JPH01237456A - ガラクトシルトランスフェラーゼの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ガラクトシルトランスフェラーゼの免疫学的
測定方法に関するものである。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕初期の
研究段階において、ガラクトース転移を触媒する酵素で
あるガラクトシルトランスフェラーゼ（以下ｒＧＴＪと
いう）が種々の悪性腫瘍において異常な高値を示すこと
が見い出された。

しかし、その後の研究により、血清中の全ＧＴ活性と悪
性腫瘍との関連性は少なく、悪性腫瘍マーカーとはなり
得ないことがわかった。しかし、ＧＴのアイソザイムで
あるガラクトシルトランスフェラーゼＩＩ　（以下ｒＧ
Ｔ−ＩＩＪという）が、癌との関連があることがボトル
スキーら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７３．
１３１９　（１９７Ｂ））によって報告され、マーカー
としての有用性が再認識された。

Ｇ　Ｔ　−ＩＩは、全血清中に微量しか存在しない全Ｇ
Ｔ中の、更にその数％を占める極微量成分であるため、
その悪性腫瘍マーカーとしての有効性を充分に確認し、
利用していくためには、アイソザイムであるＧ　Ｔ　−
ＩＩと高い親和性を持つが、ＧＴ−Ｉとは交差反応しな
いモノクローナル抗体の調製が必要不可欠であった。先
に、木発明者らは、ポリエチレングリコールを用いた通
常の細胞融合技術を用いて数種のＧ　Ｔ　−ＩＩ特異的
モノクローナル抗体の作成に成功し、特願昭６１−２８
７４３３号により特許出願をした。更に、これら抗体中
の一つの細胞株より得られたモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ）３８７２を用いた臨床結果も報告している（１９８
６年、腫瘍マーカー研究会記録３２１〜３２３）。

血中Ｇ　Ｔ　−ＩＩ値の測定には■抗Ｇ　Ｔ　−ＩＩ抗
体であるＭＡｂ３８７２を不溶性担体に固定化し、ＢＳ
Ａによりブロッキングする、そして被測定Ｇ　Ｔ−ＩＩ
を含む体液を加えインキュベートした後、担体上に反応
したＧ　Ｔ　−ＩＩの酵素活性を測定する。即ち、ＧＴ
の基質であり、ガラクトース供与体であるウリジンジホ
スホガラクト−ス（ＵＤ　Ｐ−ＧａＪｌ［３Ｈ］　）、
ガラクトース受容体である卵白アルブミン（ＯＶ　Ａ）
及びバッファーから成るア・ンセイミクスチャーを加え
てインキュベートした後、Ｇ　Ｔ　−ＩＩ活性によりＯ
ＶＡに転移したガラクト−ス［３Ｈ１のトリチウム活性
を液体シンチレーションカウンターにより定量するもの
である。

しかし、この測定方法では、該抗原を含む体液中のＧＴ
活性を測定するため、酵素活性の維持を行い、見かけ上
の該抗原量の低下を防がなければならない。この失活防
止法としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン、α−ラク
トアルブミン等のようなＧＴ酵素活性部位との親和性を
有する物質を検体中に添加するか、水溶性高分子化合物
等を添加する方法がある。これらの方法は、あくまでも
酵素の失活を軽減したり、その期間を延長するに過ぎな
いものである。また、添加剤自体の加工法、保存性等の
新たな問題を生じ、汎用性φ操作性の点で欠点を有して
いる。

本発明者らは、このような欠点を解決するため、該抗原
の酵素活性を測定する方法から、該抗原の免疫学的抗原
決定部位を利用した測定法、即ち、競合法やサンドイツ
チ法の検討を進めてきた。一般に、該抗原の酵素活性に
比較して、抗原決定基は安定であると考えられる。通常
、ＧＴ活性を測定する場合、体液を患者より採取後、−
週間までの検体や、すぐに凍結保存し、６力月保存した
検体では８０〜９０％の活性の維持はほとんどの検体に
おいて可能であるが、１〜２％の検体では顕著な失活が
認められた。これ以外の保存方法や凍結・融解を繰り返
した検体では、５０〜８０％の酵素活性の失活が確認さ
れ、癌診断法としての産業上の利用はできない。

それに比較して、抗原決定基の安定性は、ガラクトシル
トランスフェラーゼに限らず、多くの蛋白質・核酸にお
いても室温での数日間の保存や、凍結・融解を繰り返し
た検体、５６°Ｃで１時間加熱することにより非動化し
た検体においても安定であることが知られている。

