) 凝集活性イオン強度；炭酸およびFe₂（SO₄）₃
により凝集活性が阻害されるがそれ以外の各種
イオン及びイオン強度によつて凝集活性に影響
はなく、NaCl、K₂SO₄で1Mまで全く影響を与
えない。 (5) 元素分析；窒素8.64％、炭素42.80％、水素
6.87％一般式：（C₆H₁₁NO₄・xH₂O）_o (6) 紫外吸収スペクトル；第１図に示すとおり。 (7) 赤外吸収スペクトル；第２図に示すとおり。 (8) 呈色反応；ニンヒドリン反応＋キサントプロテイン反応 − エーリツヒ反応 − モリツシユ反応 − フエノール硫酸法 ± レローゼンテスト − (9) 電気泳動；密度勾配等電点電気泳動により単
一物質として確認され、等電点（pI）は8.5で
ある。 (10) 物質の色；淡黄色 (11) 塩基性、酸性、中性の区別 0.5％ｗ／ｖで水に懸濁した場合のPHは7.5
（脱イオン水のPH5.8）である。 (12) 溶剤に対する溶解性・熱水に難溶・冷水に難溶・希酸に易溶・希アルカリに難溶・アルコール類、アセトン、クロロホルム、
ベンゼン、ｎ―ペンタンに不溶。 (13) 平均分子量 16万以上本発明のPF―102の酸塩としては、燐酸塩、塩
酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩などが好まし
い。 PF―102の燐酸塩、塩酸塩、酢酸塩、乳酸塩及
びクエン酸塩の各赤外吸収スペクトルは、第３
図、第４図、第５図、第６図及び第７図に示され
る。本発明のPF―102は酸塩において、強力な凝集
活性を有するので、凝集剤としてすぐれ、また、
きわめて純粋に精製された多糖類の一種として医
薬、農薬等の生体内活性物質として大きく期待さ
れるものである。本発明の凝集活性物質PF―102は、例えば本発
明者らが和歌山県の腐植層より分離した不完全菌
―１菌によつて生産される。不完全菌―１菌
はペエシロマイセス属（Paecilomyces）に属す
ものと認められ、ペエシロマイセス―１と命名
され、該菌株は微工研にFERM Ｐ―3928
（FERM BP―1180）として寄託されている。次にペエシロマイセス―１（Paecilomyces
―１）の菌学的性質を示す。〔ａ〕顕微鏡下での観察本菌は分生胞子柄（conidiophore）を欠き、分
生胞子は栄養菌糸または栄養菌糸束から直接生え
ている一本一本独立したフイアライド
（Phialide）の先端に長い連鎖をなして派生して
いる。フイアライドは半透明で20〜45μの長さを
持ち、基部はやや太く（1.0〜1.5μ）先端はやや
先細り（0.5〜1.0μ）で、直線的あるいは先端部
がやや湾曲したものもある。分生胞子は電子顕微
鏡により葉巻タバコ型（あるいは桿菌型）であ
り、そのサイズは４〜６×1.0〜1.4μである。分生胞子は普通25〜35個の連鎖をなしている
が、まれにはもつと長鎖のものも観察される。こ
の分生胞子の連鎖は非常にもろく、一寸したシヨ
ツクで簡単にくずれる。〔ｂ〕各培地における生育状態（25℃平面培
養） (1) ツアペツク寒天培地コロニーの生育は良く14日目で直径約45mmに達
する。白色のビロード状から羊毛状の菌叢で、中
央部に房状に盛上りがあり、コロニー周辺は円形
である。水滴・シワ共になし。コロニー裏面は培
養初期白色、培養後期中央部が淡黄色を呈する。
寒天への色素産生は認められない。 (2) 麦芽寒天培地コロニーの生育は良く、14日目で直径約54mm、
コロニー周辺は円形にならず梅鉢状を呈する。菌叢の中央部は白色だが、周辺部は淡黄色を呈
する。菌叢の厚さは中程度で、中央部はやや凹状
である。水滴、シワ共に認められず、コロニー裏
面は全面淡黄色を呈す。寒天培地に淡黄色色素の
産生あり。 (3) ポテトデキストロース寒天培地コロニーの生育は非常に良く14日目に直径約60
mmに達する。白色のビロード状乃至羊毛状の可成
り厚い菌叢を形成し、中央部はやや盛上り、亜中
央部は淡い黄色を呈するやや薄い菌叢、その周辺
部は白色の比較的厚い菌叢となる。表面にシワは
ないが数個のうすい褐色の水滴が認められる。コ
ロニー裏面に放射状の数本のシワがあり、同心円
状の黄色の濃淡が認められる。寒天への淡黄色色
素の拡散がある。 (4) YpSs寒天培地（組成スターチ1.5％、イース
トエキス0.4％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄、0.05
％、寒天２％）コロニーの生育は良好で14日目に直径約50mmに
達する。白色の全体にふつくらとした羊毛状の厚
い菌叢である。水滴・シワなし。コロニー裏面は
特記すべき特徴なし。色素産生なし。 (5) MY₂₀寒天培地（組成グルコース20％、ポリ
ペプトン0.5％、イーストエキス0.3％、モルト
エキス0.3％、寒天２％）コロニーの生育はあまり良くなく14日目で直径
約30mmである。気菌糸はあまりたたず細かいシワ
が多く、周辺部は淡黄色、中央部は淡褐色を呈す
る。コロニーの裏面は淡黄色で、細かいシワがあ
る。色素産生なし。以上の形態的特徴及び培養上の性質から本菌は
モノフイアライド（monophialide）の不完全菌
と考えられオニオンとバロン共著の
monophialidicspecies of Paecilomyces（Agnes.
