JPH01252285A - 酵素包括ゲル粒子およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、酵素を固定した微細ゲル粒子とその製造遣方
法、さらに詳しくいえば光架橋性樹脂を用いて、ゲル状
態て酵素を包括させることにより、優れた酵素活性をも
つ微細酵素包括ゲル粒子とそれを製造する方法に関する
ものである。

〈従来の技術〉 これまで、酵素を固定したゲル粒子を製造する方法とし
ては、ポリビニルアルコールあるいはその誘導体の水溶
液に酵素を溶解させ、放射線を照射してポリビニルアル
コールあるいはその誘導体を架橋させると同時に酵素を
固定する方法が知られている（特公昭５６−３３号公報
、特公昭５９−１３１８９号公報）。

しかしながら、この方法は、放射線を用いなければなら
ないため、特殊な設備を必要とする上に、酵素を変質す
るおそれがあり、実用化に際して種々の問題かある。

他方、感光性樹脂を用いて酵素を固定化する方法もいく
つか知られている（特開昭５３−１４２５９４号公報、
特開昭５５−１５７０３号公報など）。

しかしなから、これらの方法によれば、フィルム状、粒
子状、繊維状の樹脂中に酵素か固定されるため、反応に
関与する酵素はこれらの表面に露出しているもののみに
限られ、固定された酵素の量に比較して利用される酵素
の量か著しく少なくなるのを免れない。

そこで、本発明者らは、先に、水溶性感光性樹脂の１種
であるスチリルピリジニウム基をもつポリビニルアルコ
ールを用い、これと酵素とさせる旨を提案している（特
開昭６１−１２８８８８号公報）。

この提案によれは、平均粒径２０〜１００μｍの酵素包
括ゲル粒子が得られ、酵素を、その作用をそこなうこと
なく、しかも効率よく機能を発揮できる状態で固定化で
きる。

〈発明が解決しようとする課題〉 しかし、この提案によフて得られる酵素包括ゲル粒子は
、２０〜１００μｍと平均粒径が比較的大きく、酵素活
性の発現の点で未た不十分である。

また、攪拌状態を維持しながら光架橋させるので、基本
的に回分操作となり、量産性の点で不十分である。　ま
た、分散状態で光照射するので、光照射量が減少し、同
時に湿潤状態でもあるので、光感度も低下する。

さらに、架橋して得られる粒子は、湿潤状態て得られる
ので、非水系酵素反応に適用する場合は乾燥が必要とな
り、乾燥を行うと粒子同士の凝集による塊状化を招き好
ましくない。　また、得られた粒子は懸濁物質で漏れて
おり、溶媒等による洗浄を行う必要がある。

木発明の目的は、平均粒径が小さく、活性の高い酵素包
括ゲル粒子とその製造方法を提供することにある。　本
発明の他の目的は、連続製造プロセスが可能で、後処理
が不要で、量産性にすぐれた酵素包括ゲル粒子とその製
造方法を提供することにある。

〈課題を解決するための手段〉 このような目的は下記の木発明によって達成される。

すなわち、本発明はスチリルピリジニウム基またはスチ
リルキノリニウム基を有するポリビニルアルコールを光
架橋した平均粒径０，１〜１０μｍのゲル粒子中に酵素
を包括固定した酵素包括ゲル粒子である。

本発明で用いるスチリルピリジニウム基またはスチリル
キノリニウム基をもつポリビニルアルコールは、公知で
あり、例えばポリビニルアルコールまたは部分けん化ポ
リ酢酸ビニルと、下記一般式で表わされるスチリルピリ
ジニウム塩、またはスチリルキノリニウム塩を反応させ
ることによって得ることができる（特公昭５６−５７６
１号公報等参照）。