しかし、免疫学的測定法の検討を進めていくうえで、血
清や血漿、腹水、胸水などの体液において、強制劣化や
長期保存した検体では、見かけ上の該抗原量の増加が数
種のＧ　Ｔ　−ＩＩ特異的抗体を用いた測定法によって
見い出された。具体的には、癌患者検体に限らず、健常
人や良性疾患患者検体においても、５６°Ｃで０．５〜
１時間インキュベーションすることにより、新鮮検体や
短期間４°Ｃ又は凍結状態で保存した同一検体の抗原量
に比較して、２倍〜士数倍の増加が認められた。

同様の比較試験を行った結果、４５℃で１日保存、３７
°Ｃで２日保存、２１°Ｃで１週間保存、４°Ｃで数カ
月保存された各検体において、見かけ上の抗原量の増加
、反応性の増大が確認された。

前記の情況に照らし、本発明の目的はＧＴを免疫学的に
測定する際に、検体の保存状態による見かけ上の抗原量
の増加を防止し、簡便、迅速、確実に測定する方法を提
供することにある。

［課題を解決するための手段及び作用］本発明者らは、
ＧＴの測定に際して上記のような欠点を克服するために
、該抗原の免疫学的測定法において、種々、改良検討を
加えた結果、検体に一般に広く用いられる酸性物質を添
加することにより、検体のｐＨをコントロールし検体の
保存中の変性を避け、免疫学的測定法における見かけ上
の抗原量の増加を防止、即ち、擬陽性の要因の軽減に有
効であることを見い出し本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、ＧＴ及びそのアイソザイムの少なくと
も一方を免疫学的に測定するＧＴの測定方法において、
ｐＨ２〜６で保存した検体を測定することを特徴とする
ＧＴの測定方法に関するものである。

本発明における検体とは、血液、血清、血漿、尿、腹水
、胸水、骨髄液などの体液である。

本発明における免疫学的測定方法とは、抗原としてＧＴ
及びそのアイソザイムであるＧＴ−ＩＩの少なくとも一
方に特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗
体を不溶性担体に固定化し、検体中の該抗原との抗原−
抗体反応を利用する測定方法である。不溶性担体に反応
した該抗原量を検定する方法としては、例えば固定化用
抗体としてモノクローナル抗体を用いた場合には、先ず
、担体上に反応した該抗原の酵素活性を測定する方法、
即ち、ＧＴ活性を、その基質であるガラクトース供与体
、ガラクトース受容体又はガラクトースをラジオアイソ
トープや酵素、蛍光物質、発光物質、アビジン、ビオチ
ンなどによって標識し、その標識体量を測定することに
よる方法；固定化モノクローナル抗体に対して、該抗原
の反応性において同等の性能物、即ち、抗原決定基の全
部又は一部を共有する機能的同等物、例えば精製抗原は
もちろん、そのモノクローナル抗体に対する抗イデイオ
抗体、アミノ酸合成又は遺伝子組み換え操作などにより
調製された抗原決定部位を有する物質等を用い前記機能
的同等物を前記標識物質により標識し、固定化抗体に検
体中の抗原と標識体を競合的に反応させ、その標識体量
の検定により抗体量を定量する方法；固定化モノクロー
ナル抗体と同一種又は別種のＧＴ及びＧ　Ｔ　−ＩＩの
少なくとも一方に特異的なモノクローナル抗体及びポリ
クローナル抗体の少なくとも一方を前記と同様に標識し
、不溶性担体上に固定化された該抗原と反応している標
識体量を測定する方法（サンドイツチ法）が挙げられる
。前記サンドイツチ法のように複数種の抗体を用いる場
合には、感度や再現性などの点で固定化用抗体及び標識
抗体の少なくとも一方にモノクローナル抗体を用いる必
要がある。

本発明における抗原及び抗体を標識する物質の代表例と
しては、１３１１．１２５１．３．１４Ｄ、ペルオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスフ
ァターゼ、グルコアミラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナ
ーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、フルオレセイン、バクテリオファージ、Ｆｅ、
Ｃｒ、Ｐｔなどの金属原子により修飾されたハプテンを
用いたもの、ポリスチレンラテックス、ゼラチン粒子、
更に不対電子を有するハブテンを用いたものがその代表
例として挙げられるが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。

