JPH01238524A - カテコールアミン誘導体を含有してなる中枢性神経退行性疾患の進行防止および治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、カテコールアミン誘導体の医薬品への利用に
関する。さらには、脳内特定組成での神経成長因子（Ｎ
ｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ＋　　以下、Ｎ
ＧＦと略す）の産生・分泌誘発作用を有するカテコール
アミン誘導体を有効成分として含有してなる中枢性神経
退行性疾患の進行防止および治療剤に関する。

〔従来の技術〕

世界的に平均寿命の延長に伴い、各種老人病の早期診断
、原因療法の確立のための研究は急速に進展している。

中枢性の神経退行性疾患もその主要な研究対象である。

特に、その典型疾患であるアルツハイマー型老年性痴呆
症（Ｓｅｎｉｌｅ　Ｄｅｍｅｎｔｉ−ａ　ｏｆ　Ａｌｚ
ｈｅｉｍｅｒ　Ｔｙｐｅ、以下５ＤＡＴと略す）は先進
諸国を中心に増加の傾向が著しいこと、進行性の悲惨な
経過を辿ることから大きな社会問題となりつつある。と
りわけ、近年、本病態に関し多くの研究者、臨床家が挑
戦しているにもかかわらず、根本的な病因解明はもとよ
り、実効的な早期診断法および治療法゛は未だ確立して
いない。

しかしながら、５ＤＡＴの特徴的早期症状である記銘力
の低下や失見当識の直接原因が、大脳基底部から記憶・
学習中枢である大脳皮質や海馬へ投射する大細胞性コリ
ン作動性神経束の進行性の変性と、それによる該支配領
域の機能不全であることを示す病理学的所見は多数蓄積
されている。また実際、脳内コリン作動系の賦活療法と
して、アセチルコリン生合成前駆体ないしコリンニスス
テラーゼ阻害剤が５ＤＡＴ患者に投与され、若干の症状
改善例も報告されているが、全殻的には、期待されたほ
どの効果は認められていない。

神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏ
ｒ、ＮＧＦと略する）は、Ｒ，Ｌｅｖｉ−ＭｏｎＬｅｒ
ｌｃｉｎｉやＳ、Ｃｏｈｅｎ等によって発見されて以来
、数多くの研究の対象となり、すでに抹消神経系とくに
胎生期の知覚および交換神経細胞の分化と成長、さらに
成ＰＭの交換神経細胞の生存と機能保持に必須の因子で
あることが生理化学的実験によって証明されている。

しかしながら、ＮＧＦは超微量生理活性物質であり、長
年の研究にもかかわらず、生体内での作用を直接裏付け
るｍ織内分布と動態についての正確な成績は得られなか
った。ごく最近、ＮＧＦの活性サブユニント（β−ＮＧ
Ｆ　、以下単にＮＧＦと言う）に対する高感度酵素抗体
測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏ
ｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ、以下ＥＬＩＳＡ）の開発、改
良が進み、上記の検討に耐えうる検出感度と特異性とが
確保されるにいたった（Ｓ、　Ｆｕｒｕｋａｗａら：Ｊ
。

Ｎｅｕｒｏｃｈｅｎ＋、　且＋　７３４−７４４＋　１
９８３およびＳ、　ＫｏｒｓｈｉｎｇとＨ，Ｔｈｏｅｎ
ｅｎ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ
　８０　３５１３−３５１６．１９８３）。

また、ＮＧＦの遺伝子がクローニングされ、構造解析さ
れて、β−ＮＧＦの相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡと略す）
をプローブとして、そのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲ
ＮＡと略す）を定量する方法も確立された（Ｄ、Ｌ、５
ｈｅｌｔｏｎとり、Ｆ、Ｒｅ１ｃｈａｒｄｔ：Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ　８１７９５
１−７９５５．１９８４およびＲ，Ｈｅｕｓ＋ａｎｎ　
ら：　ＥＭＢＯＪ。