一般式 上記一般式において、Ｒは水素原子、置換または非置換
のアルキル基、アリール基またはアラルキル基、例えば
低級ヒドロキシアルキル基等を表わす。

Ｘ−は強酸の陰イオンを表わす。

また、上記式において、ピリジン環またはベンゼン環は
置換基を有していてもよく、ピリジン環は縮合ヘンセン
環を有しキノリン環を形成していてもよい。

この際のポリビニルアルコールあるいは部分けん化ポリ
酢酸ビニルとしては、重合度５００〜３０００の範囲の
ものが適当てあり、また部分Ｇづん化ポリ酢酸ビニルを
用いる場合には、けん化率７０〜８８％のものを用いる
のか望ましい。

重合度か５００よりも少ないと光架橋されても好適なゲ
ルを生成しないし、また重合度か３０００よりも犬ぎく
なったり、ポリ酢酸ビニルのけん化度か７０％よりも少
ないと不溶化樹脂となりゲルが得られない。

同様にスチリルピリジニウム基および／またはスチリル
キノリニウム基は、ビニルアルコール単位当り、０．５
〜８モル％の範囲で導入されたものか９了ましい。

次に、本発明における固定化には、放用線照れる酵素は
特に制限されない。

例えは、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミ
セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、リゾチーム、ナ
リンジナーゼ、ヘスベリジナーセ、アン［・シアナーゼ
、アミノアシラーゼ、ウレアーセ、インベルターゼ、メ
リピアーゼ、デキストラナーゼ、ペブヂダーゼ、リボヌ
クレアーゼ、ラクターゼのような加水分解酵素、グルコ
ースオキシダーゼ、ウリカーゼ、カタラーゼ、リボキシ
ケナーゼ、チトクロムＣ、ヘルオキシダーゼのような酸
化還元酵素、グルコースイソメラーセのような異性化酵
素、シクロデキストリングルコ−ジルトランスフェラー
ゼ、トランスフェラーゼのような転移酵素、アスパルタ
ーぜ、ヒアロウロンダーゼ、コンｉ〜ロイチナーゼ、ベ
クチンエリミナーゼのような脱離酵素などを固定化する
ことかできる。

本発明方法を好適に実施するには、スチリルピリジニウ
ム基またはスチリルキノリニウム基をもつポリビニルア
ルコールを０１〜５％、特に０２〜３％の濃度で水に溶
かし、さらに所定の酵素を加え、十分に混合する。

酵素量はポリビニルアルコールの５〜５０ｗｔ％程度と
すれはよい。

次いて、この水溶液を噴霧乾燥する。

噴霧乾燥に際しては、スプレードライヤーを用いれはよ
い。　スプレーノズルとしては、２流体ノズル方式のも
のを用いることが細かい噴霧液滴かえられる点て好まし
いが、その他、大型のスプレードライヤーの場合にはエ
アレススプレーや、回転ディスクタイプのものも使用可
能である。

そして、噴霧する液滴は、５０μｍ以下、特に２０μｍ
以下に制御することが好ましい。

また、乾燥気流の初期温度は３０〜８０℃程度とするこ
とか好ましい。　この乾燥気流温度においても液滴温度
は湿球温度に保たれるのか、その気流量と噴霧量は、上
記液滴径が得られるように容易に実験的に求めることか
できる。

噴霧乾燥後、例えばサイクロン等で捕集された粒子は、
活線光線を照射されて光架橋される。

この際の活性光照射は、通常の感光材料の光硬化に使用
されている光源、例えは高圧水銀灯、キセノンランプ、
メタルハライドランプ、アーク灯、けい光灯、タングス
テンランプ、アルゴンイオンレーザ、ヘリウムカドミウ
ムレーザなどを用いて行うことかてぎる。　この活性光
の照射により、スチリルピリジニウムないしスチリルキ
ノリニウム基をもつポリビニルアルコールは光架橋し、
ゲル粒子を形成する。　この光架橋反応は、使用する樹
脂の種類、架橋化条件により若干異なるか、通常数分間
ないし数十分間で完了する。