本発明は、検体にｐＨ２〜６の酸性領域にコントロール
できるような、酸性化合物を添加することにより検体の
保存中の該抗原の抗原決定基の類似部位を含有する物質
の現出をさけ、癌診断における検体の擬陽性率を低下せ
しめ、癌診断を効果的かつ高感度・簡便に測定すること
を特徴とするものである。

本発明における添加剤は、有機酸化合物、無機酸化合物
、無機塩などから選ばれる水溶性物質で、適当な濃度に
おいてその添加剤を加えたときに検体がｐＨ２〜６の範
囲、好ましくはｐＨ３〜５．５の範囲、更に好ましくは
ｐＨ４，２〜５．３の範囲内で保存が可能となる添加剤
である。

このような化合物、例えば、クエン酸、酢酸、グルタル
酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フタル酸、フマル酸
、コハク酸、マレイン酸などに代表されるようなカルボ
キシル基を有するカルボン酸系化合物やＥＤＴＡやその
誘導体である各挿填、エステル、酸塩化物、酸無水物、
酸アミド、アシル化合物などがあり、また、硫酸、硝酸
、炭酸、リン酸、カコジル酸、バルビッール酸やその塩
化物、エステル誘導体；グリシン、グルタミン酸などの
アミノ酸、ＭＥＳ、　Ｂ　ｉ　５−Ｔｒ　ｉ　ｓ、ＡＤ
Ａなどのグツド緩衝剤、塩化カルシウム、塩化マンガン
などの無機塩化物、無機酸塩化物などが有効であった。

ここに挙げた化合物は、代表例であって本発明はこれら
化合物に限定されるものではない。

これら化合物のなかで特に有効なものは、上記ｐＨの範
囲において緩衝能をもつ化合物であることが好ましい。

本発明の実施態様としては、例えば、一種又は数種の化
合物を既定量の体液を加えたときに、被検体のｐＨが前
記の範囲内に調節され得る量を真空採血管中に粉末及び
化合物含有液の少なくとも一方を凍結乾燥したものを添
加しておき、その採血管により採血する方法がある。ま
た、別の方法としては、凍結乾燥などの操作によって、
化合物の変質や保存性等に問題のあるものでは、その儂
縮液を密閉試験管に適量加え、採血後、できる限り早く
、この試験管に規定量の被検体を添加する方法がある。

［実施例コ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例Ｉ ＧＴ−１及びＧ　Ｔ−Ｈの双方に特異的なモノク０−ナ
ル抗体、抗体番号４８８０　（以下ｒＭＡｂ４８８０Ｊ
　という）（マウス−ハイブリドーマ細胞株微工研条寄
第１７５８号から得た。）及びＧ　Ｔ　−ＩＩ特異的モ
ノクローナル抗体、抗体番号３８７２　（以下ｒＭＡｂ
３８７２Ｊという）（マウス・ハイブリドーマ細胞株Ａ
ＴＣＣＨＢ８９４５から得た。）を用いて免疫学的測定
法を行った。

各抗体を１０ｐＬｇ／−の濃度にリン酸緩衝液（２０ｍ
Ｍ　　リン酸、１５０＋ｎＭ　　ＮａＣ１、ｐＨ７，４
；以下ｒＰＢｓＪという）中に懸濁し、不溶性固定化用
担体としてマイクロタイタープレート（タンク社製）を
用い、抗体溶液を添加し、４°Ｃで２０時間静置し、抗
体をプレート」二に固定化した。固定化後、ＰＢＳで充
分に洗浄し、１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（
以下「１％ＢＳＡ−ＰＢＳＪという）を加え、４℃で２
０時間静置し、ブロッキングした。検体として、正常人
血清と癌患者腹水を用いた。各検体は以下に示す添加剤
を加え、強制劣化処理を行った後、各ウェルに１００　
用文ずつ分注し、室温で２時間静置し、抗原−抗体反応
を行わせた。ＰＢＳで充分に洗浄後、それぞれビオチン
化ＭＡｂ４８８０又はペルオキシダーゼ標識ＭＡ　ｂ　
３８７２を加え、室温で２時間反応させた。ビオチン化
ＭＡｂ４８８０を２次抗体として加えたプレートでは、
更にＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプト
アビジン（ＢＲＬ社製）を、１％ＢＳＡｅＰＢＳ中に適
宜希釈し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳで充分に洗
浄した後、０，０２％Ｈ２Ｏ２含有クエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ５，０）中に０−フェニレンジアミン（以下
ｒＯＰＤＪという）を２ｍｇ／−の濃度に発色基質とし
て溶解し、各ウェルに１００　ｐ−１添加し、室温で３
０分発色させた。９Ｎ硫酸１００ル見を各ウェルに添加
し、反応を停止させた。各ウェルは、分光光度計により
ＯＤ　４９０を測定し、吸光度により抗原量の定量を行
った。