H.S.Onions and G.L.Barron；1967，
Mycological papers No.107，Common Wealth
Mycological Institute、Kew、England）に記
載されているペエシロマイセスバシリスポラス
（Paecilomyces bacillisporus）の特徴に類似し
ている点が多い。即ち不完全菌の分類上最も重要な特徴とされる
分生胞子の形態はP.bacillisporusの分生胞子の形
態に極めて似ており、フイアライドの形態なども
良く似ている。しかし、一方各種の培地での培養
上の特徴については多少の差違が認められ、上記
文献の記載のP.bacillisporusは生育速度が本菌に
比較して遅く、菌糸は初期白色、培養後期に桃色
がかる（pinkish）と記述されているが、本菌で
は初期白色、培地によつては後期淡黄色を呈する
点で異なる。しかし前述文献にもP.bacillisporus
の菌株には培養上の特徴や分生胞子の大きさにお
いて変動がある。（Strains of P.bacillisporus
show variation in culturalcharacteristics and
in spore size）と記述されていることを考慮す
ると、本菌はPaecilomycesbacillisporusかその
類縁菌と考えられるが決定的根拠がないのでペエ
シロマイセス―１とした。不完全菌の分類上の指標としてはあまり重要視
されない性質であるが、次に本菌の生理学的性質
について示す。〔ｃ〕生理的性質 (1) 炭素源の利用性ツアペツク培地を基本培地としてその蔗糖の代
りに各種の炭素源を加えて、生育度をみた結果、
可溶性澱粉、グリコーゲン、トレハロース、ラフ
イノース、セロビオース、マルトース、蔗糖、グ
ルコース、フラクトース、ガラクトース、マンノ
ース、イノシトール、ソルビトール、グリセリン
を非常に良く利用する。次にイヌリン、ラクトース、アラビノース、リ
ボース、マニトール、乳酸、コハク酸は可成り良
く利用出来た。キシロース、ラムノース、クエン
酸の利用性は低く、酒石酸、シユウ酸は全く利用
出来ない。 (2) 窒素源の利用性ツアペツク培地を基本培地としてその窒素源を
色々変えて生育度をみた結果、アンモニア態、ア
ミノ態、硝酸態のいずれの窒素をも良く利用出来
る。 (3) 生育温度最適生育温度は23〜25℃であり、30℃では生育
がみられるが、35℃では生育出来ない。 (4) 生育PH G.Ye培地（組成グルコース２％、酵母エキス
0.2％）でPH２〜10の範囲で生育をみたところ、
いずれのPHでも良く生育した。ペーシロマイセス―１は通常の糸状菌の液体
培養方法で培養することができる。ペーシロマイセス―１の胞子または菌糸を液
体培地に接種し、好気的に培養する。炭素源とし
てはブドウ糖、麦芽糖、蔗糖、澱粉、廃糖蜜等を
使用することが出来るが好ましくはブドウ糖を用
いるのが良い。窒素源としては硫酸アンモニウ
ム、硝酸ソーダなどの無機窒素、ペプトン、酵母
エキスなどの有機窒素が使用出来る。培養温度は本凝集活性物質生産菌が凝集活性物
質を生産する範囲内で適宜変更し得るが通常は20
〜25℃で培養することが好ましい。培養時間は培
養条件によつて異なるが、通常４〜５日程度であ
り、凝集活性物質が最高に達する時間を見積つて
適当な時間に終了すればよい。ここで培養濾液を
減圧濃縮、限外濾過等の方法で濃縮して濃縮液と
してエタノール等の有機溶媒を加えて沈澱すれ
ば、特公昭56―12639号公報に記載のPF―101が
得られるのである。本発明においては、培養濾液または濾液濃縮液
に各種塩を添加し、沈澱が生じない場合は必要に
よつてはアルカリを添加してPHを７〜９として、
析出させ、析出物を分離し、水洗し、これを希酸
水溶液に溶解し、再び塩を添加するか、アルカリ
等の添加によつてPHを７〜９として、析出させ
て、高度に精製されたPF―102を得ることができ