３、３１８３−３１８９．１９８４）　。

これらの技法を用いて、まず、抹消神経系で交換神経細
胞の度合いと支配組織におけるＮＧＦの遺伝子発現との
間に正の相関が成り立つことが実証された。

さらに驚（べきことに、ラットの中枢、とりわけ海馬、
新皮質、嗅球および前脳基底部の中隔野、ブローカ対角
帯、大細胞性基底核にもＮＧＦが検出され、しかもその
ｍＲＮＡ含量は海馬、新皮質に高く、基底部の中隔野で
はＮＧＦの検出されない脳の他の領域程度に低いことが
判明した（Ｓ、Ｋｏｒｓｈｉｎｇら：ＥＭＢＯＪ、４．
１３８９−１３９３．１９８５）。本成績は、その後他
の研究グループによっても次々に追試された（Ｄ、Ｌ、
５ｈｅｌｔｏｎとり、　Ｆ、　Ｒｅ１ｃｈａｒｄｔ：Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．２７１４２７１８．１９８６お
よびＳ、Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅら：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１
．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８３　８１７−８２１
．１９８６）。

この事実はＮＧＰが抹消神経系のみならず、中枢神経系
においても遺伝子発現されていること、しかも大脳基底
部の起始核から記憶・学習の中枢である新皮質、海馬へ
投射しているコリン作動性神経束の支配領域で産生・分
泌されて、神経終末よりとりこまれ、逆軸策輸送によっ
て起始核の細胞本体に到ることを示している。ＮＧＦが
本コリン作動性神経の生存と、機能維持に必須の因子で
あることはすでに一連の生理学的実験により証明されて
おり、したがって、この成績によって中枢神経系でもＮ
ＧＦが「神経栄養因子」の一つとして特異的に機能して
いることが証明されたことになる。

その後、この成績はいくつかの研究グループによっても
追試され、また脳におけるＮＧＦ　レセプターおよび分
布に関する研究からも裏付けられた。

本発明者らは、ＮＧＦの中枢神経系での神経栄養因子と
しての機能を研究してゆく中で、５ＤＡＴの早期症状で
ある記憶・学習障害の直接原因がコリン作動神経束の進
行性の変性とそれによっておこる支配領域の機能性不全
にあるとしても、該神経支配領域におけるＮＧＦの産生
・分泌不全こそがより根本的な病因たり得るとの見地に
立つに至った。

すなわち、従来の５ＤＡＴに対する対症療法、例えばア
セチルコリンの補充療法やａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙの
向上療法では顕著な改善は得られず、大脳皮質および海
馬でのＮＧＦの産生・分泌を確保して、支配神経との間
で成立している機能上の悪循環を断つことが可能であれ
ば、はるかに効果的であると考えるものである。

尚、既に遺伝子のクローニングによってヒト型のβ−Ｎ
ＧＦの大１１ｉｌ製への道は拓かれたとは言うものの、
分子ｉｔｏ、ｏｏｏを越える蛋白質であるＮＧＦ自身の
補充療法によっては、薬理学および薬剤掌上の制約が大
きい、とくに中枢神経系の適用に関しては現時点では開
発の目途は立っていない。

以上の様な観点から、ＮＧＦの実質的、かつ効果的補充
療法として、ＮＧＦの特定組織における産生・分泌能を
誘発する能力を有する低分子化合物の探索は重要な意味
を持つ、我々は既に本作用を有するカテコール誘導体に
ついて報告した（池田：特願昭６ｌ−２２６１３５）、
さらに古川等の報告もある（Ｙ、Ｆｕｒｕｋａｗａら：
Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、、２６１６０３９（１９８６
）およびＦＢＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２０８２５８（１
９８６））　。