添加剤としては、グリシン−塩酸緩衝液　ｐＨ２，２、
ｐＨ３，０、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液　ｐ
Ｈ４，０、ｐＨ５，０、ｐＨ６，０、リン酸ナトリウム
緩衝液　ｐＨ７，４、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液　ｐＨ９，０、ｐＨ１０，０を最終濃度１００ｍＭと
なるように各検体に添加し、ブランクとして等量の蒸留
水を加えた各検体を用いた。強制劣化法として、５６°
Ｃで３０分間非動化処理を行った。比較例として、各検
体に添加剤を加えた後、強制劣化を行い、各ウェルに添
加・反応させたときの吸光度と、各検体を強制劣化した
後、添加剤を加え、各ウェルに添加・反応させたときの
吸光度を比較し、図ＩＡ及びＢに示した。更に、各検体
に蒸留水を加えて、非動化処理を行わないときの吸光度
も示した。

図ＩＡ及びＢから、ｐＨ２，０〜６．０の範囲で検体を
保存することにより、非動化処理を行っていない検体の
吸光度又は非動化後、添加剤を加えた検体の吸光度と、
添加剤を加えた後、非動化処理したときの吸光度を比較
すると、強制劣化による擬似抗原量の増加が抑制された
ことが明らかである。

実施例２ 固定化用抗体としてＭＡｂ３８７２、標識化抗体として
ＭＡｂ３８７２−ＨＲＰを利用して、実施例１と同様の
測定系を行った。添加剤としては、以下の添加剤の検討
を行った。０１００ｍＭクエン酸（ｐＨ２，４）、０１
００ｍＭ　　ベンズアミジンｉｎ蒸留水（ｐＨ４，０）
、０１００ｍＭ　　ベンズアミジン１ｎＰＢｓ　（ｐＨ
７，１）、０１００ｍＭ　　塩化カリウム・塩酸緩衝液
（ｐＨ２，０）、０１００ｍＭ　　塩化カルシウム（ｐ
Ｈ５，２）、０１００ｍＭ　　塩化マンガン（ｐＨ４，
５）、０１００ｍＭ　　塩化マグネシウム（ｐＨ６，５
）、０１％　２−メルカプトエタノール（ｐＨ７，１）
、■１％　２−メルカプト酢酸（ｐＨ２，，８）、（ｌ
ＥｌｌｌｏｏｍＭ　　ＥＤＴＡ−蒸留水（ｐＨ４，０）
、ｏｔ　００ｍＭ　　ＥＤＴＡ−ＰＢＳ　（ｐＨ６，８
）、＠Ｌ　００ｍＭ　　Ｂ　ｉ　５−Ｔｒ　ｉ　ｓ　（
ｐＨ５、７）、６１００ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ
８，０）、＠）蒸留水、■蒸留水（非動化処理なし） 検体は前記と同様、正常人血清と癌患者腹水を用い、各
試薬の濃縮液を一定量ずつ検体に加え既定の濃度として
各ウェルに分注し、測定を行った。結果を図２に示す。

図２から明らかなように、図２の１４．１５のポジティ
ブコントロールとネガティブコントロールとの比較にお
いて本発明の効果が明白である。

実施例３ ＭＡｂ３８７２をＰＢＳで１０Ｉｉ、ｇ／−の濃度に希
釈し、不溶性固定化担体であるポリスチレンビーズに抗
体含有溶液を加え４℃で２００時間反応せた。反応後、
ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中で更に４℃で２
０時間静置しブロッキングした。このビーズに検体と、
ラクトペルオキシダーゼ法により［１２５Ｉ］標識され
たＭＡｂ３８７２に対する抗イデイオモノクローナル抗
体５７１４　（以下ｒＭＡｂ５７１４Ｊという）（マウ
ス・ハイプリドーマ細胞株微工研条寄第１７５９号から
得た。）を５　ｇ　ｇ／ｌｄ［１２０，ＯＯＯｃｐｍ／
１００ル見］の濃度でそれぞれ１００ｇｕずつ加え、室
温で２時間反応させた。ＰＢＳで充分に洗浄してから、
γ線カウンターにより、放射活性を測定した。