る。 PF―102の含有液に添加される塩としては、次
の例示の塩を含めて塩の１又は２以上である。即ち、塩化カリ、塩化ナトリウム、塩化カルシ
ウム、塩化アンモニアなどの塩酸塩、硝酸カリ、
硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、酢酸ソーダなどの
酢酸塩、硫酸２カリ、硫安、硫酸カルシウム、硫
酸銅などの硫酸塩、リン酸２カリ、リン酸１カ
リ、リン酸２ソーダ、リン酸１ソーダなどのリン
酸塩などが例示される。添加する塩は溶解した状態であれば、どれだけ
でもよいが、好ましいのはPF―102含有液に対し
0.5〜50％、より好ましくは２〜40％程度である。添加する塩の種類によつてはPHが７以上になる
ので、この場合はPHの調整を行なうことなく、
PF―102が析出するので、析出物を分離すればよ
い。塩を添加しても析出を生じない場合はカセイソ
ーダ等のアルカリを用いて、PHを７〜９、好まし
くは等電点である8.5附近にPH調整を行えばよい。 PF―102含有液に塩の添加と場合によつてPH７
〜９の調整を行えば、夾雑物の妨害によつて容易
に析出しなかつたPF―102が析出を起し、夾雑物
とは分離して析出する。この析出物は遠心分離又
は濾布による濾過によつて分離できる。培養液をPH8.5の等電点処理をしてもPF―102
の析出は全く起らなかつたことからみれば、塩の
添加だけでPF―102の析出が完全に起るというこ
とはきわめて意外なことである。分離した析出物は多量の塩を含んでいるので、
これを水や溶媒で洗滌して脱塩し、酸に溶解す
る。酸としては酢酸などの有機酸、塩酸などの無機
酸などいずれの酸でもよく、また、濃度としては
0.01〜３モル程度のものがよい。析出物を酸に溶解した後は、PH７〜９の等電点
附近の処理のみで容易に析出するようになつてい
るので、カセイソーダ等のアルカリを添加し、PH
７〜９、好ましくはPH8.5とPH調整し、析出物を
得る。更に、精製するためには、この析出物を水等で
洗滌し、再び酸に溶解し、PH７〜９のPH調整を行
い、析出物を得ることができる。この精製処理は何度でも行なうことができ、精
製が完了した時点で、析出物はほぼ純粋となり、
PF―102が得られるのである。次に本発明の試験例及び実施例を示す。試験例グルコース 3 ％ポリペプトン 0.3％ CaCl₂ 0.5％ PH 7 上記培地を用いて、Paecilomyces sp ―
１、FERM Ｐ―3928（FERM BP―1180）を培
養し、培養濾液20を得た。これを、55〜60℃に
加熱しながら、限界分子量16万のUF膜にて低分
子物質の除去と濃縮を行い、液量10を得た。この清澄濃縮培養濾過液を100mlづつ24本用意
し、これに表１の塩を添加し、表１のPH調整を行
い、析出物の量を測定した。得られた結果は表１
に示される。表中の回収率＝析出物の乾燥重量／培養液中のガラク
トサミン量をインドール塩酸法で測定し、総量を算出×
100 で表示した。

【表】

【表】実施例１グルコース600ｇ、ポリペプトン60ｇ、
CaCl₂・2H₂O125ｇを水道水17に溶解し、濃
NaOH溶液でPH7.0に調整した後30容ジヤーフ
アーメンターに移した。この培地溶液に蒸気を注入することにより加
圧、加熱滅菌（121℃、20分間）を行つた。冷却
後の培地（最終液量20）に、500ml三角フラス
コに150ml同組成の培地（グルコース３％、ポリ
ペプトン0.3％、CaCl₂0.5％、PH7.0）で26℃、４
日間振盪培養したペエシロマイセス―１
FERM Ｐ―3928（FERM BP―1180）を容量比
で約10％無菌的に接種した。接種後27℃、通気量
0.5VVM、撹拌数200RPMの条件で５日間培養し
た。培養終了後培養物を濾布濾過することにより培
養濾液17を得た。この培養濾液を50℃〜60℃に
加熱しながら分画分子量16万の限外濾過膜（三菱