すなわち、生体内神経伝達物質であるドーパミン（本発
明の一般式においてＲ＋５Ｒｔ−Ｒｓがともに水素原子
であり、かつ、ｎが２の整数である化合物）およびエピ
ニン（本発明の一般式においてＲ１、Ｒ２が水素原子、
Ｒ３がメチル基であり、がっ、ｎが２の整数である）に
ＮＧＦ産生・分泌誘発作用が存することが述べられてい
る。しかし、これら以外の本発明一般式に示したドーパ
ミン型カテコールアミン化合物については何ら言及され
ていない。

一方、本発明の一般式に示したカテコールアミン誘導体
は、その化学的・生物学的興味から既に合成され、その
化学的性質および一部の生物学的性質は知られている。

しかし、本発明に係るＮＧＦ産生・分泌誘発作用は前記
ドーパミン、エピニン以外は何らの報告はなく、よって
これら化合物が中枢性神経退行性疾患の進行防止および
治療に有効である事実は本発明者等にみいだされたもの
である。

〔発明が解決しようとする課題〕 本発明の課題は、ＮＧＦの実質的、かつ効果的補充療法
として、ＮＧＦの特定組織における産生・分泌能を誘発
する能力のある医薬品を提供することであり、一般式で
示されるカテコールアミン誘導体を医薬品として利用す
ることである。

すなわち、特定神経に対して「神経栄養因子」として機
能しているＮＧＦの該神経支配組織の産生・分泌促進活
性をもつ化合物それ自身ないし薬理学および薬剤学的配
慮に基づくその修飾化合物は、通常の投与方法によって
神経変性局部へのＮＧＦの供給量を増大させ、該神経機
能を回復させることを可能にすると期待される。特に、
いまだに根本的治療法の確立されていない中枢性疾患で
ある５ＤＡＴに対して、これらの化合物の利用は理想的
である。発症早期であれば、これらは抹消投与によって
中枢神経系の大脳皮質や海馬領域のＮＧＦの産生・分泌
能を高めて、支配神経たるコリン作動性神経系の特徴的
変性の進行を防止し、損傷神経細胞の修復ないし残存神
経細胞による再支配を促して、脳機能の可塑性に依拠し
た新しい作用概念に基づく画期的な治療法を提供しうる
ちのである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は一般式 （式中、Ｒ３は水素原子またはアセチル基を、Ｒ。

、Ｒ８は独立してそれぞれ水素原子、低級アルキル基ま
たは低級アルカノイル基を、ｎは１．２または３の整数
を示す、ただしＲ＋、　Ｒｔ、Ｒ１がともに水素原子で
あり、かつ、ｎが２の整数である場合、およびＲＩ％　
Ｒ２が水素原子、Ｒ１がメチル基であり、かつ、ｎが２
の整数である場合を除く）で表されるカテコールアミン
誘導体を有効成分として含有する中枢性神経退行性疾患
の進行防止および治療剤である。

本発明の一般式で表されるカテコールアミン誘導体にお
いて、低級アルキル基とはメチル基、エチル基、プロピ
ル基、イソプロピル基、ブチル基またはイソブチル基等
を示し、低級アルカノイル基とはアセチル基、プロピオ
ニル基、ブチリル基またはイソブチリル基等を示す。