検体としては癌患者腹水を用い、次の各希釈液により順
次希釈した。希釈液■１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、■癌患者腹
水（非動化処理）、■２５ｍＭクエン酸含有癌患者腹水
　ｐＨ５，２（非動化処理）、■正常人血清、■正常人
血清（非動化処理）、０２５ｍＭ　　クエン酸含有正常
人血清　ｐＨ５，０（非動化処理） 各データを表１に示した。

表１ Ｌ単位ｃｐｍ１ 表１から、本発明による見かけ上の抗原量の増大が抑制
されていることが明らかである。

実施例４ 固定化用抗体としてＭＡ　ｂ　３８７２、標識抗体とし
てＭＡｂ３８７２−ＨＲＰ、更に固定化用担体としてポ
リスチレンビーズを用いたサンドイツチ法を行った。実
施例１と同様の手順により担体上にＭＡｂ３８７２を固
定化ブロッキングした。

下記の各検体５０１Ｌ文とＰＢＳ　（ｐＨ７，４）２０
０川交、ＭＡｂ３８７２固定化ビーズをウェル中で静置
し、２１°Ｃで１６時間反応させた。

ＰＢＳにて洗浄後、ＭＡｂ３８７２−ＨＲＰ溶液を各ウ
ェルに２００＃文添加し、２１℃で２時間反応させた。

ＰＢＳで充分に洗浄した後、０．０２％Ｈ２Ｏ２含有ク
エン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５，０にＯＰＤ　　２ｍｇ／
−加え、ビーズを移し替えたチューブに５００　ｇ１分
注し、時々振盪しながら室温で３０分反応させ、ＩＮ硫
酸溶液２ｄにて反応を停止させた。波長４９０ｎｍの吸
光度を測定した。

検体として、正常人血清８例、癌患者血清５例を次の状
態にて保存した後、測定する。各血清に２５ｍＭ　　ク
エン酸−クエン酸ナトリウム混合液を添加し、ｐＨを４
．０〜５．５の間にコントロールしたものと、無添加の
ものを一４０°Ｃで１週間又は１力月、４°Ｃで１力月
、３７°Ｃで１週間それぞれ保存した検体を用いた。

結果を表２Ａ及びＢに示した。

表２Ａ ＊Ｅ　：　増加率（Ｄ−Ａ）　／Ａｘ　１００　Ｕ９６
］表２Ｂ ＊Ｅ：増加率（Ｄ−Ａ）　／ＡＸ　１００　Ｕ９６コ表
２Ａ及びＢにより、ｐＨを酸性領域でコントロールする
ことにより保存性の向上が現れ、本発明の効果は明らか
である。

［発明の効果］ 本発明によれば、ＧＴを免疫学的に測定する際に、検体
の保存状態による見かけ上の抗原量の増加を防止し、簡
便、迅速、確実に測定する方法を提供することができる
。

【図面の簡単な説明】

図ＩＡ及び図ＩＢは、実施例１において、それぞれＭＡ
ｂ４８８０又はＭＡ　ｂ　３８７２を用いたときの吸光
度の変化を示す図である。図２は、実施例２の結果を示
す図である。 プリジン　　　　　クエンＩｌｌ　　　　りン１に　　
グリシンｄ−ＨａＯ”がｒｒＬ′グリシン　　　　クエ
ンｐｉ　　　　リン酸　　グリシン　ｄ＋１２０　　Ｏ
Ｌ−一一一一り一一一一一　　：　　シｆ一方口１「リ
　シｆ：２Ｉ０１＊、づトマ労化−→−−：非！方化豫
、＃：加剰５＃　２゜図ＩＡ −・−一一一、非を労化１友１、閉ミカａ有ＩＩＡ閂力
ａ図ＩＢ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　ガラクトシルトランスフェラーゼ及びそのアイソザイ
   ムの少なくとも一方を免疫学的に測定するガラクトシル
   トランスフェラーゼの測定方法において、ｐＨ２〜６で
   保存した検体を測定することを特徴とするガラクトシル
   トランスフェラーゼの測定方法。