このようにして、平均粒径０，１〜１０μｍ、特に０．
１〜５μｍ、酵素担持量５〜５０ｗｔ％のゲル粒子が得
られる。

このようにして得られる酵素包括ゲル粒子は、従来の固
定化酵素と同様に、カラムに充てんし基質含有溶液を流
下させる方法、基質含有溶液に加えかきまぜる方法など
によって種々の酵素反応に供することができる。

あるいは、さらにゲル粒子を必要に応じバインダーを用
い、例えば流動層造粒装置等により２次的に造粒して用
いることもできる。

この２次造粒におけるバインダーとしては、本発明のゲ
ル粒子の原料ポリマーを用いることもできるし、あるい
は酵素、ポリマーおよび酵素反応に悪影響を与えない他
のバインダーを用いることもできる。

さらに、ポリマー／酵素混合液の乾燥粉末が未露光、す
なわち未架橋の段階においては、バインダーに代えて水
を用いても２次造粒が可能である。

的に造粒してもよい。

このとき、ポーラスな２次粒子が得られるので、反応基
質と接触する表面積が増大し、きわめて活性が高く、圧
力損失の少ない大径の酵素包括ゲル粒子が得られる。

この場合の粒径としては、数ｍｍ程度まで可能である。

　また、２次粒子の気孔率は例えば２０〜６０％程度に
て制御可能である。

〈実施例〉 実施例１ 重合度１７００．鹸化度８８％のポリビニルアルコール
に、スチリルピリジニウム基１３ｍｏ１％を導入したポ
リマーの、重量濃度１１．１％の水溶液２２．５ｇを２
６８ｇの水に希釈し、これに１１７Ｕ／ｍｇの活性をも
つ生化学工業■のインベルターゼ１ｇを溶解し、酵素と
感光性樹脂の混合溶液を調整した。　溶液中の酵素と樹
脂の重量比は２．５である。

つぎにこれを小型噴霧乾燥器ヤマト科学■製パルビスミ
ニスプレーＧＡ−２１に、１．７ｍβ／　ｍ　ｉ　ｎの
流量て供給して噴霧乾燥した。

乾燥気体は温度２５℃、相対湿度７５％の空気を、５１
℃に加熱して、風量０．５Ｎｒｎ”／ｍｉｎで乾燥チャ
ンバーに供給した。

乾燥粉末は、ＧＡ−２１の捕集用サイクロンからガラス
びんに回収し、これをケミカルランプ（２０Ｗｘ５本）
で１０ｃｍの距離から３０分露光してポリマーを光架橋
させて製品を得た。

得られた製品は、走査型電子顕微鏡による観察の結果、
直径２〜５μｍ、数平均粒径２５μｍの微粉末であり、
カールフイ・ンシャー法による測定結果では、３６％で
あった。

つぎに、この固定化インベルターゼ３５ｍｇ１すなわち
インベルターゼ換算で１０ｍｇを、ｐＨ４，５に調整し
た、濃度０５モル／でマグネチックスターラーにより攪
拌すると、本固定化酵素ゲルは極めて短時間で液中に分
散する。　光学顕微鏡による観察では、本固定化酵素ゲ
ルは水中で１０〜２０μｍ程度まで膨潤する。

経時的に反応液を１ｍＡ採取し、これを、９５℃の水浴
中に保持した試験管中の３ｍＪ２の熱湯に投入してイン
ベルターゼを熱失活させ、さらにゲルを濾別してイオン
交換クロマトグラフィーで分析した。その結果、加水分
解反応は蔗糖濃度に関して１次で進行し、反応速度定数
は　０．０５８５ｍｉｎ−’であることが確認された。

一方、同量のインベルターゼを水溶液として、未固定の
まま反応させた結果は、上記同様反応は蔗糖濃度に関し
て１次で進行し、反応速度定数は　０．０７９０ｍ１ｎ
−’であった。　これら両者の比から、本発明による固
定化では、７４％という、極めて高い活性発現率が得ら
れることが確認された。