具体的には、Ｎ−プロピオニ、ルー３．４〜ジヒドロキ
シフェネチルアミン、Ｎ−ブチリル−３，４−ジヒドロ
キシフェネチルアミン、Ｎ−アセチル−３，４−ジヒド
ロキベンジルアミン、Ｎ−プロピオニル−３，４−ジヒ
ドロキシベンジルアミン、Ｎ−ブチリル−３，４−ジヒ
ドロキシベンジルアミン、Ｎ−アセチル−３，４−ジヒ
ドロキフェニルプロピルアミン、Ｎ−プロピオニル−３
，４−ジヒドロキシフェニルプロピルアミン、Ｎ−ブチ
リル−３，４−ジヒドロキシフェニルプロピルアミン、
Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−３，４−ジヒドロキシフェ
ネチルアミン、Ｎ−プロピオニル−Ｎ−メチル−３，４
−ジヒドロキシフェネチルアミン、Ｎ−ブチリル−Ｎ−
メチル−３，４−ジヒドロキシフェネチルアミン、およ
び、これらを無水酢酸と反応させて得られる相当するジ
アセトキシ体、ならびにＮ−プロピル−３，４−ジヒド
ロキシフェネチルアミン、Ｎ−ブチル−３，４−ジヒド
ロキシフェネチルアミン、Ｎ−メチル−３，４−ジヒド
ロキシベンジルアミン、Ｎ−エチル−３，４−ジヒドロ
キシベンジルアミン、Ｎ−プロピル−３，４−ジヒドロ
キシベンジルアミン、Ｎ−ブチル−３，４−ジヒドロキ
シベンジルアミン、Ｎ−メチル−３，４−ジヒドロキシ
フェニルプロピルアミン、Ｎ−エチル−３，４−ジヒド
ロキソフェニルプロピルアミン、Ｎ−プロピル−３，４
−ジヒドロキシフェニルプロピルアミン、Ｎ−ブチル−
３，４−ジヒドロキシフェニルプロピルアミン、Ｎ、Ｎ
−ジメチル−３，４−ジヒドロキシフェネチルアミン、
Ｎ−メチル−Ｎ−エチル−３，４−ジヒドロキシフェネ
チルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピル−３，４−ジヒ
ドロキシフェネチルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ−ブチル−
３，４−ジヒドロキシフェネチルアミン等が挙げられる
。

これらの化合物は公知の方法により製造可能である。例
えば、−Ｃ式においてＲ２、Ｒ１のいずれかが低級アル
カノイル基を有する化合物群は、入手の容易なＲ２、Ｒ
ｄがいずれも水素原子である化合物（例えばドーパミン
）またはＲ２、Ｒ８のいずれかが低級アルキル基である
化合物（例えばエピニン）等と酸無水物または酸ハロゲ
ン化物を塩基存在下に反応させる方法で製造できる。こ
の方法で使用する酸無水物とは、無水酢酸、無水プロピ
オン酸、無水ブタン酸等であり、酸ハロゲン化物とは、
塩化アセチル１．塩化プロピオニル、塩化ブタノイル等
である。また塩基とはトリエチルアミン、ピリジン等の
有機塩基または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の
無機塩基が使用できる。

さらに、一般式においてＲＺ、　Ｒ３の一方、または両
方が低級アルキル基を有する化合物群は、例えば、上記
の方法で製造したＲｔ、　Ｒ３のいずれかが低級アルカ
ノイル基を有する化合物を、適当な還元剤と反応させる
ことにより製造できる。適当な還元剤としては、リチウ
ムアルミニウムハイドライド（ＬｉＡｌＨ４）　、ジボ
ラン等が使用できる。

具体的な製造例を示すと次の通りである。

製造例１ ａ）Ｎ−アセチル−３，４−ジアセトキシフェネチルア
ミン ドーパミ力２．５ｇをピリジン１０ｍ１に溶解させ、ト
リエチルアミン２．７ｇを添加する。さらに無水酢酸８
ｇを加えた後、反応液を１時間６０〜７０°Ｃで加熱撹
拌する。反応液を氷水２００ｍ　ｌに注ぎ、２．５規定
の水酸化ナトリウム水溶液５０ｍ１を加えた後クロロホ
ルム１００ｍ　ｌで抽出した。クロロホルム層を２規定
塩酸３０ｍ　ｌで３回洗浄し、さらに無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥した後、溶媒を減圧上留去し、残金をシリカゲ
ルカラムクロマトによって精製した。クロロホルム：メ
タノール＝ＳＯ：ｔの混合溶媒で流出させ、３．５ｇの
純粋なＮ−アセチル−３，４−ジアセトキシフェネチル
アミンを無色油状物として得た。