レイヨン・エンジニアリング社製UF膜チユーブ
ラーモジユールＦタイプ）を通過させることによ
り、低分子画分を除き液量が約３になる迄濃縮
した。更に、約14000×Ｇで遠心分離することに
より菌体残渣、熱変性蛋白質を除去した。遠心分離後に上澄液画分３に食塩約750ｇ
（約25％濃度）を加え撹拌し、溶解後、濃NaOH
でPHを7.0〜8.5に調整した。一夜放置し塩析物を
十分析出させた後、サラン製の布（塩化ビニリデ
ンと塩化ビニールの共重合体）上に塩析物を回収
した。更にこの塩析物の上から大量の微アルカリ
性の水（PH7.0以上）を撒布することにより余分
の食塩及び培養液に同時に混在している中性糖、
その他の夾雑物を洗い流した。次に、水洗後の塩析物に0.1M塩酸溶液を容量
比で約３倍量加え溶解した。この溶解物に濃
NaOH溶液を加えポリガラクトサミンの等電点
であるPH8.5に合せた。一夜放置し十分析出物を
析出させた後、上記と同様サラン製の布上に析出
物を回収し、大量の水道水で洗つた。この水洗物
をもう１度0.1M塩酸に溶解後、等電点沈澱を行
い水洗を繰返すことにより精製した。この精製した析出物を121℃、15分間滅菌後、
凍結乾燥することにより、ポリガラクトサミンを
主成分とするPF―102の精製粉末（ポリガラクト
サミンとしての純度約99％）を７ｇ得た。また、用途により上記精製粉末の１部を0.1M
塩酸に溶解し分画分子量30万の限外濾過膜（アミ
コン社製分子篩膜タイプXM300）で分画し、平
均分子量16〜30万のものと平均分子量30万以上の
ものに分画することもできる。

【図面の簡単な説明】

第１図はPF―102の塩酸塩の紫外吸収スペクト
ルを示す図、第２図はPF―102赤外吸収スペクト
ルを示す図である。第３図はその燐酸塩の赤外吸
収スペクトル、以下同様に、第４図は塩酸塩、第
５図は酢酸塩、第６図は乳酸塩、第７図はクエン
酸塩の赤外吸収スペクトルを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有するPF―102及びそ
の塩。 (1) 凝集活性；きわめて微量で懸濁微細物を凝集
する。 (2) 凝集活性PH範囲；PH２〜９で安定に凝集活性
を示す。 (3) 凝集活性温度範囲；０〜100℃で凝集活性が
認められる。 (4) 凝集活性イオン強度；炭酸およびFe₂（SO₄）₃
により凝集活性が阻害されるがそれ以外の各種
イオン及びイオン強度によつて凝集活性に影響
はなく、NaCl、K₂SO₄で1Mまで全く影響を与
えない。 (5) 元素分析；窒素8.64％、炭素42.80％、水素
6.87％一般式：（C₆H₁₁NO₄・xH₂O）_o (6) 紫外吸収スペクトル；第１図に示すとおり。 (7) 赤外吸収スペクトル；第２図に示すとおり。 (8) 呈色反応；ニンヒドリン反応＋キサントプロテイン反応 − エーリツヒ反応 − モリツシユ反応 − フエノール硫酸法 ± レローゼンテスト − (9) 電気泳動；密度勾配等電点電気泳動により単
一物質として確認され、等電点（pI）は8.5で
ある。 (10) 物質の色；淡黄色 (11) 塩基性、酸性、中性の区別 0.5％ｗ／ｖで水に懸濁した場合のPHは7.5
（脱イオン水のPH5.8）である。 (12) 溶剤に対する溶解性・熱水に難溶・冷水に難溶・希酸に易溶・希アルカリに難溶・アルコール類、アセトン、クロロホルム、
ベンゼン、ｎ―ペンタンに不溶。 (13) 平均分子量 16万以上２その塩が塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸
塩、乳酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸
塩、ギ酸塩及び酢酸塩から選択された１以上であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
PF―102の塩。