本固定化酵素ゲル表面に付着している未固定の酵素量を
求めるため、ゲルを水洗してその洗液の活性を調へた。

　水洗は、上記反応と同量の固定化酵素ゲルをＢｍｆｌ
の水中で３分間攪拌して遠心沈降させ、上澄みを洗液と
して採取する操作を３回繰返すことで行った。　そ　の
結果、洗液はゲルの０３６％の活性しか示さず、ゲル表
面に未固定の酵素はほとんどないことが判明した。

次いて、本固定化酵素ゲルからの酵素の脱落量を求める
ため、上記と同条件で洗浄したゲルで反応を開始し、３
０分後に採取した液からゲ゛ルを除去してその濾液中の
酵素の活性を求めた。　その結果、濾液中の酵素の活性
はゲルの０１２％の活性しか示さず、酵素の脱落は実質
的に無視てきることが判明した。

比較例 特開昭６１−１２８８８８号公報の懸濁架橋法に従い、
２０〜１００μｍの直径の酵素包括ころ、活性発現率は
３０％であった。

実施例２ 実施例１のインベルターゼにかえ、実施例１と同様にし
てリゾバスリパーセのゲル粒子を得た。　基質としてオ
リーブ油を用いて活性を測定したところ、良好な結果を
得た。

実施例３ 実施例１のゲル粒子を小型流動層造粒装置ベルビスミン
ベッドＧＡ−３１にて、バインダーとして実施例１のポ
リマーの０．０２ｗｔ％水溶液をＱ、５ｍｕ／ｍｉｎで
供給し、風量を０．０２〜０．１　Ｎｍ３／ｍ　ｉ　ｎ
まで徐々に増加させながら、５０℃で造粒して、粒径０
２〜０．５ｍｍ、平均気孔率５５％の２次粒子を得た。

　実施例１と同様に反応速度定数を測定したところ、活
性発現率は４２％であった。

〈発明の効果〉 本発明によれば、平均粒径０５〜１０μと微細な酵素包
括ゲル粒子が得られるので、その活性はきわめて高いも
のとなる。

また、本発明の製造方法は連続プロセスか可能であるの
で、生産性か高い。

また、粒子は乾燥状態て得られるので、光架橋の効率か
高い。　また、乾燥物として得られるので、懸濁媒体等
の除去を必要とせず、生産性か高い。

また、このような粒子を２次造粒すれは、大径で、しか
も活性が高く、圧力損毛の少ないゲル粒子がえられる。

本発明の２次造粒粒子は、本発明と同一のポリマーを用
いた特開昭５５−２３９４１号公報に述へられているキ
ャスト−風乾−露光法に比較して、乾燥時間か圧倒的に
短い（１／１０４）ため風乾時に時としておこる酵素と
ポリマーの相分離がおこらず、その結果均一なゲルのメ
ツシュワークか形成され、さらに酵素も素のリークも実
質的に無視できるという理想的な包括固定状態が実現で
きる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）スチリルピリジニウム基またはスチリルキノリニ
   ウム基を有するポリビニルアルコールを光架橋した平均
   粒径０．１〜１０μｍのゲル粒子中に酵素を包括固定し
   た酵素包括ゲル粒子。
2. （２）請求項１に記載のゲル粒子を２次的に造粒した酵
   素包括ゲル粒子。
3. （３）スチリルピリジニウム基またはスチリルキノリニ
   ウム基を有するポリビニルアルコールの水溶液中に酵素
   を溶解し、次いでこの水溶液を噴霧乾燥し、活性光を照
   射し光架橋させる酵素包括ゲル粒子の製造方法。
4. （４）平均粒径０．１〜１０μｍの酵素包括ゲル粒子を
   得る請求項３に記載の酵素包括ゲル粒子の製造方法。
5. （５）請求項３または４に記載の製造方法で得たゲル粒
   子を２次的に造粒する酵素包括ゲル粒子の製造方法。