ＮＭＲδｐｐ−（ＣＤＣｈ）　　： １．９６（Ｓ、　３８）　、２．３２（Ｓ、６８）、２
．７８（ｔ、　２１１）、３．３２〜３．５６（ｍ、　
２Ｈ）　、６．００（ｂｒ、　ＩＨ）、７．００〜７．
１６（＋ｍ、　３１） ｂ）Ｎ−アセチル−３，４−ジヒドロキシフェネチルア
ミン 先に合成したＮ−アセチル−３，４−ジアセトキシフェ
ネチルアミン１ｇをメタノール６０ｍ２に溶解させ、水
冷下、水３１）＋　１および飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液３０ｍ　ｊ！を添加した後、室温で１２時間撹拌し
た。水冷下、３規定塩酸を滴下し、反応液を弱酸性にし
た後、クロロホルム５０ｍ　ｌで４回抽出した、さらに
水層を酢酸エチル４０ｍ　ｌで３回抽出し、再抽出液を
乾燥後、減圧上留去する。残香を合わせてシリカゲルカ
ラムクロマトグラフで精製した。クロロホルム：メタノ
ール＝２０１で流出させ、純粋なＮ−アセチル−３，４
−ジヒドロキシフェネチルアミン０．３ｇを得た。

Ｎ門Ｒδｐｓ−（ＤＭＳＯ−ｄＪ　　：１．７８（Ｓ、
　３８）　、２．３０〜２．６０（ｍ、　２Ｈ）　、２
．９０〜３．２４（ｍ、　２Ｈ）　、６．３０〜６．６
８（ｍ、　３Ｈ）　、７．７６（ｔ、　ＩＩＩ）　、８
．５０（ｂｒ、　２Ｈ）製造例２ Ｎ−エチル−３，４−ジヒドロキフェネチルアミン・臭
化水素酸塩 ホモベラトリルアミン５ｇをピリジン２０Ｉｌｌに溶解
し、無水酢酸５．６ｇを添加した後、６５〜７０’Ｃで
２時間加熱撹拌する。氷水１５０１１１に反応液を注ぎ
、６規定塩酸５０ｍ　ｌ！で弱酸性にする。クロロホル
ム５０ｍ　ｌで３回抽出し、抽出液は合わせて重曹水で
洗浄後、無水芒硝で乾燥する。減圧下、溶媒を留去し、
残香にエーテルを加え、析出した結晶を濾取して、ｍρ
、１０１〜１０２°ＣのＮ−アセチルホモベラトリルア
ミン５．７ｇが無色結晶として得られた。

リチウムアルミニウムハイドライド０．９８ｇを乾燥テ
トラヒドロフラン（ＴＩＩＦ）５０＋ｓｌに懸濁し、撹
拌下、Ｎ−アセチルホモベラトリルアミン３ｇのＴＨＦ
２５ｍｌ溶液を滴下する。３時間加熱還流した後、反応
液を氷冷する。激しく撹拌下、水１（１／！とＴＨＦｌ
ｏｍｌの混合溶媒を徐々に滴下する。不溶物を濾別した
後、濾液を濃縮し、残香を酢酸エチル５０ｍ２に溶解さ
せる。２回水洗した後、無水芒硝で乾燥する。溶媒を減
圧上留去すると油状物質としてＮ−エチルホモベラトリ
ルアミンが２．３ｇ得られた。

Ｎ−エチルホモベラトリルアミン１．０ｇを４８％臭化
水素酸６ａ＋１および酢酸４−２の混合溶媒に溶解させ
、５時間、１２０〜１３０°Ｃで加熱撹拌させる。

溶媒を減圧上留去し、残香をエーテルより結晶化させ、
粗結晶１．２ｇを得る。イソプロピルアルコールより再
結晶すると、ｓｐ、　１４９〜１５１°ＣのＮ−エチル
−３，４−ジヒドロキフェネチルアミン・臭化水素酸塩
が０．６８ｇ得られた。

ＮＭＲδｅｅ、　　（ＤＭＳＯ−ｄり　　：１．２０（
ｔ、　　３１４）　　、２．６Ｑ〜３．２０（鶴、　　
６１（）　　、６．４０〜６．８０（＋＊、　　３Ｈ）
　　、８．５０（ｍ、　　４Ｂ）次に本発明化合物の中
枢性神経退行性疾患の進行防止および治療剤としての有
効性は、以下の試験によって確認した。

すなわち、古川等（Ｙ、Ｆｕｒｕｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ
：Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６１　６３０３９（１９８６）により報
告されている、マウス線維芽細胞樹立株、Ｌ−Ｍ細胞（
ＡＴＣＣ，ＣＣＬｌ、２）を用い、培地中に本発明化合
物を供存させることにより、産生・分泌されるＮＧＦ　
ｆｉ度を高感度ＥＬＩＳＡ法によって測定する方法を用
いた。

さらに、中ＩＩＸ組織での主要なＮＧＦ産生・分泌細胞
と考えられるアストロダリア細胞を用いた系においても
、そのＮＧＦ濃度を測定した。これらの試験により、本
発明化合物は非常に強いＮＧＦ産生・分泌促進能を有す
ることが発見され、よってカテコールアミン誘導体が中
枢性神経退行性疾患、とりわけ５ＤＡＴに対し有効な進
行防止および治療剤と成り得る可能性を確認した。

また、本発明の化合物を中枢性神経退行性疾患の進行防
止および治療剤として使用する場合、その投与量、列形
は化合物の物性、投与対象の症状等により当然異なるが
、経口的に投与する場合、成人１日当たり、５０〜５０
０ｍｇを１回または数回に分割し、錠剤、顆粒剤、散剤
、懸濁剤、カプセル剤等として、また非経口的に投与す
る場合、１〜１０ｈｇを１回または数回に分割し、例え
ば注射剤、座剤、輸液用等張液等として投与でる。

例えば錠剤とする場合、吸着剤としては結晶性セルロー
ス、軽質無水ケイ酸等を用い、賦形剤としてはトウモロ
コシデンプン、乳糖、燐酸カルシウム、ステアリン酸マ
グネシウム等が用いられる、また注射剤とする場合、化
合物の水溶液または綿実油、トウモロコシ油、ラッカセ
イ油、オリーブ油等を用いた懸濁性水溶液、さらにはＨ
ＣＯ−６０等の界面活性化剤等を用いた乳濁液として使
用される。

〔実施例〕

以下、本発明を生物試験した実施例により示す、ただし
、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

実施例１ くマウスＬ、Ｍ細胞に対するＮＧＦ産生・分泌促進作用
〉 古川らの方法（Ｙ、Ｆｕｒｕｋａｗａら：Ｊ、Ｂｉｏ１
．ＣｈｅｍＪｆｉｌ、　６０３９−６０４７　、１９８
６）に従った。

すなわち、０．５χペプトン添加１９９培地ＣＧｉｂｃ
ｏ社製）にてＬ−Ｍ細胞を前培養し、２４孔培養プレ一
トＣＦａｌｃｏｎ社製、培養孔あたりの培養面積２．１
ｃ＋１）に約３ＸＩＯ’個／培養孔の細胞をまき、３日
間３７°Ｃにて培養して完全コンフルエント（約１０’
細胞／培養孔）とする、培地を０．５％牛血清アルブミ
ン（第五両分、＾ｒｓ＋ｏｕｒ社製）添加１９９培地（
０，５ｍｌ／培養孔）に交換する。被検化合物は本培地
中に所定の濃度で含有させ、２４時間後の培養培地中の
ＮＧＦ　１度を高感度ＥＬＩＳＡ法（Ｓ、Ｆｕｒｕｋａ
ｗａら：Ｊ、Ｎｅｕ−ｒｏｃｈｅｍ、１．７３４−７４
４．１９８３）によって測定する。

結果は被検化合物を含まない培地にて培養した対象の培
養培地中の濃度に対する倍率として求めた０本−ＥＬＩ
ＳＡ法の検出限界は０．２５ｐｇ／＋１であり、対照ノ
ＮＧＦ　４度は、通常５０−５０−２００ｐ、５ｍｌ／
培養孔である。値は同一細胞標品を用いた４回の試行の
平均値として示しである。

結果を表１に示す。

（以下余白） 実施例２ くマウス脳アストロダリア細胞に対するＮＧＦ産生・分
泌促進作用〉 アストロダリア細胞はマウス前脳から誘導し、培養系に
移した（Ｓ、Ｆｕｒｕｋａｗａら：Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、」甚、５７−６
３．１９８６）。

すなわち、生後８日目のマウス脳を細切し、カルシウム
、マグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ
）で洗浄後、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ中で３７
゛Ｃ１３０分間処理し、パスツール・ピペットで＆ｌＩ
ｍをほぐして懸濁液とする。２００Ｘｇで５分間遠心し
て細胞および細胞凝集体を回収する。

これを１０％牛脂児血清、５Ｘ１０−’ユニットｍｅの
ペニシリン、５μｇ７ａｉｌのストレプトマイシンを含
有するダルベツコ変法イーグル培地（以下Ｄ？ＩＥ？１
培地、Ｇｉｂｃｏ社製）に移し、３日毎に同培地を変換
しながら、１０〜１４日間初代培養する。コンフルエン
トに達したら、トリプシン処理して別の培養器に分配し
て植え継ぐ、さらに２回以上植え継いで形態的に均一な
細胞集団とする０本実験に用いるのは、抗ヒトダリア線
維タンパクＭ　（ＧＦＡＰ）ウサギ抗血清を用いたＰＡ
Ｐ染色法（パーオキシダーゼ抗パーオキシダーゼ染色法
）で、９７％以上が染色される細胞集団であり、これを
以下アストロダリア細胞と呼ぶ。

アストログリア細胞を２４孔培養プレート（Ｆａｔｅ−
ｏｎ社製、培養孔あたりの培養面積２．ｌｃ＋１）に約
３Ｘ１０’個／培養孔まき、１０％牛脂児血清含有［Ｉ
ＭＥＭ培地にて３日間培養し完全コンフルエント（約１
０７細胞／培養孔）とする、培地を０．５％牛血清アル
ブミン（第五両分）含有ＤＭＥＦＩ培地に交換（０，５
ｍｌ／培養孔）して３日間培養する。さらに３日間毎培
地交換して細胞を培養静止期（ｑｕｉｓｃｅｎｔ　ｓ−
ｔａｇｅ）に誘導する。被検化合物を所定の濃度で含む
０．５ｍｊ２の同培地に交換し、２４時間後の培養培地
中のＮＧＦ濃度を前述の高感度ＥＬＩＳＡ法によって測
定する。結果は被検化合物を含まない培地で培養した対
照の培養培地中の濃度に対する倍率として求めた。本Ｅ
ＬＩＳＡの検出限界は０．２５ｐｇ／ｍ　ｌであり、対
照のＮＧＰ濃度は通常１〜１０ｐｇ１０．５ｍｆ培養孔
であった。値は同一細胞標品を用いた４回の試行の平均
値として示しである。

結果を表２に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１は水素原子またはアセチル基を、Ｒ＿２
   、Ｒ＿３は独立してそれぞれ水素原子、低級アルキル基
   または低級アルカノイル基を、ｎは１、２または３の整
   数を示す、ただしＲ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３がともに水素
   原子であり、かつ、ｎが２の整数である場合、およびＲ
   ＿１、Ｒ＿２が水素原子、Ｒ＿３がメチル基であり、か
   つ、ｎが２の整数である場合を除く）で表されるカテコ
   ールアミン誘導体を有効成分として含有する中枢性神経
   退行性疾患の進行防止および治療剤。